水產動物及人類病原菌－嗜水氣單胞菌基因診斷試劑盒及檢測方法
2023-12-05 11:11:21 1
專利名稱：水產動物及人類病原菌－嗜水氣單胞菌基因診斷試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及水生經濟動物和人類病原菌的診斷試劑盒及檢測方法，主要是針對嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)基因診斷的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種廣布於近岸海水、河流湖泊、下水道廢水及飲用水中，是一種條件致病菌，可以引起人和多種動物的敗血病、腹瀉等疾病，在一定的條件會引起暴發流行。近年來，我國常有因嗜水氣單胞菌引起許多動物(特別是水產動物)發病或大量死亡以及使人類致病的報導。目前已知脊椎動物中除圓口綱動物未報導有嗜水氣單胞菌引起疾病外，其它各綱動物均發現有嗜水氣單胞菌引起的疾病。尤其是引起養殖動物的暴發性疾病，給養殖戶造成巨大的損失，如鰱、鱅、錦鯉、鴨、羅非魚、鱉、蟹、翹嘴鮊、草魚等。一些珍貴動物如大熊貓、白暨豚等也受到嗜水氣單胞菌的感染而發病。可見嗜水氣單胞菌的感染範圍之廣，造成的損失之大。
嗜水氣單胞菌能使人患上很多疾病，常見的有腹瀉病、敗血症、食物中毒、傷口感染等。嗜水氣單胞菌主要是當人免疫力低下時而發病，如燒傷病人，用不潔水衝洗傷口，受到嗜水氣單胞菌感染而引起敗血症、炎症等。人們主要通過吃生食，或用不潔物品和水接觸傷口，從而感染嗜水氣單胞菌而發病，而出現腹瀉、發熱、嘔吐等症狀。
因此，可以說嗜水氣單胞菌是水生經濟動物細菌病的主要病原菌，也是對人類健康安全危害較大的一種病原菌。嗜水氣單胞菌病具有暴發快、流行廣、死亡率高等特點，由於細菌極易對抗生素產生抗藥性，因此目前對嗜水氣單胞菌病還未有特效的治療方法，推行水產品的健康養殖是最有效的預防措施，而這主要依賴於早期的快速檢測。目前對細菌的檢測技術主要包括傳統的形態及生理生化鑑定法、免疫學方法(主要有單克隆抗體技術、酶聯免疫檢測法(ELISA))、免疫電鏡技術、分子生物學方法(主要有分子雜交技術、限制性內切酶長度多態(RELP))等。這些檢測方法有些對技術條件要求高，檢測時間長。有些所需的材料製備麻煩，費用高，有些方法靈敏度不高，特異性不強，因此廣大水產養殖業主和醫生掌握的技術難度很大，很難推廣，限制了這些技術的應用和發展。
早期快速診斷水產動物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌是目前水產經濟動物養殖的主要措施和減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法是廣大水產養殖者急切盼望的。
多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR技術)，是上世紀80年代發展起來的一種體外擴增特異DNA片斷的技術，由於具有快速、敏感、特異性強等特點，所以這種方法建立後，很快就被應用於實踐中。
發明內容
本發明的目的是利用嗜水氣單胞菌基因保守序列設計的一對引物，建立嗜水氣單胞菌PCR反應體系，在此基礎上優化和設計，提供水產動物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒可批量生產，操作簡單，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用於水產動物各時期養殖過程中的細菌跟蹤檢測，也可用於人類急性敗血症的臨床檢測，還可以用於環境監測，避免病菌傳播流行，具有很高的實用價值。
本發明的水產動物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，1管，內裝1×PBS，pH7.4；2).PCR反應液B液，1管，內裝PCR擴增反應液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物AhF、引物AhR和TaqE；3).陽性對照液C液，1管，內裝嗜水氣單胞菌的總DNA，作為陽性模板；4).盒子；5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，裝於盒子中；泡沫板上有不少於上述小管數量的小孔，上述各小管分別對應放置於這些小孔中。
上述水產動物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒中所述的一對引物AhF和AhR是根據嗜水氣單胞菌基因保守區序列設計的，其DNA序列分別如下AhF5』-CCA AAC GAG AGA AGC CCT TAhR5』-AAA ACT TAG ATG TTT CAG TTC用本發明上述試劑盒檢測水產動物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的方法，按下列步驟進行1).取新鮮待檢樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，於無菌勻漿器中冰浴勻漿；待檢樣品可以是直接取自待檢動物的任何部位組織，最好是消化道或肌肉組織；對於人，可取糞便或傷口膿液作為待檢樣品。
2).6000～8000r/min離心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放於冰上5～10min；4).6000～8000r/min離心10min，上清作PCR模板；5).分別取模板和C液，加入到PCR反應液B液中，混勻後離心數秒(通常為500～1000r/min離心5～10sec)，置於PCR儀上；6).按下列條件擴增95℃3min預變性→94℃1min 34個循環→72℃10min→4℃保存49℃45sec72℃1min
7).反應結束後取5～10μl加2μl溴酚藍混勻，經1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘後於紫外儀上觀察，若在615bp處出現明亮的反應條帶，則為嗜水氣單胞菌陽性；若無反應條帶顯示，則為陰性。
本發明的有益效果本發明的水產動物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒及檢測方法，是以根據嗜水氣單胞菌基因保守區序列設計的一對引物為主體而設計的。利用該對引物，可以特異性地擴增攜帶嗜水氣單胞菌的待測樣品的有關基因片斷，所建立的優化的PCR體系保證檢測結果的快速性、準確性和穩定性。因此，使用本發明的試劑盒及檢測方法，可以簡便、快速、靈敏而特異的地檢測感染嗜水氣單胞菌的水產動物，大大高於傳統和常規的生物學方法，可運用於水產動物各時期養殖過程細菌中的細菌跟蹤檢測，也可用於人類急性敗血症的臨床檢測，還可以用於環境監測，避免病菌傳播流行，具有很高的實用價值。
圖1是感染嗜水氣單胞菌的羅非魚肝臟組織樣品的PCR擴增結果。其中MDNA分子量標準；1嗜水氣單胞菌陽性對照；2嗜水氣單胞菌陰性對照；3檢測樣品；具體實施方式
以下通過具體實施例對本發明作進一步說明。
實施例1嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒該試劑盒由下列部分構成(10樣份)1).樣品稀釋液(A液)，1管，5ml/管，內裝1×PBS，pH7.4。
2).PCR反應液(B液)，1管，250μl/管，內裝PCR擴增反應液(25μl體系)，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物AhF、引物AhR和TaqE。
3).陽性對照液(C液)，1管，20μl/管，內裝嗜水氣單胞菌總DNA，作為陽性模板；4).長方體盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個孔，孔徑1.3cm，第二排五個孔，孔徑1.0cm，第三、四排分別六個孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對應放置於這些小孔中，裝於長方體盒子中。
該試劑盒中的一對引物的DNA序列如下AhF5』-CCA AAC GAG AGA AGC CCT TAhR5』-AAA ACT TAG ATG TTT CAG TTCPCR擴增反應液體系(25μl體系)如下ddH2O21μl
10×Buffer 1.8μldNTP 0.4μl引物AhF 0.3μl引物AhR 0.3μlTaqE 0.2μl實施例2水產動物和人類病原菌—嗜水氣單胞菌的檢測方法使用實施例1的試劑盒，按下列步驟進行1).用無菌操作方法，取新鮮羅非魚肝臟組織0.05g，加入樣品稀釋液(A液)500μl稀釋10倍，於無菌勻漿器中冰浴勻漿；2).6000r/min離心5min；3).取上清100μl，煮沸15min，立刻放於冰上5min；4).6000r/min離心10min，上清作為PCR模板；5).分別取模板和C液1μl，加入到PCR反應液(B液)中，混勻後，1000r/min離心10sec，置於PCR儀上；6).按下列條件擴增95℃3min預變性→94℃1min 34個循環→72℃10min→4℃保存49℃45sec72℃1min7).反應結束後取5～10μl加2μl溴酚藍混勻，經1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)後於紫外儀上觀察，若在615bp處出現一明亮的反應條帶(與陽性對照在同一位置)，則為嗜水氣單胞菌陽性，說明檢測樣品中攜帶嗜水氣單胞菌；若無反應條帶顯示，則為陰性，表明檢測樣品中不含嗜水氣單胞菌(見圖1)。
權利要求
1.水產動物及人類病原菌-嗜水氣單胞菌的基因診斷試劑盒，其特徵是該試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，1管，內裝1×PBS，pH7.4；2).PCR反應液B液，1管，內裝PCR擴增反應液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物AhF、引物AhR和TaqE；AhF為5』-CCA AAC GAG AGA AGC CCT T-3』，AhR為5』-AAA ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3』；3).陽性對照液C液，1管，內裝嗜水氣單胞菌的總DNA；4).盒子；5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，裝於盒子中；泡沫板上有不少於上述小管數量的小孔，上述各小管分別對應放置於這些小孔中。
2.一種檢測水產動物及人類病原菌-嗜水氣單胞菌的方法，其特徵是使用權利要求1所述試劑盒，按下列步驟進行1).取新鮮待檢樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，於無菌勻漿器中冰浴勻漿；2).6000～8000r/min離心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放於冰上5～10min；4).6000～8000r/min離心10min，上清作PCR模板；5).分別取模板和C液，加入到PCR反應液B液中，混勻後離心數秒，置於PCR儀上；6).按下列條件擴增95℃ 3min預變性→94℃ 1min 34個循環→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反應結束後取5～10μl加2μl溴酚藍混勻，經1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘後於紫外儀上觀察，若在615bp處出現明亮的反應條帶，則為嗜水氣單胞菌陽性；若無反應條帶顯示則為陰性。
全文摘要
本發明提供一種水產動物(如中華鱉、羅非魚，鰻鱺和三角帆蚌等)及人類病原菌—嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒及檢測方法是以嗜水氣單胞菌基因保守區序列設計的一對引物為主體而設計的。本發明採用聚合酶鏈式反應(PCR)技術，對水產動物(如中華鱉、羅非魚，鰻鱺和三角帆蚌等)及人類的病原菌—嗜水氣單胞菌的特異性DNA片斷進行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用於水產動物各時期養殖過程中的細菌跟蹤檢測，也可用於人類腹瀉病、敗血症、食物中毒等的臨床檢測，還可以用於環境監測，避免病菌傳播流行，具有很高的實用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1560275SQ20041001546
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月26日 優先權日2004年2月26日
發明者鄧先餘, 何建國, 王智學, 黃志堅, 翁少萍 申請人:中山大學, 珠海福德隆生物技術有限公司