蚯蚓纖連蛋白酶在B型肝炎治療中的應用的製作方法

2023-12-05 18:17:21

專利名稱：蚯蚓纖連蛋白酶在B型肝炎治療中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術的領域，具體地說，本發明提供蚯蚓纖連蛋白酶 降解纖維連接蛋白的應用，以及在B型肝炎治療中的應用。
背景技術：
B型肝炎，簡稱B肝，是由B型肝炎病毒(HBV)引起的傳染病。 通過血液與體液傳播，具有慢性攜帶狀態。本病在我國廣泛流行。據有 關資料，肝炎檢測陽性的患者己經達到1.89億，而應就診未就診人數(攜 帶者)將近4億。是當前危害人民健康最嚴重的傳染病。多見於兒童及 青壯年。B肝臨床表現多樣化，易發展為慢性肝炎和肝硬化，少數病人 可轉變為原發性肝癌，這些疾病對病人以及社會的危害更加嚴重。
發病過程 一般來說，肝細胞受B肝病毒入侵後，B肝病毒本身並 不直接引起肝細胞的病變。B肝病毒只是利用肝細胞攝取的養料賴以生 存並在肝細胞內進行複製。病毒複製的表面抗原、e抗原和核心抗原都釋 放在肝細胞膜上，激發人體的免疫系統來辨認，並發生反應。這種在肝 細胞膜上發生的抗原抗體反應可造成肝細胞的損傷和破壞，從而產生一 系列臨床症狀。
治療手段我國多數患者是在圍生期或年幼時感染HBV造成免疫耐 受，往往形成慢性感染，這些患者需要積極而有效的治療，否則可能發 展為肝硬化甚至肝癌，導致死亡。然而迄今尚無一種可靠的治療方法能 清除或永久抑制HBV的複製，從而終止肝臟的炎症和壞死。慢性乙型肝 炎目前的治療目標是①抑制HBV複製(HBsAg、 HBeAg消失)；②非 擴增法檢測不出HBVDNA水平；③病情改善，ALT復常；④肝組織學 改善； 減少肝臟失代償、肝硬化、肝細胞肝癌的發生率。目前用於治療B肝的藥物主要包括幹擾素、核苷酸類似物等抗病毒藥物和胸腺肽等 免疫調節藥物。
1. 傳統幹擾素與聚乙二醇幹擾素幹擾素目前仍是治療B型肝炎 的一線藥物，它具有明確的療程，療效好，可使HBsAg消失和抗HBs 產生，無耐藥性等優點，但是由於同時存在副作用較多、不能使用於失 代償性肝硬化患者、注射治療麻煩及代價昂貴等缺點而限制了其使用。 在美國，很多的醫生傾向於選擇核苷(酸)類似物治療慢性B肝。
2. 拉米夫定短期用拉米夫定對HBV DNA的抑制作用、HBeAg 轉陰率、HBeAg血清轉換率及血清ALT復常率均優於幹擾素，而且服用 方便，可以用於失代償性肝硬化及肝移植前後患者，但是其持續應答率 不及幹擾素，而且存在一個較突出的耐藥性問題，且隨著服用時間的延 長，耐藥性也會逐漸增加。
3. 阿德福韋酯是一新型核昔(酸)類似物，口服阿德福韋酯是阿德 福韋的前體，能有效抑制B肝病毒複製、改善組織學、延緩疾病進展成 肝硬化、肝功能失代償及肝癌，它的耐藥性發生低於拉米夫定，且對拉 米夫定耐藥者有很好的治療效果，但是長期服用有一定腎毒性，需定期 監測血清肌酐和血磷。
4. 恩替卡韋是環戊醯鳥苷類似物，我國SFDA去年年底剛批准 用於慢性B型肝炎的治療。
5. 其他其他還在進行n、 m期臨床試驗的藥物有恩曲他濱、特必
夫定、克拉夫定。
6. 免疫調節治療免疫調節治療是治療慢性B型肝炎的重要手段之
一，目前用於治療B型肝炎的免疫調節藥物主要是胸腺肽。胸腺肽剌激
T細胞，增強非特異性免疫功能，其不良反應小，耐受性好，使用安全，
對於有抗病毒治療指針，但不能耐受或不願接受幹擾素和核苷酸類似物 治療的患者可選用胸腺肽。
隨著B型肝炎發病機理研究的深入，研究工作者發現纖維連接蛋白
在B型肝炎發病過程中發揮著重要作用。纖維連接蛋白(Fibronectin， FN) 是一種存在於血液、體液及各種組織中的具有多種功能的糖蛋白，來源 於肝細胞，枯否細胞和內皮細胞，通過與整合素結合調節細胞間的粘附、免疫、凝血和血小板的聚集，另外在腫瘤與纖維化的發展與發病機制中， FN也起著重要的作用。
一、 纖維連接蛋白的結構及功能
FN按分布不同可分為兩種， 一種是分布於血漿的血漿型FN(pFN)， 另一種是廣泛分布於人體內細胞表面的細胞型FN(cFN)。 pFN是一種可溶 性的蛋白質，在血液中濃度很高。血液中的可溶性的FN大部分是由肝細 胞合成。cFN作為不溶性FN的一部分，可以摻入到細胞周圍基質中，肝 髒中的FN主要由內皮細胞，貯脂細胞及枯否細胞分泌。FN分子可以結合 多種分子發揮其功能，如膠原蛋白、肝素、血纖維蛋白及細胞表面受體， 其中與細胞表面受體的結合主要是通過FN分子中的RGD序列。識別RGD 序列的一些粘合素分子都可以識別FN中的RGD序列，所以FN可通過RGD 與受體相連，從而發揮調節作用。
FN還具有病毒結合活性，與A型肝炎病毒(HAV)結合後，發生HAV 的屏蔽現象，可幹預病毒檢測的放免法，通過富含FN的血產品有助於肝 炎病毒的頻繁傳播。有學者發現人肝臟中的FN通過與HBV前S2區編碼的 一特異抗原決定簇結合，從而使病毒在肝竇內循環時被肝細胞所吸收， 促進病毒對肝細胞的作用。同時，在肝纖維化及肝細胞癌時，FN在RNA 水平發生變化。
二、 纖維連接蛋白與慢性肝炎、肝硬化
HCV和HBV感染後常進展為慢性病毒性肝炎。慢性肝病尤其是活動 性病變，由於致病因素的持續作用和機體免疫功能失調，以致肝細胞持 續受損，纖維組織不斷增生而導致肝硬化。Martinez-Hernandez等提出FN 在肝臟的纖維化過程中發揮重要的作用，可促使肝細胞分泌膠原，促進 成纖維細胞的趨化性，促進成纖維細胞及肝細胞等與膠原基質的粘附作 用。存在於成纖維細胞表面的細胞連結素，它與酸性粘多糖及膠原具有 很強的親和性，以FN為核心，結合粘多糖及膠原成為三元複合體，做成 細網構造，被視為肝纖維化的基礎。與正常人群相比較，慢性活動型肝 炎(CAH)患者中FN水平明顯增加。
血漿型FN絕大部分由肝細胞合成，炎症造成血漿中FN消耗導致血漿 中FN降低，FN減少則反映了肝細胞合成蛋白質功能的減退，故在肝硬化時，血漿FN水平則明顯降低，然而在急、慢性肝炎時增加。Odenthal等 提出在肝纖維化的急性階段及接近纖維化階段，細胞型的FN mRNA表達 增加。Jamagin等用鼠急性肝損傷模型檢測到，內皮細胞主要產生EIII-A 陽性的FN，相反被激活的貯脂細胞主要分泌EIII-B陽性FN。 Shigem等採 用免疫組化及原位雜交法檢測到了在肝纖維化區細胞型FN(EIII-APR陽 性)沉積，提示細胞型FN在肝纖維化時起關鍵作用。在纖維化肝臟中，肝 細胞與非實質細胞中細胞型FN的mRNA表達增加，而且表達FN的細胞也 有所增加，細胞型FN在肝纖維化形成的早期發揮著重要的作用。 三、纖維連接蛋白與肝細胞癌
細胞外基質(ECM)被認為在腫瘤、腫瘤侵襲及轉移中發揮重要的作 用。不同分化的肝癌其ECM定位不同。FN、 FN受體(整合素a5與(31)及其 片段mAD2(惡性病變相關DNA連接蛋白2)的研究，提示整合素a5(31和FN 與肝癌分化有關，並影響肝癌的侵襲性與轉移。
現已證實FN參與慢性肝炎、肝硬化及肝癌的發生發展，主要通過選 擇性剪切和改變與受體的結合來發揮調節作用。其在分子水平中的調控 機制仍不清楚，尚需進一步的研究。
蚯蚓俗稱地龍，其種類繁多，資源豐富。蚯蚓作為藥物使用，在我 國已有1200多年的歷史。最原始的方法是利用整個鮮蚯頓或幹蚯頓；隨 著發展，後來發現蚯蚓的藥用價值與其中含有的多種化學成分有關。目 前已經分離到多種不同純度的蚯蚓成分，其中包括纖溶酶、纖溶酶原激 活劑、鈣調素和鈣調素結合蛋白、膽鹼酯酶、過氧化氫酶、超氧化物歧 化酶SOD、促髓系細胞增殖組分、抗微生物蛋白、收縮血管蛋白、溶血 蛋白、免疫球蛋白樣粘連物和抗腫瘤蛋白、抗菌肽等，取得了較大的進 展。
在蚯蚓體內有一組蛋白，其胺基酸序列選自SEQ ID NO.l, SEQ ID N0.2， SEQIDNO.3, SEQIDNO.4, SEQIDN0.5， SEQIDNO.6, SEQ IDNOJ， SEQIDN0.8， SEQIDN0.9， SEQIDNO.IO， SEQIDNO.ll， SEQIDN0.12， SEQIDNO,13， SEQIDN0.14， SEQIDNO.15 (這15
種胺基酸序列的共性具有共同的功能域H43， D91， S^(其上編號對應
於SEQ ID NO.l胺基酸序列)組成的催化三聯體，其中SEQ ID NO.2- SEQ
8IDNO.ll與SEQIDNO.l具有85%以上的同源性)。本發明首次發現其 在與血清孵育過程中可迅速降解血清組分纖維連接蛋白，因此將其稱為 蚯蚓纖連蛋白酶。通過進行用所述蚯蚓纖連蛋白酶對HepG 2.2.15細胞水 平的作用的研究，發現蚯蚓纖連蛋白酶處理組對HBsAg， HBeAg的分泌 具有抑制作用，通過用所述蚯蚓纖連蛋白酶對HBV轉基因小鼠的治療作 用的研究表明，轉基因小鼠血清中ALT， AST上升被抑制，HBsAg分泌 受到抑制，並且其可使HBsAg轉基因小鼠的肝臟壞死病變減輕。因此， 所述蚯弼l纖連蛋白酶可以用於製備預防或治療與纖維連接蛋白相關的疾 病，如B型肝炎的藥物的應用。

發明內容
本發明的一個目的是提供蚯蚓纖連蛋白酶用於降解纖維連接蛋白的 應用。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶的胺基酸序列為SEQ ID NO.l。
在另一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列， 其胺基酸序列具有H43， D91， S,其上編號對應於SEQ ID NO.l胺基酸 序列)組成的催化三聯體。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列，所 述胺基酸序列與SEQ ID NO.l具有80%以上的同源性。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列，所 述胺基酸序列與SEQ ID NO.l具有85%以上的同源性。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列，所 述胺基酸序列選自SEQIDN0.2， SEQIDNO.3, SEQIDNO.4, SEQ ID N0.5， SEQIDN0.6， SEQIDNO.7, SEQIDN0.8， SEQIDN0.9， SEQ ID NO.IO， SEQIDNO,ll， SEQ ID NO,12， SEQ ID N0.13, SEQ ID N0.14, SEQ ID NO.15所示的胺基酸序列。
在一個優選實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為選自SEQ ID NO.l, SEQIDNO.2, SEQ IDNO.3, SEQ IDNO.4, SEQIDNO.5, SEQ ID NO.6，SEQIDNO,7， SEQIDNO.8, SEQ ID NO,9， SEQ ID NO.IO， SEQ ID NO.ll， SEQIDN0.12， SEQIDNO.13, SEQIDNO.14,或SEQIDNCU5 所示的胺基酸序列的單一組分使用。
在一個優選實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為粗酶混合物使用， 所述混合物包括SEQ ID NO.l, SEQ ID N0.2， SEQ ID NO.3, SEQ ID N0.4， SEQIDN0.5， SEQIDNO,6， SEQIDNO.7, SEQIDNO.S， SEQ IDN0.9， SEQIDNO.IO， SEQ ID NO.ll, SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDN0.14， SEQIDN0.15所示的胺基酸序列中的兩種或多種。
在一個優選實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為粗酶混合物使用， 所述混合物主要成分有SEQ ID NO.l ， SEQ ID NO,2， SEQ ID NO.12, SEQ IDN0.13, SEQIDNO.14,以及SEQ ID N0.15，其中SEQ ID NO. 1豐度 最高。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶的用量為0~10pM。 在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶的用量為0-2pM。 在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶的用量為0-5pg/ml。 本發明的另一個目的是提供所述蚯蚓纖連蛋白酶用於製備藥物的應
用，所述藥物用於預防或治療與纖維連接蛋白有關的疾病。
在一個實施方案中，所述疾病為B型肝炎，慢性B型肝炎，肝硬化，
腫瘤等疾病。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶的胺基酸序列為SEQ ID NO.l。
在另一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列， 其胺基酸序列具有H43， D91， S^(其上編號對應於SEQ IDNO.l胺基酸 序列)組成的催化三聯體。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列，所 述胺基酸序列與SEQ ID NO.l具有80。/。以上的同源性。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列，所 述胺基酸序列與SEQ ID NO.l具有85%以上的同源性。
在一個實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列，所 述胺基酸序列選自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4， SEQ IDN0.5， SEQIDNO-6， SEQIDN0.7， SEQIDN0.8， SEQIDNO,9， SEQ ID NO.IO， SEQ ID NO.l 1， SEQ ID N0.12, SEQIDNO.13, SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的胺基酸序列。
在一個優選實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為選自SEQ ID NO.l, SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDNO-4， SEQIDN0.5， SEQIDNO,6， SEQ ID N0.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO.ll， SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15 所示的胺基酸序列的單一組分使用。
在一個優選實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為粗酶混合物使用， 所述混合物包括SEQ ID NO.l, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID N0.4， SEQIDNO.5, SEQIDNO.6, SEQIDNO.7, SEQ ID NO.8 ， SEQ IDN0.9， SEQIDNO.IO， SEQ ID NO.l 1， SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15所示的胺基酸序列中的兩種或多種。
在一個優選實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為粗酶混合物使用， 所述混合物主要成分有SEQ ID NO.l ， SEQ ID NO.2, SEQ ID NO,12， SEQ IDN0.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15,其中SEQ ID NO.l豐度最高。
在一個優選實施方案中，所述蚯頓纖連蛋白酶的劑量為2000mg/kg 大鼠體重。
在一個優選實施方案中，所述蚯蚓纖連蛋白酶的劑量為50mg/kg小 鼠體重。
本發明還提供一種用於治療與纖維蛋白相關的疾病的藥物，所述藥物 包含上述蚯蟲引纖連蛋白酶作為活性成分。所述藥物的有效量可以由本領 域技術人員根據實際情況確定。
在一個實施方案中，所述疾病為B型肝炎，慢性B型肝炎，肝硬化，
腫瘤等疾病。
在一個優選實施方案中，所述藥物所用劑量為2000mg/kg大鼠體重。 在另一個優選實施方案中，所述藥物所用劑量為50mg/kg小鼠體重。 所述藥物的所用配製方法，使用方法以及所用的輔料為本領域技術人 員所眾所周知。本發明所針對的對象，為哺乳動物，如人，小鼠，大鼠。在一個實施 方案中，本發明所述的蚯蚓纖連蛋白酶以及包含其的藥物針對人進行施 用。
本發明通過蚯蚓纖連蛋白酶與人血清孵育後SDS-PAGE檢測血清蛋 白的變化，首次發現所述蚯蚓纖連蛋白酶有快速降解纖維連接蛋白的能 力。本發明將所述蚯蚓纖連蛋白酶與血清共孵育，經SDS-PAGE發現有 幾個血清蛋白條帶消失或者變淡。經質譜鑑定，得到一快速降解的蛋白 為纖維連接蛋白。該蛋白在機體內有相當多的生理功能，其中之一就是 與B型肝炎病變的發展有關。用蚯蚓纖連蛋白酶降解纖維連接蛋白純品， 將降解片段進行N端測序，發現作用位點比較單一，主要集中在賴氨酸 和精氨酸兩個鹼性胺基酸附近，具有典型的胰蛋白酶的特性，具有一定 的水解特異性。
本實驗還進行了所述蚯蚓纖連蛋白酶對HepG 2.2.15細胞水平的作用 的研究。實驗結果表明，與空白細胞相比，蚯蚓纖連蛋白酶處理組HBsAg， HBeAg的分泌均受到抑制，細胞培養基中HBsAg， HBeAg含量有所下降。 與拉米夫定陽性對照組相比，蚯蚓纖連蛋白酶對HBeAg的分泌有更強的 抑制作用。
本實驗室還進行了蚯蚓纖連蛋白酶對HBV轉基因小鼠的治療作用的 研究。結果表明，與生理鹽水陰性對照組相比，轉基因小鼠血清中ALT， AST上升被抑制，HBsAg分泌受到抑制，這兩個指標均優於拉米夫定的 治療效果。生理鹽水組及拉米夫定組轉基因小鼠的血清FN隨生存時間的 延長而增加，使用蚯蚓纖連蛋白酶後含量基本維持在恆定的水平。對肝 髒的病理學觀察結果顯示，蚯蚓纖連蛋白酶組對B型肝炎有治療作用，
與生理鹽水組相比，可使HBV轉基因小鼠的肝臟壞死病變減輕，療效與 拉米夫定組類似。
因此，本發明在HBV轉基因小鼠水平證明蚯蚓纖連蛋白酶對乙型肝 炎轉基因小鼠的HBsAg分泌有一定的抑制作用，對血清ALT、 AST維持 正常的水平有有益的幫助。B型肝炎轉基因小鼠病理切片觀察發現，蚯 蚓纖連蛋白酶對HBV轉基因小鼠的肝臟病變有一定的保護作用。
本發明認為蚯蚓纖連蛋白酶在對B型肝炎治療中，對慢性B型肝炎的治療更有優勢。目前臨床使用的B型肝炎治療藥物，包括幹擾素、拉
米夫定、阿德福韋酯等主要使HBsAg,HBVDNA恢復到一定的水平。但 B型肝炎治療的另一個困難是病變引起肝硬化的發生，蚯蚓纖連蛋白酶 恰巧具有降解纖維連接蛋白的能力，不僅可以在一定程度上阻斷病毒的 傳播，而且可以降低肝臟的纖維連接蛋白的量，緩解肝硬化的發生。
本發明認為蚯弼l纖連蛋白酶對B型肝炎、尤其是慢性B型肝炎預防和 治療作用機理之一是蚯蚓纖連蛋白酶有快速降解纖維連接蛋白的能力。 由於纖維連接蛋白在機體內的生理功能很多，與細胞間的粘附、免疫、 凝血和血小板的聚集以及老化都有關係，所以預期蚯蚓纖連蛋白酶對凝 血、腫瘤等疾病也有一定的作用。


圖h蚯蚓纖連蛋白酶與血清共同孵育後SDS-PAGE圖
A:血清在37。C孵育不同時間後SDS-PAGE圖(M:標準分子量；1:對照
(未加蚯蚓纖連蛋白酶的血清)；2: 15min; 3: 30min; 4: 45min; 5: 60min; 6: 90min; 7: 120min; 8: 180min )
B:蚯蚓纖連蛋白酶與血清在37。C共同孵育不同時間後SDS-PAGE圖(M:
標準分子量；1:對照(未加蚯蚓纖連蛋白酶的血清)；2: 15min; 3: 30min; 4: 45min; 5: 60min; 6: 90min; 7: 120min; 8: 180min) 圖2: MALDI-TOFMS法鑑定被蚯蚓纖連蛋白酶迅速降解的條帶 圖3:蚯蚓纖連蛋白酶對纖維連接蛋白作用位點圖
圖4:大鼠口服蚯蟲引纖連蛋白酶後血清中纖維連接蛋白相對含量的變化 (Mean士SD, n=6).
圖5:蚯蚓纖連蛋白酶對HBV轉基因小鼠的治療作用 5-1: ALT的變化 5-2: AST的變化 5-3: HBsAg的變化
5-4:血清中纖維連接蛋白FN相對含量的變化 5-5:轉基因小鼠肝臟病理觀察結果
A:生理鹽水組(IO倍)B:蚯蚓纖連蛋白酶處理組(IO倍) C:拉米夫定組(IO倍)
圖6蚯弼l纖連蛋白酶對HepG2.2.15細胞水平的作用 6-1:蚯蟲引纖連蛋白酶對HBsAg和HBeAg分泌的影響 6-2:拉米夫定對HBsAg和HBeAg分泌的影響
以下本文將通過具體的實施例來描述本發明。如未特別指明之處，可
根據本領域技術人員所熟悉的參考書如蛋白質技術手冊(汪家政、範 明主編，科學出版社)、抗體技術實驗指南(沈關心、龔非力等譯，科學 出版社)、藥理實驗方法學(第三版，主編徐淑雲，人民衛生出版社)、 分子生物學實驗指導(劉進元，清華大學出版社)、分子克隆實驗指南(第 三版，黃培堂等譯，科學出版社)等以及本文所引用的參考文獻中所列 的方法來實施。
實施例
實施例l蚯蚓纖連蛋白酶與血清共孵育試驗
實驗方法與結果
1. 取新鮮人血清，稀釋2倍，加入一定濃度的蚯蚓纖連蛋白酶(0 10j^M) (SEQIDNO.l)於37。C孵育，分別於15, 30, 45, 60, 90, 120禾口180min取
樣，同時以空白血清(在37。C孵育15, 30,45, 60，90, 120和180min)作為對照。
2. 將上述血清酶解產物及空白血清孵育樣品用去離子水稀釋10倍，加入 2xSDS-PAGE上樣緩衝液，煮沸10分鐘，進行8% SDS-PAGE，最後以考 馬斯亮藍染色。
3. SDS-PAGE圖見圖1。結果顯示空白血清在37。C孵育不同時間蛋白質條 帶無明顯變化(見圖1A)。血清與蚯蚓纖連蛋白酶的孵育產物中有一些蛋 白條帶迅速降解(見圖1B)。
實施例2典型蛋白條帶的鑑定
實驗方法與結果
14儀器日本島津/KRATOS雷射離子化質譜儀AXlMA-CFRTMPlus型，質 量數範圍1 500,000Da，質量數精度< 5ppm，解析度20,000，靈敏度 lOfmol。
步驟
1. 將所選擇的膠帶'a，用切膠筆切下，置於eppendorf(EP)管中，並記錄
點號及相應的位置；
2. 力口 50(iLDDH2O洗兩次，10min/次；
3. 加50mMNH4HCCV乙腈4: 1溶液50jiL，超聲脫色5min或37。C脫 色20min，吸乾；
4. 重複步驟3，直至藍色褪去；
5. 加乙腈50jaL脫水至膠粒完全變白，真空抽乾5min;
6. 力B 10 mM 二硫蘇糖醇(DTT) (10jjL1MDTT， 990(iL 25mM NH4HC03 配製)20(xL， 56。C水浴lhr;
7. 冷卻到室溫後，吸乾，快速加55mM碘代乙醯胺(IAM) (55pL 1M IAM， 945^iL25mMNH4HC03配製)20pL，置於暗室45min;
8. 依次用25mMNH4HC03、 50%乙腈溶液和100%乙腈洗，乙腈脫水到 膠粒完全變白為止，真空抽乾5min;
9. 將0.1嗎/pL的胰蛋白酶儲液以25mMNH4HCO3稀釋10倍，每EP管 加2nL，稍微離心一下，讓酶液充分與膠粒接觸，4。C或冰上放置30min， 待溶液被膠塊完全吸收，加25mMNH4HC03 10-15pL置37°C，消化過夜；
10. 加入2%三氟醋酸(TFA)終止反應，使TFA終濃度為0.1%,振蕩 混勻，10000rpm離心。
11. 消化產物上清液進行質譜分析(參考蛋白質化學與蛋白質組學一書。 夏其昌、曾嶸等，科學出版社)，獲得酶解肽段的分子質量。
12. 將不同肽段的分子質量結果與NCBI資料庫進行比對(MASCOT search program)。確定鑑定的蛋白質。
結果鑑定結果表明，蛋白條帶V為纖維連接蛋白(見圖2，在鑑定肽段 中，有21個肽段與纖維連接蛋白的酶解肽段比對成功，可能性分數為92， 結果可靠。)實施例3蚯蚓纖連蛋白酶對纖維連接蛋白水解位置的確定
實驗方法與結果
1. 將10^纖維連接蛋白(Sigma-aldrich， USA， lmg/ml)與2^1蚯蚓纖 連蛋白酶(SEQIDNO.l) (0 2pM)在37"C孵育不同時間，將酶解產物 進行8% SDS-PAGE並轉至PVDF膜(Millipore， USA)。
2. 將膜進行考馬斯亮藍染色，將酶解產生的主要條帶進行N端測序(儀 器為Applied Biosystem Automated Protein Sequencer, Applied Biosystem Inc., USA),確定水解位點。
3. 蚯蚓纖連蛋白酶對纖維連結蛋白的作用位點見圖3。結果顯示蚯蚓纖 連蛋白酶對纖維連結蛋白的作用位點比較單一，主要集中在賴氨酸和精 氨酸兩個鹼性胺基酸附近，具有典型的胰蛋白酶的特性。
實施例4大鼠口服蚯蚓纖連蛋白酶後血清中纖維連接蛋白濃度的變化
實驗方法與結果
1. 選擇健康雄性SD大鼠6隻(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)
(200~250g)，禁食12小時，自由飲水。
2. 服藥前取空白血0.5ml。灌胃服用蚯蚓纖連蛋白酶(粗酶，硫酸銨沉澱 法獲得，參考文獻Zhou J, Wu C, He RQ，(1998) J. Biochem. Mol. Bio.& Biophys. 5， 17-18,主要成分有SEQ ID NO.l， SEQ ID N0.2, SEQ ID NO.12, SEQIDN0.13， SEQIDN0.14， SEQIDNO,15，其中SEQID NO.l豐度最高)(每kg大鼠體重灌胃服用2000mg蚯蚓纖連蛋白酶)， 定時取血(0.5， 1， 1.5， 2， 3， 4， 6， 8， 26h)，經眼眶靜脈叢收集全 血，分離血清，於-2(TC保存備用。
3. ELISA法測定上述血清中纖維連結蛋白的濃度
(1) 將血清(步驟2製得)稀釋50倍，在96孔酶標板(Coming incorporated Costar , USA)中每孔加入樣品50|il， 37。C孵育2小時，PBST
(137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, lOmmol/L Na2HP04, 2mmol/L KH2P04， 0.02% Tween 20， pH7.4)洗滌。
(2) 加入100W 5%馬血清(北京中杉金橋生物技術有限公司)37。C封 閉2小時，PBST洗滌。(3) 加入50 pl纖維連結蛋白抗體(Sigma, USA) ， 37。C孵育2h， PBST 洗滌。
(4) 加入IOO pl辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(北京中杉金橋生物 技術有限公司)，37"孵育lh， PBST洗滌。
(5)加入100 ^顯色劑暗處顯色10分鐘。加入50 pl 2M的硫酸終止反應。
顯色劑的配製方法為
四甲基聯苯胺(TMB)溶液(6mgTMB溶於lmlN， N-二甲基甲醯胺) 100^1， 30%雙氧水15|il， 0.1mol/L PB (1.0M NaH2P04 87.7ml， 1.0M Na2HP04 12.3ml，稀釋至1000ml, pH6.0) 10ml。酶標儀450nm測定OD 值。用OD值的變化表徵纖維連結蛋白濃度的變化(以用藥前纖維連結 蛋白的ODo值為100%，用藥後某一時刻t纖維連結蛋白的相對濃度
FN =^ixl00%， ODt為不同時間點測得的Jtoi青中鄉書t^蛋白的OD值。 OD。
4.大鼠灌胃服用蚯蚓纖連蛋白酶後血清中纖維連接蛋白濃度的變化見圖 4。結果顯示纖維連接蛋白濃度首先隨著時間的延長而降低，約4小時達 到最低點，然後隨時間的延長有所恢復。
實施例5蚯蚓纖連蛋白酶對HBV轉基因小鼠的治療作用
實驗方法與結果
1. 實驗動物C57BL/6J-HBV轉基因小鼠(購自北京大學醫學部實驗動 物部)。轉入的基因片段是編碼包膜蛋白HBsAg的S基因，preS基因以及 編碼X抗原的X基因(參考文獻董宇紅、席宏麗、田楓、康愛君，苦 參素對HBsAg轉基因小鼠血清Thl和Th2細胞因子水平的影響中華實驗和 臨床病毒學雜誌，2004， 18 (3) 277-280。 Chisarl FV. Hepatitis B virus transgenic mice: insights into the virus and the disease. Hepatology， 1995， 22: 1316-1325.)小鼠在北京大學醫學部實驗動物部符合SPF級動物飼 養標準的環境中進行實驗。
2. 實驗分組實驗前進行動物的篩選，選擇HBsAg陽性(按照商業購買 試劑盒的操作步驟進行測定與評判，Hepanostika HBsAg Ultra,Biom6rieux， Netherlands)的實驗動物27隻，按照HBV轉基因小鼠血清中
分泌HBsAg的高低(以OD值(450nm)的大小表示)進行分組，每組9 □
/ 、 o
陰性對照生理鹽水(0.9%NaCl)
陽性對照拉米夫定(灌胃劑量為100mg拉米夫定/kg小鼠體重) 藥物蚯蚓纖連蛋白酶(混合物(與上同)，灌胃劑量為50mg蚯蚓 纖連蛋白酶/kg小鼠體重)
3. 給藥方案
(1) 灌胃每天灌胃一次，持續21天，觀察至30天。
(2) 取血分別在用藥前，用藥10天、20天取血，製備血清，測定谷-丙轉氨酶(ALT)，谷-草轉氨酶(AST)(使用中生北控公司的IFCC推 薦法，儀器為日立7170A型全自動生化分析儀。操作步驟按照試劑盒說明 書進行操作)。在用藥後7、 14、 21、 30天取血，製備血清，測定HBsAg
(使用試齊U盒為Hepanostika HBsAg Ultra, Biom&ieux， Netherlands,檢 測儀器為BIO-TEK Instruments EL311型酶標儀。操作步驟按照試劑盒說 明書進行操作)。
因為小鼠血容量有限，為了保證小鼠的生存質量，每次取血體積一 般控制在0.2ml以下，並間隔足夠的時間，所以測定ALT、 AST的取血時 間與測定HBsAg的取血時間不同。
(3) 取組織在實驗最後一天取血完成後，斷頸處死小鼠，收集肝組織， 部分保存於4%甲醛中固定，製備石蠟切片，HE染色，進行肝臟病理變化 觀察；部分保存於液氮中備用。
4. 檢測指標(1)體重；(2)谷-丙轉氨酶(ALT);(3)谷-草轉氨酶(AST); (4)HBsAg; (5)對肝臟的病理學觀察。
5. 實驗結果隨著實驗的進行，三個實驗組動物活動狀態沒有顯著性的 差別。體重也沒有顯著性差異。與生理鹽水組相比，轉基因小鼠血清中 ALT, AST上升有所抑制，結果見圖5-l， 5-2。與生理鹽水組相比，轉基 因小鼠血清中HBsAg有所降低，結果見圖5-3。轉基因小鼠血清中纖維連 接蛋白(FN)含量的變化見圖5-4，結果顯示，生理鹽水組及拉米夫定組 轉基因小鼠的FN隨生存時間的延長而增加，蚯蚓纖連蛋白酶實驗動物組
18FN含量基本維持在恆定的水平。對轉基因小鼠肝臟的病理學觀察結果見
圖5-5。 A:生理鹽水組，肝小葉結構存在，肝細胞水腫，以肝小葉中央區 為著。肝血竇和中央靜脈明顯擴張，點灶狀肝細胞壞死，每10個低倍視 野可見12個肝細胞壞死灶。B:肝小葉結構存在，肝細胞水腫，以肝小葉 中央區為著。肝血竇和中央靜脈明顯擴張，點灶狀肝細胞壞死和少量單 核淋巴細胞浸潤，每10個低倍視野可見4個肝細胞壞死灶。C:肝小葉結 構存在，肝細胞水腫，以肝小葉中央區為著。肝血竇和中央靜脈明顯擴 張，小灶狀肝細胞微泡狀脂肪性變性，每10個低倍視野可見4個肝細胞壞 死灶。生理鹽水組6隻轉基因小鼠，蚯蚓纖連蛋白酶處理組6隻轉基因小 鼠與拉米夫定組6隻轉基因小鼠的肝組織病理切片觀察結果表明與生理 鹽水組相比，蚯頓纖連蛋白酶實驗動物組HBsAg轉基因小鼠的肝臟壞死 病變減輕，療效與拉米夫定組類似。
實施例6蚯蚓纖連蛋白酶對H印G 2.2.15細胞水平的作用
1.細胞系及培養條件HepG 2.2.15細胞系(Mount Sinai Medical College, New York)，其特點是基因組中插入HVB基因(參考文獻 Production of hepatitis B vims particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 1005-1009)。培養基為DMEM高糖培養基(Dulbecco，s modified eagle medium, Gibco， Invitrogen Corporation, US A)，同時加入10°/。的胎牛血清 (PAA, Austria), 380嗎/ml抗生素G-418 (Amresco， USA)和青黴素-鏈黴 素溶液(終濃度為100 units/ml青黴素和100嗎/ml鏈黴素，HyClone, USA)。培養條件為C02培養箱，37'C培養。
2. 實驗分組
陽性對照拉米夫定處理組；
用藥組蚯蟲引纖連蛋白酶處理組(單一組分SEQIDNO.l)。
3. 用藥方案
將HepG2.2.15細胞進行接種(96孔板，每孔lx104個細胞)。細胞接種 三天後，分別加入不同濃度的蚯蚓纖連蛋白酶(培養基中藥物終濃度為 0-5(ig/ml)和拉米夫定(培養基中藥物終濃度為0-100)iM)。細胞接種六天時更換相應的含藥培養基。在細胞接種九天時收集細胞培養基，用於
測定HBsAg， HBeAg。
4. HBsAg， HBeAg的測定方法將步驟3收集的細胞培養基12000rpm離心 5min，取適量，採用B型肝炎病毒s抗原及e抗原診斷試劑盒(酶聯免疫 法，華美生物工程公司)按照說明書步驟進行測定。
5. 實驗結果見圖6，結果表明，與空白細胞相比，蚯蚓纖連蛋白酶處理 組HBsAg， HBeAg的分泌均受到抑制，細胞培養基中HBsAg， HBeAg 含量有所下降。蚯蚓纖連蛋白酶的幾種純化產物的胺基酸序列序列表
SEQ ID NO.l
MIVGGIEARP YEFPWQVSVR RKSSDSHFCG GS函DRWVV CAAHCMQGES
IFSLVGIVSW GIGCASGYPG VYSRVGFHAG WITDIITNN SEQ ID N0.2
FSLVGIVSWG IGCASGYPGV YSRVGFHAGW ITDTIT則 SEC ID NO.3
MELPPGTKIV GGIEARPYEF PWQVSVRRKS SDSHFCGGSI INDRWVVCAA
SVKDGSGIFS LIGIVSWGIG CASGYPGVYS RVGFHAAWIT DIITNN SEQ ID NO.4
LSVKDGSGIF SLIGIVSWGI GCASGYPGVY ARVGSQTGWI TDIITNN
21SEQ ID NO.5
VKDGSGIFSL GGIVSWGIGC ASGYPGVYSR VGFHAGWITD TITNN SEQ ID NO.6
MELPPGTKIV GGIEARPYEF PWQVSVRRKS SDSHFCGGSI INDRWVVCAA
SVKDGSGIFS LIGIVSWGIG CASGYPGVYS RVGFHAAWIT DIITNN SEC ID NO.7
DDIYSPLYTI TSDMICATDN TGQNERDSCQ GDSGGPLSVK DGNGIFSLIG IVSWGIGCAS GYPGVYARVG SQTGWITDII TNN
SE(J ID NO.8
SEQ ID NO.9formula see original document page 23HFASAINIGG NVQAALLPAN NNNDYSDLTC VISGWGRTGS SNVLPDTLQK ASIQVIGTTQ CQSLMGSIGN IWDNHICLYD NANNVGSCNG DSGGPLNCPD GGTRVAGVTS WGVSSGAGNC LQTYPSVYTR TSAYLSWIAN NS
SEQ ID N0.14
PVITTAQCTAAMVGVGGANI WDNHICVQDP AGNTGACNGD SGGPLNCPDG GTRVVGVTSW VVSSGLGACL PDYPSVYTRV SAHLGWIGDN SR
SEQ ID NO.15
PVITTAQCTAAMVGVGGANI WDNHICVQDP AGNTGACNGD SGGPLNCPDG GTRVVGVTSW VVSSGLGACL PDYPSVYTRV SAYLGWIGDN SR參考文獻
1. B型肝炎病毒和C型肝炎病毒對纖維連接蛋白基因表達的調節。胃腸
病學和肝病學雜誌2004， 13 (1) : 85-87。
2. 纖維連接蛋白在慢性中毒性肝病中的變化及其意義。現代中西醫結 合雜誌2003， 12 (16) : 1692-1693。
3. 纖維連接蛋白檢測在肝病中的臨床意義。中國熱帶醫學2006， 6(5): 818-819。
4. Activation of fibronectin gene expression by hepatitis B virus x antigen. Journal of Viral Hepatitis, 2004, 11, 332—341.
5. Differentially expressed cellular genes following HBV: potential targets of anti-HBV drugs Journal of Viral Hepatitis, 2005， 12， 357—363.
6. Fibronectin is essential for hepatitis B virus propagation in vitro: May be a potential cellular target Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 757—764.
7. Fibronectin of Human Liver Sinusoids Binds Hepatitis B Virus: Identification by an Anti-Idiotypic Antibody Bearing the Internal Image of the Pre曙S2 Domain. Journal of Virology, Feb. 1995, p. 840—848.
8. Expression, localization and alternative splicing pattern of fibronectin messenger RNA in fibrotic human liver and hepatocellular carcinoma. Journal ofHepatology， 1997,27:843-853.
9. Latent fibronectin-degrading serine proteinase activity in N-terminal heparin-binding domain of human plasma fibronectin. Eur. J. Biochem. 1991, 201: 71 -77.
10. Collagen-binding domain of human plasma fibronectin contains a latent type-IV collagenase. Eur. J. Biocheni. 1991, 201: 79-84.序列表
中國科學院生物物理研究所
<120〉蚯頓纖連蛋白酶在B型肝炎治療中的應用
<130〉 IB080567
<160〉 15
<170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
239
<212〉 PRT
<213〉 蚯蚓
<400〉 1
Met lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin 15 10 15
Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser 20 25 30
lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gin Gly 35 40 45
Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser 50 55 60
Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val 65 70 75 80
Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu Asn Asp Val Ser Val lie 85 90 95
Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp lie Asn Val Gly Pro lie Cys 100 105 110
Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser 115 120 125
Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie Cys Cys Pro Ala Val Leu 130 135 "0
Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Ala Val 145 150 155 160
Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met lie Cys Ala Thr Asp Asn165 170 175
Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gy Gly Pro 180 185 190
Uu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe Ser Leu Val Gly lie Val
195
200 205
Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg
210
215 220
Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp lie lie Thr Asn Asn
225
<210〉 2
238
PRT
蚯頓
〈400〉 2
230 235
lie 1
Val
Gly Gly lie Glu
5
Ala Arg Pro Tyr Glu 10
Phe Pro Trp Gin Val 15
Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie 20 25 30
lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu 35 40 45
Ala Pro Ala. Uu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser Ala.
50
55
60
Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val Asn
65
70
75
80
Glu Asn Tyr Asp Pro Ala. Thr Leu Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys 85 90 95
Thr Ala Val Ala lie Thr Phe Asp lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala
100
105
110
Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly
115
120
125
Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly Val Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg
130
135
140
Tyr Val Thr Uu Asn lie Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Ala. Val Tyr
145
150
155
160
Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr 165 170 175
Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 180 185 190
27Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe Ser Leu Val Gly lie Val Ser 195 200 205
Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val 210 215 220
Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp Thr lie Thr Asn Asn 225 230 235
<210〉 3
<211〉 246
PRT
蚯蟲引
3
Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg
1
5
10
15
Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp
20
25
30
Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys 35 40 45
Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val
50
55
60
Val Gly G]u His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His
65
70
75
80
Asp Val Asp Ser lie Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Thr Asn 丁hr Leu 85 90 95
Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ser Val Ala lie Thr Phe Asp
100
105
110
lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tvr Val 115 120 125
Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly 130 135 140
lie Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Asp Thr Thr
145
150
155
160
Asn Gin Tyr Cys Glu Asp Val Tvr Pro Leu Asn Ser lie Tyr Asp Asp 165 170 175
Met lie Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp SeT Cys 180 185 190
Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie
195
200
205
28formula see original document page 29lie Phe Ser Leu lie Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cvs Ala Ser 210 215 220
Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly Ser Gin Thr Gly Trp lie 22^ 230 235 240
Thr Asp lie lie Thr Asn Asn 245
〈210〉 5
〈211〉 245
〈212〉 PRT
〈213> 蚯頓
5
Met 1
Glu
Leu Pro Pro Gly Lys 5
lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg Pro 10 15
Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser
20
25 30
His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala
35
40 45
Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val
50
55
60
Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp
65
70
75 80
Val Asp Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu
85
90 95
Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp lie
100
105 110
Asn Va.l Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr
115
120 125
Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie 130 135 140
Cys Cys Pro Ala Va.l Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn
145
150
155 160
Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met
165
170 175
lie Cys A〗a Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin
180
185 190
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe
195
200 205
Ser Leu Gly Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr210 215 220
Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly 丁rp lie Thr Asp
225 230
Thr lie Thr Asn Asn 245
235 240
〈210〉 〈213>
6
246 PRT 蚯蚓
<400〉 6 Met
Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys lie Val Gly Gly lie 5 10
Glu Ala Arg 15
Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp
20 25
30
Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys 35 40 45
Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val 50 55 60
Val Gly Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His
65
70 75
80
Asp Val Asp Ser lie Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Ala Asn Thr Leu
85 90
95
Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ser Val Ala lie Thr Phe Asp
100 105
110
lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val 115 120 125
Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly 130 135 140
lie Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Val Thr Thr
145
150 155
160
Asn Gin Phe Cys Glu Asp Val Tyr Pro Leu Asn Ser lie Tyr Asp Asp
165 170
175
Met lie Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp Ser Cys
180 185
190
Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie 195 200 20^
Phe Ser Leu lie Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly 210 215 220
31Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Ala Trp lie Thr
225 230
Asp lie lie Thr Asn Asn 245
<210〉 7
〈211〉 283
PRT
〈213〉 蚯頓
235 240
<400〉 7
Met Leu 1
Leu Leu Ala Leu Ala Ser Leu Val Ala Val Gly Phe Ala Gin 5 10 15
Pro Pro Val Trp Tyr Pro Gly G1y Gin Cys Ser Val Ser Gin Tyr Ser 20 25 30
Asp Ala Gly Asp Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys lie Val Glv Gly 35 40 45
lie Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg
50
55 60
Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg
65
70 75 80
Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu 85 90 95
Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val 100 105 110
Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val His Glu Asp Tyr Asn 115 120 125
Gly Asn Thr Phe Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Val Asn Ala
130
135 140
lie Ala lie Asp lie Asn Asp Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala 145 150 155 160
Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie 165 170 175
Asn Ser Gly Gly Val Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Va.l Thr Leu 180 185 190
Asn Val Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Asp lie Tyr Ser Pro Leu Tyr 195 200 205
Thr lie Thr Ser Asp Met lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Gin Asn
210
215 220
32Glu Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys
225
230 235 240
Asp Gly Asn Gly lie Phe Ser Leu lie Gly lie Val Ser Tip Gly lie 245 250 255
Gly Cys Ala Ser Glv Tyr Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly Ser Gin 260 265 270
Thr Gly Trp lie Thr Asp lie lie Thr Asn Asn 275 280
8
245
PRT
<213〉 蚯蟲引
8
Met 1
Glu
Leu Pro Pro 5
G工y Lys lie
Val Gly Gly 10
lie Glu Ala
Arg Pro 15
Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser
20
25
30
His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Ala Cys Ala
35
40
45
Ala His Cvs Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val 50 55 60
Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp
65
70
75
80
Val Asp Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu 85 90 95
Asn A印Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp lie
100
105
110
Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr
115
120
125
Arg Lvs Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie 130 13^ 140
Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn
145
150
155
160
Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met
165
170
175
lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin
180
185 190Gly Asp Ser 195
Ser Leu Val 210
Pro Gly Val 225
Thr lie Thr
<210〉 9
〈211〉 246
PRT
〈213〉 蚯躬l
〈400〉 9
Met Glu Leu 1
Pro Tyr Glu
Ser His Phe 35
Ala Ala. His 50
Val Gly Glu 65
Asp Val Asp
Glu Asn Asp
lie Asn Val 115
Tyr Arg Lvs '130
lie Cys Cys 145
Asn Ala Phe
Met lie Cys
Gin Gly Asp
Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe 200 205
Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr 215 220
Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp 230 235 240
Asn Asn 245
Pro Pro Gly Thr Lvs lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg 5 10 15
Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Thr Asp 20 25 30
Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys 40 45
Cys Met Gin Gly Giu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val 55 60
His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His 70 75 80
Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asn Pro Arg Thr Leu 85 90 95
Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp 100 105 110
Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val 120 125
Ser Gin Cys Ser Glv Trp Gly Ser lie Asn Ser Gly Gly 135 140
Pro Ala Val Uu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr 150 155 160
Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp 165 170 175
Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys 180 185 190
Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie
34195 200 205
Phe Ser Leu Val Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly 210 215 22i)
Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr
235 240
225 230
Asp Thr lie Thr Asn Asn 245
〈210〉 10
245
<212〉 PRT
〈213〉 蚯蟲弓l
<400〉 10
Met Glu Leu Pro Pro Gly Lys lie Val Gly Gly lie Glu Ala Gly Pro 15 10 15
Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Pro Ser Asp Ser 20 25 30
His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala 35 40 45
Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val 50 55 60
Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp 65 70 75 80
Val Asp Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu 85 90 95
Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp He 100 105 110
Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr 115 120 125
Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie li30 135 ' 140
Cvs Cys Pro Ala Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn 145 150 155 160
Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met 165 170 175
lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met 丁hr Asp Arg Asp Ser Cys Gin 180 185 190
Glv Asp Ser Gly Glv Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe 195 200 205
35Ser Leu Val Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala. Ser Gly Tyr 210 215 220
Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp
225 230
Thr lie Thr Asn Asn 245
235 240
<210〉 〈211〉
11
239 PRT 蚯頓
<400〉 11
lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val 15 10 15
Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie 20 25 30
lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cvs Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu 35 40 45
Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Va.l Gly Glu His Asp Ser Ser Ala 50 55 60
Ala. Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val His 65 70 75 80
Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Thr Phe Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys 85 90 95
Thr Val Asn Ala lie Ala lie Asp lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala 100 105 110
Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly 115 120 ' 125
Trp Gly Thr Val Asn Ser Gly Gly Val Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg 130 135 140
Tyr Val Thr Leu Asn Val Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Asp lie 丁yr 145 150 155 160
Ser Pro Leu Tyr Thr lie Thr Ser Asp Met lie Cvs Ala Thr Asp Asn 165 170 175
Thr Gly Gin Asn Glu Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Glv Pro 180
Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe Ser Leu lie G1y lie Val 195 20i) 205formula see original document page 37Gin
225
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13 242 PRT 蚯蟲引
<400〉 13
Met Gly 1
Gly Glu Gin 5
Tyr lie lie Glv Gly Ser Asn Ala Ser 10
Pro Gly 15
Glu Phe Pro Trp Gin Leu Ser Gin Thr Arg Gly Gly Ser His Ser Cys 20 25 30
Gly Ala Ser Leu Leu Asn Ala. Leu Asn Gly Leu Ser Ala Ser His Cys 35 40 45
Val Asp Gly Ala Ala Pro Gly Thr lie Thr Val lie Ala Gly Leu His 50 55 60
Asp Arg Ser Gly Thr Pro Gly Ser Gin Glu Val Asp lie Thr Gly Tyr 65 70 75 80
Thr Met His Glu Asn Tyr Asn Gin Gly Thr Asn Thr Tyr Ala Asn Asp 85 90 95
lie Ala lie Leu His Phe Ala Ser Ala lie Asn lie Gly Gly Asn Val 100 105 110
Gin Ala Ala Leu Leu Pro Ala Asn Asn Asn Asn Asp Tyr Ser Asp Leu 115 120 125
Thr Cys Val lie Ser Gly Trp Gly Arg Thr Gly Ser Ser Asn Val Leu 130 135 140
Pro Asp Thr Leu Gin Lys Ala Ser lie Gin Val lie Gly Thr Thr Gin 145 150 155 160
Cys Gin Ser Leu Met Gly Ser lie Gly Asn lie Trp Asp Asn His lie 165 170 175
Cys Leu Tyr Asp Asn Ala Asn Asn Val Gly Ser Cys Asn Gly Asp Ser 180 185 19b
Gly Gly Pro Uu Asn Cys Pro Asp Gly Gly Thr Arg Val Ala Gly Val 195 200 205
Thr Ser Trp Gly Val Ser Ser Gly Ala Gly Asn Cys Leu Gin Thr Tyr 210 215 220
Pro Ser Val Tyr Thr Arg Thr Ser Ala Tyr Leu Ser Trp lie Ala Asn 225 230 235 240
Asn Ser
38<210〉 <213〉
14 192 PRT 蚯弼l
〈400〉 14
Val lie Gly Gly Thr Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gin Leu 15 10 15
Ser Gin Gin Arg Gin Ser Gly Ser Trp Ser His Ser Cys Gly Ala Ser 20 25 30
Leu Leu Ser Ser Thr Ser Ala Leu Ser Ala Ser His Cys Val Asp Gly 35 40 4
Val Leu Pro Asn Asn lie Arg Val lie Ala Gly Leu Trp Gin Gin Ser
50 55 60
Asp Thr Ser Gly Thr Gin Thr Ala Asn Val Asp Ser Tyr Thr Met His 65 70 75 80
Glu Asn Tyr Gly Ala Gly Thr Ala Ser Tyr Ser Asn Asp lie Ala. lie 85 90 95
Leu His Leu Ala Thr Ser lie Ser Leu Gly Gly Asn lie Gin Ala Ala 100 105 110
Val Leu Pro Ala Asn Asn Asn Asn Asp Tyr Ala Gly Thr Thr Cys Val 115 120 125
lie Ser Glv Trp Gly Arg Thr Asp Gly Thr Asn Asn Leu Pro Asp lie 130 135 140
Leu Gin Lys Ser Ser lie Pro Val lie Thr Thr Ala Gin Cys Thr Ala 145 150 155 160
Ala Met Val Gly Val Gly Gly Ala. Asn lie Trp Asp Asn His lie Cys 165 170 175
Val Gin Asp Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly 180 185 190
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15 242 PRT 蚯蚓
15
Val lie Gly Gly Thr Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gin Leu 15 10 15Ser Gin Gin Arg Gin Ser Gly Ser Trp Ser His Ser Cys Gly Ala Ser 20 25 30
Leu Leu Ser Ser Thr Ser Ala Leu Ser Ala Ser His Cys Val Asp Gly 35 40 45
Val Leu Pro Asn Asn lie Arg Val lie Ala Gly Leu Trp Gin Gin Ser 50 55 60
Asp Thr Ser Gly Thr Gin Thr Ala. Asn Val Asp Ser Tyr Thr Met His 65 70 75 80
Glu Asn Tyr Gly Ala Gly Thr Ala Ser Tyr Ser Asn Asp lie Ala lie 85 90 95
Leu His Leu Ala Thr Ser lie Ser Leu Gly Gly Asn lie Gin Ala Ala
ioo 105 no
Val Leu Pro Ala Asn Asn Asn Asn Asp Tyr Ala Gly Thr Thr Cys Val 115 120 125
lie Ser Gly Trp Gly Arg Thr Asp Gly Thr Asn Asn Leu Pro Asp lie 130 135 140
Leu Gin Lys Ser Ser lie Pro Val He Thr Thr Ala Gin Cys Thr Ala 145 150 155 160
Ala Met Val Gly Val Gly Gly Ala Asn lie Trp Asp Asn His lie Cys 165 170 175
Val Gin Asp Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly 180 185 190
Gly Pro Leu Asn Cys Pro Asp Gly Gly Thr Arg Val Val Gly Val Thr 195 20b 205
Ser Trp Val Val Ser Ser Gly Leu Gly Ala Cys Leu Pro Asp Tyr Pro 210 21^ 220
Ser Val Tyr Thr Arg Val Ser Ala Tyr Leu Gly Trp lie Gly Asp Asn 225 230 23^ 240
Ser Arg
權利要求
1.蚯蚓纖連蛋白酶用於降解纖維連接蛋白的應用。
2.權利要求1的應用，其中所述蚯蚓纖連蛋白酶的胺基酸序列為SEQ IDNO.l。
3. 權利要求1的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序列， 其胺基酸序列具有H43， D91， S^(其上編號對應於SEQIDN0.1胺基酸序 列)組成的催化三聯體。
4.權利要求1或3的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序 列，所述胺基酸序列與SEQ IDNO.l具有80%以上的同源性。
5.權利要求1或3的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序 列，所述胺基酸序列選自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4， SEQ IDN0.5， SEQIDN0.6, SEQIDN0.7， SEQIDNO,8， SEQIDNO,9， SEQ IDNO.IO， SEQIDNO.il， SEQIDNO,12， SEQIDN0.13， SEQIDN0.14， SEQ ID NO.15所示的胺基酸序列。
6.蚯躬l纖連蛋白酶用於製備藥物的應用，所述藥物用於預防或治療與 纖維連接蛋白有關的疾病。
7.權利要求6的應用，所述疾病為B型肝炎，慢性B型肝炎，肝硬 化，腫瘤疾病。
8. 權利要求6或7的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶的胺基酸序列為SEQ ID NO.l。
9. 權利要求6或7的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸序 列，其胺基酸序列具有H43， D91， S'88(其上編號對應於SEQIDN0.1氨基 酸序列)組成的催化三聯體。
10. 權利要求6或7的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸 序列，所述胺基酸序列與SEQ IDNO.l具有80%以上的同源性。
11. 權利要求6或7的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶具有這樣的胺基酸 序列，所述胺基酸序列選自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4，SEQIDNO,5， SEQIDN0.6， SEQIDNO,7， SEQIDNO,8， SEQIDNO,9， SEQIDNO.IO， SEQIDNO.ll， SEQIDNO,12， SEQIDN0.13， SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的胺基酸序列。
12. 權利要求6的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為選自SEQ ID NO.l, SEQIDNO.2, SEQIDNO,3， SEQIDN0.4， SEQIDN0.5， SEQIDN0.6， SEQ ID NO.7 ， SEQ ID N0.8 ， SEQ ID NO.9， SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO. 11 ， SEQIDN0.12， SEQIDN0.13， SEQIDNO.14, SEQ ID NO.15所示的胺基酸序列的單一組分使用。
13. 權利要求6的應用，其中所述蚯蚓纖連蛋白酶作為粗酶混合物使用， 所述混合物包括SEQ ID NO.l, SEQ ID N0.2， SEQ ID NO.3 ， SEQ ID N0.4， SEQIDNO.5, SEQIDNO.6, SEQIDN0.7， SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO, SEQIDNO.il， SEQIDN0.12， SEQIDNO,13， SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的胺基酸序列中的兩種或多種。
14. 權利要求13的應用，所述蚯蚓纖連蛋白酶作為粗酶混合物使用，所 述混合物主要成分有SEQ ID NO.l ， SEQ ID N0.2， SEQ ID N0.12, SEQ ID N0.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15,其中SEQ ID NO.l豐度最高。
15. —種用於治療與纖維連接蛋白相關疾病的藥物，所述藥物包含所述 蚯蚓纖連蛋白酶作為活性成分。
16. 權利要求15的藥物，其中所述纖維連接蛋白相關疾病為B型肝炎， 慢性B型肝炎，肝硬化或腫瘤疾病。
17. 權利要求15或16的藥物，所述蚯蚓纖連蛋白酶的胺基酸序列為 SEQIDNO.l;或具有H43， D91， S"8(其上編號對應於SEQ ID NO.l氨基 酸序列)組成的催化三聯體；或與SEQ ID NO.l具有80%以上的同源性； 或選自SEQIDNO.2, SEQ ID NO.3 ， SEQIDNO.4, SEQIDNO.5, SEQ ID N0.6， SEQIDNO.7, SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO, SEQ ID NO.l 1， SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15 所示的胺基酸序列。
18. 權利要求15或16的藥物，其中所述蚯蚓纖連蛋白酶作為選自SEQ ID NO.l, SEQIDNO.2, SEQ ID NO.3 ， SEQIDNO.4, SEQIDNO.5, SEQ IDN0.6, SEQIDN0.7， SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO,SEQIDNO.il， SEQ ID NO. 12， SEQ ID NO. 13， SEQ ID NO. 14， SEQ ID N0.15所示的胺基酸序列的單一組分使用；或作為粗酶混合物使用，所述 混合物包括SEQIDNO.l, SEQIDNO.2, SEQIDN0.3， SEQ ID NO.4, SEQIDNO,5， SEQIDNO.6, SEQIDNO,7， SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO， SEQIDNO.il， SEQIDNO.12, SEQIDNO,13， SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的胺基酸序列中的兩種或多種。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，本發明提供了蚯蚓纖連蛋白酶對纖維連接蛋白的降解作用；本發明還提供了所述蚯蚓纖連蛋白酶用於治療B型肝炎的應用，尤其是對慢性B型肝炎，B型肝炎引起的肝硬化的預防和治療作用；本發明還提供了一種藥物，所述藥物包含所述蚯蚓纖連蛋白酶作為活性成分。
文檔編號A61P31/20GK101525610SQ20081010135
公開日2009年9月9日 申請日期2008年3月5日 優先權日2008年3月5日
發明者榮 潘, 王學清, 蓉 肖, 赫榮喬, 嵐 陳 申請人:中國科學院生物物理研究所