一種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法
2023-12-05 10:22:46 5
一種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法
【專利摘要】本發明屬於實驗樣品處理【技術領域】，具體為一種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法。本發明步驟包括：漂洗液的配製、包埋劑的配製、漂洗、脫水和浸透、聚合。本發明藉助水浴超聲清洗及真空烘箱梯度浸透和固化，解決了禽類羽毛透射電鏡樣品處理過程中，樣品不易潤溼、包埋劑浸透困難的問題，使得最後得到的樣品切片能夠鋪展平整，切片皺褶、捲曲、破損、剝離的現象大大減少，由此方便了對羽毛內部的超微結構的進一步觀察和研究。
【專利說明】—種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於實驗樣品處理【技術領域】，具體涉及一種禽類羽毛的樣品處理方法，尤其涉及一種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法。
【背景技術】
[0002]羽毛是禽類特有的表皮衍生物，幾乎覆蓋禽體全身。羽毛質輕堅韌，富有彈性和保暖性。其中，飛羽和尾羽對飛翔有很大意義。各種禽類的羽毛還具有色彩斑斕的顏色，這些顏色的功能大致有兩種，即保護色和性選擇，對於人類來說，則具有很高的觀賞價值。
[0003]一般來說顏色的形成由兩種方式，即色素色和結構色。色素色是由色素有選擇地吸收某些顏色的光而反射或散射其他色彩的光。結構色是因羽毛上皮表面的凹凸溝紋以及羽小枝內的小顆粒、氣泡和液泡等對光線的折射和幹涉作用而形成的，如許多鳥所擁有的藍色、彩虹色和金屬色等。結構色普遍比色素色明亮，永不褪色，且具有虹彩效應，即隨著觀察角度變化其色彩會發生改變。結構色的這些特點使其在生物仿生製備新型友好顏料等領域有重要的應用前景，也為未來科技設計和製備新型的光子結構材料和器件提供了新思路。
[0004]雖然常規的光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察已經很好的揭示了羽毛表面的微觀結構，但是更為複雜和精細的羽毛內部結構還有待進一步的探究。藉助透射電子顯微鏡觀察羽毛內部結構，正是越來越多相關研究者的需要。但是羽毛表面不良的潤溼性，使得常規包埋處理時，包埋劑不能充分浸透，而使樣品在切片、撈片和觀察過程中容易破損、捲曲，甚至整片丟失。
【發明內容】
[0005]本發明對現有技術中的缺陷，提供一種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，通過使用非離子型去汙劑、水浴超聲清洗，使得禽類羽毛能夠快速有效的被液體潤溼；通過真空梯度浸透，使得包埋劑更加充分滲入樣品。常規使用的Spon樹脂不易浸透樣品的情況得到了很大的改善。本發明解決了在對禽類羽毛進行透射電鏡樣品處理過程中，樣品潤溼困難、包埋劑浸透不充分的問題。
[0006]本發明提出的禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，包括漂洗、脫水、浸透和聚合，具體步驟如下:
(1)漂洗液的配製:0.08-0.12% Tween-20,0.2-0.28M NaOH,甲酸/乙醇按體積比為2:(2.8-3.2)的混合液;優選 0.1% Tween-20,0.25M NaOH,甲酸 / 乙醇混合液(v:v/2:3)；
(2)包埋劑的配製:
SP1-Pon812包埋劑的配製:將SPI_Pon812、DDSA、NMA、DMP-30，逐樣加入燒杯中，玻璃棒攪拌混合後，置於磁力攪拌器攪動均勻；攪動約2(T60min後，用真空烘箱將包埋劑中的氣泡抽出，將配製好的包埋劑轉入乾燥離心管中，4°C保存備用；
(3)漂洗:將羽小枝放入盛有Tween-20和NaOH混合液的青黴素瓶中，超聲振蕩；吸盡混合液，加入甲酸/乙醇混合液，手動振蕩後靜置2~3h ；
(4)脫水:用無水乙醇和丙酮對樣品進行脫水；
(5)浸透:用丙酮與包埋劑的混合液對樣品進行梯度浸透，最後換成包埋板，用純包埋劑浸透樣品；
(6)聚合:加熱聚合，完成樣品的包埋。
[0007]作為優選，步驟(2)中的SP1-Pon812包埋劑的配製:SPI_Pon812、DDSA, NMA,DMP-30按重量份數分別為:8—12份、3—5份、6—8份和0.3—0.4份；優選為:10份、3份、7份和0.32份。
[0008]作為優選，步驟(3)中，對羽毛樣品先剝離出單根羽小枝並剪成2~3mm長度。
[0009]作為優選，步驟(3)中，清洗採用水浴超聲振蕩，至樣品不再漂浮於漂洗液液面即可。
[0010]作為優選，步驟(4)中，用無水乙醇對樣品脫水2~3次，每次ClOmin ;丙酮脫水2~3次，每次10~20min。
[0011]作為優選，步驟(5)中，用15%~80%的丙酮和包埋劑的混合液對樣品進行三級梯度浸透；處理條件均為，25~35°C真空環境下，浸透24~48h。樣品轉入包埋板中後，純包埋劑浸透樣品；25~35°C真空環境下，浸透48~60h。
[0012]作為優選，步驟(6)中，真空環境下聚合，聚合溫度為6(T70°C，聚合時間為48~72h。
[0013] 本發明公開了一種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，通過使用超聲振蕩，幫助樣品表面清潔，從而能夠更快更好的潤溼樣品，使得樣品能夠有效的進行後續的脫水浸透等處理。通過較長時間的梯度浸透及採用梯度浸透過程在真空烘箱進行，使得包埋劑更加充分滲入樣品，克服了粘性較大的Spon樹脂不易浸透樣品的問題。解決了在對禽類羽毛樣品進行透射處理過程中，樣品潤溼困難，包埋劑浸透不充分的問題。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為鴛鴦毛處理例示。
[0015]圖2為大股雞毛處理例示。
【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0017]孔雀羽毛的透射電鏡樣品處理，具體操作步驟如下:
漂洗液的準備:0.1% Tween-20,0.25M NaOH,甲酸/乙醇混合液(v:v/2:3)；
SP1-Pon812包埋劑的配製:將SP1-Pon812、DDSA、NMA、DMP_30，按重量份數分別加入10份、3份、7份和0.32份，逐樣加入燒杯中，玻璃棒攪拌混合後，置於磁力攪拌器攪動均勻。攪動約30min後，用真空烘箱將包埋劑中的氣泡抽出，將配製好的包埋劑轉入乾燥離心管中，4 °C保存備用。
[0018]將剝離出來的孔雀羽毛的羽小枝剪成約3mm長度，放入盛有0.1% Tween-20和0.25M NaOH混合液的青黴素瓶中，超聲振蕩15min。然後吸盡混合液，加入甲酸/乙醇混合液，手動振蕩後靜置2.5h。[0019]去除甲酸/乙醇混合液，先用無水乙醇對樣品脫水兩次，每次5min ;再用丙酮脫水兩次，每次lOmin。
[0020]去除脫水劑後，用體積比為4:1、2:1、1:3的丙酮和包埋劑的混合液對樣品進行梯度浸透。處理條件均為，30°C真空環境下，浸透24h。樣品轉入包埋板中後，純包埋劑浸透樣品。30°C真空環境下，浸透48h。
[0021 ] 真空環境下，升溫至60°C，聚合48h。冷卻至室溫後，進行超薄切片，供電鏡觀察。
[0022]大股雞羽毛的透射電鏡樣品處理，具體操作步驟如下:
漂洗液的準備:0.1% Tween-20,0.25M NaOH,甲酸/乙醇混合液(v:v/2:3)；SP1-Pon812包埋劑的配製:將SP1-Pon812、DDSA、NMA、DMP_30，按重量份數分別加入10份、3份、7份和0.32份，逐樣加入燒杯中，玻璃棒攪拌混合後，置於磁力攪拌器攪動均勻。攪動約30min後，用真空烘箱將包埋劑中的氣泡抽出，將配製好的包埋劑轉入乾燥離心管中，4 °C保存備用。
[0023]將剝離出來的大股雞羽毛的羽小枝剪成約3mm長度，放入盛有0.1% Tween-20和
0.25M NaOH混合液的青黴素瓶中，超聲振蕩20min。然後吸盡混合液，加入甲酸/乙醇混合液，手動振蕩後靜置2.5h。
[0024]去除甲酸/乙醇混合液，先用無水乙醇對樣品脫水兩次，每次5min ;再用丙酮脫水兩次，每次lOmin。
[0025]去除脫水劑後，用體積比為4:1、2:1、1:3的丙酮和包埋劑的混合液對樣品進行梯度浸透。處理條件均為，30°C真空環境下，浸透24h。樣品轉入包埋板中後，純包埋劑浸透樣品。30°C真空環境下，浸透48h。
[0026]真空環境下，升溫至60°C，聚合48h。冷卻至室溫後，進行超薄切片，供電鏡觀察。
【權利要求】
1.一種禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，包括漂洗、脫水、浸透和聚合，其特徵在於具體步驟為: (1)漂洗液的配製:0.08-0.12% Tween-20,0.2-0.28M NaOH,甲酸/乙醇按體積比為2:(2.8-3.2)的混合液； (2)包埋劑的配製: SP1-Pon812包埋劑的配製:將SPI_Pon812、DDSA、NMA、DMP-30，逐樣加入燒杯中，攪拌混合後，置於磁力攪拌器攪動均勻；攪動2(T60min後，用真空烘箱將包埋劑中的氣泡抽出，將配製好的包埋劑轉入乾燥離心管中，4°C保存備用； (3)漂洗:將羽小枝放入盛有Tween-20和NaOH混合液的青黴素瓶中，超聲振蕩；吸盡混合液，加入甲酸/乙醇混合液，手動振蕩後靜置2~3h ； (4)脫水:用無水乙醇和丙酮對羽小枝樣品進行脫水； (5)浸透:用丙酮與包埋劑的混合液對羽小枝樣品進行梯度浸透，最後換成包埋板，用純包埋劑浸透樣品； (6)聚合:加熱聚合，完成羽小枝樣品的包埋。
2.根據權利要求1所述的禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，其特徵在於，步驟(2)的SP1-Pon812 包埋劑中，SP1-Pon812、DDSA、NMA、DMP-30 按重量份數分別為:8_12 份、3-5 份、6-8 份和 0.3—0.4 份。
3.根據權利要求1所述的禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，其特徵在於，步驟(3)中對羽毛樣品先剝離出單根羽小枝並剪成2~3mm長度。
4.根據權利要求1所述的禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，其特徵在於，步驟(3)中，羽小枝浸泡於混合清洗液中，藉助水浴超聲振蕩，使羽小枝能較快浸潤直至不再漂浮於漂洗液上。
5.根據權利要求1所述的禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，其特徵在於，步驟(4)中，用無水乙醇對樣品脫水2~3次，每次5~10min ;丙酮脫水2~3次，每次l(T20min。
6.根據權利要求1所述的禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，其特徵在於，步驟(5)中，用1 5%~80%的丙酮和包埋劑的混合液對樣品進行三級梯度浸透；處理條件均為，25~35°C真空環境下，浸透24~48h ;樣品轉入包埋板中後，純包埋劑浸透樣品；25~35°C真空環境下，浸透48~60h。
7.根據權利要求1所述的禽類羽毛的透射電鏡樣品處理方法，其特徵在於，步驟(6)中，真空環境下聚合，聚合溫度為6(T70°C，聚合時間為48~72h。
【文檔編號】G01N1/36GK104020025SQ201410237904
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月2日 優先權日:2014年6月2日
【發明者】陳燕, 張亞峰, 趙慧玲, 李莉 申請人:復旦大學