生物體染色劑的製作方法
2023-12-05 01:53:16 3
本發明涉及在多光子雷射顯微鏡下使用的新型生物體染色劑及使用了該染色劑的細胞的觀察方法，在多光子雷射顯微鏡下使用的新型生物體染色劑的選擇、評價方法，利用該方法選擇的新型細胞染色劑，在多光子雷射顯微鏡下使用的新型腫瘤細胞染色劑及使用了該染色劑的腫瘤細胞的檢測方法，以及用於使用多光子吸收現象對患者的組織進行觀察、同時選擇性地破壞該組織的一部分的多光子雷射診斷治療裝置。
背景技術：
在癌症診斷中使用各種診斷方法，近年來開發了使用內窺鏡(包含纖維內窺鏡等柔性鏡和支氣管窺鏡等硬性鏡這兩者)對患部細胞進行觀察，確認消化系統、呼吸系統、腎泌尿系統、子宮卵巢生殖系統及腦脊髓神經系統等的疾病、特別是腫瘤的腫瘤細胞是否存在的非侵襲性診斷方法。
作為日本人的死亡原因，自從1981年癌症超過腦中風之後，因癌症導致的死亡人數持續增加。因此，抑制癌症死亡患者數量是社會的當務之急。癌症由於隨著發生後時間的經過而進展，因此認為在其治療中，早期發現是很重要的。在消化器官癌症的早期發現中，內窺鏡檢查發揮著重要的作用。
由乳癌的研究可知，多數癌從發生開始至6年後會達到直徑5毫米左右。採用目前的內窺鏡極難檢測到這種程度大小的癌。之後，在第7年成為直徑達到10毫米的被稱作早期癌症的狀態，若能在這時檢測到，則多可通過內科醫生使用內窺鏡的黏膜切除手術進行治療。但是，由於該檢測界限，採用內窺鏡檢查僅能發現在7年±半年的時期接受診查的患者的早期癌症。
如此，可作為早期癌症被發現的時期有限。過了該時期而變成晚期癌症時將難以利用內窺鏡進行治療，2期、3期的晚期癌症將不得不依賴於外科醫生進行癌切除開腹手術。當癌症進一步進展到4期時，癌遠端轉移至肝臟、肺、腦等消化道外的臟器的可能性高，變得需要內科醫生進行化學療法-放射線療法。因此，可以說內窺鏡的癌發現性能決定了早期癌症的發現率、甚至癌症的治療可能性。
在消化器官的病理組織診斷中，能夠直接觀察病變的內窺鏡檢查發揮重要的作用。近年來，通過增強顯示黏膜表層的毛細血管、黏膜微細結構形態的窄波成像技術(narrowbandimaging(nbi))(註冊商標)內窺鏡系統的開發，正在實現微細病變的早期發現。但是，即使是nbi也無法觀察各個細胞，病變的準確診斷需要活檢(活體組織切片)。
因此，活檢組織診斷在胃癌等消化道疾病的診斷中仍發揮著重要的作用。活檢組織診斷是通過病理醫生對通過內窺鏡檢查採集的問題部位的組織進行蘇木精-伊紅染色(he染色)所製作的標本進行組織診斷來進行的。但是，活檢不僅是侵襲性的處置，而且存在費用也高，至獲得診斷結果需要花費10天左右的問題。
長期以來提出了對生物體細胞進行染色、由其細胞圖像診斷疾病的嘗試，但所使用的色素的安全性成為問題。特別是，為了開發新型色素，法律上也要求證明在候補色素給予時是否顯示有害作用。該安全性證明操作中，為新型色素化合物時，每1種化合物需要花費最低10年的歲月和數十億日元的成本。
作為對生物體組織的深部進行觀察的方法，還提出了使用專利文獻1～3中記載的多光子雷射顯微鏡的診斷方法。多光子雷射顯微鏡中，利用多光子激發現象將超短脈衝雷射聚光至組織內部，在聚光位置處觀察被超短脈衝雷射激發而發出的螢光。多光子雷射顯微鏡在原理上由於能夠精確定點激發，因此通過一邊使超短脈衝雷射掃描一邊檢測螢光進行圖像處理，可以獲得高解析度的螢光圖像。
利用多光子雷射顯微鏡的存在於細胞內的fad(黃素腺嘌呤二核苷酸)的可視化由於可以低侵襲性地對細胞或分子的行為進行分析，因此期待在內窺鏡技術中的應用。通過多光子雷射顯微鏡，由於在730nm左右的波長下、細胞內的核黃素被可視化，因此不需要對細胞進行染色即可獲取自體螢光圖像(rogart,j.n.,etal.,"multiphotonimagingcanbeusedformicroscopicexaminationofintacthumangastrointestinalmucosaexvivo",clingastroenterolhepatol2008january；6(1):95-101)。但是，在多光子雷射顯微鏡下獲得的圖像是低對比度的。另外，通過多光子雷射的照射，在生物體內產生紫外線，因此由於dna損傷的危險性，無法批准在人體上的應用。另外，細胞的自體螢光強度隨著臟器不同而有很大差異，自體螢光強的大腸等消化道上皮細胞使用目前市售的多光子雷射顯微鏡可對細胞圖像進行可視化，但自體螢光弱的卵巢上皮細胞或膀胱上皮細胞使用目前市售的多光子雷射顯微鏡難以進行細胞圖像的可視化(cruz,j.,etal.biomedicalopticusexpress1,5,1320-1330,2010年)。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1：日本特開平10-186424號公報
專利文獻2：日本特開2008-286883號公報
專利文獻3：日本特開2010-8082號公報
非專利文獻
非專利文獻1：rogart,j.n.,etal.,clingastroenterolhepatol2008january；6(1):95-101
非專利文獻2：cruz,j.,etal.biomedicalopticusexpress2010,1,5,1320-1330
非專利文獻3:：hogan,c.,etal.,nat.cellbiol.,2009,11(4),460-467
技術實現要素：
發明欲解決的課題
為了利用內窺鏡(包括如纖維內窺鏡的柔性鏡和如支氣管窺鏡的硬性鏡這兩者)檢查進行消化系統、呼吸系統、腎泌尿系統、子宮卵巢生殖系統及腦脊髓神經系統等的疾病的早期發現，甚至早期地實現抑制社會性當務之急的癌症死亡患者數量，本發明的第一觀點是提供在多光子雷射顯微鏡下使用的新型生物體染色劑及使用了該染色劑的細胞的觀察方法，第二觀點是提供在多光子雷射顯微鏡下使用的新型生物體染色劑的評價方法，第三觀點是提供在多光子雷射顯微鏡下使用的新型腫瘤細胞染色劑及使用了該染色劑的腫瘤細胞的檢測方法。
另外，利用多光子雷射顯微鏡可以獲得高解析度的螢光圖像，可以發現早期癌症階段的小的癌細胞。但是，即使是通過多光子雷射顯微鏡發現了癌細胞或癌組織也無法進行治療，治療需要利用其他裝置或進行外科處置，在早期癌症的輕微狀態下，在治療時仍有花費功夫來確定癌細胞或癌組織的位置的可能性。
因此，本發明的另一個目的是解決現有技術中存在的問題，提供容易發現生物體內的小的癌組織且還可將所發現的癌組織除去的診斷治療裝置。
因此，本發明的第四觀點是提供用於使用多光子吸收現象對患者的組織進行觀察、同時將該組織的一部分選擇性地破壞的多光子雷射診斷治療裝置。
用於解決課題的方法
第一觀點中，本發明者們在數量眾多的自然色素或人工合成色素中，關注對人體的經口給予得到認可的食品著色用色素。對大量色素的多光子雷射螢光發生活性和細胞染色性進行了研究，其結果發現了多種在多光子雷射顯微鏡下能夠以高對比度且高解析度將細胞組織形態圖像化者，進而完成了本發明。
第一方式中，本發明提供一種生物體染色劑，其為用於在多光子雷射顯微鏡下進行觀察的生物體染色劑，其含有可食用的1種或多種色素化合物。色素化合物選自包含焦油系色素(紅色3號(赤蘚紅)、紅色104號(螢光桃紅)、紅色105號、紅色106號、綠色3號(固綠fcf)、紅色2號、紅色102號、藍色2號(靛藍胭脂紅)、黃色4號(檸檬黃)、黃色5號(日落黃fcf)等)、環烯醚萜系色素(highmelon(日文原文：(ハイメロン)p-2(梔子藍：梔子苷)、高藍at(梔子藍色素：梔子苷)等)、類胡蘿蔔素系色素(highmelonp-2(黃色素：藏紅花素)、胭脂樹紅(胭脂樹n2r25、紅木果實：胭脂素、降胭脂樹素)、highmelonp-2(梔子藍：梔子苷)、藏紅花素g150(梔子黃色素)、藏紅花素l(梔子黃色素)、β胡蘿蔔素、胭脂樹wa-20(胭脂樹紅色素紅木的種子：降胭脂樹素)等)、黃酮系色素(高紅g150(葡萄皮色素、花青素)、高紅ra200(紅蘿蔔色素：天竺葵色素苷)、高紅v80(紫芋色素：矢車菊素葡萄糖苷及芍藥素葡萄糖苷)、芹菜定(高粱色素)、花青色素、花翠素(茄子色素)、菲瑟定(黑荊色素)、錦葵色素(藍色的香豌豆色素)、花葵素、刺槐定(刺槐木色素)、tricetinidin(紅茶色素)、甲花翠素(紅莓色素)、辣椒紅(辣椒色素)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠茶、紅花y1500(紅花色素、羥基紅花黃色素a+b)、薑黃色素、硫黃菊素、楊梅酮(葡萄、洋蔥色素)或槲皮黃酮(洋蔥、柑橘類色素))、醌系色素(胭脂蟲(胭脂蟲紅al、胭脂紅酸)、高紅s(紫膠紅色素-蟲膠酸)等)、甜菜紅鹼系色素(高紅bl(紅甜菜色素：甜菜苷、異甜菜苷)等)、吲哚菁綠及姜辣素(生薑辛辣成分)的螢光色素群。
本發明的生物體染色劑可以對管腔的上皮細胞-腺細胞系和/或結締組織-毛細血管系的細胞、優選癌細胞進行染色。色素化合物被700nm以上、優選800nm以上的長波長的多光子雷射激發。
第二方式中，本發明提供一種方法，其為使用上述生物體染色劑對受試者體內及取出至受試者體外的細胞或培養細胞進行觀察的方法，其包含：1)將該生物體染色劑應用於該細胞、2)在多光子雷射顯微鏡下對該細胞進行觀察。根據方式不同，本發明的觀察方法進一步包含3)根據所述細胞之間的染色性差異識別正常細胞和癌細胞。
第二觀點中，本發明者們以提供對具有優先地對癌細胞或者優先地對正常細胞或者兩者同等程度地進行染色的細胞染色特性的染色劑進行高效地評價、選擇的方法為課題進行了深入研究，結果完成了這種染色劑的評價、選擇方法。此外，利用該評價、選擇方法，從1200多種的大量食用染色劑中發現了具有上述細胞染色特性的染色劑。
第一方式中，本發明提供一種方法，其為利用多光子雷射顯微鏡下的觀察評價生物體染色劑的細胞染色特性的方法，其包含a)將癌細胞和正常細胞混在，b)培養所述混在物至達到匯合或半匯合的狀態，c)將待評價的染色劑應用於所述培養物，d)確定所述染色劑i)是否特異性地對癌細胞進行染色、ii)是否特異性地對正常細胞進行染色、或iii)是否對癌細胞和正常細胞均進行染色。優選所述工序b)中，在癌細胞優先增殖的條件下對所述混合物進行培養直至達到匯合或半匯合的狀態。優選所述方法中，所述癌細胞是表達rasv12的狗腎臟腎小管上皮細胞(mdck-rasv12)，通過添加四環素以使該癌細胞優先地增殖。為了評價癌細胞是否被特異性地染色，優選上述方法包含利用報告基因對癌細胞進行標記、將報告基因的表達和利用染色劑的染色進行對比的步驟。優選所述報告基因是gfp基因。
第二方式中，本發明提供一種細胞染色劑，其為用於在多光子雷射顯微鏡下進行觀察的、相比較於正常細胞更特異性地對癌細胞進行染色的染色劑，其為含有選自磺基水楊酸甲氯環素、鹽酸甲烯土黴素、紅汞、固綠fcf、紅色3號(赤蘚紅)及紅色104號中的1種或多種色素化合物而成。
此外，本發明還提供一種細胞染色劑，其為用於在多光子雷射顯微鏡下進行觀察的、相比較於癌細胞更特異性地對正常細胞進行染色的染色劑，其為含有選自米託蒽醌二鹽酸鹽及阿黴素鹽酸鹽中的1種或多種色素化合物而成。
此外，本發明還提供一種細胞染色劑，其為用於在多光子雷射顯微鏡下進行觀察的、對正常細胞和癌細胞同等地進行染色的染色劑，其為含有選自恩波吡維銨、芝加哥天藍6b、玫瑰紅鈉鹽、酸性紅及高紅v80(紫芋色素)中的1種或多種色素化合物而成。
此外，本發明還提供一種細胞染色劑，其含有用於在多光子雷射顯微鏡下進行觀察的下述細胞染色劑的混合物而成：作為相比較於正常細胞更特異性地對癌細胞進行染色的染色劑且含有選自磺基水楊酸甲氯環素、鹽酸甲烯土黴素、紅汞、固綠fcf、紅色3號(赤蘚紅)及紅色104號中的1種或多種色素化合物而成的細胞染色劑；和作為同等地對正常細胞和癌細胞進行染色的染色劑且含有選自恩波吡維銨、芝加哥天藍6b，玫瑰紅鈉鹽、酸性紅及高紅v80(紫芋色素)中的1種或多種色素化合物而成的細胞染色劑。
優選所述細胞染色劑在染色劑的總濃度中以0.1μm～10μm的濃度使用。優選上述細胞染色劑進一步含有等滲劑、ph調節劑、穩定劑、增粘劑、防腐劑、香料和/或粘合劑。優選所述細胞是管腔的上皮細胞-腺細胞系和/或結締組織-毛細血管系的細胞。優選所述色素化合物被700nm以上的多光子雷射激發。
第三方式中，本發明提供一種方法，其為使用上述細胞染色劑對由受試者獲得的細胞或培養細胞中的癌進行檢測的方法，其包含1)將該癌細胞染色劑應用於該癌細胞、2)在多光子雷射顯微鏡下根據染色性的差異對正常細胞和癌細胞進行識別。所述方法優選進一步包含3)通過多光子雷射照射將所述腫瘤細胞排除。
第四方式中，本發明提供一種方法，其為通過多光子雷射顯微鏡下的觀察對生物體染色劑的多能幹細胞來源的細胞的染色特性進行評價的方法，其包含a)將待評價的染色劑應用於混在有多能幹細胞來源的正常分化細胞和未分化細胞的所述培養物中、b)判斷所述染色劑i)是否對未分化細胞特異性地進行染色、ii)是否對正常分化細胞特異性地進行染色、或iii)是否對正常分化細胞、未分化細胞均進行染色。正常分化細胞和未分化細胞混在狀態的上述培養物的培養可以是培養至培養混合物達到匯合或半匯合的狀態，然後應用所述染色劑。所述多能幹細胞可以是ips細胞、es細胞或muse細胞。為了評價多能幹細胞是否被特異性地染色，優選所述方法包含用報告基因對多能幹細胞進行標記、將報告基因的表達與利用染色劑的染色進行對比。優選所述報告基因是gfp基因。該未分化細胞也可以是癌細胞。
第三觀點中，本發明者們在數量眾多的自然色素或人工合成色素中，關注了對人的經口給予已得到認可的食品著色用色素等。對多種色素研究了多光子雷射螢光發生活性和細胞染色性，結果獲得了特定的色素在多光子雷射顯微鏡下、以能夠識別正常細胞和腫瘤細胞的程度、以高對比度且高解析度對細胞組織形態進行圖像化的認識，從而完成了本發明。
因此，第一方式中，本發明提供一種腫瘤細胞染色劑，其為用於在多光子雷射顯微鏡下進行觀察的腫瘤細胞染色劑，其含有選自薑黃色素、硫黃菊素、赤蘚紅、表沒食子兒茶素沒食子酸酯及酸性紅中的1種或多種色素化合物而成。本發明的染色劑可以對管腔的上皮細胞-腺細胞系和/或結締組織-毛細血管系的細胞進行染色。上述色素化合物被700nm以上、優選800nm以上的長波長的多光子雷射激發。
第二方式中，本發明提供一種方法，其為使用上述腫瘤細胞染色劑對受試者體內及取出至受試者體外的細胞或培養細胞中的腫瘤進行檢測的方法，其包含1)將該腫瘤細胞染色劑應用於該細胞、2)在多光子雷射顯微鏡下、根據染色性的差異識別正常細胞和腫瘤細胞。根據方式不同，本發明的檢測方法進一步包含3)利用多光子雷射照射將腫瘤細胞排除。
通過多光子雷射顯微鏡可以獲取高解析度的螢光圖像、可以發現早期癌症階段的小的癌細胞。但是，即使是通過多光子雷射顯微鏡發現了癌細胞或癌組織，也無法進行治療，治療需要利用其他的裝置或進行外科處置，在早期癌症的輕微狀態下，在治療時仍有要花費功夫確定癌細胞或癌組織的位置的可能性。因此，期待提供解決現有技術中存在的問題、易於發現生物體內的小的癌組織且能夠將所發現的癌組織除去的診斷治療裝置。
因此，第四觀點中，本發明鑑於上述目的提供一種多光子雷射診斷治療裝置，其為用於一邊使用多光子吸收現象對患者的組織進行觀察、一邊選擇性地將該組織的一部分破壞的多光子雷射診斷治療裝置，其具備：發射可調整頻率及功率的脈衝雷射的雷射光源，將來自所述雷射光源的脈衝雷射照射到所述組織的聚光位置的光學系統，使所述聚光位置變位的聚光位置變位裝置，對通過所述脈衝雷射的照射由所述組織發出的螢光進行檢測的光檢測器，通過對由所述聚光位置變位裝置獲得的表示所述聚光位置的參數和通過所述光檢測器檢測的螢光的強度協調處理而生成所述組織的螢光圖像的螢光圖像生成裝置，和控制裝置；其中，所述光學系統的周圍被筒狀的屏蔽構件覆蓋，該屏蔽構件通過與待觀察的組織的周邊壓接、形成密封該光學系統的空間，該屏蔽構件具備用於調節該空間內的壓力的通氣口，所述控制裝置包含設定所述脈衝雷射的強度的脈衝光強度設定部、在所述螢光圖像上設定所述脈衝雷射的照射範圍的照射範圍設定部、和設定所述脈衝雷射的照射時間的照射時間設定部，一邊利用所述聚光位置變位部僅以所述照射時間設定部規定的時間將由所述脈衝光強度設定部規定的強度的所述脈衝雷射掃描至由所述照射範圍設定部規定的坐標範圍、一邊進行照射，利用所述脈衝雷射的能量，將由所述照射範圍設定部規定的照射範圍的所述組織的細胞選擇性地破壞。
所述屏蔽構件還可進一步具備用於向所述空間內供給液體及進行排液的給液口及排液口，其中，該給液口及排液口可以是相同的也可以是不同的，此外該給液口及排液口還可兼為所述吸氣口及排氣口。優選所述液體是包含用於對組織進行染色的染色劑的染色液及用於對該染色液進行洗滌的洗滌液。
上述多光子雷射診斷治療裝置中，利用光學系統將來自雷射光源的脈衝雷射照射至患者的組織，通過利用光檢測器檢測通過多光子吸收現象被脈衝雷射激發的螢光，從而通過螢光圖像生成裝置生成患者組織的螢光圖像。特別是，多光子激發在原理上在精確定點發生，因此可獲得高解析度的螢光圖像。醫生可以基於該高解析度的螢光圖像進行診斷、確定癌組織的部位。另外，螢光圖像是對表示由聚光位置變位裝置獲得的聚光位置的參數(即坐標)和由聚光位置的組織發出的螢光強度進行關聯處理所獲得的，可以一對一地使螢光圖像上的各坐標點與聚光位置變位裝置的設定對應起來，可以在對應於螢光圖像上各坐標點的患者組織上的點重現使脈衝雷射的聚光位置變位的設定。因此，在所生成的螢光圖像上，通過控制裝置的照射範圍設定部將癌組織的部位設定為脈衝雷射的照射範圍，通過控制裝置的脈衝光強度設定部及照射時間設定部將脈衝雷射的強度及照射時間設定為足以破壞癌細胞的值，若在設定的照射範圍內進行脈衝雷射的照射，則可以在螢光圖像上利用所指定的照射範圍準確地通過多光子吸收現象選擇性地對癌組織進行破壞、治療。此外，多光子激發由於在原理上在精確定點發生，因此能夠破壞以細胞單位計的癌組織，因而可以以最低限度的範圍將癌組織破壞。因此，在破壞癌細胞時，可以將患者的負擔抑制到最低。
所述組織是通過在表面上塗布染色劑而被染色的組織，所述螢光圖像生成裝置優選基於來自所述經染色的組織的螢光來生成螢光圖像。
另外，所述聚光位置變位裝置優選包含在正交於所述脈衝雷射的光軸的二軸方向上掃描所述脈衝雷射的二維掃描部、和用於調節所述組織的所述雷射的聚光位置的深度的聚光深度調節部。
此外，所述脈衝強度設定部優選包含設定用於進行診斷的脈衝雷射強度的診斷用脈衝強度設定部、和設定用於治療的脈衝雷射強度的治療用脈衝強度設定部。此時，由所述診斷用脈衝強度設定部設定的脈衝雷射強度優選是由治療用脈衝強度設定部設定的強度的1/10以下。
所述光學系統優選含有用於將所述脈衝雷射聚光至聚光位置的物鏡、該物鏡的開口數為1.0以上。
所述光學系統和所述聚光位置變位裝置設定在雷射照射頭內，多光子雷射診斷治療裝置還可以進一步具備用於固定所述患者的患者固定臺、和使所述患者固定臺和所述雷射照射頭在3軸方向上相對移動的移動裝置，所述光學系統還可以設置在內窺鏡內、通過所述內窺鏡從所述雷射光源將脈衝雷射照射至所述組織。
發明效果
關於多光子雷射螢光發生活性和細胞染色性，在對多個可經口攝入的化合物進行分析的過程中發現，各色素在正常細胞和/或癌細胞中的染色樣式因數個染色特異性的不同而被分類。因此，根據本發明，可以利用癌和正常細胞的染色性差異、迅速地找到病變部，由細胞形態確定黏膜病變的本質(病名)。
利用本發明的生物體染色劑進行的染色法與現有的自體螢光觀察法相比，由於能夠將為攝入足以進行圖像診斷的畫質的細胞圖像所需的雷射照射量抑制至30分之1左右(使用砷化鎵高感度光電倍增管時為100分之1左右)、大幅度地降低黏膜細胞的光損傷、另外由於能夠將雷射激發波長設定在長波長側(800nm以上)，因此可以抑制組織內的紫外線發生、減少黏膜細胞的dna損傷。另外，由本發明的生物體染色劑進行了可視化的圖像與通過螢光色素的靜脈內全身給予獲得的共聚焦雷射顯微鏡圖像或通過無染色自體螢光獲得的多光子雷射顯微鏡圖像相比，是足夠高的畫質。
另外，通過本發明的裝置，可以利用脈衝雷射產生的多光子吸收現象獲取高解析度的螢光圖像、進行癌症診斷。另外，通過調整脈衝雷射的強度及照射時間，可以將螢光圖像上確定的區域的細胞破壞、容易且準確地將所發現的癌組織除去。
附圖說明
圖1是本發明的多光子雷射診斷治療裝置的概略構成圖。
圖2是表示本發明第1實施方式的多光子雷射診斷治療裝置的整體構成圖。
圖3是表示本發明第2實施方式的多光子雷射診斷治療裝置的整體構成圖。
圖4表示本發明多光子雷射診斷治療裝置的光學系統被屏蔽構件包圍的狀態。
圖5表示光學系統被屏蔽構件包圍的內窺鏡。
圖6a是表示提供高對比度的多光子雷射圖像的色素化合物的染色樣式的顯微鏡照片。
圖6b是表示提供高對比度的多光子雷射圖像的色素化合物的染色樣式的顯微鏡照片。
圖6c是表示提供高對比度的多光子雷射圖像的色素化合物的染色樣式的顯微鏡照片。
圖6d是表示提供高對比度的多光子雷射圖像的色素化合物的染色樣式的顯微鏡照片。
圖7a是表示薑黃色素優先地對上皮細胞-腺細胞系進行了染色的顯微鏡照片。
圖7b是表示硫黃菊素優先地對上皮細胞-腺細胞系進行了染色的顯微鏡照片。
圖8a是表示胭脂樹紅優先地對結締組織-毛細血管系進行了染色的顯微鏡照片。
圖8b是表示胭脂樹紅及槲皮素優先地對結締組織-毛細血管系進行了染色的顯微鏡照片。
圖9a是表示紅色106號優先地對上皮細胞-腺細胞系和結締組織-毛細血管系兩者進行了染色的顯微鏡照片。
圖9b是表示綠色3號優先地對上皮細胞-腺細胞系和結締組織-毛細血管系兩者進行了染色的顯微鏡照片。
圖10表示磺基水楊酸甲氯環素特異性地對癌細胞進行染色。gfp-rasv12陽性細胞優先地被染色。gfp-rasv12陽性細胞從最小1個到數個的細胞集團均被染色。
圖11表示鹽酸甲烯土黴素特異性地對癌細胞進行染色。gfp-rasv12陽性細胞優先地被染色。gfp-rasv12陽性細胞從最小1個到數個的細胞集團均被染色。
圖12表示紅汞特異性地對癌細胞進行染色。gfp-rasv12陽性細胞優先地被染色。gfp-rasv12陽性細胞從最小1個到數個的細胞集團均被染色。
圖13表示米託蒽醌二鹽酸鹽相比較於癌細胞更特異性地對正常細胞進行染色。gfp-rasv12細胞未被特異性地染色而正常細胞染色了。
圖14表示阿黴素鹽酸鹽相比較於癌細胞更特異性地對正常細胞進行染色。gfp-rasv12細胞未被特異性地染色而正常細胞染色了。
圖15表示恩波吡維銨對正常細胞和癌細胞同等地進行染色。
圖16表示芝加哥天藍6b對正常細胞和癌細胞同等地進行染色。白色箭頭：gfp-rasv12陽性細胞的細胞黏附部位被芝加哥天藍6b(chicagoskyblue6b)染色。gfp-rasv12陽性細胞的一部分是細胞質被染色。
圖17表示固綠fcf將癌細胞特異性地染色。
圖18表示紅色3號(赤蘚紅)將癌細胞特異性地染色。gfp-rasv12陽性細胞優先地被染色。gfp-rasv12陽性細胞從最小1個到數個的細胞集團均被染色。少數的正常細胞也被紅色104號染色。
圖19表示紅色104號(螢光桃紅，phloxine)將癌胞特異性地染色。白色粗箭頭：全部的gfp-rasv12陽性細胞被紅色104號染色。gfp-rasv12陽性細胞從最小1個到數個的細胞集團均被紅色104號染色。癌細胞染色強度是正常細胞染色強度的6.7倍。白色細箭頭：少數的正常細胞也被紅色104號染色。
圖20表示玫瑰紅鈉鹽將正常細胞和癌細胞同等地染色。
圖21表示酸性紅將正常細胞和癌細胞同等地染色。
圖22a表示高紅v80(紫芋色素)將正常細胞和癌細胞同等地染色。
圖22b表示高紅v80的構成成分花青色素烷醯葡萄糖(cyanidinsialicglycoside，花青色素唾液酸苷？)。
圖22c表示高紅v80的構成成分芍藥花素烷醯葡萄糖。
圖23表示被薑黃色素染色的正常大腸黏膜(a)和大腸癌腫瘤部(b)的多光子雷射顯微鏡照片。
圖24是在用1％鏈黴蛋白酶進行處理後被薑黃色素染色的正常大腸黏膜(a)和大腸癌腫瘤部(b)的多光子雷射顯微鏡照片。
圖25是表示被薑黃色素染色的大腸癌的結構異型性(a)及細胞異型性(b)的多光子雷射顯微鏡照片。
圖26是利用薑黃色素染色及硫黃菊素染色獲得的高對比度的多光子雷射顯微鏡圖像。
圖27a是被薑黃色素優先地染色的上皮細胞-腺細胞系的多光子雷射顯微鏡照片。
圖27b是被硫黃菊素優先地染色的上皮細胞-腺細胞系的多光子雷射顯微鏡照片。
圖28a是表示僅對2個癌細胞進行雷射照射(功率：45％；照射時間：2秒)將其排除的過程的多光子雷射顯微鏡照片。
圖28b是表示僅對10個癌細胞進行雷射照射(功率：45％；照射時間：10秒)將其排除的過程的多光子雷射顯微鏡照片。
圖29是表示對直徑0.5毫米的癌進行雷射照射(功率：100％；照射時間：20秒)將其排除的過程的多光子雷射顯微鏡照片。
圖30是小鼠膀胱上皮細胞的多光子雷射顯微鏡照片，(a)是以82％的雷射功率拍攝未被薑黃色素染色的細胞的照片(自體螢光)、(b)是以3％的雷射功率拍攝經薑黃色素染色的細胞的照片。
圖31是小鼠氣管上皮細胞的多光子雷射顯微鏡照片，(a)是以82％的雷射功率拍攝未被薑黃色素染色的細胞的照片(自體螢光)、(b)是以3％的雷射功率拍攝經薑黃色素染色的細胞的照片。
圖32是對經外科手術切除的新鮮胃黏膜的正常胃黏膜部位(a)或胃癌部位(b)進行薑黃色素染色、使雷射功率為1％進行拍攝的多光子雷射顯微鏡照片。
圖33是色素化合物的染色性評價步驟的說明圖。
具體實施方式
＜新型的生物體染色劑＞
本發明的生物體染色劑作為食品添加物等已得到認可、包含可食用的天然(動物性或植物性)或合成的色素化合物。在本說明書中使用時，「可食用」並非是指對象化合物的用途本來是食用的，而是確保有能夠添加在食品等中的安全性、可應用於人體等具有管腔臟器的動物。本發明的可食用色素化合物例如選自包含焦油系色素、特別是食用焦油系色素、環烯醚萜系色素、類胡蘿蔔素系色素、黃酮系色素(例如兒茶素類；花青素類、特別是花色素類；查耳酮類；薑黃色素類)、醌系色素、甜菜紅鹼系色素的螢光色素化合物組。本發明的色素化合物根據結構可如下進行分類。
1.焦油系色素
作為焦油系色素的例子，可舉出以下的化合物：
紅色3號(赤蘚紅)、紅色104號(螢光桃紅)、紅色105號、紅色106號(酸性紅)、綠色3號(固綠fcf)、紅色2號、紅色102號、藍色2號(靛藍胭脂紅)、黃色4號(檸檬黃)、黃色5號(日落黃fcf)等。
2.環烯醚萜系色素
作為環烯醚萜系色素的例子，可舉出以下的化合物：highmelonp-2(梔子藍：梔子苷)、高藍at(梔子藍色素：梔子苷)等。
3.類胡蘿蔔素系色素
作為類胡蘿蔔素系色素的例子，可舉出以下的化合物：
highmelonp-2(黃色素：藏紅花素)、胭脂樹紅(胭脂樹n2r25、紅木果實：胭脂素、降胭脂樹素)、highmelonp-2(梔子藍：梔子苷)、藏紅花素g150(梔子黃色素)、藏紅花素l(梔子黃色素)、β胡蘿蔔素、胭脂樹wa-20(胭脂樹紅色素紅木的種子：降胭脂樹素)等。
4.黃酮系色素
作為黃酮系色素的例子，有花青素類、特別是花色素類、兒茶素類、查耳酮類、薑黃色素類等。
作為花青素類的例子，可舉出以下的化合物：
高紅g150(葡萄皮色素、花青素)、高紅ra200(紅蘿蔔色素：天竺葵色素苷)、高紅v80(紫芋色素：矢車菊素葡萄糖苷及芍藥素葡萄糖苷)、芹菜定(高粱色素)、花青色素、花翠素(茄子色素)、菲瑟定(黑荊色素)、錦葵色素(藍色的香豌豆色素)、花葵素、刺槐定(刺槐木色素)、tricetinidin(紅茶色素)、甲花翠素(紅莓色素)、辣椒紅(辣椒色素)等。
作為兒茶素類的例子，有表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠茶等。
作為查耳酮類的例子，有紅花y1500(紅花色素、羥基紅花黃色素a+b)等。
作為薑黃色素類的例子，有薑黃色素等。
作為其他黃酮系色素的例子，可舉出以下的化合物：
硫黃菊素、楊梅酮(葡萄、洋蔥色素)、槲皮黃酮(洋蔥、柑橘類色素)等。
5.醌系色素
作為醌系色素的例子，可舉出以下的化合物：
胭脂蟲(胭脂蟲紅al、胭脂紅酸)、高紅s(紫膠紅色素-蟲膠酸)等。
6.甜菜紅鹼系色素
作為甜菜紅鹼系色素的例子，可舉出高紅bl(紅甜菜色素：甜菜苷、異甜菜苷)等。
作為其他螢光色素化合物的例子，可舉出吲哚菁綠、姜辣素(生薑辛辣成分)等。
本發明中使用的色素化合物具有各自不同的染色性，從對正常細胞的染色性出發，可如下進行分類。
1)被多光子雷射強烈地激發、提供明亮的生物體細胞圖像的色素
薑黃色素(來源於薑黃等)、硫黃菊素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、紅色3號(赤蘚紅)、紅色106號、綠色3號、紅色2號、紅色102號、紅色104號(螢光桃紅)、藍色2號、黃色4號、黃色5號、highmelon、胭脂樹紅、吲哚菁綠、梔子黃色素、藏紅花素g-150、羥基紅花黃色素、高藍at、螢光素、花青色素、花翠素、菲瑟定、刺槐定、花葵素、芹菜定、錦葵色素、β胡蘿蔔素、紅105號、高紅ra200、高紅v80、高紅bl、6-姜辣素、槲皮素、楊梅酮、トリセニジン及甲花翠素。
2)優先地將構成消化道等管腔臟器的特定的細胞結構強烈染色的色素
消化道黏膜的細胞構成可以如下分類：由覆蓋食物通過的黏膜表面的上皮細胞和上皮細胞陷入成疣狀並分泌粘液的腺細胞構成的細胞組(第一系列)；由包埋上皮細胞、腺細胞周圍的毛細血管、結締組織細胞構成的細胞組(第二系列)。當自黏膜表面拉近物鏡，在其聚焦聚焦在黏膜表面時、主要觀察到上皮細胞，在聚焦聚焦在深部時、則觀察到腺細胞和結締組織-毛細血管。
2-1)優先地對第一系列的細胞組進行染色的色素
薑黃色素(色素編號1號)、硫黃菊素(色素編號2號)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(色素編號3號)、紅色3號(赤蘚紅)(色素編號4號)、紅色104號(螢光桃紅)(色素編號9號)、吲哚菁綠(色素編號15號)、錦葵色素(色素編號27號)、β胡蘿蔔素(色素編號28號)、高紅bl(色素編號32號)、6-姜辣素(色素編號33號)、楊梅酮(色素編號35號)、トリセニジン(色素編號36號)及甲花翠素(色素編號37號)。
這些色素中，薑黃色素和硫黃菊素的染色性高，優選。
2-2)優先地對第二系列的細胞組進行染色的色素
胭脂樹紅(色素編號14號)、槲皮素(色素編號34號)、藍色2號(色素編號10號)、梔子黃色素(色素編號16號)、藏紅花素g-150(色素編號17號)、羥基紅花黃色素(色素編號18號)、刺槐定(色素編號24號)、高紅v80(色素編號31號)及色素編號34號的槲皮素(色素編號34號)。
這些色素中，胭脂樹紅和槲皮素的染色性高，優選。
2-3)對第一系列及第二系列這兩者的細胞組進行染色的色素
紅色106號(色素編號5號)對上皮細胞-腺細胞的細胞膜和結締組織-毛細血管系強烈地進行染色。另外，綠色3號(色素編號6號)對一部分的腺細胞和結締組織-毛細血管系強烈地進行染色。
本發明的生物體染色劑不僅是正常細胞、癌細胞也可染色。例如薑黃色素、硫黃菊素、紅色3號(赤蘚紅)等多種色素相比較於正常黏膜更濃地對癌病變部進行染色。通過利用這種染色特異性，可以迅速地探索病變部。其中，在通過螢光色素的靜脈注射進行給予的、使用共聚焦雷射顯微鏡的消化道黏膜細胞的圖像化中，癌細胞比正常細胞更濃地被染色這一認識在本發明以前是沒有的。
此外，病變部是癌細胞時，癌細胞具有與正常細胞不同的形態特徵，因此根據形態差異，可以區別正常細胞和癌細胞。具體而言，異型性分類為結構型(細胞集團未在基底膜上規整地排列、未形成腺結構等)及細胞異型(各個細胞的大小不同、核大、其位置不均一、極性不均一等)這兩種。目前的內窺鏡難以對直徑5毫米左右的癌進行檢測，但在細胞形態可圖像化的多光子雷射顯微鏡下使用本發明的生物體染色劑時，則根據形態差異，即使不進行活檢、也可通過目視早期地檢測到直徑1毫米左右的癌。檢測到癌時，還可以通過多光子雷射照射將其燒灼、排除。
生物體染色中使用的色素化合物適當選自上述化合物組。本發明的生物體染色劑可以單獨含有或含有多種所選擇的色素化合物。通過組合不同的色素化合物，則可獲得不同的染色樣式。各色素化合物的配合量只要是色素化合物在生物體染色劑中不沉澱並可獲取病理診斷所需的圖像，則無特別限定。此外，考慮對受試者造成的毒性來決定色素化合物的濃度。此外，色素化合物的濃度按照在生物體染色劑中不發生沉澱的方式適當進行調節，例如色素化合物可以在生物體染色劑中配合約0.01mg/ml～5mg/ml的範圍、例如約1mg/ml。優選上述色素化合物可以以0.1μm～10μm的濃度(摩爾濃度)進行使用。另外，除了上述色素化合物，還可以含有在內窺鏡檢查等中一直使用的碘等公知的色素。色素化合物在常用的溶劑、例如pbs、乙醇/甘油、dmso等溶解。
上述色素化合物具有固有的螢光發生活性，但均被700nm以上、優選800nm以上的長波長的多光子雷射激發。激發光的觀察在多光子雷射顯微鏡下進行，在本說明書中進行使用時，「多光子雷射顯微鏡」是指利用多光子激發過程的螢光顯微鏡。以激發光為雙光子的情況為例進行說明時，多光子激發過程是與單光子激發相比，1個螢光分子將2個波長約為2倍、即能量為1/2的光子同時吸收，從而變為激發狀態的非線形光學現象。此外，從由此激發狀態返回至能量低的穩定狀態時，能量作為螢光被釋放，測定其螢光強度，構建高對比度的圖像。這種多光子激發通過作為光源使用脈衝寬為飛秒級、且峰值功率大的脈衝雷射強制地進行。本發明的生物體染色劑不僅在雙光子、在三光子等多光子激發過程中也可利用，所使用的多光子雷射顯微鏡只要是具備產生長波長的雷射的功能，則無特別限定。
本發明的生物體染色劑可以對管腔、優選消化器官的上皮細胞-腺細胞系和/或結締組織-毛細血管系的細胞進行染色。此外，本發明的生物體染色劑在體外的細胞觀察中也可使用，例如可以是由受試者通過活檢獲得的細胞或者培養細胞(例如單層培養細胞)。本說明書中進行使用時，用語「培養細胞」包含各種幹細胞、例如人工多能幹細胞(ips細胞)、胚胎幹細胞(es細胞)、muse細胞、組織幹細胞等培養物。通過本發明的觀察方法，也可對在將這些細胞應用於再生醫療時在培養過程中產生的癌化細胞或未分化細胞進行檢測。
生物體染色劑的給予方法並無特別限定，例如可以將生物體染色劑直接應用於或黏膜下給予到管腔中，或者也可以經口、經靜脈或給予至腹腔內。生物體染色劑的染色性弱時，通過用鏈黴蛋白酶處理黏膜表面，將粘液除去，細胞結構的識別性提高。當將染色劑直接應用於管腔內壁(例如塗布或噴霧)時，劑型優選是液體，也可以以顆粒、片劑等形態進行使用。另外，也可根據劑型等，適當地將所需的追加成分、例如等滲劑、ph調節劑、穩定劑、增粘劑、防腐劑、香料或粘合劑等添加物配合在生物體染色劑中。例如，可以在本發明的生物體染色劑中預先配合鏈黴蛋白酶。鏈黴蛋白酶是作為黏膜除去劑使用的具體例子。作為所述等滲劑的具體例子，有氯化鈉或甘油等，作為食品添加物使用的ph調節劑的具體例子，有檸檬酸、葡糖酸、琥珀酸、碳酸鉀、乳酸等，作為穩定劑或增粘劑的具體例子，有角叉菜膠、羧甲基纖維素鈉、黃原膠、瓜爾豆膠、果膠等，作為防腐劑(保存料)的具體例子，有苯甲酸等，作為粘合劑的具體例子，有明膠、澱粉、酪蛋白等，只要是對生物體細胞可以安全地使用的物質，則並不限定於此。
本發明的細胞觀察方法包含將生物體染色劑應用於自受試者獲得的細胞或培養細胞，在多光子雷射顯微鏡下對染色細胞進行觀察。其他方式中，本發明的觀察方法還包含根據所染色的細胞之間的染色性差異、檢測癌病變。
＜新型生物體染色劑的細胞染色特性的評價方法＞
本發明提供對在多光子雷射顯微鏡下的觀察下的生物體染色劑的細胞染色特性、即是否特異性地對癌細胞進行染色、是否特異性地對正常細胞進行染色、或是否對癌細胞和正常細胞均同等地進行染色進行評價的方法。本發明的評價方法中使用的正常細胞和癌細胞優選是來自同一種的哺乳動物細胞，例如癌細胞可以是將癌基因轉染到正常細胞而獲得。作為哺乳動物細胞的例子，可舉出mdck細胞、mdbk細胞、cos-細胞、bsc-1細胞、llc-mk細胞、cv-1細胞、vero細胞、crfk細胞、raf細胞、rk-細胞、tcmk-1細胞、llc-pk細胞、pk15細胞、llc-rk細胞、mdok細胞、bhk-21細胞、cho細胞、ns-1細胞、mrc-5細胞、wi-38細胞、bhk細胞、293細胞、rk-細胞等，但並不限定於此。另外，作為正常細胞，優選在本發明評價方法中使用的細胞為狗腎臟腎小管上皮細胞來源的細胞株即mdck正常細胞，癌細胞為表達癌基因產物rasv12的mdck-gfp-rasv12細胞(rasv12是ras的第12個胺基酸殘基甘氨酸取代成纈氨酸的產物，在大腸癌中30～40％可見突變)。表達癌基因產物rasv12的細胞具有通過添加四環素、與正常細胞相比可以更為優異地使其增殖的性質。
上述評價方法中，優選利用報告基因對癌細胞進行標記，從而可以對報告基因的表達和利用染色劑的染色進行對比，可以確認癌細胞是否被該染色劑特異性地染色。作為報告基因，只要是編碼作為檢測標記物可發揮功能的報告蛋白的基因，則無特別限定，優選可舉出編碼gfp、螢火蟲螢光素酶、β-半乳糖苷酶、海腎螢光素酶、鹼性磷酸酶等蛋白質的基因。這些報告基因中，編碼gfp的基因由於可通過有無螢光的簡單方法進行鑑定、檢測，因此在本發明中優選。
優選將上述報告基因以能夠發揮作用的方式連接在上述癌基因的啟動子上，與上述癌基因的表達聯動地表達。
本發明者們通過上述評價方法進行了1200多種生物體染色劑的評價，結果發現了如下的細胞染色特性：
在多光子雷射顯微鏡觀察下，與正常細胞相比更特異性地對癌細胞進行染色的染色劑：
磺基水楊酸甲氯環素
鹽酸甲烯土黴素
紅汞
固綠fcf
紅色3號(赤蘚紅)
紅色104號(螢光桃紅)
在多光子雷射顯微鏡觀察下，與癌細胞相比更特異性地對正常細胞進行染色的染色劑：
米託蒽醌二鹽酸鹽
阿黴素鹽酸鹽
在多光子雷射顯微鏡觀察下，同等地對正常細胞和癌細胞進行染色的染色劑：
恩波吡維銨
芝加哥天藍6b
玫瑰紅鈉鹽
酸性紅
高紅v80(紫芋色素)
在多光子雷射顯微鏡觀察下，與正常細胞相比更特異性地對癌細胞進行染色的染色劑在與正常黏膜的比較中，更濃地對癌病變部進行染色。通過利用這種染色特異性，可以迅速地探索病變部。特別是，由於癌細胞具有不同於正常細胞的形態特徵，因此根據形態差異，可以區別正常細胞和癌細胞。具體而言，異型性分為結構異型(細胞集團未在基底膜上規整地排列、未形成腺結構等)及細胞異型(各個細胞的大小不同、核大、其位置不均一、極性不均一等)這兩種。目前的內窺鏡難以對直徑5毫米左右的癌進行檢測，但通過在細胞形態可圖像化的多光子雷射顯微鏡下使用本發明的生物體染色劑，即使不進行活體組織檢查、也可通過目視根據形態差異早期地檢測到直徑1毫米左右的癌。正常細胞和癌細胞的區分不僅醫生可以進行、細胞檢查技師等也可進行。
在多光子雷射顯微鏡觀察下，與癌細胞相比更特異性地對正常細胞進行染色的染色劑在與癌病變部的比較中，更濃地對正常黏膜進行染色。通過利用這種染色特異性，可以確認觀察部位是否是病變部。
在多光子雷射顯微鏡觀察下，同等地對正常細胞和癌細胞進行染色的染色劑例如通過在多光子雷射顯微鏡觀察下、與相比較於正常細胞更特異性地對癌細胞進行染色的染色劑組合使用，可以進一步確認病變部位。僅使用對癌細胞特異性染色的染色劑時，有時難以判斷所染色的部位是否是真正患癌的部位。當將與正常細胞相比更特異性地對癌細胞進行染色的染色劑和同等地對正常細胞與癌細胞進行染色的染色劑並用時，可以防止假陰性的判斷，是有利的。
因此，本發明還提供一種細胞染色劑的混合物(cocktail)，該混合物含有下述細胞染色劑：用於在多光子雷射顯微鏡下進行觀察的、與正常細胞相比更特異性地對癌細胞進行染色的染色劑，包含選自磺基水楊酸甲氯環素、鹽酸甲烯土黴素、紅汞、固綠fcf、紅色3號(赤蘚紅)及紅色104號中的1種或多種色素化合物而成的細胞染色劑；和同等地對正常細胞和癌細胞進行染色的染色劑，包含選自恩波吡維銨、芝加哥天藍6b，玫瑰紅鈉鹽、酸性紅及高紅v80(紫芋色素)中的1種或多種色素化合物而成的細胞染色劑。
在多光子雷射顯微鏡下使用上述染色劑檢測到癌時，例如可以使用以下說明的本發明的多光子雷射診斷治療裝置，通過多光子雷射照射進行燒灼、蒸散。此時，直接利用檢測所用的圖像的坐標軸、瞄準待蒸散的癌細胞，提高雷射功率以照射高功率的雷射，從而能夠以一個單位精確定點地僅將腫瘤細胞排除。一般來說，利用黏膜表面塗布進行的多光子雷射顯微鏡細胞圖像化中，雷射功率為3％以下(0.09w)足矣，但在排除癌細胞時，雷射功率可設定為45％(1.35w)左右，關於照射時間，若癌細胞為數個集團則以約2秒鐘的時間可以排除、若癌細胞為數十個集團則以約10秒鐘的時間可以排除。
當蒸散癌細胞時，若並非是照射至細胞整體，而是限定多光子雷射的掃描範圍地對細胞膜的一部分進行雷射照射，則能夠以更少量的光量將細胞破壞。
利用本發明的染色劑進行了可視化的圖像的質量是相比較於利用螢光色素的靜脈內全身給予獲得的共聚焦雷射顯微鏡圖像或者利用無染色自體螢光獲得的多光子雷射顯微鏡圖像相比，是足夠高的畫質。
本發明的色素化合物均可使用市售品。細胞染色劑中的色素化合物的配合量並無特別限定，例如可以在染色劑中配合0.01mg/ml～1mg/ml。優選上述色素化合物能夠以0.1μm～10μm的濃度進行使用。另外，除了上述色素化合物之外，還可含有在內窺鏡檢查等中以往使用的碘等公知的色素。
本發明的色素化合物具有固有的螢光發生活性，均被700nm以上、優選800nm以上的長波長的多光子雷射激發。激發光的觀察在多光子雷射顯微鏡下進行，通過在多光子雷射顯微鏡下進行觀察，能夠實時地進行組織診斷。所使用的多光子雷射只要是能夠產生長波長的雷射，則無特別限定。
染色劑的給予方法並無特別限定，例如可以將本發明的染色劑直接應用於內腔或者進行黏膜下給予，或者還可經口、經靜脈或給予至腹腔內。染色劑的染色性弱時，通過用鏈黴蛋白酶處理黏膜表面，將粘液除去、細胞結構的識別性提高。當將染色劑直接應用於管腔內壁(例如塗布或噴霧)時，劑型優選是液體，也可以以顆粒、片劑等形態進行使用。另外，也可根據劑型等，適當地將必要的追加成分、例如等滲劑、ph調節劑、穩定劑、增粘劑、防腐劑、香料或粘合劑等添加物配合在染色劑中。例如，可以在本發明的染色劑中預先配合鏈黴蛋白酶。
本發明還提供由於能夠基於多光子雷射顯微鏡下使用了生物體染色劑的染色特性來判斷多能幹細胞的分化狀態，因此對再生醫療用移植組織的安全性進行評價的方法。期待ips細胞、es細胞、組織來源的幹細胞等多能幹細胞在再生醫療中的應用-開發，例如由ips細胞製作分化成希望進行移植的組織細胞的細胞集團時，目前在該ips細胞來源的分化誘導組織細胞集團中部分混入了未完全分化成所希望的組織細胞的未分化細胞、分化成所希望的組織細胞以外的細胞的細胞、幾乎完全未分化的原來的ips細胞。這些未分化細胞或原來的ips細胞在直接被移植到生物體內時，將來有發生癌化的可能性。因此，在移植中使用該ips細胞來源的分化誘導組織細胞集團時，優選預先對殘留在移植細胞集團內的未分化細胞或原來的ips細胞進行鑑定確認、進一步將它們排除。通過本發明的方法，只要找出能夠判斷以ips細胞為代表的多能幹細胞的分化狀態或癌化風險的染色劑，則可以防止在移植時ips細胞來源的未分化細胞的混入，在能夠保證移植安全性的方面是極為有效的。這裡，多能性幹細胞也具有未分化細胞的染色特性，例如確認了紅色104號對未分化細胞的染色。
上述方法中，優選利用報告基因預先對多能幹細胞進行標記。作為報告基因可以使用與標記上述腫瘤細胞的基因相同的基因。優選上述報告基因以能夠發揮作用的方式連接於多能幹細胞的多能性標記物的基因的啟動子上，與上述多能性標記物基因聯動地進行表達。作為多能幹細胞標記物並無特別限定，例如有nanog、oct4、tra-1-60、ssea-3、afp等。為了評價多能幹細胞來源的未分化細胞或正常分化細胞是否被特異性地染色，將報告基因導入至多能幹細胞中，根據報告基因的種類不同，在正常分化的細胞中報告基因表達或者僅在未分化細胞中報告基因表達，從而能夠對比利用染色劑進行的染色。這裡，作為在正常分化細胞中表達報告基因的方法，在afp(肝臟)、fox3(神經)、betaiii-tubulin(神經)、neurofilament(神經)、nkx2.5(心肌)、ctnt(心肌)等正常分化細胞的標記物基因的啟動子下遊使用gfp作為報告基因。另外，作為在多能幹細胞及未分化細胞中表達報告基因的方法，在nanog、oct4、tra-1-60、ssea-3等標記物基因的啟動子的下遊使用gfp作為報告基因。
＜腫瘤細胞染色劑＞
本發明中作為色素化合物使用的薑黃色素、硫黃菊素及表沒食子兒茶素沒食子酸酯是黃酮的一種。赤蘚紅(紅色3號)及酸性紅(紅色106號)作為焦油系色素已知。各個色素化合物均可經口給予。這些色素化合物均被多光子雷射強烈地激發、可以提供明亮的生物體細胞圖像。另外，這些色素化合物具有優先地對構成消化道等管腔臟器的特定的細胞結構強烈染色的性質。
這裡，消化道黏膜的細胞構成可以如下分類：由覆蓋食物通過的黏膜表面的上皮細胞和上皮細胞陷入成疣狀並分泌粘液的腺細胞構成的細胞組(第一系列)；由包埋上皮細胞、腺細胞周圍的毛細血管或結締組織細胞構成的細胞組(第二系列)。薑黃色素、硫黃菊素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯及赤蘚紅可以優先地對第一系列的細胞組進行染色。酸性紅可以對第一系列及第二系列這兩細胞組進行染色。另外，顯微鏡下觀察的消化道黏膜的細胞排列根據聚焦面的不同而不同。具體而言，自黏膜表面拉近物鏡時，在其焦點聚焦在黏膜表面時、主要觀察到上皮細胞，在焦點聚焦在深部時、則觀察到腺細胞和結締組織-毛細血管。
此外，上述色素化合物在與正常黏膜的比較中，更濃地對癌病變部進行染色。通過利用這種染色特異性，可以迅速地探索病變部。特別是，由於腫瘤細胞具有不同於正常細胞的形態特徵，因此根據形態差異，可以區別正常細胞和腫瘤細胞。具體而言，異型性分為結構異型(細胞集團未在基底膜上規整地排列、未形成腺結構等)及細胞異型(各個細胞的大小不同、核大、其位置不均一、極性不均一等)這兩種。目前的內窺鏡難以對直徑5毫米左右的癌進行檢測，但通過在細胞形態可圖像化的多光子雷射顯微鏡下使用本發明的染色劑，即使不進行活檢，也可通過目視根據形態差異早期地檢測到直徑1毫米左右的癌。正常細胞和癌細胞的區分不僅是醫生可以進行、細胞檢查技師等也可進行。
在多光子雷射顯微鏡下使用本發明的染色劑檢測到癌時，可以通過多光子雷射照射進行燒灼、排除。此時，直接利用檢測所用的圖像的坐標軸、瞄準待排除的腫瘤細胞，提高雷射功率以照射高功率的雷射，從而能夠以一個單位精確定點地僅將腫瘤細胞排除。一般來說，利用黏膜表面塗布進行的多光子雷射顯微鏡細胞圖像化中，雷射功率為3％以下(0.09w)足矣，但在排除癌細胞時，雷射功率可設定為45％(1.35w)左右，關於照射時間，若癌細胞為數個集團則以約2秒鐘的時間可以排除、若癌細胞為數十個集團則以約10秒鐘的時間可以排除。
當排除癌細胞時，若並非是照射至細胞整體，而是對細胞膜的一部分進行雷射照射，則能夠以更少量的光的量將細胞破壞。
利用本發明的染色劑進行了可視化的圖像的質量與利用螢光色素的靜脈內全身給予獲得的共聚焦雷射顯微鏡圖像或者利用無染色自體螢光獲得的多光子雷射顯微鏡圖像相比，是足夠高的畫質。
本發明的色素化合物均可使用市售品。例如可以使用化學合成的純的薑黃色素、含有薑黃色素的薑黃提取物。或者，還可根據公知的方法從薑黃等中提取。薑黃色素和硫黃菊素可分別單獨使用，但為了獲得不同的染色樣式，也可組合使用。配合量並無特別限定，例如可以在染色劑中配合0.01mg/ml～1mg/ml。優選上述色素化合物能夠以0.1μm～10μm的濃度進行使用。另外，除了上述色素化合物之外，還可含有在內窺鏡檢查等中一直使用的碘等公知的色素。
本發明的色素化合物具有固有的螢光發生活性，均被700nm以上、優選800nm以上的長波長的多光子雷射激發。激發光的觀察在多光子雷射顯微鏡下進行，通過在多光子雷射顯微鏡下進行觀察，能夠實時地進行組織診斷。所使用的多光子雷射只要是能夠產生長波長的雷射，則無特別限定。
本發明的染色劑在體外的細胞觀察中也可使用，例如可以是由受試者通過活檢獲得的細胞或者培養細胞(例如單層培養細胞)。在本說明書中進行使用時，用語「培養細胞」包括各種幹細胞、例如人工多能幹細胞(ips細胞)、muse細胞、胚胎幹細胞(es細胞)、組織幹細胞等培養物。本發明的檢測方法還可應用於在對細胞或es細胞進行分化誘導、製作組織移植細胞時有可能產生的未分化細胞或癌化細胞的檢測和排除。
染色劑的給予方法並無特別限定，例如可以將本發明的染色劑直接應用於內腔或者進行黏膜下給予，或者還可經口、經靜脈或給予至腹腔內。染色劑的染色性弱時，通過用鏈黴蛋白酶處理黏膜表面，將粘液除去，細胞結構的識別性提高。當將染色劑直接應用於管腔內壁(例如塗布或噴霧)時，劑型優選是液體，也可以以顆粒、片劑等形態進行使用。另外，也可根據劑型等，適當地將必要的追加成分、例如等滲劑、ph調節劑、穩定劑、增粘劑、防腐劑、香料或粘合劑等添加物配合在染色劑中。例如，可以在本發明的染色劑中預先配合鏈黴蛋白酶。
＜多光子雷射診斷治療裝置＞
接著，參照附圖說明本發明的多光子雷射診斷治療裝置的實施方式。
首先參照圖1說明本發明的多光子雷射診斷治療裝置的整體構成。多光子雷射診斷治療裝置11具備雷射振蕩器13、光束直徑調節器15、二維掃描器17、分色鏡19、物鏡21、聚光深度調節器23、光檢測器25、螢光圖像生成裝置27、監視器29和控制裝置31。
雷射振蕩器13可以射出超短脈衝雷射(以下僅記載為脈衝雷射)、調整脈衝雷射的強度。作為雷射振蕩器13，使用能夠在脈衝寬度度為數十～數百飛秒、脈衝的反覆頻率為數十～數百mhz的範圍調節脈衝雷射的功率的雷射振蕩器。另外，雷射振蕩器13隻要是例如在波長800nm下能夠輸出3.2w的脈衝雷射即可。此外，脈衝雷射例如優選是能夠輸出波長680～1100nm的範圍者。其中，多光子吸收現象中，產生具有所入射的光子的波長一半波長的光子，為了防止產生對人體有害的紫外線域(波長小於400nm)的光子，則優選使用800nm以上波長的脈衝雷射。
光束直徑調節器15按照根據來自控制裝置31的光束直徑調節信號來改變脈衝雷射的光束直徑的方式構成。作為光束直徑調節器15，例如可以使用光束擴展器。
二維掃描器17根據來自控制裝置31的驅動信號使對患者對象部位的超短脈衝雷射的聚光位置沿垂直於光軸的2軸方向變化。二維掃描器15例如由2張電流計鏡(galvanometermirror)構成，根據驅動信號在相互直行的2根光軸周圍搖動，從而進行二維掃描。
分色鏡19是用於對通過脈衝雷射的照射而在患者的組織中產生的螢光進行分離而設置的。這裡，使用具有以下特性者：對與照射於患者組織的脈衝雷射的波長相同的光進行反射、而使其他波長的光透過的特性。因此，從二維掃描器17送出的脈衝雷射通過分色鏡19向物鏡21反射，而在組織中產生的螢光則透過分色鏡19。如此，在組織中產生的螢光被分色鏡19分離。
物鏡21將由二維掃描器17導入、被分色鏡19反射的脈衝雷射聚光至患者組織的聚光位置，另一方面利用多光子吸收現象將在患者組織中產生的螢光聚光、導向分色鏡19的方向。其中，物鏡21可根據控制信號、通過聚光深度調節器23向光軸方向移動，可以調節聚光位置。分色鏡19及物鏡21還包含其間的光路而構成光學系統。另外，二維掃描器17及聚光深度調節器23構成了聚光位置變位裝置。
為了在組織中引起多光子吸收，需要提高光子密度至多個光子同時衝撞於對象物的程度。因此，即使是低強度的脈衝雷射，也易於製成高光子密度的狀態，因此物鏡21優選使用開口數大者。另外，由於僅在聚光位置產生引起多光子吸收現象的程度的光子密度高的狀態，因此多光子吸收現象僅在聚光位置發生、在其他區域內不會發生。使用開口數大的物鏡21時，可以極度地減小多光子吸收現象發生的範圍，因此能夠以細胞單位選擇性地進行破壞。物鏡21的開口數優選為0.6以上、為了能夠進行細胞單位的破壞，更優選為1.0以上。
光檢測器25對組織中產生的螢光進行檢測，變換成對應螢光強度的電信號。作為光檢測器25，可以使用光電子倍增管(pmt)等。
二維掃描器17的掃描狀態及聚光深度調節器23的調節位置(深度方向的位置)成為表示聚光位置的坐標的參數，螢光圖像生成裝置27將表示這些坐標的參數和由光檢測器25發出的電信號(即螢光強度)相對應地進行記憶，對這些數據進行處理，生成螢光圖像。將所生成的螢光圖像顯示在監視器29上。
控制裝置31包含動作控制部33、診斷用脈衝強度設定部35、治療用脈衝強度設定部37、照射範圍設定部39和照射時間設定部41。動作控制部33對雷射振蕩器13、光束直徑調節器15、二維掃描器17、聚光深度調節器23的動作進行控制。診斷用脈衝強度設定部35為了進行診斷、按照雷射振蕩器13輸出適於獲得患者組織的螢光圖像的強度的脈衝雷射的方式設定脈衝雷射強度，治療用脈衝強度設定部37為了進行治療、按照雷射振蕩器13輸出對於破壞患者組織而言足夠的強度(比診斷用脈衝雷射強度大)的脈衝雷射的方式設定脈衝雷射強度。診斷用脈衝強度設定部35及治療用脈衝強度設定部37所設定的脈衝雷射強度可以使用預先設定的值，也可使用未圖示的輸入手段(例如鍵盤等)根據使用者的情況適當地進行設定。照射範圍設定部39進行在患者組織中照射治療用脈衝雷射強度的脈衝雷射的範圍的設定，通過動作控制部33控制二維掃描器17或聚光深度調節器23的動作，從而以所設定的照射範圍及深度將治療用脈衝雷射強度的脈衝雷射照射、聚光。照射範圍設定部39所設定的照射範圍可以通過在利用將診斷用脈衝雷射強度的脈衝雷射照射至患者的組織所獲得並顯示在監視器29上的螢光圖像上，使用者使用未圖示的輸入手段(滑鼠等)對範圍進行指定來設定。螢光照射時間設定部41設定將治療用脈衝雷射強度的脈衝雷射照射至患者組織的照射範圍的時間、通過動作控制部33控制雷射振蕩器13的功率，從而僅在所設定的時間內，將治療用脈衝雷射強度的脈衝雷射照射至由照射範圍設定部39所設定的照射範圍。作為被照射時間設定部41設定的照射時間，可以使用預先設定的值，也可使用未圖示的輸入手段(鍵盤等)由使用者適當地進行設定。
本發明的多光子雷射診斷治療裝置11可以以多種形態實現。例如，如圖2所示，在雷射照射頭43內設置光束直徑調節器15、二維掃描器17、由分色鏡19、物鏡21和其間的光路所構成的光學系統、以及聚光深度調節器23，同時設置用於載置患者的患者固定臺45和移動裝置47，利用移動裝置47使雷射照射頭43與患者固定臺45相對地移動。如此，只要是能夠使雷射照射頭43和患者固定臺45在獨立的3軸方向上相對移動，則雷射對患者患部附近的照射變得容易。另外，如圖3所示，可以用內窺鏡49將分色鏡19與物鏡21之間的光路的一部分替換，同時在內窺鏡49的前端配置物鏡21及聚光深度調節器23。為這種構成時，能夠通過低侵襲的內窺鏡手術進行體內部位的癌診斷及治療、可減輕患者身體的負擔。
圖4表示上述圖1中包含物鏡21的光學系統的詳細內容。圖4顯示物鏡50的周圍被筒狀的屏蔽構件51覆蓋，該屏蔽構件通過與待觀察的組織52的周邊進行壓接、形成將該光學系統密封的空間53。此外，該屏蔽構件具備用於調節該空間內壓力的通氣口54、55。通氣口54、55例如連接於真空泵等吸引手段上，通過使上述空間內為負壓，提高該屏蔽構件與組織的密合性，其結果即使是患者的微小的動作、也可保持物鏡與觀察組織的相對位置關係，防止圖像的偏移等。在圖像拍攝或手術結束後，通過釋放通氣口54、55，所述空間內的負壓狀態恢復至常壓、可以使光學系統50從組織上脫離。通氣口54、55可以是1個或多個，為多個時，使1個持久地連接在吸引手段上、通過開關其他的通氣口容易地調節空間內的空氣壓。
優選該屏蔽構件進一步具備用於向所述空間內供給及排液含有用於對組織進行染色的染色劑的染色液及用於洗滌該染色液的洗滌液的給液口56及排液口57。該給液口56及排液口57可以相同也可不同，而且該給液口56及排液口57還可兼為所述通氣口54、55。優選方式中，染色液介由給液口56導入到所述空間中對組織進行染色，之後介由排液口57對該染色液進行排液，若需要，則介由與上文相同或不同的給液口56將洗滌液導入至所述空間中，由與上文相同或不同的排液口57進行排液，從而對組織進行洗滌。
密封構件的材質並無特別限定，可以是合成橡膠、天然橡膠、氟橡膠、氨基甲酸酯橡膠、有機矽橡膠、環氧樹脂、有機矽樹脂、酚醛樹脂、蜜胺樹脂、尿素樹脂、聚醯胺樹脂、聚醯亞胺樹脂、聚氨酯樹脂、聚苯硫醚樹脂、聚對苯二甲酸丁二醇酯樹脂、聚醯胺醯亞胺樹脂等。優選是提高屏蔽構件與組織的密合性的合成橡膠、天然橡膠、氟橡膠、氨基甲酸酯橡膠、有機矽橡膠等彈性彈性體。圖4中，物鏡50固定顯示在屏蔽構件51的上表面，可電磁性地進行調整。為了電磁性地進行調整，利用橡膠或彈簧等彈性構件支撐屏蔽構件的物鏡固定部與物鏡之間，將使用了磁鐵和線圈的往復運動氣缸設置在x軸(正交於光軸的水平1方向)、y軸(正交於光軸、水平1的水平2方向)、z軸(光軸方向)這3軸方向上，從而得以實現。如此通過追加往復運動氣缸，可以利用來自外部的電流進行控制，能夠以更高精度、大範圍地進行檢查、分析、蒸散的操作。圖3中的二維掃描器17可作為物鏡的位置變更用使用、上述往復運動氣缸可作為屏蔽構件內的掃描調整用使用。上述往復運動氣缸也可以並非是3軸，只要至少具有1軸則有效。
圖5表示以光學系統的周圍被筒狀屏蔽構件51覆蓋的狀態存在的內窺鏡61。圖5中63是插入部、為了光滑地通過消化器設為柔軟的結構。64是鑷子口、65是鑷子、66簡化顯示左右上下的彎角鈕操作部。67是進行能見度調節等的接眼部、68是目鏡部、69是送氣、送水操作部、70是吸引操作部、71是與檢查器主體(未圖示)的連接部、71是導光管，在其附近以能夠與檢查器主體相連接的方式構成送氣口、染色劑插入口、染色劑吸引口等。這裡，內窺鏡前端部62的光學系統50的物鏡周圍被筒狀屏蔽構件51覆蓋，以在與圖4的關係中說明的那樣，該屏蔽構件與待觀察的組織的周邊壓接、形成將該光學系統密封的空間(圖4的53)，此外該內窺鏡61的屏蔽構件仍如在與圖4的關係中說明的那樣，具備連接於能夠調節該空間內壓力的內窺鏡所具備的吸引手段的通氣口54、55，從而使上述空間內為負壓、提高該屏蔽構件與組織的密合性，其結果，即使是患者的微小動作、也可保持物鏡與觀察組織的相對位置關係，防止在用內窺鏡檢查或手術中的圖像的偏移等。在圖像拍攝或手術結束後，通過釋放通氣口54、55，所述空間內的負壓狀態恢復至常壓、可以使光學系統50從組織上脫離。上述操作可以使操作按鈕集中在69送氣、送水操作部、70吸引操作部，由於染色操作是準備過程，因此與患部拍攝、蒸散、削除手術操作不同，可以利用設置在檢查器主體側的操作按鈕類進行。通過使用這種內窺鏡，較以往內窺鏡手術精度更好的癌等病理組織的發現以及消除手術變為可能。
接著，對圖1所示的多光子雷射診斷治療裝置11的動作進行說明。
首先，在診斷時以控制裝置31的診斷用脈衝強度設定部35所設定的脈衝雷射強度從雷射振蕩器13輸出脈衝雷射，根據來自控制裝置31的動作控制部33的動作指令，通過光束直徑調節器15調節至規定的光束直徑。調節至規定的光束直徑的脈衝雷射根據來自控制裝置31的動作控制部33的動作指令，通過二維掃描器17按照進行二維掃描的方式控制規定範圍、同時被導入至分色鏡19並向物鏡21反射。通過物鏡21聚光的脈衝雷射在聚光位置為患者組織內的規定深度的2維平面上進行掃描。其中，脈衝雷射的聚光位置根據來自控制裝置31的動作控制部33的指令，在患者的組織中調節至預先規定的深度。
在患者的組織中，在聚光位置發生多光子吸收現象、將螢光激發。還可以將患者的細胞所含的核黃素激發、發出螢光，但所得螢光的強度弱、螢光圖像的對比度會降低。因此，為了提高所得螢光圖像的對比度，優選預先利用染色劑對組織的表面進行染色、使染色的色素激發、發出螢光。另外，當在患者的患部組織表面塗布染色劑、進行染色之後，利用多光子吸收現象獲得螢光圖像時，由於因多光子吸收現象自染色劑的色素分子發出的螢光強度比因多光子吸收現象自細胞內的核黃素髮出的螢光強度還高，因此，使用小強度的脈衝雷射即可獲得更為鮮明的圖像。因而，可以將診斷用脈衝雷射強度設定得較低。具體而言，在組織的表面塗布染色劑之後獲得螢光圖像時，可以在不塗布染色劑的情況下，以獲得螢光圖像時的脈衝雷射強度的1/10以下的脈衝雷射強度獲得同水平的螢光圖像。由此，能夠將脈衝雷射對患者組織造成的不良影響也抑制在最小限。
作為染色劑，可以使用螢光素、吲哚菁綠(icg)、靛藍胭脂紅等已被認可的螢光劑，優選使用對人體的安全性高的食用色素等。特別是，作為發明者發現獲得了鮮明的圖像的色素，例如可舉出赤蘚紅、薑黃色素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、硫黃菊素、酸性紅等。
分色鏡19由於具有對與照射至患者組織的脈衝雷射的波長相同的光進行反射而使其他波長的光透過的特性，因此在入射的光中，對脈衝雷射的反射光進行反射而使自組織發出的螢光透過，將螢光分離。所分離的螢光入射到光檢測器25中被檢測、變換成對應強度的大小的電信號。螢光圖像生成裝置27根據所變換的電信號和二維掃描器17及聚光深度調節器23的動作狀態，與聚光位置信息相關聯，生成螢光圖像，顯示在監視器29上。
另一方面，在治療時以控制裝置31的治療用脈衝強度設定部37所設定的脈衝雷射強度、從雷射振蕩器13輸出脈衝雷射，根據來自控制裝置31的動作控制部33的動作指令，通過光束直徑調節器15調節至所需的光束直徑。其中，治療用脈衝雷射強度在脈衝雷射的聚光位置的組織中，對於發生因多光子吸收現象導致的破壞具有足夠的高度，相比較於診斷用脈衝雷射強度、更高地進行設定。調節至規定的光束直徑的脈衝雷射按照對控制裝置31的照射範圍設定部39所設定的照射範圍進行掃描的方式，根據來自控制裝置31的動作控制部33的動作指令，一邊由二維掃描器17進行控制、一邊導入至分色鏡19中向物鏡21反射。由物鏡21聚光的脈衝雷射在聚光位置為患者組織內的規定深度的二維平面上、對由照射範圍設定部39所設定的照射範圍進行掃描。聚光位置可以通過由控制裝置31的動作控制部33控制的聚光深度調節器23來控制。如此，通過對所期望的照射範圍照射脈衝雷射，將照射範圍的組織的細胞破壞、將癌細胞排除。
這裡，利用多光子吸收現象將組織或細胞破壞的原因在於，由於多光子吸收現象，細胞內的分子發生離子化而產生等離子體，從而將細胞的細胞膜破壞。
其中，在治療時通過在聚光位置的組織或細胞中產生多光子吸收現象，將組織或細胞破壞。因此，需要將足以發生破壞的能量賦予給組織或細胞。因而，按照根據所照射的脈衝雷射的強度、由控制裝置31的照射時間設定部41設定照射時間並僅對照射範圍照射所設定的時間的方式，由控制裝置31的動作控制部33進行控制。照射時間從照射時間設定部41所預先設定的值中進行選擇，使用者也可以通過輸入至照射時間設定部41來設定為適當的值。
通過使用開口數大的物鏡，由於能夠以細胞單位控制多光子吸收現象的發生，因此在診斷時能夠獲得患者的患部組織的高解析度的螢光圖像，即使是小的癌細胞或癌組織，也易於與正常組織相區別。由此，癌細胞或癌組織的發現變得容易。另外，將在診斷時獲得螢光圖像時的二維掃描器17及聚光深度調節器23的動作狀態和所檢測的螢光強度相關聯，將螢光圖像上發現的癌病變部位設定在照射範圍中，以治療用脈衝雷射強度照射脈衝雷射，則可以準確地破壞所指定的照射範圍內的癌病變部位。此外，若使用開口數大的物鏡，則能夠以單位細胞以下的尺寸範圍進行脈衝雷射的照射，因此細胞單位的破壞成為可能。
下面，對使用利用了波長800nm下的峰值功率為3.2w的雷射振蕩器13和開口數為1.05的物鏡21的多光子雷射診斷治療裝置11進行癌症診斷及治療的順序進行說明。
優選預先對患者的診斷對象組織的表面塗布染色劑。通過在組織表面塗布染色劑，發生癌病變的組織相比較於正常組織被色素強烈染色、正常組織與癌病變組織的螢光差異增大，從而易於發現癌病變部位。認為其原因在於在正常組織中，細胞黏附強、細胞間的間隙幾乎沒有，而在癌病變部中，細胞之間的黏附弱、在細胞間多有間隙，染色劑易於滯留在其間隙中。作為染色劑，優選使用對人體的安全性高的食用色素等，特別是作為增大正常組織與癌病變組織的螢光差異的染色劑，例如優選使用赤蘚紅、薑黃色素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、硫黃菊素、酸性紅等。
接著，以控制裝置31的診斷用脈衝強度設定部35所設定的脈衝雷射強度、利用物鏡21將由雷射振蕩器13輸出的脈衝雷射聚光至患者的患部組織內的聚光位置，利用二維掃描器17使聚光位置在垂直於光軸的二維平面上掃描。組織內的聚光位置通過利用控制裝置31的動作控制部33控制聚光深度調節器23的動作，可以調節至各種深度。如此，利用光檢測器25檢測通過對患者的組織照射脈衝雷射、引起多光子吸收現象所獲得的螢光，將所檢測的螢光強度與由二維掃描器17及聚光位置深度調節器23的狀態獲得的表示聚光位置的參數(即坐標)關聯地進行處理，從而可以獲得螢光圖像，將所得螢光圖像顯示在監視器29上。
醫生可以基於癌細胞與正常細胞的螢光圖像的形態差異、根據監視器29上的螢光圖像判斷是否是癌細胞或組織來進行診斷。本發明者發現在組織的表面塗布染色劑、將組織染色從而獲得螢光圖像的情況下，發生癌病變的組織比正常組織被更濃地染色、可獲得更強的螢光。認為其原因在於，在正常組織中細胞黏附強、幾乎沒有細胞間的間隙，而在癌病變部中細胞之間的黏附弱、細胞間多有間隙，染色劑易於滯留在該間隙中。利用這種現象，癌病變組織相比較於正常組織發出更強的螢光，根據螢光強度的對比易於發現正常組織與癌病變組織的差異，診斷變得容易。另外，染色劑的色素分子與細胞內核黃素相比，通過多光子吸收現象、發出了更高強度的螢光，因此若使用染色劑，則與未使用染色劑的情況相比，使用低強度的脈衝雷射即可獲得鮮明的螢光圖像。因此，可以將診斷用的脈衝雷射強度設定得較低。
具體而言，在組織的表面塗布染色劑以獲得螢光圖像時，可以在不塗布染色劑的情況下，以獲得螢光圖像時的脈衝雷射強度的1/10以下的脈衝雷射強度獲得同水平的螢光圖像。例如，當使用功率為3.2w的雷射振蕩器13和開口數為1.05的物鏡21進行螢光圖像診斷及治療時，治療用脈衝雷射強度的設定值無論是未進行利用染色劑的色素染色還是進行利用染色劑的色素染色，均是最高功率的50％，但為了獲得同程度的螢光圖像，診斷用脈衝雷射強度的設定值在未進行色素染色時為20％，而進行色素染色時則為3％以下(1％左右)就足夠了。
此外，當欲檢測來自細胞內核黃素的螢光時，所照射的脈衝雷射的波長需要是735nm前後，因此所產生的螢光的波長約為370nm、發出紫外線，有導致細胞的dna損傷的可能。與其相對，利用染色劑進行染色時，以800nm以上波長的脈衝雷射即可產生螢光，還具有可抑制紫外線發生的優點。
由醫生確定癌病變部位時，利用多光子吸收現象、將確定的癌病變部位的腫瘤細胞破壞。詳細地說，通過在監視器29中顯示的螢光圖像上指定所期望的治療範圍，由照射範圍設定部39設定照射範圍，按照達到與獲取螢光圖像時的聚光深度為相同深度的方式、利用聚光深度調節器23進行調節，並按照以控制裝置31的治療用脈衝強度設定部37所設定的脈衝雷射強度將由雷射振蕩器13輸出的脈衝雷射聚光在患者組織的聚光位置上、對所設定的照射範圍僅照射由控制裝置31的照射時間設定部41所設定的時間的方式，利用二維掃描器17進行掃描。當將治療用脈衝雷射強度設定為最高功率的50％時，若為數個左右的細胞則能夠以約2秒的照射進行破壞，若為數十個細胞的集團時則能夠以約10秒的照射進行破壞。
通過利用物鏡21將比診斷用脈衝雷射強度還高的治療用脈衝雷射強度的脈衝雷射聚光在聚光位置上，在聚光位置的組織中，利用多光子吸收現象將組織或細胞破壞。另外，通過對在診斷時所用螢光圖像上確定的範圍照射治療用脈衝雷射強度的脈衝雷射，將該範圍的組織或細胞破壞，因此能夠將指定範圍內的癌病變部位準確地破壞。此外，若使用開口數大的物鏡21時，則能夠以單位細胞以下的尺寸範圍進行脈衝雷射的照射，因此可以破壞細胞單位。
優選在治療後，通過再次在治療部位的組織表面塗布染色劑，然後以診斷用脈衝強度設定部35所設定的脈衝雷射強度將脈衝雷射照射至治療部位的組織，檢測所發生的螢光，從而生成螢光圖像，通過所生成的螢光圖像，確認已將癌病變部位破壞、排除。
當未利用染色劑進行組織的染色時，診斷用脈衝雷射強度需要是脈衝雷射的最高功率的20％以上，與治療用脈衝雷射強度(最高功率的50％左右)的差異小，當在診斷時和確認時的2次均進行脈衝雷射的照射時，則對於癌病變部位周圍的正常細胞、脈衝雷射的照射量也增多，正常細胞也發生光損傷的可能性提高。與其相對，利用染色劑進行組織的染色時，由於可以將診斷用脈衝雷射強度設為脈衝雷射的最高功率的3％以下，因此可以大幅度降低正常細胞的光損傷發生的可能性。
以上參照圖示的實施方式說明了本發明的多光子雷射診斷治療裝置11，但本發明並不限定於所圖示的實施方式。例如，使用者也可在控制裝置31中設定診斷時的脈衝雷射的照射時間。
本發明的多光子雷射診斷治療裝置11所提供的能夠破壞組織中的數個腫瘤細胞的功能在針對ips細胞、es細胞、組織幹細胞的再生醫療應用的培養過程中，也可利用於通過癌化細胞或未分化細胞的檢測及排除的移植細胞的品質管理。
以下舉出具體例子更為具體地說明本發明。需要說明的是，本發明並不限定於此。
實施例1
1.色素化合物的染色性評價
對8周齡的c57b6小鼠(雄性、約20g)給予含2％(w/v)葡聚糖硫酸鈉(dss)的飲水7日。將5％水合氯醛0.2ml腹腔內注射以實施麻醉，然後將小鼠的腹壁縱向切開約1cm，將消化道在腹壁上提起約1cm。這裡，流向消化道的血流由流入腸繫膜附著部的血管維持。將消化道在腸繫膜附著部的相反側包含肌層和黏膜地縱向切開約1cm。切開腸繫膜附著部的相反側是為了防止血管的切斷/損傷、使出血達到最小限。將消化道的切開部位上下打開時，在內部可看到作為食物通路的消化道黏膜面。這裡，有食物消化物時，用紙巾擦去。
為了進一步清楚地觀察消化道黏膜面，在黏膜面上滴加1％鏈黴蛋白酶溶液、靜置15分鐘。通過該鏈黴蛋白酶處理將黏膜表面的粘液除去、細胞結構變得易於觀察。接著，從黏膜表面上將鏈黴蛋白酶除去、用生理鹽水(pbs)進行洗滌。
將金屬環(外形為16毫米、內徑為6毫米)放在實驗臺上，在單側面整周地塗布瞬間粘合劑(aronalpha)。使用小鑷子保持以使塗布有瞬間粘合劑的金屬環低於粘合劑塗布面，靜置在經過鏈黴蛋白酶處理的黏膜面上。利用瞬間粘合劑將金屬環固定在黏膜上約5分鐘，利用pbs對應用色素化合物的區域進行洗滌。
按照黏膜表面不乾燥的方式，在經過鏈黴蛋白酶處理的黏膜面上一滴滴地滴加用生理鹽水(pbs)稀釋了薑黃色素儲備溶液或硫黃菊素儲備溶液所獲得的溶液(稀釋倍率參照表1～3)，靜置1分鐘，用pbs洗滌3次，在金屬環上載置蓋玻片，從蓋玻片上方拉近多光子雷射顯微鏡(奧林巴斯公司制fv1000mpe)的物鏡，觀察圖像。
評價色素化合物中使用的條件等及評價結果示於下表。
◎：具有對圖像診斷而言為理想的亮度和對比度的圖像；○：具有對圖像診斷而言為充分的亮度和對比度的圖像；×：具有對圖像診斷而言為不充分的亮度和對比度的圖像；△為○與×的中間狀態
令人吃驚的是，與有無黏膜表面的鏈黴蛋白酶處理無關，薑黃色素、硫黃菊素、紅色3號(赤蘚紅)等多種色素相比較於正常黏膜、更為顯著地將癌病變部強烈染色。並非是為了在理論上進行限定，作為將癌病變部強烈染色的理由，可舉出由於相對於細胞黏附強、幾乎沒有細胞間的間隙的正常黏膜，在癌病變部中細胞之間的黏附弱、細胞間多有空隙，因此色素易於殘留在其間隙中。作為第二可能性，考慮細胞分裂早的癌細胞的細胞外親油性物質(多數色素具有良好地溶於油的性質)的攝入活性比正常細胞高。
2.強烈被激發而提供明亮的生物體細胞圖像的色素
在上述色素化合物中，當將特定的化合物塗布在小鼠大腸的黏膜表面時，被多光子雷射被強烈地激發而提供明亮的圖像。特別是對於獲得明亮圖像的色素化合物，將螢光圖像名單示於圖6。從色素化合物的給予到進行觀察的順序如上述染色性評價的項目所記載的那樣進行(以下同樣)。另外，色素在黏膜表面的給予濃度僅在色素編號1號的薑黃色素時為5mg/ml、其他色素全部為1mg/ml。
3.優先地對上皮細胞-腺細胞系進行染色的色素
確認優選地對上皮細胞-腺細胞系進行染色的各種色素，作為代表例將色素編號1號的薑黃色素或色素編號2號的硫黃菊素的染色樣式示於圖7。這些色素將上皮細胞-腺細胞系強烈染色，將結締組織-毛細血管系淡淡地染色。另外，色素編號3號的表沒食子兒茶素沒食子酸酯、色素編號4號的紅色3號(赤蘚紅)、色素編號9號的紅色104號(螢光桃紅)、色素編號15號的吲哚菁綠、色素編號27號的錦葵色素、色素編號28號的β胡蘿蔔素、色素編號32號的高紅bl、色素編號33號的6-姜辣素、色素編號35號的楊梅酮、色素編號36號的トリセニジン、色素編號37號的甲花翠素也將上皮細胞-腺細胞系優先地染色(結果未示出)。
4.優先地對結締組織-毛細血管系進行染色的色素
確認了優先地對結締組織-毛細血管系進行染色的各種色素，作為代表例，將色素編號14號的胭脂樹紅和色素編號34號的槲皮素的染色樣式示於圖8。這些色素將結締組織-毛細血管系強烈染色，將上皮細胞-腺細胞系淡淡地染色。另外，色素編號10號的藍色2號、色素編號16號的梔子黃色素、色素編號17號的藏紅花素g-150、色素編號18號的羥基紅花黃色素、色素編號24號的刺槐定、色素編號31號的高紅v80、色素編號34號的槲皮素也對結締組織-毛細血管系優先地進行染色。
5.對上皮細胞-腺細胞系和結締組織-毛細血管系這兩者進行染色的色素
還確認對上皮細胞-腺細胞系和結締組織-毛細血管系這兩者進行染色的色素，作為代表例，將色素編號5號的紅色106號或色素編號6號的綠色3號的染色樣式示於圖9。為色素編號5號的紅色106號時，將上皮細胞-腺細胞的細胞膜和結締組織-毛細血管系強烈地染色。為色素編號6號的綠色3號時，將一部分腺細胞和結締組織-毛細血管系強烈地染色。
實施例2
作為超早期癌模型的mdck-rasv12癌化細胞小集團體外分析系統
(材料)
·狗腎臟腎小管上皮細胞來源的細胞株即mdck正常細胞。
·表達使屬於綠色螢光蛋白的gfp與恆常活化的癌基因產物rasv12融合而成的gfp-rasv12的mdck-gfp-rasv12細胞(rasv12是ras的第12號胺基酸殘基甘氨酸替換成纈氨酸而成的、大腸癌中30～40％可見突變)。
·帶酚紅dmem(高糖)(和光純藥)
·無酚紅dmem(高糖)(和光純藥)
·四環素系統專用胎牛血清(clontech)
·青黴素/鏈黴素(x100)(nacalaitesque)
·glutamax(x100)(invitrogen)
·胰蛋白酶(0.25％)(無酚紅、invitrogen)+edta(3mm)(nacalaitesque)
·博來黴素(100mg/ml、invivogen)
·殺稻瘟素(blasticidin)(10mg/ml、invivogen)
·四環素(sigma)/100％ethanol(100mg/ml)
·10cm培養皿(bdfalcon)
·6cm培養皿(bdfalcon)
·96-孔培養皿(lumox(註冊商標)multiwell96、sarstedt)
·dmso(nacalaitesque)
·美國fda(foodanddrugadministration)已認可的化合物prestwickhemicallibrary(1200種)
·日本厚生勞動省已認可的食品添加物(30種)
·多光子雷射顯微鏡(fv1000mpe、olympus)
(方法)
在10cm培養皿中培養mdck正常細胞、在6cm培養皿中培養mdck-gfp-rasv12細胞。培養液為：mdck正常細胞使用dmem(帶酚紅)+10％fbs+青黴素/鏈黴素、mdck-gfp-rasv12細胞使用dmem(帶酚紅)+10％fbs+青黴素/鏈黴素+博來黴素(400μg/ml)+殺稻瘟素(5μg/ml)。均在達到約90％匯合(密集度)時，利用胰蛋白酶(0.25％)+edta(3mm)將各個細胞從培養皿剝離，按照mdck正常細胞與mdck-gfp-rasv12細胞的比率達到50～100：1的方式接種於96孔培養皿中。此時，按照每1孔達到1.0～3.0×104個細胞的方式，使用dmem+10％fbs+青黴素/鏈黴素的培養液進行接種。接種1.0×104個時，在4天後將2μg/ml濃度的四環素添加在培養液中，在接種3.0×104個時，在1天後將2μg/ml濃度的四環素添加在培養液中，使gfp-rasv12表達，在mdck正常細胞中形成癌化細胞小集團(非專利文獻4)。在18～36小時後，用200μl的pbs對各孔的細胞進行洗滌，將用100μl容量的pbs稀釋至1μm的各個prestwickchemicallibrary化合物及厚生勞動省已認可的食品添加物添加在各孔中，在室溫下使細胞攝入5分鐘。之後用200μl的pbs洗滌3次，根據情況進一步用100μl的無酚紅dmem洗滌1次，然後用多光子雷射顯微鏡進行觀察。在紅色可見光區域，從化學庫(chemicallibrary)所含的1200種化合物及厚生勞動省已認可的食品添加物中探索-鑑定脈衝雷射子通過逐步的750、800、850以及900nm區域的激發、相比較於正常細胞更濃地對gfp-rasv12陽性的癌化細胞小集團進行標記的化合物，或者相比較於癌化細胞小集團更濃地對mdck正常細胞進行標記的化合物。
(結果)
從1200種prestwickchemicallibrary中，作為通過750、800、850以及900nm的所有區域的光子激發而在紅色可見光下相比較於正常細胞更濃地對gfp-rasv12陽性的癌化細胞小集團進行標記、即顯示更強螢光的化合物，鑑定了磺基水楊酸甲氯環素、鹽酸甲烯土黴素、紅汞這3種(圖10、11、12)。說明圖10～圖12的螢光狀態。圖10是磺基水楊酸甲氯環素的評價結果，上部顯示其結構式。該圖為使用850nm的雷射進行評價的圖、左端所示的「gfp」圖是通過mdck-gfp-rasv12細胞鮮明地觀察到綠色螢光的結果。圖10「磺基水楊酸甲氯環素」所示的中央的圖是鮮明地觀測到通過磺基水楊酸甲氯環素染色的紅色螢光的結果。這裡，紅色的螢光由於通過多光子雷射以具有寬度的波長使其發光，因此是利用紅色濾波器以紅色螢光為中心進行提取而得到的圖。圖10中右端的「融合」所示者是將上述「gfp」與「磺基水楊酸甲氯環素」重疊而得到的圖。這裡，專利說明書中的黑白顯示可能難以把握其精度，但可知「gfp」所示的mdck-gfp-rasv12細胞與利用磺基水楊酸甲氯環素染色獲得的螢光是精度非常好地進行了重疊。由此可知，利用磺基水楊酸甲氯環素的染色可準確地通過螢光顯示癌細胞。圖11是作為染色劑使用鹽酸甲烯土黴素、圖12是作為染色劑使用紅汞進行同樣評價而得到的圖，兩圖的左端「gfp」均是綠色、中央的利用染色劑獲得的圖可觀測到紅色的螢光，圖10同樣在右端的「融合」中顯示圖10同樣精度良好地重疊、為帶紅色的綠色(接近於黃色的發光色)。可知利用鹽酸甲烯土黴素、以及紅汞進行的染色也準確地通過螢光顯示癌細胞。另外，作為通過750、800、850以及900nm的所有區域的光子激發、與癌化細胞小集團相比對mdck正常細胞更濃地進行標記的化合物，為米託蒽醌二鹽酸鹽以及阿黴素鹽酸鹽這2種(圖13、14)，圖13～圖14的螢光狀態與圖10～圖12不同，僅正常細胞通過染色顯示螢光，兩圖中央的照片由於正常細胞顯示紅色的螢光，因此可知未顯示螢光的部位為癌細胞。作為將癌化細胞小集團和正常細胞這兩者標記的化合物，鑑定了恩波吡維銨以及芝加哥天藍6b這2種(圖15、16)。關於圖15～圖16的螢光狀態，可知左「gfp」為使腫瘤細胞發出綠色螢光，中央「恩波吡維銨」、「芝加哥天藍」在正常細胞、腫瘤細胞中均發出紅色的螢光。從厚生勞動省已認可的食品添加物中，作為通過750、800、850以及900nm的所有區域的光子激發並在紅色可見光下相比較於正常細胞更濃地對gfp-rasv12陽性的癌化細胞小集團進行標記的化合物，鑑定了固綠fcf、赤蘚紅以及螢光桃紅這3種(圖17、18、19)。圖17～圖19中，可知各中央的圖為腫瘤細胞發出強螢光而被觀察到。另外，作為將癌化細胞小集團和正常細胞這兩者標記的化合物，鑑定了玫瑰紅鈉鹽、酸性紅以及高紅v80(紫芋色素)這3種(圖20、21、22)。圖20～圖22的各中央的圖中，可知正常細胞、癌細胞均發出紅色螢光。
即，作為相比較於正常細胞更濃地對gfp-rasv12陽性的癌化細胞小集團進行標記的化合物，鑑定了磺基水楊酸甲氯環素、鹽酸甲烯土黴素、紅汞、固綠fcf、赤蘚紅以及螢光桃紅這6種，作為相比較於癌化細胞小集團更濃地對mdck正常細胞進行標記的化合物，鑑定了米託蒽醌二鹽酸鹽、以及阿黴素鹽酸鹽這2種，作為對癌化細胞小集團和正常細胞這兩者進行標記的化合物，鑑定了恩波吡維銨、芝加哥天藍6b、玫瑰紅鈉鹽、酸性紅以及高紅v80(紫芋色素)這5種。
從fda已認可的化合物1200種的prestwickchemicallibrary中鑑定的化合物全部以1μm濃度的染色劑將細胞染色。另外，從厚生勞動省已認可的食品添加物中鑑定的食品添加物全部以1mg/ml的濃度將細胞染色。如上所述，通過將發出對癌細胞、正常細胞的任一個特異性地染色的螢光的物質與將兩者染色的物質混合使用，可提高檢測精度，易於發現兩組織的邊界附近。如此，通過將邊界附近的正常細胞也消除等，可以防止假陰性的判斷、在防止復發策略方面可有效地應用。這裡所使用的報告基因「gfp」作為對腫瘤細胞濃濃地進行標記的物質來利用，但也可使用對正常細胞濃濃地進行標記的報告基因進行同樣的評價。
【實施例3】
1.色素化合物的染色性評價
對8周齡的c57b6小鼠(雄性、約20g)給予含2％(w/v)葡聚糖硫酸鈉(dss)的飲水7日。將5％水合氯醛0.2ml進行腹腔內注射以實施麻醉，然後將小鼠的腹壁縱向切開約1cm，將消化道在腹壁上提起約1cm。這裡，流向消化道的血流由流入腸繫膜附著部的血管維持。將消化道在腸繫膜附著部的相反側包含肌層和黏膜地縱向切開約1cm。切開腸繫膜附著部的相反側是為了防止血管的切斷/損傷並使出血達到最小限。將消化道的切開部位上下打開時，在內部可看到作為食物通路的消化道黏膜面。這裡，有食物消化物時用紙巾擦去。
為了進一步清楚地觀察消化道黏膜面，在黏膜面上滴加1％鏈黴蛋白酶溶液、靜置15分鐘。通過該鏈黴蛋白酶處理將黏膜表面的粘液除去、細胞結構變得易於觀察。接著，從黏膜表面上將鏈黴蛋白酶除去、利用生理鹽水(pbs)進行洗滌。
將金屬環(外形為16毫米、內徑為6毫米)放在實驗臺上，在單側面上整周地塗布瞬間粘合劑(aronalpha)。使用小鑷子進行保持，使得塗布有瞬間粘合劑的金屬環低於粘合劑塗布面，靜置在經過鏈黴蛋白酶處理的黏膜面上。利用瞬間粘合劑將金屬環固定在黏膜中約5分鐘，利用pbs對應用色素化合物的區域進行洗滌。
按照黏膜表面不乾燥的方式，在經過鏈黴蛋白酶處理的黏膜面上一滴滴地滴加用生理鹽水(pbs)稀釋了薑黃色素儲備溶液或硫黃菊素儲備溶液所獲得的溶液(稀釋倍率參照表1)，靜置1分鐘，用pbs洗滌3次，在金屬環上載置蓋玻片，從蓋玻片上方拉近多光子雷射顯微鏡(奧林巴斯公司制fv1000mpe)的物鏡，觀察圖像。作為與上述色素化合物的染色性評價步驟說明相對應的圖，示出圖33。
評價色素化合物中使用的條件等及評價結果示於以下表中。
◎：具有對圖像診斷而言為理想的亮度和對比度的圖像；○：具有對圖像診斷而言為充分的亮度和對比度的圖像；×：具有對圖像診斷而言為不充分的亮度和對比度的圖像；△為○與×的中間狀態
在利用多光子雷射顯微鏡進行的觀察中，關於獲得用薑黃色素、硫黃菊素塗布黏膜表面時的螢光圖像所需的光子量，在無染色情況下分別為3％、4％即足夠了(結果未示出)。
2.正常部與癌腫瘤部的染色樣式的比較
接著，對在大腸黏膜面上確認了直徑為2～4毫米的蘑菇狀隆起(癌)的小鼠的大腸進行染色(無鏈黴蛋白酶處理)，結果相比較於正常黏膜，薑黃色素和硫黃菊素均顯著地將癌病變部強烈染色。將被薑黃色素染色的結果示於圖23(物鏡為10倍；z-stack圖像)。
此外，將用1％鏈黴蛋白酶ms處理15分鐘時的薑黃色素的染色樣式示於圖24(強放大、物鏡為25倍)。令人意外的是，與有無黏膜表面的鏈黴蛋白酶處理無關，薑黃色素相比較於正常黏膜均可顯著地對癌病變部強烈染色。硫黃菊素也是同樣的(結果未示出)。其中，每張染色照片均是正常部及癌腫瘤部在相同條件下拍攝。
並非是為了在理論上進行限制，作為對癌病變部濃濃地進行染色的理由，可舉出以下原因：相對於細胞黏附強、幾乎沒有細胞間的間隙的正常黏膜，在癌病變部中細胞之間的黏附弱、細胞間多有間隙，因此色素易於殘留在該間隙。作為第二個可能性，考慮細胞分裂快的癌細胞對細胞外的親油性物質(多數色素具有良好地溶於油的性質)的攝入活性比正常細胞高。另外，雖未顯示結果，但即使是單層培養細胞也可確認通過色素在黏膜上皮表面塗布、癌細胞比正常細胞更濃地染色的性質。
此外，還通過獲取小鼠大腸癌的多光子雷射顯微鏡圖像確認了作為該癌形態特徵的異型性。將使用薑黃色素的結果示於圖25。由此結果可以確認癌的檢測所需的結構異型性和細胞異型性。圖25(a)中，由於細胞集團未在基底膜上規整地排列、並且未形成腺結構，因此確認了結構異型。另一方面，在圖3(b)中確認了細胞異型、例如各個細胞的大小不同、大核、不均一的位置、極性不均一及細胞黏附的解離。
3.其他染色性的探討
此外，薑黃色素和硫黃菊素在被塗布於小鼠大腸的黏膜表面時，被多光子雷射強烈地激發而提供明亮的圖像。將結果示於圖26。從色素化合物的給予到進行觀察的順序如上述染色性評價的項目中記載的那樣進行(以下同樣)。另外，色素在黏膜表面的給予濃度是薑黃色素為5mg/ml、硫黃菊素為1mg/ml。
此外，確認了薑黃色素和硫黃菊素對上皮細胞-腺細胞系優先地進行染色的特性。將結果示於圖27a及b。這些色素對上皮細胞-腺細胞系濃濃地進行染色、對結締組織-毛細血管系淡淡地進行染色。
4.利用雷射照射排除癌細胞
利用多光子雷射照射以精確定點將通過上述順序染色的細胞中的癌細胞排除。這裡，待排除的腫瘤細胞是直接利用檢測所用的圖像的坐標軸進行瞄準。照射條件是雷射功率為45％左右、照射時間為2～10秒。將結果示於圖28a及b中。
此外，將雷射功率變換成100％、照射時間變換成20秒，成功地將在消化道黏膜表面檢測的直徑為0.5毫米的癌細胞完全地排除(圖29)。另外，結果雖未示出，但即使是以更少量的光量雷射照射細胞膜的一部分時，也可將細胞膜破壞、將癌細胞排除。
在不對小鼠膀胱上皮細胞進行薑黃色素染色、而是通過細胞的自體螢光並使雷射功率為82％而拍攝的多光子雷射顯微鏡照片(圖30a)中，圖像暗、對比度也低、是對於診斷而言不充分的細胞圖像，但在對小鼠膀胱上皮細胞進行薑黃色素染色並使雷射功率為3％而拍攝的多光子雷射顯微鏡照片(圖30b)中，獲得了對於診斷而言充分的亮度和對比度的圖像。
在不對小鼠膀氣管上皮細胞進行薑黃色素染色、而是通過細胞的自體螢光並使雷射功率為82％而拍攝的多光子雷射顯微鏡照片(圖31(a))中，圖像暗、對比度也低、是對於診斷而言不充分的細胞圖像，但在對小鼠氣管上皮細胞進行薑黃色素染色並使雷射功率為3％而拍攝的多光子雷射顯微鏡照片(圖31(b))中，獲得對於診斷而言充分的亮度和對比度的圖像。
對於經外科手術切除的人的新鮮胃黏膜也同樣地進行染色。將對人正常胃黏膜部位進行薑黃色素染色並使雷射功率為1％而拍攝的多光子雷射顯微鏡照片示於圖32(a)中。該圖中，排列成圓形的正常上皮細胞被染色、形成幾乎均一大小的圓形結構。圓形結構的中心是胃底腺的出口。如此，可以確認就大小而言沒有大小不同的上皮細胞排列成圓形的正常組織的特徵。另一方面，將對同樣獲得的新鮮的人胃黏膜中的胃癌部位進行薑黃色素染色並使雷射功率為1％而拍攝的多光子雷射顯微鏡照片示於圖32(b)中。該圖中，腫瘤細胞被染色、細胞大小的大小不同明顯、細胞的排列也不規則。在各細胞中，黑色空心的橢圓形位置是核。如此，可以確認就大小而言大小不同明顯的細胞不規則地排列的癌組織的特徵。
產業上的實用性
利用本發明的生物體染色劑，與以往的多光子雷射顯微鏡下的自體螢光觀察相比，可以顯著地抑制紫外線對細胞導致的基因缺陷或熱量所導致的缺陷等光損傷等，另外可以以高對比度將細胞組織形態圖像化。因此，本發明的生物體染色劑可以優選地在包含消化器官的上皮細胞-腺細胞系、結締組織-毛細血管系細胞等的其他病理組織診斷等中廣泛地使用。
符號說明
11多光子雷射診斷治療裝置
13雷射振蕩器
17二維掃描器
19分色鏡
21物鏡
23聚光深度調節器
25光檢測器
27螢光圖像生成裝置
29監視器
31控制裝置
33動作控制部
35診斷用脈衝強度設定部
37治療用脈衝強度設定部
39照射範圍設定部
41照射時間設定部
43雷射照射頭
45患者固定臺
47移動裝置
49內窺鏡
50光學系統
51屏蔽構件
52組織
53空間
54通氣口
55通氣口
56給液口
57排液口
61帶屏蔽構件的內窺鏡
62前端部
63插入部
64鑷子口
65鑷子
66彎角鈕操作部
67接眼部
68目鏡
69送氣、送水操作部
70吸引操作部
71連接部
72導光管