一種易感基因snp位點檢測方法及試劑盒的製作方法

2023-08-11 20:03:41

一種易感基因snp位點檢測方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，提供了一種易感基因SNP位點檢測方法及試劑盒。所述方法包括以下步驟：A.利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，將擴增產物可尋址的固定在固相載體上；B.對固定在固相載體上的擴增產物中的易感基因待測SNP位點進行測序，確定其基因型。所述試劑盒包括用於通過非單分子擴增獲得含易感基因待測SNP位點的核酸片段的特異性引物對和用於可尋址固定含易感基因待測SNP位點的核酸片段的固相載體。本發明的方法和試劑盒能夠避免不同探針之間的相互幹擾，提高了對易感基因SNP位點檢測的通量。
【專利說明】一種易感基因SNP位點檢測方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種易感基因SNP位點檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]單核苷酸多態性(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)是指基因組內 DNA 中某一特定核苷酸位置上存在轉換、顛換、插入、缺失等變化。目前，國內外已有的易感基因SNP位點檢測方法有sanger測序法、基於晶片技術的SNP分型方法、等位基因特異性擴增法(Amplification Refractory Mutation System Real Time PCR, ARMS-RT PCR)和 Taqman螢光探針法等。
[0003]其中，基於晶片技術的SNP分型方法因為能夠同時檢測多個SNP位點，通量相對較高等優點最為常用，其原理是將大量的探針分子固定在支持物上，然後使這些探針與帶標記的樣品分子進行雜交，並在除去未結合的分子後，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，即每個探針分子所結合的樣品分子的標記的信號強度，來判斷樣品分子的SNP情況。但是這種方法對探針的設計要求高，容易出現高背景值，特別是在同時進行多個易感基因的多個SNP位點檢測時，不同探針之間的相互幹擾現象非常常見。因此，基於晶片技術的SNP分型方法的探針設計難度高，通量和準確性受限於探針的設計而偏低，且準確性隨著通量的增加急劇下降，使得易感基因SNP位點檢測的準確性和通量得不到保證。
[0004]因此，需要一種新的能夠高通量的對易感基因SNP位點進行檢測方法。

【發明內容】

[0005]本發明的目的之一在於提供一種能夠準確的對易感基因SNP位點進行檢測方法，旨在解決現有技術中易感基因SNP位點檢測方法通量低的問題。
[0006]為了實現發明目的，本發明的易感基因SNP位點檢測方法，包括以下步驟:
A.利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，將擴增產物可尋址的固定在固相載體上；
B.對固定在固相載體上的擴增產物中的易感基因待測SNP位點進行測序，進而確定易感基因待測SNP位點的基因型。
[0007]其中，所述擴增產物通過微球間接的可尋址固定在固相載體上。
[0008]其中，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得擴增產物；
A2、將擴增產物與接頭連接，得連接產物；
A3、將連接產物固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上。
[0009]其中，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得擴增產物；
A2、將擴增產物與固定在微球上的接頭連接，得被固定在微球上的連接產物；A3、將固定有連接產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
[0010]其中，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得固定在微球上的擴增產物；所述特異性引物對中僅有一種引物被預先固定在微球上；
A2、將固定有擴增產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
[0011 ] 上述任一方案中，所述易感基因待測SNP位點有多個，所述步驟A為:利用多種特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得多種含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物，進而將這些擴增產物分別可尋址的固定在固相載體上。
[0012]優選的，所述含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物均連有標籤序列；所述標籤序列用於識別易感基因待測SNP位點的類型。
[0013]上述任一方案中，所述待測樣本有多個；所述步驟A為:利用特異性引物對對多個待測樣本進行非單分子擴增，得多種含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物，進而將這些擴增產物分別可尋址的固定在固相載體上；所述各樣本的含易感基因待測SNP位點的擴增產物均連有標籤序列；所述標籤序列用於識別不同的待測樣本。
[0014]上述任一方案中，所述待測樣本有多個；所述易感基因待測SNP位點有多個；所述步驟A為:
利用多種特異性引物對分別對多個待測樣本進行非單分子擴增，得多種不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物，進而將這些擴增產物分別可尋址的固定在固相載體上；
所述多種不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物均連有標籤序列；所述標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
[0015]其中，所述標籤序列來源於特異性引物對或與擴增產物連接的接頭。
[0016]其中，所述特異性引物對中的至少一種引物上含有歸一化序列；或所述接頭中含有歸一化序列。
[0017]進一步的，所述標籤序列與歸一化序列同時位於每個特異性引物對中的同一種引物上，或同時位於與擴增產物連接的接頭上，且所述標籤序列和歸一化序列相連。
[0018]其中，所述步驟B中的測序方法為基於連接測序法或合成測序法。
[0019]進一步的，所述步驟B進行測序反應時的錨定引物為易感基因待測SNP位點所在位點的3』端的互補序列或易感基因待測SNP位點所在位點的5』端的互補序列。
[0020]更進一步的，當所述步驟B中的測序方法為連接測序法時，所述錨定引物上用於連接寡核苷酸探針的一端距易感基因待測SNP位點I至9bp之間；所述步驟B中的測序方法為合成測序法時，所述錨定引物的3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp之間。
[0021]為了更好的實現本發明的目的，本發明還提供了一種易感基因SNP位點檢測試劑盒，包括:特異性引物對和固相載體；所述特異性引物對，用於通過非單分子擴增獲得含易感基因待測SNP位點的核酸片段；所述固相載體用於可尋址固定含易感基因待測SNP位點的核酸片段。
[0022]其中，所述易感基因SNP位點檢測試劑盒還包括接頭，所述接頭用於連接含易感基因待測SNP位點的核酸片段，所述接頭上含有修飾標記，用於使含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過接頭間接固定在固相載體上。[0023]其中，所述易感基因SNP位點檢測試劑盒還包括錨定引物，所述錨定引物為各特異性引物對中的一段序列；或各特異性引物對中的一段序列的互補序列；或易感基因待測SNP位點所在位點的3』端的互補序列；或易感基因待測SNP位點所在位點的5』端的互補序列。
[0024]進一步的，所述錨定引物的3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp之間。
[0025]進一步的，所述接頭為單突出末端接頭，且該突出末端為其所在鏈的3』末端，鹼基為T。
[0026]其中，所述特異性引物對或接頭上含有標籤序列。
[0027]其中，所述特異性引物對中的至少一種引物上含有歸一化序列；或所述接頭中含
有歸一化序列。
[0028]進一步的，所述標籤序列與歸一化序列同時位於每個特異性引物對中的同一種引物上，或同時位於與擴增產物連接的接頭上，且所述標籤序列和歸一化序列相連。
[0029]由上可知，本發明的方法和試劑盒將非單分子擴增獲得的產物可尋址的固定在固相載體上，然後通過測序反應測定非單分子擴增獲得的產物中的易感基因SNP位點信息，避免了不同探針之間的相互幹擾，提高了對易感基因SNP位點檢測的通量。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0030]圖1是本發明一個實施例中接頭的結構示意圖；
圖2是本發明另一個實施例中接頭的結構示意圖；
圖3是本發明另一個實施例中接頭的結構示意圖；
圖4是本發明另一個實施例中接頭的結構示意圖；
圖5a是本發明一個實施例中錨定引物所處位置的示意圖；
圖5b是本發明另一個實施例中錨定引物所處位置的示意圖；
圖5c是本發明另一個實施例中錨定引物所處位置的示意圖；
圖5d是本發明另一個實施例中錨定引物所處位置的示意圖；
圖5e是本發明另一個實施例中錨定引物所處位置的示意圖；
圖5f是本發明另一個實施例中錨定引物所處位置的示意圖；
圖5g是本發明另一個實施例中錨定引物所處位置的示意圖；
圖6是本發明一個具體實施例中接頭的結構示意圖；
圖7是本發明一個具體實施例中隨機抽取的10個樣本的SNP位點rs2296239分別進行第一次PCR擴增後所得產物的電泳圖；
圖8是本發明一個具體實施例中隨機抽取的8個樣本的rs2296241分別進行第二次PCR擴增後所得產物的電泳圖；
圖9是本發明一個具體實施例中對各樣本的SNP位點同時進行檢測時的局部圖像；
圖10是本發明一個具體實施例中對各樣本的含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連接頭上的標籤序列進行檢測時的局部圖像；
圖11是本發明一個典型性實施例中對樣本I的rs671進行檢測的局部圖像；
圖12是本發明一個典型性實施例中對100個樣本的rs671同時進行檢測的局部圖像； 圖13是本發明一個典型性實施例中對100個樣本的rs671的核酸片段所連接頭上的標籤序列進行檢測時的局部圖像；
圖14是本發明另一個典型性實施例中對樣本7的10個SNP位點同時進行檢測的局部圖像；
圖15是本發明另一個典型性實施例中對樣本7的10個SNP位點的核酸片段所連接頭上的標籤序列進行檢測時的局部圖像。
【具體實施方式】
[0031]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。
[0032]本發明提出第一典型實施例，一種易感基因SNP位點檢測方法，包括以下步驟:
A.利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得擴增產物，將擴增產物可尋址的固定在固相載體上；
B.對固定在固相載體上的擴增產物中的易感基因待測SNP位點進行測序，進而確定易感基因待測SNP位點的基因型。
[0033]需要說明的是:
所述易感基因是指和特定事項具有一定關聯的基因或等位基因。
[0034]所述易感基因待測 SNP位點是指易感基因上的SNP位點，可位於編碼區，也可位於非編碼區。
[0035]所述特異性引物對為用於擴增含易感基因待測SNP位點的核酸片段的PCR引物。
[0036]所述待測樣本為含核酸的任意形式的樣品，包括但不限於經純化後的DNA、cDNA或RNA (包括但不限於mRNA和rRNA)。
[0037]所述單分子擴增是指在擴增開始前，各模板分子以極微量甚至單分子的形式在空間上隔離(但這些模板分子整體上還是屬於同一個反應體系)，並且在各自的空間內實現擴增的方法，例如:乳液PCR、橋式PCR、乳液橋式PCR。
[0038]所述非單分子擴增是指在進行擴增時，各模板分子在同一個反應體系中進行擴增，且相互之間並未發生空間上的隔離，包括但不限於:普通PCR擴增、RT-PCR、多重PCR、不對稱PCR、固相PCR、原位PCR、反轉錄PCR、巢式PCR、兼併引物PCR、免疫PCR、反向PCR和遞減PCR等。
[0039]本發明所述步驟B中的測序方法可為第二代高通量基因測序技術，包括但不限於連接測序法或合成測序法。
[0040]所述連接測序法是基於連接酶在核酸片段之間進行連接反應的過程中的保真性來實現的，以待測序核酸片段為模板，錨定引物(又稱測序引物，其與待測序核酸片段所在鏈互補)和寡核苷酸探針(該探針的特定位置上帶有螢光標記)進行連接反應，通過檢測連接產物上的螢光標記從而確定寡核苷酸探針上帶有螢光標記的特定位置對應的序列的信息。目前，市場上常見的連接測序法有多種，包括但不限於:深圳華因康基因科技有限公司的Pstar連接測序法、ABI公司的連接測序法、Complete Genomics公司的連接測序法。
[0041]所述合成測序法是基於聚合酶在延伸核酸鏈過程中的保真性來實現的，以待測序核酸片段為模板，錨定引物(又稱測序引物，其與待測序核酸片段所在鏈互補)互補結合至待測序核酸片段上，通過檢測在延伸過程中產生的信號來確定待測序核酸片段上相應位置的序列信息。目前，市場上常見的合成測序法有多種，包括但不限於=Illumina公司的Solexa合成測序法、Roche公司的454合成測序法、Life Technologies公司的1ntorrent> 1n Proton 合成測序法。
[0042]上述常見的測序方法的通量均在GB以上，能夠同時對成百上千甚至上萬個樣本的成百上千甚至上萬個SNP位點進行檢測，且準確度均在99.9%以上。
[0043]所述可尋址的固定，是指能夠確定位置信息的固定。即，固定載體上每一具體位置上所固定的含易感基因待測SNP位點的核酸片段與其它具體位置上所固定的含易感基因待測SNP位點的核酸片段是能夠明確區分的。
[0044]本實施例中，非單分子擴增獲得的擴增產物(含易感基因待測SNP位點的核酸片段)可尋址的固定在固相載體上，然後通過測序反應測定非單分子擴增獲得的擴增產物中的易感基因待測SNP位點信息，避免了現有技術中基於晶片技術的SNP分型方法中不同探針之間的相互幹擾，易感基因待測SNP位點的檢測通量和準確性僅受限於所採用的測序技術，大大的提高了對易感基因待測SNP位點進行檢測的通量。與現有技術相比，還能同時保證準確性不因通量的增加而急劇下降，保證了易感基因SNP位點檢測的準確性。此外，與通過對單分子擴增產物進行測序獲得易感基因待測SNP位點序列信息相比，非單分子擴增方法無需特殊的前處理步驟，更簡單，且擴增效率更高、更快速(循環數更少)，能夠顯著的提高易感基因SNP位點檢測的效率。
[0045]優選的，所述非單分子擴增為普通PCR擴增、多重PCR、不對稱PCR和巢式PCR。
[0046]其中，普通PCR擴增設計最為簡單，擴增條件寬鬆，只需要通過簡單的設計即可實現本發明；多重PCR可一次性擴增多個核酸片段，即可同時擴增多個不同的易感基因待測SNP位點，能顯著提 高擴增效率；不對稱PCR能夠實現易感基因待測SNP位點靶鏈的大量單鏈擴增；巢式PCR能夠顯著提高擴增的特異性，得到高質量的擴增產物，保證後續易感基因待測SNP位點檢測的正確性。
[0047]其中，含易感基因待測SNP位點的核酸片段(非單分子擴增的擴增產物)可通過直接或間接的方式可尋址的固定在固相載體上。
[0048]針對通過間接的方式實現含易感基因待測SNP位點的核酸片段的可尋址固定，優選所述擴增產物通過微球間接的可尋址固定在固相載體上，本發明提出第一實施例:所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得擴增產物；
A2、將擴增產物與接頭連接，得連接產物；
A3、將連接產物固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上。
[0049]針對所述擴增產物通過微球間接的可尋址固定在固相載體上，本發明又提出第二實施例:
所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得擴增產物；
A2、將擴增產物與固定在微球上的接頭連接，得被固定在微球上的連接產物；
A3、將固定有連接產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
[0050]需要說明的是，在第一實施例和第二實施例中，所述接頭上含有修飾標記，用於使其固定在微球上。[0051]所述接頭可採用多種形式，包括但不限於平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭或含莖環結構的接頭。
[0052]所述平末端接頭是指雙鏈之間完全互補配對的雙鏈核酸接頭。優選的，所述平末端接頭的兩條鏈的5』末端均不含磷酸基團，其可避免連接過程中接頭自連現象的出現，減少對後續測序實驗的幹擾，提聞SNP分型檢測的準確率。
[0053]所述突出末端接頭，是指雙鏈核酸分子中的至少一端帶有突出核苷酸序列，而其餘核昔Ife則完全互補的雙鏈核Ife接頭。關出末糹而接頭可為單關出末糹而(圖1)，也可以是含有兩個突出末端的雙突出末端，這兩個突出末端可在一條核苷酸鏈上(圖2a)或在不同的核昔Ife鏈上(圖2b)。所述關出末糹而接頭能夠避免連接過程中接頭自連現象的出現，減少對後續測序實驗的幹擾，提高SNP分型檢測的準確率。在本實施例的【具體實施方式】中，所述接頭優選為單突出末端接頭，且該突出末端為其所在鏈的3』末端，鹼基為T ;該接頭能夠與通過Taq酶擴增的含A尾的PCR擴增產物直接連接，提高連接效率。
[0054]所述分叉型接頭包括互補區和分叉區，其基本結構如圖3所示，互補區雙鏈的核苷酸互補配對，配對的核苷酸對數不限。互補區末端可為平末端或突出末端。所述分叉型接頭能夠避免連接過程中接頭自連現象的出現，減少對後續測序實驗的幹擾，提高SNP分型檢測的準確率。在本實施例的【具體實施方式】中，所述接頭優選為互補區的3』末端為突出末端，且突出末端最後一個鹼基為T的T末端分叉接頭；該接頭能夠與通過Taq酶擴增的含A尾的PCR擴增產物直接連接，提高連接效率。
[0055]所述帶莖環結構的接頭，如圖4所示。該接頭為單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子包括第一互補配對區1、莖環區2和第二互補配對區3(圖4a)，第一互補配對區I能夠與第二互補配對區3互補配對。如圖4b所示，帶莖環結構的接頭還可帶有突出末端4，該突出末端可位於單鏈核酸分子的3』 端。突出末端4的存在能夠防止接頭自連現象的發生，減少對後續測序實驗的幹擾，提高SNP分型檢測的準確率。該突出末端優選為T ;該接頭能夠與通過Taq酶擴增的含A尾的PCR擴增產物直接連接，提高連接效率。
[0056]所述修飾標記可為生物素、親和素、鏈黴親和素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸、納米金、碘乙醯、巰基、氨基、醛基、羧基、異硫氰基、矽烷基或丙烯醯胺，它們均能特異性的與相對應的基團或分子結合。
[0057]與第一實施例相比，第二實施例中的接頭被預先固定在微球上，減少了連接產物與微球連接的步驟，實驗效率更高。固定有接頭的微球的密度可能會與連接反應中的其他成分的密度不同，因此，在連接過程中，使整個連接反應體系周期性震蕩，可有效提高固定在微球上的接頭與含易感基因待測SNP位點的核酸片段的連接效率，避免連接反應體系中各成分分層而引起的連接效率低現象的出現。
[0058]針對所述擴增產物通過微球間接的可尋址固定在固相載體上，本發明又提出第三實施例:
所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得固定在微球上的擴增產物；所述特異性引物對中僅有一種引物被預先固定在微球上；
A2、將固定有擴增產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
[0059]本實施例中通過將特異性引物對中的一種引物預先固定在微球上，使得含易感基因待測SNP位點的核酸片段在被擴增的同時直接固定在微球上，可直接進一步的進行可尋址固定，簡化了實驗步驟，提高了實驗效率，同時微球的存在使得純化擴增產物更為快速、便捷，效率高。此外，固定有引物的微球的密度往往會與擴增反應中的其他成分的密度不同，在擴增反應過程中，可使整個擴增反應體系周期性震蕩，以有效提高擴增效率。
[0060]針對通過直接的方式實現含易感基因待測SNP位點的核酸片段的可尋址固定，本發明提出第四實施例，所述步驟A具體如下:
利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，從而將擴增產物可尋址的固定在固相載體上；所述特異性引物對中的一種引物被預先固定在固相載體上。
[0061]需要說明的是，本方案通過預先將特異性引物對中的一種引物固定在固相載體上，只通過一步反應即完成了非單分子擴增和可尋址固定，實驗步驟簡單，實驗效率高。
[0062]在上述實施例中，當步驟B中對易感基因待測SNP位點進行測序反應時，對應的錨定引物一般可如圖5所示，設計為:
a、接頭中的一段序列；或
b、特異性引物對中的一段序列；或
c、特異性引物對中的一段序列的互補序列；或
d、接頭的3』端的部分序列與特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列；或
e、接頭的3』端的部分 序列與特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列所組成的核酸鏈的互補序列；或
f、易感基因待測SNP位點所在位點的3』端的互補序列；或
g、易感基因待測SNP位點所在位點的5』端的互補序列。
[0063]其中，a、d、e方案適用於含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案山、C、f、g適用於所有的技術方案。
[0064]在含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案中，當將錨定引物設計成接頭中的一段序列時，為了避免接頭序列對所述步驟B中測序反應的幹擾，可使接頭僅與含易感基因待測SNP位點的核酸片段的一端連接。為實現上述目的，優選的，所述特異性引物對中僅有一種引物(上遊引物或下遊引物)的5』端含有磷酸基團。更優選的，所述特異性引物對中僅將用於擴出易感基因待測SNP位點所在鏈的引物的5』端設計成含有磷酸基團的引物。
[0065]本發明可對多個易感基因待測SNP位點、多個待測樣本或多個易感基因待測SNP位點和多個待測樣本同時進行檢測。
[0066]針對多個易感基因待測SNP位點的同時檢測，本發明在第一典型實施例的基礎上提出第二典型實施例，一種易感基因SNP位點檢測方法，包括以下步驟:
A.利用多種特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得多種含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物，將上述擴增產物可尋址的固定在固相載體上；
B.對固定在固相載體上的擴增產物中的易感基因待測SNP位點進行測序，進而確定各易感基因待測SNP位點的基因型。
[0067]需要說明的是:
所述多種特異性引物對為分別用於擴增含不同的易感基因待測SNP位點的核酸片段的PCR引物。[0068]所述可尋址的固定，是指能夠確定位置信息的固定。所述分別可尋址的固定在固相載體上，是指在每一個具體位置上所固定的含易感基因待測SNP位點的核酸片段的種類是相同。即，固定載體上每一具體位置上所固定的含易感基因待測SNP位點的核酸片段的種類是能夠確定的。
[0069]所述待測樣本為含核酸的任意形式的樣品，包括但不限於經純化後的DNA、cDNA或RNA (包括但不限於mRNA和rRNA)。
[0070]本實施例避免了現有技術中基於晶片技術的SNP分型方法中不同探針之間的相互幹擾，易感基因SNP位點的檢測通量和準確性僅受限於所採用的測序技術，大大的提高了對易感基因SNP位點進行檢測的通量；與現有技術相比，還能同時保證準確性不因通量的增加而急劇下降，保證了易感基因SNP位點檢測的準確性。此外，與通過對單分子擴增產物進行測序獲得SNP位點序列信息相比，非單分子擴增方法無需特殊的前處理步驟，更簡單，且擴增效率更高、更快速(循環數更少)，能夠顯著的提高易感基因SNP位點檢測的效率。
[0071]優選的，所述多種含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物均連有第一標籤序列；所述第一標籤序列用於識別易感基因待測SNP位點的類型。
[0072]所述含易感基因待測SNP位點的擴增產物所連有的第一標籤序列可以是在非單分子擴增過程中獲得的，也可以是在所述步驟A的可尋址固定過程中獲得。
[0073]針對所述含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的第一標籤序列是在非單分子擴增過程中獲得的，本發明提出第五實施例，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用多種特異性引物對分別對待測樣本進行非單分子擴增，得含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物；
A2、將含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物分別固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上；
所述多種特異性引物對均含有第一標籤序列；所述第一標籤序列用於識別易感基因待測SNP位點的類型。
[0074]需要說明的是:
所述多種特異性引物對為分別用於擴增含不同的易感基因待測SNP位點的核酸片段的PCR引物。
[0075]所述第一標籤序列可設置在每個特異性引物對中的至少一種引物上。
[0076]通過上述設計，在步驟B中增加一個檢測第一標籤序列的步驟，即可實現對同一樣本的不同SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0077]優選的，所述第一標籤序列位於每個特異性引物對中的用於擴增易感基因待測SNP位點所在鏈的引物上。這樣，在步驟B中的測序過程中，僅需錨定引物互補至對易感基因待測SNP位點所在鏈上進行測序反應，即可實現對易感基因待測SNP位點和標籤序列的檢測，進而確定不同待測樣本來源的易感基因待測SNP位點的基因型；本方案還能減少後續數據處理過程中的步驟，例如:當第一標籤序列位於易感基因待測SNP位點所在鏈的互補鏈時，步驟B中的測序反應獲得的就是第一標籤序列的互補序列，這樣在後續的數據處理過程中就必須對這一部分數據進行轉換。
[0078]更優選的，所述第一標籤序列在其所在引物的5』端。
[0079] 針對所述含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在非單分子擴增過程中獲得的，本發明又提出第六實施例，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用多種特異性引物對分別對待測樣本進行非單分子擴增，得多種含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物的微球；
A2、將多種含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物的微球可尋址的固定在固相載體
上；
所述多種特異性引物對含有第一標籤序列，且所述多種特異性引物對中分別僅有一種引物被預先固定在微球上；所述第一標籤序列分別被包含在各特異性引物對中的至少一種引物上，用於識別易感基因待測SNP位點的類型。
[0080]通過上述設計，在步驟B中增加一個檢測第一標籤序列的步驟，即可實現對同一樣本的不同SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0081]優選的，所述第一標籤序列位於每個特異性引物對中的用於擴增易感基因待測SNP位點所在鏈的引物上。這樣，在步驟B中的測序過程中，僅需錨定引物互補至對易感基因待測SNP位點所在鏈上進行測序反應，即可實現對易感基因待測SNP位點和標籤序列的檢測，進而確定不同待測樣本來源的易感基因待測SNP位點的基因型；本方案還能減少後續數據處理過程中的步驟，例如:當第一標籤序列位於易感基因待測SNP位點所在鏈的互補鏈時，步驟B中的測序反應獲得的就是第一標籤序列的互補序列，這樣在後續的數據處理過程中就必須對這一部分數據進行轉換。
[0082]與第五實施例相比，本實施例中通過分別將各特異性引物對中的一種引物預先固定在微球上，使得含 易感基因待測SNP位點的核酸片段在被擴增的同時直接固定在微球上，可直接進一步的進行可尋址固定，簡化了實驗步驟，提高了實驗效率，同時微球的存在使得純化擴增產物更為快速、便捷，效率高。此外，固定有引物的微球的密度可能會與擴增反應中的其他成分的密度不同，因此，在擴增反應過程中，可使整個擴增反應體系周期性震蕩，以有效提聞擴增效率。
[0083]針對所述含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在所述步驟A的可尋址固定過程中獲得，優選在連接接頭的時候，通過帶有標籤序列的接頭獲得。對此，本發明分別提出第七、八實施例，具體如下所述。
[0084]在第七實施例中，所述步驟A2包括以下步驟:
A21、將含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物分別與不同的接頭連接，得多種連接產物；
A22、將多種連接產物分別固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上。
[0085]需要說明的是，本實施例中，所述不同的接頭均含有修飾標記和第一標籤序列；所述不同的接頭之間的不同之處優選僅在於第一標籤序列的不同；所述修飾標記，用於使其所在接頭能被固定在微球上；所述第一標籤序列用於識別不同的易感基因待測SNP位點類型。這樣在步驟B中增加一個檢測第一標籤序列的步驟，同樣可以實現對同一樣本的多個SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0086]在第八實施例中，所述步驟A2包括以下步驟:
A21、將含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物分別與不同的固定在微球上的接頭連接，得多種被固定在微球上的連接產物；
A22、將多種固定有連接產物的微球可尋址的固定在固相載體上。[0087]需要說明的是，本實施例中，所述不同的固定在微球上的接頭均含有修飾標記和第一標籤序列；所述不同的固定在微球上的接頭之間的不同之處優選僅在於第一標籤序列的不同；所述修飾標記，用於使其所在接頭能被固定在微球上；所述第一標籤序列用於識別易感基因待測SNP位點的類型。這樣在步驟B中增加一個檢測第一標籤序列的步驟，同樣可以實現對同一樣本的多個SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0088]與第七實施例相比，第八實施例中的接頭被預先固定在微球上，減少了連接產物與微球連接的步驟，實驗效率更高。固定有接頭的微球的密度可能會與連接反應中的其他成分的密度不同，因此，在連接過程中，使整個連接反應體系周期性震蕩，可有效提高固定在微球上的接頭與含易感基因待測SNP位點的核酸片段的連接效率，避免連接反應體系中各成分分層而引起的連接效率低現象的出現。
[0089]在第七實施例和第八實施例中，所述接頭同前述一樣，可採用多種形式，包括但不限於平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭或含莖環結構的接頭，在此不再贅述。不過需要特別指出的是，針對含不同易感基因待測SNP位點的核酸片段，所採用的接頭可以是相同或不同的。這使得本方案的適用範圍廣，能夠針對各種實際情況的不同，包括但不限於:待測樣本的不同、含易感基因待測SNP位點的核酸片段的具體序列的不同，採用不同的技術方案，以實現最優配置。
[0090]其中，含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物可通過直接或間接的方式可尋址的固定在固相載體上。
[0091]針對通過間接的方式可尋址的固定在固相載體上，本發明已經在第五至八實施例中進行了一定的闡述，在此不再贅述。
[0092]針對通過直接的方式可尋址的固定在固相載體上，本發明提出第九實施例，所述步驟A具體如下:
利用多種特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，從而將擴增產物可尋址的固定在固相載體上；所述各多種特異性引物對中均有一種引物被預先固定在固相載體上。
[0093]需要說明的是，所述多種特異性引物對分別用於擴增含不同的易感基因待測SNP位點的核酸片段；本方案通過預先將各特異性引物對中的一種引物固定在固相載體上，只通過一步反應即完成了非單分子擴增和可尋址固定，實驗步驟簡單，實驗效率高。
[0094]在上述實施例中，當步驟B中對多個不同易感基因待測SNP位點進行測序反應時，對應的錨定引物一般可如圖5所示，設計為:
a、接頭中的一段序列；或
b、各特異性引物對中的一段序列；或
c、各特異性引物對中的一段序列的互補序列；或
d、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列；或
e、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列所組成的核酸鏈的互補序列；或
f、各易感基因待測SNP位點所在位置的3』端的互補序列；或
g、各易感 基因待測SNP位點所在位置的5』端的互補序列。
[0095]其中，a、d、e方案適用於含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案山、C、f、g適用於所有的技術方案。[0096]在各含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案中，當將錨定引物設計成接頭中的一段序列時，為了避免接頭序列對所述步驟B中測序反應的幹擾，可使接頭僅與各含易感基因待測SNP位點的核酸片段的一端連接。為實現上述目的，優選的，所述多種特異性引物對中均僅有一種引物(上遊引物或下遊引物)的5』端含有磷酸基團。更優選的，所述多種特異性引物對中均僅將用於擴出易感基因待測SNP位點所在鏈的引物的5』端設計成含有磷酸基團的引物。
[0097] 針對多樣本的易感基因待測SNP位點檢測，本發明在第一典型實施例的基礎上提出第三典型實施例，一種易感基因SNP位點檢測方法，包括以下步驟:
A.利用特異性引物對對多個待測樣本進行非單分子擴增，得多種含易感基因待測SNP位點的擴增產物，將上述擴增產物可尋址的固定在固相載體上；
B.對固定在固相載體上的擴增產物中的易感基因待測SNP位點進行測序，進而確定各易感基因待測SNP位點的基因型。
[0098]所述特異性引物對為用於擴增含易感基因待測SNP位點的核酸片段的PCR引物。
[0099]本實施例避免了現有技術中基於晶片技術的SNP分型方法中不同探針之間的相互幹擾，易感基因SNP位點的檢測通量和準確性僅受限於所採用的測序技術，大大的提高了對易感基因SNP位點進行檢測的通量；與現有技術相比，還能同時保證準確性不因通量的增加而急劇下降，保證了易感基因SNP位點檢測的準確性。此外，與通過對單分子擴增產物進行測序獲得SNP位點序列信息相比，非單分子擴增方法無需特殊的前處理步驟，更簡單，且擴增效率更高、更快速(循環數更少)，能夠顯著的提高易感基因SNP位點檢測的效率。
[0100]優選的，所述多種易感基因待測SNP位點的擴增產物均連有第二標籤序列；所述第二標籤序列用於識別不同的待測樣本。
[0101]所述含易感基因待測SNP位點的擴增產物所連有的第二標籤序列可以是在非單分子擴增過程中獲得的，也可以是在所述步驟A的可尋址固定過程中獲得。
[0102]針對所述含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在非單分子擴增過程中獲得的，本發明提出第十實施例，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用多種特異性引物對分別對不同的待測樣本進行非單分子擴增，得不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的擴增產物；
A2、將不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的擴增產物分別固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上；
所述多種特異性引物對均含有第二標籤序列，不同之處僅在於第二標籤序列的不同；所述第二標籤序列用於識別不同的待測樣本。
[0103]需要說明的是:
所述待測樣本為含核酸的任意形式的樣品，包括但不限於經純化後的DNA、cDNA或RNA(包括但不限於mRNA和rRNA)。
[0104]所述第二標籤序列可設置在每個特異性引物對中的至少一種引物上。
[0105]通過上述設計，在步驟B中增加一個檢測第二標籤序列的步驟，即可實現對多個樣本的同一 SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0106]優選的，所述第二標籤序列位於每個特異性引物對中的用於擴增易感基因待測SNP位點所在鏈的引物上。這樣，在步驟B中的測序過程中，僅需錨定引物互補至對易感基因待測SNP位點所在鏈上進行測序反應，即可實現對易感基因待測SNP位點和標籤序列的檢測，進而確定不同待測樣本來源的SNP位點的基因型；本方案還能減少後續數據處理過程中的步驟，例如:當第二標籤序列位於易感基因待測SNP位點所在鏈的互補鏈時，步驟B中的測序反應獲得的就是第二標籤序列的互補序列，這樣在後續的數據處理過程中就必須對這一部分數據進行轉換。
[0107]更優選的，所述第二標籤序列在其所在引物的5』端。
[0108]針對所述含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在非單分子擴增過程中獲得的，本發明又提出了第十一實施例，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用多種特異性引物對分別對各待測樣本進行非單分子擴增，得多種固定有含易感基因待測SNP位點的擴增產物的微球；
A2、將多種固定有含易感基因待測SNP位點的擴增產物的微球可尋址的固定在固相載體上；
所述多種特異性引物對含有第二標籤序列，不同之處僅在於第二標籤序列的不同，且所述多種特異性引物對中分別僅有一種引物被預先固定在微球上；所述第二標籤序列分別被包含在各特異性引物對中的至少一種引物上，用於識別不同的待測樣本。
[0109]通過上述設計，在步驟B中增加一個檢測第二標籤序列的步驟，即可實現對多個樣本的同時檢測，提高檢測效率。
[0110]優選的，所述第二標籤序列位於每個特異性引物對中的用於擴增易感基因待測SNP位點所在鏈的引物上 。這樣，在步驟B中的測序過程中，僅需錨定引物互補至對易感基因待測SNP位點所在鏈上進行測序反應，即可實現對易感基因待測SNP位點和標籤序列的檢測，進而確定不同待測樣本來源的SNP位點的基因型；本方案還能減少後續數據處理過程中的步驟，例如:當第二標籤序列位於易感基因待測SNP位點所在鏈的互補鏈時，步驟B中的測序反應獲得的就是第二標籤序列的互補序列，這樣在後續的數據處理過程中就必須對這一部分數據進行轉換。
[0111]與第十實施例相比，本實施例中通過分別將各特異性引物對中的一種引物預先固定在微球上，使得含易感基因待測SNP位點的核酸片段在被擴增的同時直接固定在微球上，可直接進一步的進行可尋址固定，簡化了實驗步驟，提高了實驗效率，同時微球的存在使得純化擴增產物更為快速、便捷，效率高。此外，固定有引物的微球的密度可能會與擴增反應中的其他成分的密度不同，因此，在擴增反應過程中，可使整個擴增反應體系周期性震蕩，以有效提聞擴增效率。
[0112]針對所述含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在所述步驟A的可尋址固定過程中獲得，優選在連接接頭的時候，通過帶有標籤序列的接頭獲得。本發明分別分別提出第十二、十三實施例，具體如下所述。
[0113]在第十二實施例中，所述步驟A2包括以下步驟:
A21、將不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的擴增產物分別與不同的接頭連接，得多種連接產物；
A22、將多種連接產物分別固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上。
[0114]需要說明的是，本實施例中，所述不同的接頭均含有修飾標記和第二標籤序列；所述不同的接頭之間的不同之處優選僅在於第二標籤序列的不同；所述修飾標記，用於使其所在接頭能被固定在微球上；所述第二標籤序列用於識別不同的待測樣本。這樣在步驟B中增加一個檢測第二標籤序列的步驟，同樣可以實現對多個樣本的同時檢測，提高檢測效率。
[0115]在第十三實施例中，所述步驟A2包括以下步驟:
A21、將不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的核酸片段分別與不同的固定在微球上的接頭連接，得多種被固定在微球上的連接產物；
A22、將多種固定有連接產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
[0116]需要說明的是，本實施例中，所述不同的固定在微球上的接頭均含有修飾標記和第二標籤序列；所述不同的固定在微球上的接頭之間的不同之處優選僅在於第二標籤序列的不同；所述修飾標記，用於使其所在接頭能被固定在微球上；所述第二標籤序列用於識別不同的待測樣本。這樣在步驟B中增加一個檢測第二標籤序列的步驟，同樣可以實現對多個樣本的同時檢測，提高檢測效率。
[0117]與第十二實施例相比，第十三實施例中的接頭被預先固定在微球上，減少了連接產物與微球連接的步驟，實驗效率更高。固定有接頭的微球的密度可能會與連接反應中的其他成分的密度不同，因此，在連接過程中，使整個連接反應體系周期性震蕩，可有效提高固定在微球上的接頭與含易感基因待測SNP位點的核酸片段的連接效率，避免連接反應體系中各成分分層而引起的連接效率低現象的出現。
[0118]在第十二實 施例和第十三實施例中，所述接頭同前述一樣，可採用多種形式，包括但不限於平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭或含莖環結構的接頭，在此不再贅述。不過需要特別指出的是，針對不同的樣本來源的含易感基因待測SNP位點的核酸片段，所採用的接頭可以是相同或不同的。這使得本方案的適用範圍廣，能夠針對各種實際情況的不同，包括但不限於:待測樣本的不同、含易感基因待測SNP位點的核酸片段的具體序列的不同，採用不同的技術方案，以實現最優配置。
[0119]其中，不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的擴增產物同樣可通過直接或間接的方式可尋址的固定在固相載體上。
[0120]針對通過間接的方式可尋址的固定在固相載體上，本發明已經在第十至十三實施例中進行了一定的闡述，在此不再贅述。
[0121]針對通過直接的方式可尋址的固定在固相載體上，本發明提出第十四實施例，所述步驟A具體如下:
利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的擴增產物，然後將不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的擴增產物可尋址的固定在固相載體上；所述特異性引物對中有一種引物上含有標記基團，所述標記基團用於使其固定在固相載體上。
[0122]本方案通過在各種特異性引物對中設置含有標記基團的引物，使得擴增產物中含有標記基團，進而通過該標記基團固定在固相載體上，實驗步驟簡單，實驗效率聞。
[0123]優選的，特異性引物對中的標記基團位於引物的5』端。所述標記基團可為生物素、未和素、鏈黴未和素、納米金、鵬乙酸、疏基、氣基、醒基、竣基、異硫氛基、娃烷基或丙稀醯胺。
[0124]優選的，所述特異性引物對中的一種引物被預先固定在固相載體上。[0125]更優選的，所述特異性引物對有多種，它們均含有第二標籤序列；所述第二標籤序列用於識別待測SNP位點的類型，所述第二標籤序列位於標記基團所在的引物上。
[0126]本方案可通過預先分別將多種特異性引物對中的含標記基團的引物分別可尋址固定在固相載體上，然後只通過一步反應即實現了含易感基因待測SNP位點的核酸片段的擴增和固定，實驗步驟簡單，實驗效率高，且本方案可不僅僅通過對固相載體進行物理分區實現可尋址的固定，還可通過第二標籤序列驗證，提高檢測的準確性。
[0127]優選的，所述第二標籤序列位於其所在引物的5』端。本方案降低了對非單分子擴增反應中引物設計的難度，減少了對非單分子擴增的影響。
[0128]在上述實施例中，當步驟B中對多個樣本的易感基因待測SNP位點進行測序反應時，對應的錨定引物一般可如圖5所示，設計為:
a、接頭中的一段序列；或
b、各特異性引物對中的一段序列；或
c、各特異性引物對中的一段序列的互補序列；或
d、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列；或
e、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列所組成的核酸鏈的互補序列；或
f、各易感基因待測SNP 位點所在位置的3』端的互補序列；或
g、各易感基因待測SNP位點所在位置的5』端的互補序列。
[0129]其中，a、d、e方案適用於含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案山、C、f、g適用於所有的技術方案。
[0130]在不同待測樣本來源的含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案中，當將錨定引物設計成接頭中的一段序列時，為了避免接頭序列對所述步驟B中測序反應的幹擾，可使接頭僅與各含易感基因待測SNP位點的核酸片段的一端連接。為實現上述目的，優選的，所述特異性引物對中僅有一種引物(上遊引物或下遊引物)的5』端含有磷酸基團。更優選的，所述特異性引物對中僅將用於擴出易感基因待測SNP位點所在鏈的引物的5』端設計成含有磷酸基團的引物。
[0131]針對多樣本的多個易感基因待測SNP位點檢測，本發明在第一、二、三典型實施例的基礎上提出第四典型實施例，一種易感基因SNP位點檢測方法，包括以下步驟:
A.利用多種特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得多種不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物，進而將這些擴增產物分別可尋址的固定在固相載體上；
B.對固定在固相載體上的擴增產物中的易感基因待測SNP位點進行測序，進而確定易感基因待測SNP位點的基因型；
所述多種不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物均連有標籤序列；所述標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
[0132]需要說明的是，所述可尋址的固定，是指能夠確定位置信息的固定。所述分別可尋址的固定在固相載體上，進一步指在每一個具體位置上所固定的含易感基因待測SNP位點的核酸片段的樣本來源是相同。即，固定載體上每一具體位置上所固定的含易感基因待測SNP位點的核酸片段的樣本來源是能夠確定的。[0133]所述多種特異性引物對為分別用於擴增不同待測樣本來源的含不同的易感基因待測SNP位點的核酸片段的PCR引物。
[0134]本實施例避免了現有技術中基於晶片技術的SNP分型方法中不同探針之間的相互幹擾，易感基因待測SNP位點的檢測通量和準確性僅受限於所採用的測序技術，大大的提高了對易感基因待測SNP位點進行檢測的通量。與現有技術相比，還能同時保證準確性不因通量的增加而急劇下降，保證了易感基因SNP位點檢測的準確性。此外，與通過對單分子擴增產物進行測序獲得易感基因待測SNP位點序列信息相比，非單分子擴增方法無需特殊的前處理步驟，更簡單，且擴增效率更高、更快速(循環數更少)，能夠顯著的提高易感基因SNP位點檢測的效率。
[0135]所述不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列可以是在非單分子擴增過程中獲得的，也可以是在所述步驟A的可尋址固定過程中獲得。
[0136]針對所述不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在非單分子擴增過程中獲得的，本發明提出第十五實施例，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用多種特異性引物對分別對不同的待測樣本進行非單分子擴增，得不同待測樣本來源的含不同易感基因待 測SNP位點的擴增產物；
A2、將不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物分別固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上；
所述多種特異性引物對均含有第三標籤序列；所述第三標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
[0137]需要說明的是:
所述待測樣本為含核酸的任意形式的樣品，包括但不限於經純化後的DNA、cDNA或RNA(包括但不限於mRNA和rRNA),或是含有核酸的石臘包埋組織、全血、血清、血眾或細胞。
[0138]所述多種特異性引物對分別用於擴增各種不同待測樣本來源的不同的易感基因待測SNP位點。
[0139]所述第三標籤序列可設置在每個特異性引物對中的至少一種引物上。
[0140]通過上述設計，在步驟B中增加一個檢測第三標籤序列的步驟，即可實現對多個樣本的不同易感基因待測SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0141]優選的，所述第三標籤序列位於每個特異性引物對中的用於擴增易感基因待測SNP位點所在鏈的引物上。這樣，在步驟B中的測序過程中，僅需錨定引物互補至對易感基因待測SNP位點所在鏈上進行測序反應，即可實現對易感基因待測SNP位點和標籤序列的檢測，進而確定不同待測樣本來源的SNP位點的基因型；本方案還能減少後續數據處理過程中的步驟，例如:當第三標籤序列位於易感基因待測SNP位點所在鏈的互補鏈時，步驟B中的測序反應獲得的就是第三標籤序列的互補序列，這樣在後續的數據處理過程中就必須對這一部分數據進行轉換。
[0142]更優選的，所述第三標籤序列在其所在引物的5』端。
[0143]針對所述不同樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在非單分子擴增過程中獲得的，本發明又提出第十六實施例，所述步驟A包括以下步驟:
Al、利用多種特異性引物對分別對各待測樣本進行非單分子擴增，得多種固定有含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物的微球；
A2、將多種固定有含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物段的微球可尋址的固定在固相載體上；
所述多種特異性引物對均含有第三標籤序列，且所述多種特異性引物對中分別僅有一種引物被預先固定在微球；所述第三標籤序列分別被包含在各特異性引物對中的至少一種引物上，用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
[0144]所述多種特異性引物對分別用於擴增各種不同樣本來源的不同的易感基因待測SNP位點；針對同一易感基因待測SNP位點的特異性引物對的區別在於第三標籤序列的不同；針對同一樣本來源的不同易感基因待測SNP位點的特異性引物對的第三標籤序列也不同。
[0145]所述第三標籤序列可設置在每個特異性引物對中的至少一種引物上。
[0146]通過上述設計，在步驟B中增加一個檢測第三標籤序列的步驟，即可實現對多個樣本的不同易感基因待測SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0147]優選的，所述第三標籤序列位於每個特異性引物對中的用於擴增易感基因待測SNP位點所在鏈的引物上。這樣，在步驟B中的測序過程中，僅需錨定引物互補至對易感基因待測SNP位點所在鏈上進行測序反應，即可實現對易感基因待測SNP位點和標籤序列的檢測，進而確定不同待測樣本來源的SNP位點的基因型；本方案還能減少後續數據處理過程中的步驟，例如:當第三標籤序列位於易感基因待測SNP位點所在鏈的互補鏈時，步驟B中的測序反應獲得的就是第三標籤序列的互補序列，這樣在後續的數據處理過程中就必須對這一部分數據進行轉換。
[0148]更優選的，所述第三標籤序列在其所在引物的5』端。
[0149] 與第十五實施例相比，本實施例中通過分別將各特異性引物對中的一種引物預先固定在微球上，使得含易感基因待測SNP位點的核酸片段在被擴增的同時直接固定在微球上，可直接進一步的進行可尋址固定，簡化了實驗步驟，提高了實驗效率，同時微球的存在使得純化擴增產物更為快速、便捷，效率高。此外，固定有引物的微球的密度可能會與擴增反應中的其他成分的密度不同，因此，在擴增反應過程中，可使整個擴增反應體系周期性震蕩，以有效提聞擴增效率。
[0150]針對所述含易感基因待測SNP位點的核酸片段所連有的標籤序列是在所述步驟A的可尋址固定過程中獲得，優選在連接接頭的時候，通過帶有標籤序列的接頭獲得。本發明分別得第十七、十八實施例，具體如下所述。
[0151]在第十七實施例中，所述步驟A2包括以下步驟:
A21、將不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物分別與不同的接頭連接，得多種連接產物；
A22、將多種連接產物分別固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上。
[0152]需要說明的是，本實施例中，所述不同的接頭均含有修飾標記和第三標籤序列；所述不同的接頭之間的不同之處優選僅在於第三標籤序列的不同；所述修飾標記，用於使其所在接頭能被固定在微球上；所述第三標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
[0153]在第十八實施例中，所述步驟A2包括以下步驟:
A21、將不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物分別與不同的固定在微球上的接頭連接，得多種被固定在微球上的連接產物；
A22、將多種固定有連接產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
[0154]需要說明的是，本實施例中，所述不同的固定在微球上的接頭均含有修飾標記和第三標籤序列；所述不同的固定在微球上的接頭之間的不同之處優選僅在於第三標籤序列的不同；所述修飾標記，用於使其所在接頭能被固定在微球上；所述第三標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
[0155]與第十七實施例相比，第十八實施例中的接頭被預先固定在微球上，減少了連接產物與微球連接的步驟，實驗效率更高。固定有接頭的微球的密度可能會與連接反應中的其他成分的密度不同，因此，在連接過程中，使整個連接反應體系周期性震蕩，可有效提高固定在微球上的接頭與含易感基因待測SNP位點的核酸片段的連接效率，避免連接反應體系中各成分分層而引起的連接效率低現象的出現。
[0156]在第十七實施例和第十八實施例中，所述接頭同前述一樣，可採用多種形式，包括但不限於平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭或含莖環結構的接頭，在此不再贅述。不過需要特別指出的是，針對不同的樣本來源的含易感基因待測SNP位點的核酸片段，所採用的接頭可以是相同或不同的。這使得本方案的適用範圍廣，能夠針對各種實際情況的不同，包括但不限於:待測樣本的不同、含易感基因待測SNP位點的核酸片段的具體序列的不同，採用不同的技術方案 ，以實現最優配置。
[0157]其中，不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的核酸片段同樣可通過直接或間接的方式可尋址的固定在固相載體上。
[0158]針對通過間接的方式可尋址的固定在固相載體上，本發明已經在第十五至十八實施例中進行了一定的闡述，在此不再贅述。
[0159]針對通過直接的方式可尋址的固定在固相載體上，本發明提出第十九實施例，所述步驟A具體如下:
利用多種特異性引物對對不同的待測樣本進行非單分子擴增，得不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物，然後將不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物可尋址的固定在固相載體上；所述各多種特異性引物對中均有一種引物上含有標記基團，所述標記基團用於使其固定在固相載體上。
[0160]本方案通過在各種特異性引物對中設置含有標記基團的引物，使得擴增產物中含有標記基團，進而通過該標記基團固定在固相載體上，實驗步驟簡單，實驗效率聞。
[0161]優選的，特異性引物對中的標記基團位於引物的5』端。所述標記基團可為生物素、未和素、鏈黴未和素、納米金、鵬乙酸、疏基、氣基、醒基、竣基、異硫氛基、娃烷基或丙稀醯胺。
[0162]優選的，所述特異性引物對中的一種引物被預先固定在固相載體上。
[0163]更優選的，所述特異性引物對有多種，它們均含有第三標籤序列；所述第三標籤序列用於識別待測SNP位點的類型和不同的待測樣本，所述第三標籤序列位於標記基團所在的引物上。[0164]本方案可通過預先分別將多種特異性引物對中的含標記基團的引物分別可尋址固定在固相載體上，然後只通過一步反應即實現了含易感基因待測SNP位點的核酸片段的擴增和固定，實驗步驟簡單，實驗效率高，且本方案可不僅僅通過對固相載體進行物理分區實現可尋址的固定，還可通過第三標籤序列驗證，提高檢測的準確性。
[0165]優選的，所述第三標籤序列位於其所在引物的5』端。本方案降低了對非單分子擴增反應中引物設計的難度，減少了對非單分子擴增的影響。
[0166]在上述實施例中，當步驟B中對多個樣本的不同易感基因待測SNP位點進行測序反應時，對應的錨定引物一般可如圖5所示，設計為:
a、接頭中的一段序列；或
b、各特異性引物對中的一段序列；或
C、各特異性引物對中的一段序列的互補序列；或
d、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列；或
e、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列所組成的核酸鏈的互補序列；或
f、各易感基因待測SNP位點所在位置的3』端的互補序列；或
g、各易感基因待測SNP位點所在位置的5』端的互補序列。 [0167]其中，a、d、e方案適用於含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案山、C、f、g適用於所有的技術方案。
[0168]在不同樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案中，當將錨定引物設計成接頭中的一段序列時，為了避免接頭序列對所述步驟B中測序反應的幹擾，可使接頭僅與各含易感基因待測SNP位點的核酸片段的一端連接。為實現上述目的，優選的，所述各特異性引物對中均僅有一種引物(上遊引物或下遊引物)的5』端含有磷酸基團。更優選的，所述各特異性引物對中均僅將用於擴出易感基因待測SNP位點所在鏈的引物的5』端設計成含有磷酸基團的引物。
[0169]基於上述任一方案，尤其是當含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過微球固定在固相載體上時，所述固相載體優選為玻片或矽片。玻片或矽片具有優良的特性，便於修飾以利於與微球的結合，所述玻片或矽片與微球之間的結合方式包括但不限於:生物素-親和素/鏈黴親和素、納米金/碘乙醯-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、矽烷基-丙烯醯胺。同時，玻片或矽片具有良好的透光性，有利於後續測序反應的順利進行。
[0170]當採用合成測序法進行測序時，優選的，所述錨定引物的3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp之間，更優選在I至4bp之間。本方案使得在步驟B中的測序反應僅需通過I個或數個延伸反應循環即可完成易感基因待測SNP位點檢測，能有效提高檢測效率，降低檢測成本。
[0171]當採用連接測序法進行測序時，優選的，所述錨定引物上用於連接寡核苷酸探針的一端距易感基因待測SNP位點I至9bp之間，更優選在I至5bp之間。因為最為常見的連接酶——T4連接酶最大限度能保證6個鹼基正確互補配對，所以，本方案使得所述步驟B中的測序反應僅需進行一輪連接反應即可實現易感基因待測SNP位點的檢測，能有效提高檢測效率，降低檢測成本。
[0172]基於上述任一實施例，所述每個特異性引物對中的至少一種引物的3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp。因為用於擴增易感基因待測SNP位點的特異性引物對的設計和錨定引物的設計有共通之處，均需要保證匹配的特異性，以避免非特異性擴增或非特異性互補配對。所以，在本方案中，可將錨定引物設計在特異性引物對中3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp的引物上，這可有效提高實驗設計效率，且使得步驟B中的測序反應僅需進行一輪連接反應即可實現易感基因待測SNP位點的檢測，或僅需通過I個或數個延伸反應循環即可完成易感基因待測SNP位點檢測，能有效提高檢測效率，降低檢測成本。
[0173]因為在步驟B的測序反應過程中，針對同一種易感基因待測SNP位點的錨定引物往往是相同的，但是針對不同易感基因待測SNP位點的錨定引物往往並不相同，這往往會使得測序過程中不同易感基因待測SNP位點的測序信號存在差異，影響SNP位點檢測的準確性。
[0174]對此，發明人對本發明進行了進一步的改進:每個特異性引物對中的至少一種引物上含有第一歸一化序列，並在步驟B中對第一歸一化序列進行檢測。所述第一歸一化序列為一確定長度和序列的核苷酸序列，用於在測序過程中歸一化不同SNP位點檢測的測序信號。本方案通過在步驟B的測序反應過程中，對第一歸一化序列進行檢測，進而在後續的數據處理過程中，歸一化各易感基因待測SNP位點檢測所獲得測序信號，從而提高測序的準確性。
[0175]優選的，所述第一歸一化序列的長度在I至9bp之間；更優選在I至5bp之間。
[0176]當每個特異性引物對中的含有標籤序列，所述標籤序列用於識別不同的待測樣本，或用於識別易感基因待測SNP位點的類型，或用於同時識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型時，優選的，所述第一歸一化序列與標籤序列相連，可位於標籤序列的5』端，也可位於標籤序列的3』端，這樣標籤序列和第一歸一化序列的檢測可以使用同一個錨定引物，既減少 了錨定引物的設計工作量，又提高了檢測的效率。
[0177]此外，針對上述包括含易感基因待測SNP位點的核酸片段與接頭連接步驟的方案，發明人還提出了另一方案:所述接頭上含有第二歸一化序列，並在步驟B中對第一歸一化序列進行檢測。所述第二歸一化序列為一確定長度和序列的核苷酸序列，用於在測序過程中歸一化不同SNP位點檢測的測序信號。本方案通過在步驟B的測序反應過程中，對第二歸一化序列進行檢測，進而在後續的數據處理過程中，歸一化各易感基因待測SNP位點檢測所獲得測序信號，從而提高測序的準確性。
[0178]優選的，所述第二歸一化序列的長度在I至9bp之間；更優選在I至5bp之間。
[0179]當接頭中含有標籤序列，所述標籤序列用於識別不同的待測樣本，或用於識別易感基因待測SNP位點的類型，或用於同時識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型時，優選的，所述第二歸一化序列與標籤序列相連，可位於標籤序列的5』端，也可位於標籤序列的3』端，這樣標籤序列和第二歸一化序列的檢測可以使用同一個錨定引物，既減少了錨定引物的設計工作量，又提高了檢測的效率。
[0180]為了更好的解決本發明的技術問題，本發明還提供了一種易感基因SNP位點檢測試劑盒，包括:特異性引物對和固相載體；所述特異性引物對，用於通過非單分子擴增獲得含易感基因待測SNP位點的核酸片段；所述固相載體，用於可尋址固定含易感基因待測SNP位點的核酸片段。
[0181]本方案中，利用特異性引物對擴增所得的非單分子擴增產物(含易感基因待測SNP位點的核酸片段)能夠可尋址的固定在固相載體上，然後可通過測序反應測定非單分子擴增獲得的產物中的易感基因待測SNP位點信息，從而避免了現有技術中基於晶片技術的SNP分型方法中不同探針之間的相互幹擾，SNP位點的檢測通量和準確性僅受限於所採用的測序技術，大大的提高了對SNP位點進行檢測的通量；與現有技術相比，還能同時保證準確性不因通量的增加而急劇下降，保證了易感基因SNP位點檢測的準確性。此外，與通過單分子擴增引物進行單分子擴增，然後對單分子擴增產物進行測序獲得SNP位點序列信息相t匕，非單分子擴增方法無需特殊的前處理步驟，更簡單，且擴增效率更高、更快速(循環數更少)，能夠顯著的提高易感基因SNP位點檢測的效率。即，本方案中的試劑盒能夠提供一種避免現有技術中基於晶片技術的SNP分型方法中不同探針之間的相互幹擾，大大的提高了對易感基因待測SNP位點進行檢測的通量的試劑盒，且該試劑盒在使用過程中無需特殊的前處理步驟，更簡單，且擴增效率更高、更快速(循環數更少)，能夠顯著的提高易感基因SNP位點檢測的效率。
[0182]進一步的，所述SNP分型試劑盒還可包括接頭，所述接頭用於連接含易感基因待測SNP位點的核酸片段，所述接頭上含有修飾標記，用於使含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過接頭間接固定在固相載體上。
[0183]所述接頭可採用多種形式，包括但不限於平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭或含莖環結構的接頭。
[0184]所述平末端接頭是指雙鏈之間完全互補配對的雙鏈核酸接頭。優選的，所述平末端接頭的兩條鏈的5』末端均不含磷酸基團，其可避免連接過程中接頭自連現象的出現，減少對後續測序實驗的幹擾，提聞SNP分型檢測的準確率。
[0185]所述突出末 端接頭，是指雙鏈核酸分子中的至少一端帶有突出核苷酸序列，而其餘核昔Ife則完全互補的雙鏈核Ife接頭。關出末糹而接頭可為單關出末糹而(圖1)，也可以是含有兩個突出末端的雙突出末端，這兩個突出末端可在一條核苷酸鏈上(圖2a)或在不同的核昔Ife鏈上(圖2b)。所述關出末糹而接頭能夠避免連接過程中接頭自連現象的出現，減少對後續測序實驗的幹擾，提高SNP分型檢測的準確率。在本實施例的【具體實施方式】中，所述接頭優選為單突出末端接頭，且該突出末端為其所在鏈的3』末端，鹼基為T ;該接頭能夠與通過Taq酶擴增的含A尾的PCR擴增產物直接連接，提高連接效率。
[0186]所述分叉型接頭包括互補區和分叉區，其基本結構如圖3所示，互補區雙鏈的核苷酸互補配對，配對的核苷酸對數不限。互補區末端可為平末端或突出末端。所述分叉型接頭能夠避免連接過程中接頭自連現象的出現，減少對後續測序實驗的幹擾，提高SNP分型檢測的準確率。在本實施例的【具體實施方式】中，所述接頭優選為互補區的3』末端為突出末端，且突出末端最後一個鹼基為T的T末端分叉接頭；該接頭能夠與通過Taq酶擴增的含A尾的PCR擴增產物直接連接，提高連接效率。
[0187]所述帶莖環結構的接頭，如圖4所示。該接頭為單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子包括第一互補配對區1、莖環區2和第二互補配對區3(圖4a)，第一互補配對區I能夠與第二互補配對區3互補配對。如圖4b所示，帶莖環結構的接頭還可帶有突出末端4，該突出末端可位於單鏈核酸分子的3』端。突出末端4的存在能夠防止接頭自連現象的發生，減少對後續測序實驗的幹擾，提高SNP分型檢測的準確率。該突出末端優選為T ;該接頭能夠與通過Taq酶擴增的含A尾的PCR擴增產物直接連接，提高連接效率。[0188]所述修飾標記可為生物素、親和素、鏈黴親和素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸、納米金、碘乙醯、巰基、氨基、醛基、羧基、異硫氰基、矽烷基或丙烯醯胺，它們均能特異性的與相對應的基團或分子結合。
[0189]需要特別指出的是，針對不同的樣本來源的含易感基因待測SNP位點的核酸片段，所採用的接頭可以是相同或不同的。這使得本方案的適用範圍廣，能夠針對各種實際情況的不同，包括但不限於:待測樣本的不同、含易感基因待測SNP位點的核酸片段的具體序列的不同，採用不同的技術方案，以實現最優配置。
[0190]進一步的，所述SNP分型試劑盒還可包括錨定引物。根據利用本試劑盒獲得的含易感基因待測SNP位點的核酸片段的可尋址固定方式的不同，所述錨定引物可採用不同的設計，具體如下:
a、接頭中的一段序列；或
b、各特異性引物對中的一段序列；或
c、各特異性引物對中的一段序列的互補序列；或
d、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列；或
e、接頭的3』端的部分序列與各特異性引物對中與之相連的5』端的部分序列所組成的核酸鏈的互補序列；或
f、各易感基因待測SNP位點所在位置的3』端的互補序列；或
g、各易感基因待測SNP位點所在位置的5』端的互補序列。
[0191]其中，a、d、e方案適用於含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案山、C、f、g適用於所有的技術方案。
[0192]在不同樣本來源的含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過間接方式可尋址固定在固相載體的方案中，當將錨定引物設計成接頭中的一段序列時，為了避免接頭序列對所述步驟B中測序反應的幹擾，可使接頭僅與各含易感基因待測SNP位點的核酸片段的一端連接。為實現上述目的，優選的，所述特異性引物對中僅有一種引物(上遊引物或下遊引物)的5』端含有磷酸基團。更優選的，所述特異性引物對中僅將用於擴出易感基因待測SNP位點所在鏈的引物的5』端設計成含有磷酸基團的引物。
[0193]此外，根據利用本試劑盒獲得的含易感基因待測SNP位點的核酸片段被可尋址固定後所採用的檢測方法的不同，錨定引物還可進行進一步的設計。
[0194]當採用合成測序法進行測序時，優選的，所述錨定引物的3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp之間，更優選在I至4bp之間。本方案使得在步驟B中的測序反應僅需通過I個或數個延伸反應循環即可完成易感基因待測SNP位點檢測，能有效提高檢測效率，降低檢測成本。
[0195] 當採用連接測序法進行測序時，優選的，所述錨定引物上用於連接寡核苷酸探針的一端距易感基因待測SNP位點I至9bp之間，更優選在I至5bp之間。因為最為常見的連接酶——T4連接酶最大限度能保證6個鹼基正確互補配對，所以，本方案使得所述步驟B中的測序反應僅需進行一輪連接反應即可實現易感基因待測SNP位點的檢測，能有效提高檢測效率，降低檢測成本。
[0196]基於上述任一實施例，所述每個特異性引物對中的至少一種引物的3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp。因為用於擴增易感基因待測SNP位點的特異性引物對的設計和錨定引物的設計有共通之處，均需要保證匹配的特異性，以避免非特異性擴增或非特異性互補配對。所以，在本方案中，可將錨定引物設計在特異性引物對中3』端距易感基因待測SNP位點I至9bp的引物上，這可有效提高實驗設計效率，且使得步驟B中的測序反應僅需進行一輪連接反應即可實現易感基因待測SNP位點的檢測，或僅需通過I個或數個延伸反應循環即可完成易感基因待測SNP位點檢測，能有效提高檢測效率，降低檢測成本。
[0197]因為在步驟B的測序反應過程中，針對同一種易感基因待測SNP位點的錨定引物往往是相同的，但是針對不同易感基因待測SNP位點的錨定引物往往並不相同，這往往會使得測序過程中不同易感基因待測SNP位點的測序信號存在差異，影響SNP位點檢測的準確性。
[0198]對此，發明人對本發明進行了進一步的改進:每個特異性引物對中的至少一種引物上含有第一歸一化序列。所述第一歸一化序列為一確定長度和序列的核苷酸序列，用於在測序過程中歸一化不同SNP位點檢測的測序信號。本方案的試劑盒在使用中通過歸一化各易感基因待測SNP位點檢測所獲得測序信號，從而提高測序的準確性。
[0199]優選的，所述第一歸一化序列的長度在I至9bp之間；更優選在I至5bp之間。
[0200]此外，針對含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過接頭間接可尋址固定在固相載體上的方案，發明人還提出了另一方案:所述接頭上含有第二歸一化序列。所述第二歸一化序列為一確定長度和序列的核苷酸序列，用於在測序過程中歸一化不同SNP位點檢測的測序信號。本方案的試劑盒在使用過程中通過歸一化各易感基因待測SNP位點檢測所獲得測序信號，從而提高測序的準確性。
[0201]優選的，所述第二歸一化序列的長度在I至9bp之間；更優選在I至5bp之間。 [0202]基於上述任一方案，尤其是當含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過微球固定在固相載體上時，所述固相載體優選為玻片或矽片。玻片或矽片具有優良的特性，便於修飾以利於與微球的結合，所述玻片或矽片與微球之間的結合方式包括但不限於:生物素-親和素/鏈黴親和素、納米金/碘乙醯-巰基、氨基-醛基/羧基/異硫氰基、矽烷基-丙烯醯胺。同時，玻片或矽片具有良好的透光性，有利於後續測序反應的順利進行。
[0203]優選的，所述特異性引物對中含有標籤序列，所述標籤序列用於識別不同的待測樣本和/或易感基因待測SNP位點的類型。
[0204]為了實現對多個樣本的多個SNP位點的同時檢測，本發明的試劑盒中的特異性引物對中可含有標籤序列；所述標籤序列可設置在每個特異性引物對中的至少一種引物上。所述標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
[0205]本方案可實現對多個樣本的不同SNP位點的同時檢測，提高檢測效率。
[0206]優選的，所述標籤序列位於每個特異性引物對中的用於擴增易感基因待測SNP位點所在鏈的引物上。這樣，在測序過程中，僅需錨定引物互補至對易感基因待測SNP位點所在鏈上進行測序反應，即可實現對易感基因待測SNP位點和標籤序列的檢測，進而確定不同待測樣本來源的SNP位點的基因型；本方案還能減少後續數據處理過程中的步驟，例如:當標籤序列位於易感基因待測SNP位點所在鏈的互補鏈時，測序反應獲得的就是標籤序列的互補序列，這樣在後續的數據處理過程中就必須對這一部分數據進行轉換。
[0207]更優選的，所述標籤序列在其所在引物的5』端。
[0208]優選的，所述第一歸一化序列與標籤序列相連，可位於標籤序列的5』端，也可位於標籤序列的3』端，這樣標籤序列和第一歸一化序列的檢測可以使用同一個錨定引物，既減少了錨定引物的設計工作量，又提高了檢測的效率。
[0209]當然，本發明的試劑盒還可通過在接頭中設計標籤序列而達到同時對多個樣本進行檢測的目的，或者更進一步實現對更多樣本進行同時檢測的目的。所述標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。針對不同的樣本和易感基因待測SNP位點的類型組合，所使用的接頭之間優選僅在於標籤序列的不同。
[0210]優選的，所述第二歸一化序列與標籤序列相連，可位於標籤序列的5』端，也可位於標籤序列的3』端，這樣標籤序列和第二歸一化序列的檢測可以使用同一個錨定引物，既減少了錨定引物的設計工作量，又提高了檢測的效率。
[0211]針對上述各技術方案，為進一步說明本發明所記載技術方案的技術效果及優越性，本發明給出下述具體實施例。
[0212]在一具體實施例中，以100個人的血液基因組DNA為模板，對腫瘤易感基因SNP位點進行檢測，相關基因和SNP位點如下:CYP27B1基因的rs3782130，CYP24A1基因的 rs229624U rs2296239、rs6068816、rs4809957, VDR 基因的 rs731236、rsll574129、rs2228570, GC 基因的 rs7041、rs4588。
[0213]其中，針對上述各SNP位點與相對應的PCR擴增引物的對應關係如表1所示:
表1各SNP位點對應的引 物
【權利要求】
1.一種易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: A.利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，將擴增產物可尋址的固定在固相載體上； B.對固定在固相載體上的擴增產物中的易感基因待測SNP位點進行測序，進而確定易感基因待測SNP位點的基因型。
2.根據權利要求1所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述擴增產物通過微球間接的可尋址固定在固相載體上。
3.根據權利要求2所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述步驟A包括以下步驟: Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得擴增產物； A2、將擴增產物與接頭連接，得連接產物； A3、將連接產物固定在微球上，然後將微球可尋址的固定在固相載體上。
4.根據權利要求2所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述步驟A包括以下步驟: Al、利用特異性 引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得擴增產物； A2、將擴增產物與固定在微球上的接頭連接，得被固定在微球上的連接產物； A3、將固定有連接產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
5.根據權利要求2所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述步驟A包括以下步驟: Al、利用特異性引物對對待測樣本進行非單分子擴增，得固定在微球上的擴增產物；所述特異性引物對中僅有一種引物被預先固定在微球上； A2、將固定有擴增產物的微球可尋址的固定在固相載體上。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述待測樣本有多個；所述易感基因待測SNP位點有多個；所述步驟A為: 利用多種特異性引物對分別對多個待測樣本進行非單分子擴增，得多種不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物，進而將這些擴增產物分別可尋址的固定在固相載體上； 所述多種不同待測樣本來源的含不同易感基因待測SNP位點的擴增產物均連有標籤序列；所述標籤序列用於識別不同的待測樣本和易感基因待測SNP位點的類型。
7.根據權利要求6所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述標籤序列來源於特異性引物對或與擴增產物連接的接頭。
8.根據權利要求7所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述特異性引物對中的至少一種引物上含有歸一化序列；或所述接頭中含有歸一化序列。
9.根據權利要求1所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述步驟B中的測序方法為基於連接測序法或合成測序法。
10.根據權利要求9所述的易感基因SNP位點檢測方法，其特徵在於，所述步驟B進行測序反應時的錨定引物為易感基因待測SNP位點所在位置的3』端的互補序列或易感基因待測SNP位點所在位置的5』端的互補序列。
11.一種易感基因SNP位點檢測試劑盒，其特徵在於，包括:特異性引物對和固相載體； 所述特異性引物對，用於通過非單分子擴增獲得含易感基因待測SNP位點的核酸片段； 所述固相載體，用於可尋址固定含易感基因待測SNP位點的核酸片段。
12.根據權利要求11所述的易感基因SNP位點檢測試劑盒，其特徵在於，還包括接頭，所述接頭用於連接含易感基因待測SNP位點的核酸片段，所述接頭上含有修飾標記，用於使含易感基因待測SNP位點的核酸片段通過接頭間接固定在固相載體上。
13.根據權利要求11所述的易感基因SNP位點檢測試劑盒，其特徵在於，還包括錨定引物，所述錨定引物為特異性引物對中的一段序列；或 特異性引物對中的一段序列的互補序列；或 易感基因待測SNP位點所在位點的3』端的互補序列；或 易感基因待測SNP位點所在位點的5』端的互補序列。
14.根據權利要求12所述的易感基因SNP位點檢測試劑盒，其特徵在於，所述接頭為單突出末端接頭，且該突出末端為其所在鏈的3』末端，鹼基為T。
15.根據權利要求12所述的易感基因SNP位點檢測試劑盒，其特徵在於，所述特異性引物對或接頭上含有標籤序列。
16.根據權利要求12所述的易感基因SNP位點檢測試劑盒，其特徵在於，所述特異性引物對中的至少一種引物上含有歸一化序列；或所述接頭中含有歸一化序列。
【文檔編號】C12Q1/68GK103981258SQ201410175486
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月25日 優先權日:2014年4月25日
【發明者】盛司潼 申請人:深圳華因康基因科技有限公司