α1β1整聯蛋白的可誘導的配體和用途的製作方法

2023-08-11 16:11:41

專利名稱：α1β1整聯蛋白的可誘導的配體和用途的製作方法
背景一種特殊的整聯蛋白受體——整聯蛋白α1β1，在與阿爾波特症候群(Alport syndrome)相關的間質病的發展過程中發揮作用。這種作用是通過將阿爾波特小鼠(Alport mouse)與整聯蛋白α1基因剔除小鼠雜交證實的(Cosgrove等，Am.J.Path.，157，1649-1659(2000))。儘管該整聯蛋白在腎臟中廣泛表達，但所述整聯蛋白剔除突變對正常小鼠的腎臟發育或功能沒有明顯影響(Gardner等，Dev.Biol.175，301-313(1996))。不過，當在阿爾波特小鼠的遺傳背景中添加α1整聯蛋白突變時，顯著減輕了腎小球病和腎小管間質病。腎小球病理的減輕與對腎小球膜擴張的影響和GBM中腎小球膜層粘連蛋白的沉積相關(Cosgrove等，Am.J.Path.，157，1649-1659(2000))。不過，α1整聯蛋白無效突變對腎小管間質病的影響尚不很清楚。
概述本發明正是基於發現在阿爾波特小鼠腎的血管內皮細胞表面上存在特異的，可誘導的配體。重要的是，由此提供了多種治療方法和鑑定適合用於所述治療方法中的化合物(例如，小有機分子和肽)的方法。
優選地是，該特異的可誘導的配體存在於阿爾波特小鼠腎而不是正常腎的血管內皮細胞表面上。該配體結合純化的整聯蛋白α1β1，並且阿爾波特(Alport)腎中單核細胞是整聯蛋白α1β1-陽性的。根據單核細胞運輸測定，新流出的單核細胞是整聯蛋白α1β1-陽性的，而只有一部分骨髓衍生的單核細胞(10％)是整聯蛋白α1β1-陽性的。整聯蛋白α1β1-缺陷型阿爾波特(DKO)小鼠中單核細胞流出速度比非阿爾波特小鼠中的流出速度低得多。通過注射純化的整聯蛋白α1β1(從Chemicon，Temecula，CA購買)功能性地阻斷所述配體降低了單核細胞流入阿爾波特腎的間質間隙的速度。總之，該證據證明了阿爾波特血管內皮上存在整聯蛋白α1β1的可誘導的配體，該配體介導整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入間質。DKO數據顯示流出開始的延遲，流出速度慢得多，DKO數據與通過注射純化的α1β1整聯蛋白得到的配體阻斷數據一起說明了功能性阻斷該配體(配體定義為腎臟中能結合Alexa-標記的整聯蛋白α1β1的物質，其中結合在將該試劑注射到7周齡的純合的129Sv/J遺傳背景的阿爾波特小鼠的尾靜脈內之後6小時內出現)將降低單核細胞流出的速度，這對於任何慢性炎性疾病來說都具有治療益處，其中，在這些疾病中觀察到整聯蛋白α1β1-陽性間質單核細胞/淋巴細胞積累。
在一種實施方案中，本發明提供了治療患有慢性炎性疾病的患者的方法。該方法包括給所述患者施用阻斷劑(例如，肽或中和抗體)，以便中和膠原XIII結合α1β1整聯蛋白的能力。所述慢性炎性疾病優選以由浸潤性單核細胞、淋巴細胞，或這兩者導致的漸進性病理為特徵。所述慢性炎性疾病的實例包括腎臟纖維化，肺纖維化、肝纖維化、類風溼關節炎、牛皮癬、實驗性結腸炎、或新月體性腎小球腎炎。優選的是，所述阻斷劑能阻斷外周血單核細胞和/或淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與慢性發炎組織的血管內皮上膠原XIII的相互作用。
在另一種實施方案中，本發明提供了用於治療患有炎性疾病或其他狀況的受試者的方法，在該疾病或狀況中觀察到整聯蛋白α1β1-陽性間質單核細胞和/或淋巴細胞積累。該方法包括給所述受試者施用能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的活性劑。優選地，所述活性劑阻斷膠原XIII(位於慢性發炎組織血管內皮上)和α1β1整聯蛋白(位於外周血單核細胞和/或淋巴細胞上)的結合。優選地，所述阻斷劑是肽或抗體。優選地，所述炎性疾病或其他狀況是腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化、類風溼關節炎、牛皮癬、實驗性結腸炎、或新月體性腎小球腎炎。
在另一種實施方案中，本發明提供了一種減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質的方法。該方法包括將外周血單核細胞和/或淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與幹擾膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的活性劑接觸。這一目的可以通過幾種不同的途徑實現。例如，減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質包括讓所述α1β1整聯蛋白與具有膠原XIII的至少一部分胺基酸序列的能特異結合α1β1整聯蛋白的肽接觸。備選地，減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質包括在能有效封閉膠原XIII的結合位點的條件下與抗體接觸，該抗體結合發炎組織的血管/毛細血管內皮細胞的細胞表面上的膠原XIII配體。在另一種備選實施方案中，減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質包括在能有效防止膠原XIII蛋白在所述細胞表面上表達的條件下讓所述血管內皮與小的抑制性RNAs接觸。
在另一種實施方案中，本發明提供了一種降低單核細胞和/或淋巴細胞流入慢性發炎組織的間質間隙的速度的方法。該方法包括阻斷膠原XIII與α1β1整聯蛋白結合。這一目的可以通過阻斷膠原XIII配體實現或可以通過阻斷α1β1整聯蛋白實現。在一種實施方案中，所述阻斷劑是含有α1β1整聯蛋白的結合位點的膠原XIII的肽片段。在備選實施方案中，所述阻斷劑是單特異性抗體，它能結合發炎組織的血管/毛細血管內皮細胞表面上的膠原XIII。
在另一種實施方案中，本發明提供了一種降低單核細胞和/或淋巴細胞流入慢性發炎組織的間質間隙的速度的方法。該方法包括阻斷膠原XIII與α1β1整聯蛋白結合。
在另一種實施方案中，本發明提供了一種阻斷外周血單核細胞和/或淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與慢性發炎組織的血管內皮上的膠原XIII相互作用的方法。該方法包括讓單核細胞和/或淋巴細胞、血管內皮、或這兩者與一種試劑接觸，該試劑佔據α1β1整聯蛋白上的膠原XIII結合位點(例如，肽抑制劑)或封閉膠原XIII上的α1β1結合位點(例如，中和性單克隆抗體)。
本發明提供了鑑定能抑制單核細胞流入模型的間質間隙的試劑的方法，該模型中，涉及到間質單核細胞或淋巴細胞。該方法包括鑑定能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的試劑。在一種實施方案中，所述試劑抑制Alexa-綴合的純化α1β1整聯蛋白與MCP-1處理的原代內皮細胞的結合。在備選實施方案中，所述試劑是能阻斷Alexa-綴合的經純化的α1β1整聯蛋白與培養物中MCP-1處理的血管內皮細胞相互作用的抗體。
本發明還提供了具有序列GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)的分離的肽，其中，所述肽能破壞(例如，阻斷)膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用。優選地，所述分離的肽具有序列GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)。在某些實施方案中，所述分離的肽的長度為8-16個胺基酸。在其他實施方案中，所述分離的肽長度為12-16個胺基酸。對某些實施方案來說，所述分離的肽由GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)組成。對某些實施方案來說，所述分離的肽由GEKGAEGSPGLL(SEQ IDNO2)組成。
本發明還提供了分離的肽，它的胺基酸序列與GAEGSPGL(SEQ IDNO.1)具有至少70％的序列同一性，其中，所述序列能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用。在另一種實施方案中，本發明提供了分離的肽，它的胺基酸序列與GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)具有至少70％的序列同一性，其中，所述肽能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用。
本發明還提供了針對本文所描述的肽的抗體。
在本文中，「一個(a)」或「一個(an)」表示一個或多個(或至少一個)，從而例如，活性劑(即活性氧化應激調節劑)的組合可用於本發明的組合物和方法中。因此，包括「一個」多肽的組合物表示包括一個或多個多肽的組合物。
本文所使用的「胺基酸」表示具有以下通式的化合物NH2---CRH---COOH，側鏈R是H或有機基團。當R是有機基團時，R可以改變，並且是極性的或非極性的(即，疏水的)。本發明的胺基酸可以是天然存在的或合成的(通常稱作非蛋白原的)。在本文中，有機基團是歸類為脂族基團的烴基、環狀基團或脂族和環狀基團的組合。術語「脂族基團」表示飽和的或非飽和的線性或支鏈烴基。例如，該術語被用於包括烷基、鏈烯基、和炔基。術語「環狀基團」表示閉合的環狀烴基，它被歸類為脂環基、芳基、或雜環基。術語「脂環基」表示環狀烴基，其具有類似於脂族基團的性質。術語「芳基」表示單環或多環芳族烴基。在本文中，有機基團可以是取代的或未取代的。
術語「多肽」和「肽」在本文中可以互換使用，用於表示胺基酸的聚合物。這些術語並不表示胺基酸聚合物的特定長度。因此，例如，術語寡肽、蛋白、和酶包括在多肽或肽的定義內，無論該寡肽、蛋白和酶是採用重組技術、化學或酶促合成生產的或天然存在的。該術語還包括業已修飾或衍生化的多肽，如通過糖基化、乙醯化、和磷酸化等修飾或衍生。
在本申請中使用了以下縮略語
附圖簡述

圖1A和1B.阿爾波特間質中的單核細胞主要是整聯蛋白α1β1-陽性的。圖片表示來自所標明的年齡的阿爾波特腎皮質組織切片的免疫螢光免疫染色的圖片，該免疫螢光免疫染色使用了抗CD11b的抗體(圖1A)和抗整聯蛋白α1β1的抗體(圖1B)。注意到所有單核細胞對α1β1整聯蛋白都是免疫陽性的。
圖2A-2E.大約10％的骨髓衍生的單核細胞表達整聯蛋白α1β1。螢光激活細胞分類術(FACS)用於骨髓衍生的淋巴細胞的雙色分析，其中使用單核細胞(CD11bPE)和整聯蛋白α1β1(VLA Alexa)的抗體標記，和同種型匹配的對照抗體。大約10％的CD11b-陽性細胞同樣是整聯蛋白α1β1陽性的(圖2E，雙重-陽性細胞，位於頻率分布圖的上部右側象限)。
圖3A-3D.尾靜脈注射Alexa 568-標記的葡聚糖使得CD11b-陽性單核細胞能夠運輸；募集到阿爾波特小鼠的腎小管間質中的所有單核細胞都是整聯蛋白α1β1陽性的。用1μg的Alexa-568-綴合的葡聚糖注射7-周齡的阿爾波特小鼠。在注射3天之後，收穫腎臟，將其包埋在OCT含水包埋介質中，並且製作冰凍切片。用FITC-綴合的抗整聯蛋白α1β1-特異抗體(圖3C)或FITC-綴合的抗-CD11b抗體(圖3A)對組織切片進行免疫染色。結果明確地表明新滲入阿爾波特腎小管間質的Alexa-標記的細胞都是單核細胞，並且都是整聯蛋白α1β1-陽性的。圖3B和3D顯示在尾靜脈注射Alexa 568-綴合的葡聚糖三天後，在阿爾波特腎的間質中的Alexa 568-陽性細胞。只有單核細胞(CD11b是單核細胞的特異標記)被標記(圖3B中的所有螢光信號與圖3A中的螢光信號進行相位對正)。新流出的單核細胞(圖3D)對整聯蛋白α1β1都是免疫-陽性的(VLA1，圖3C)。
圖4A和4B.與阿爾波特小鼠相比，在整聯蛋白α1β1-缺陷型阿爾波特小鼠的腎皮質中單核細胞流出被推遲，並且單核細胞流出的速度降低。用純化的α1β1整聯蛋白阻斷該配體可以降低單核細胞流入間質的速度。圖4A.通過尾靜脈注射Alexa 568-標記的葡聚糖單核細胞評估的單核細胞運輸是在阿爾波特小鼠中相對α1β1-整聯蛋白-缺陷型(DKO)阿爾波特小鼠進行分析的，作為腎病發展的函數。數據點表示兩種獨立動物的20個視野(放大200倍)。僅使用ImagePro-Plus(Media Cybernetics，Bethesda，MD)軟體對CD11b-陽性/Alexa-陽性信號打分。所述明確的數據表明，與阿爾波特小鼠相比，DKO小鼠中單核細胞流出的開始推遲了。曲線的斜率(來自採用Sigma Plot(Sigma，St.Louis，MO)軟體的線性回歸)表明與阿爾波特小鼠相比，在DKO小鼠中單核細胞的流出速度顯著降低了。圖4B表示在用標記的葡聚糖注射前1天，用5μg純化的α1β1整聯蛋白注射阿爾波特小鼠或不用它注射，並且每天用5μg強化，直到注射標記過的葡聚糖之後三天。對單核細胞(抗-cd11b)的冰凍切片進行染色，並且按上述方法計數雙重標記的細胞。結果表明了在用純化的整聯蛋白注射的小鼠中單核細胞流出減弱，確定了整聯蛋白介導單核細胞流入腎小管間質間隙的功能。線條表示標準誤。
圖5A-5C.α1β1整聯蛋白能結合阿爾波特腎的血管內皮，但不能結合正常腎的血管內皮。將純化的α1β1整聯蛋白綴合到Alexa 568螢光染料，並且注射到正常(A)小鼠和阿爾波特(B)小鼠的尾靜脈中。24小時之後，收穫腎臟，冰凍切片，並且使用螢光顯微鏡成像。圖5C表示Alexa-標記的整聯蛋白結合在單核細胞中不是被吞噬的整聯蛋白，因為這兩種信號(比較圖5B中信號和圖5C中信號的位置)不是共定位的。
圖6.與對照相比，來自阿爾波特小鼠的血管內皮細胞中誘導了膠原XIII mRNA。從野生型和阿爾波特腎中分離內皮細胞，然後提取RNA。用寡聚dT引物逆轉錄RNA。用GAPDH(泳道1-3)和膠原XIII-880bp(泳道4-6)實施PCR擴增。泳道1水對照GAPDH；泳道2野生型GAPDH；泳道3阿爾波特GAPDH；泳道4水對照ColXIII；泳道5野生型Col XIII；泳道6阿爾波特Col XIII；和泳道M100bp序列梯。
圖7.MCP-1能促進VLA1重組蛋白在體外的內皮細胞結合。用標明濃度的重組MCP-1處理來自小鼠腎臟的經培養的原代內皮細胞。對一式三份的孔進行分析，分析與純化的螢光染料-綴合的整聯蛋白α1β1結合的能力。數據表示來自3次獨立實驗的平均值和標準差。
圖8.過氧化氫能促進VLA1重組蛋白在體外的內皮細胞結合。用標明濃度的過氧化氫處理來自小鼠腎臟的經培養的原代內皮細胞。對一式三份的孔進行分析，分析與純化的螢光染料-綴合的整聯蛋白α1β1結合的能力。數據表示來自3次獨立實驗的平均值和標準差。
圖9.來自培養的腎內皮細胞的膠原XIII的間接免疫沉澱反應。對未處理過的或MCP-1處理的原代內皮細胞進行間接免疫沉澱反應分析。裂解細胞，並且將純化的α1β1整聯蛋白添加到裂解液中。用抗-α1整聯蛋白抗體使複合體免疫沉澱。通過用抗-膠原XIII抗體檢測的蛋白印跡分析免疫沉澱。用箭頭表示膠原XIII的預期的帶(分別為93和115千道爾頓)。
圖10.在阿爾波特腎中，膠原XIII與血管內皮細胞標記CD31是共定位的，但在正常腎中則不是。用針對膠原XIII或CD31的抗體對來自正常對照和阿爾波特小鼠的腎冰凍切片進行免疫螢光分析。用線條框起來的區域是膠原XIII與血管內皮明確相位對正的區域。這些區域只在纖維化的腎臟中觀察到。
本發明闡明性實施方案詳述本發明基於發現阿爾波特小鼠腎的血管內皮細胞表面上存在特異的可誘導的配體。重要的是，它提供了目的在於破壞可誘導的配體及其受體(α1β1整聯蛋白)之間的相互作用的多種治療方法。
所述特異的可誘導的配體是膠原XIII。與對照相比，在來自阿爾波特腎的內皮細胞中誘導了膠原XIII mRNA。通過MCP-1和過氧化氫誘導了純化的α1β1整聯蛋白的結合。注射到阿爾波特小鼠而不是正常小鼠的尾靜脈中的標記過的α1β1整聯蛋白能結合所述血管內皮。不過，應當指出的是，在正常小鼠血管內皮上和未處理過的內皮細胞培養物中觀察到了膠原XIII表達的基礎水平。可能有其他因素促進了「可誘導的」結合。可能的候選物是選擇蛋白，它是能促進淋巴細胞、單核細胞、和B-細胞在血管內皮上「緩慢滾動(slowrolling)」的蛋白家族的成員。這種緩慢滾動是通過較典型的配體/受體相互作用促進牢固粘附所需的。所述選擇蛋白是在炎性組織，而不是正常組織的血管內皮上誘導的。
重要的是，本發明提供了用於治療炎性疾病或其他狀況的方法，其中，觀察到了整聯蛋白α1β1-陽性間質單核細胞和/或淋巴細胞累積。所述方法包括對患有所述狀況的受試者施用能破壞(例如，阻斷或中和)所述可誘導的配體膠原XIII及其受體α1β1整聯蛋白之間的相互作用的活性劑。所述狀況包括，例如，腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化、類風溼關節炎、牛皮癬、實驗性結腸炎、和新月體性腎小球腎炎。本發明還提供了鑑定適用於所述治療方法的試劑(例如，小有機分子、肽、抗體、SiRNAs)。
具體地講，本發明提供了以下發現所述可誘導的配體能結合純化的整聯蛋白α1β1；阿爾波特腎中的所有單核細胞是整聯蛋白α1β1-陽性的；根據單核細胞運輸測定，新流出的單核細胞都是整聯蛋白α1β1-陽性的，而只有一部分骨髓衍生的單核細胞(10％)是整聯蛋白α1β1-陽性的；整聯蛋白α1β1-缺陷型阿爾波特(DKO)小鼠中單核細胞流出的速度明顯比非阿爾波特小鼠的慢；通過注射純化的整聯蛋白α1β1功能性阻斷所述配體，能降低單核細胞流入阿爾波特腎的間質間隙的速度。總之，該證據證實了在阿爾波特血管內皮上存在整聯蛋白α1β1的可誘導的配體，該配體介導了整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入所述間質。
因此，本發明提供了阻斷/減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織間質的方法。該方法包括讓循環的外周血單核細胞/淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與本文所描述的活性劑(例如，具有膠原XIII的部分組成的肽，它能特異結合α1β1整聯蛋白)接觸。備選地，該方法包括施用一種活性劑(例如，人源化單特異性抗體製劑)，它能以如下方式結合發炎組織的血管/毛細血管內皮細胞的細胞表面上的膠原XIII配體，使得結合的活性劑(例如，抗體)封閉膠原XIII的結合位點，從而防止外周血單核細胞/淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與血管/毛細血管內皮細胞上的膠原XIII結合。另外，該方法可以包括活性劑(例如，小的抑制性RNAs)的用途，它能以如下方式靶定所述血管內皮，從而防止膠原XIII蛋白在所述細胞表面上的表達，從而防止/減弱α1β1整聯蛋白-陽性單核細胞/淋巴細胞向發炎組織的粘附/跨內皮遷移。
所述DKO數據表明流出的開始推遲，並且具有明顯變慢的流出速度，與通過注射純化的α1β1整聯蛋白獲得的配體封閉結果結合在一起，闡明了功能性地封閉該配體(被定義為腎臟中結合Alexa-標記的整聯蛋白α1β1的物質，它能在將該試劑注射到純的129Sv/J遺傳背景的7周齡阿爾波特小鼠的尾靜脈6小時之內結合Alexa-標記的整聯蛋白α1β1)能降低單核細胞流出速度。
因此，本發明提供了降低單核細胞(和/或淋巴細胞)流入慢性發炎組織間質間隙的速度的方法。該方法包括通過讓淋巴細胞和/或單核細胞的細胞表面上的α1β1整聯蛋白與能破壞(例如，阻斷或中和)膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的試劑接觸來阻斷膠原XIII與α1β1整聯蛋白結合，特別是當α1β1整聯蛋白受體呈遞給循環的外周血單核細胞或淋巴細胞表面上的膠原XIII配體的時候。這可由使用諸如含有α1β1整聯蛋白結合位點的膠原XIII的肽片段的活性劑導致。備選地，該方法包括使用諸如單特異性抗體的活性劑，該活性劑能以如下方式結合發炎組織的血管/毛細血管內皮細胞表面上的膠原XIII從而阻斷血管內皮細胞上的膠原XIII與循環的外周血單核細胞/淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白相互作用(例如，結合)的能力，從而防止/減弱整聯蛋白α1β1-陽性淋巴細胞/單核細胞的粘附和向發炎組織的間質間隙中轉移。
用Alexa-568葡聚糖-加載的單核細胞進行的骨髓轉移研究顯示了與對照相比，來自α1整聯蛋白無效小鼠的細胞的單核細胞流出速度明顯降低。採用用於檢測相互作用結合配偶體(partner)的噬菌體展示方法，鑑定膠原XIII是α1β1整聯蛋白的內皮細胞配體。這種獨特的膜結合膠原以前業已顯示能結合α1β1整聯蛋白，不過該膠原的功能在本發明記載的發現之前是未知的。與對照相比，在來自阿爾波特小鼠的內皮細胞上發生了膠原XIII的增強的表達。通過單核細胞化學引誘蛋白1(MCP-1)在腎臟內皮細胞培養物中誘導了膠原XIII，MCP-1是以前記載的在阿爾波特腎中誘導的趨化因子，並且業已表徵了它在慢性發炎的組織中募集單核細胞的作用。阻斷膠原XIII與α1β1整聯蛋白結合的能力對於任何慢性炎性疾病來說都有治療益處，在所述疾病中觀察到整聯蛋白α1β1-陽性間質單核細胞積累。因此，本發明提供了治療慢性炎性疾病的方法，該疾病為諸如腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化、類風溼關節炎、牛皮癬、實驗性結腸炎，和新月體性腎小球腎炎。該方法包括阻斷膠原XIII與α1β1整聯蛋白的結合(或中和它們的相互作用)。在本文中，「治療」表示在所述狀況的至少一種臨床症狀上出現了改善。例如，治療涉及通過抑制或減弱單核細胞/淋巴細胞流入慢性炎症位點的間質間隙延緩或抑制慢性炎性狀況的發展。
使用本文所描述的Alexa-綴合的葡聚糖注射方法，本領域技術人員可以測定治療劑(即，活性劑)抑制單核細胞流入模型(例如，小鼠模型)的間質間隙的能力，在該模型中涉及到間質單核細胞或淋巴細胞。在本文中，「抑制」表示通過阻斷或減少外周血淋巴細胞/單核細胞細胞表面上的α1β1整聯蛋白受體粘附在炎性組織的血管/毛細血管內皮上的膠原XIII配體上來抑制或減弱淋巴細胞/單核細胞從外周血循環跨內皮遷移到發炎組織的間質間隙中。
所述測定包括，例如至少兩種實驗策略。第一種測定包括分析討論中的治療劑抑制Alexa-綴合的純化的α1β1整聯蛋白與MCP-1處理的原代內皮細胞結合的能力。例如，這一目的可以通過使用在具體方法中描述的96孔微量滴定板形式和螢光平板讀出器實現。可以將製劑滴定到所述結合測定中，並且通過抑制結合所需要的濃度判斷它們的相對效力。然後能夠以多種劑量將肽、抗體或SiRNAs導入阿爾波特小鼠模型。可以按照本文所描述的具體方法注射Alexa螢光染料-綴合的葡聚糖對體內效力進行定量評估。間質中的標記過的細胞都是單核細胞(例如，參見圖3A和3B)。與年齡和性別匹配的載體注射的阿爾波特小鼠相比，Alexa-標記的單核細胞數量的百分比(％)減少可以被認為是討論中的特定試劑的體內效力的直接量度。
第二種測定方法涉及使用單特異性抗體。這種抗體是通過將包含膠原XIII的整聯蛋白結合結構域(例如，SEQ ID NO2)的肽抗原注射到小鼠或注射到大鼠體內，以便產生抗體以引起針對所述肽抗原的免疫反應。從脾臟分離來自所述動物的能產生抗體的B細胞，並且採用常規技術(聚乙二醇融合方法)將該B細胞與骨髓瘤細胞融合。來自抗體產生性細胞的克隆群體(雜交瘤)的培養物上清液含有單特異性(或單克隆)抗體。首先測定用這種方法製備的抗體阻斷Alexa-綴合的純化的α1β1整聯蛋白與本文描述的培養物中MCP-1處理的血管內皮細胞的相互作用的能力。在體內分析具有這種特性的單特異性抗體。所述抗體是從培養物上清液中純化的，該純化包括與A蛋白瓊脂糖結合併且隨後從它上面洗脫，這是用於從雜交瘤上清液中純化/濃縮抗體的標準化方法。將有效量的抗體注射到阿爾波特小鼠模型體內，並且在24小時之後，用Alexa-綴合的葡聚糖注射相同小鼠。在注射葡聚糖三天後，收穫所述腎臟，並且用FITC-綴合的抗-CD11b抗體(用以標記單核細胞)對冰凍切片復染，並且對Alexa-陽性單核細胞進行計數。將Alexa-陽性單核細胞的數量與被提供等量的同種型匹配的不相關抗體的年齡和性別匹配的阿爾波特小鼠的Alexa-阻性單核細胞的數量進行比較。Alexa-陽性(新流出的)的單核細胞的顯著減少表明抗體具有潛在的治療益處。所述治療劑包括，但不局限於小有機分子、具有序列GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)或更具體地講、具有序列GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)的分離的肽、所述肽的抗體、以及小的抑制性RNAs(SiRNAs)。在這裡，「分離的」肽是天然存在的或合成來源的，並且不存在於它的天然環境中的肽。
優選的是，所述分離的肽可以具有至少8個胺基酸。更優選的是，它們具有至少12個胺基酸。所述肽的長度足以獲得所希望的功能。對某些實施方案來說，它們的長度不超過16個胺基酸。
血管內皮上的膠原XIII上的該胺基酸序列與循環的白細胞上的α1β1整聯蛋白相互作用。另外，活性肽(即，SEQ ID NOs1或2的活性類似物)可以包括這樣的序列，它與GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)，或更具體地講與GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)具有至少70％的序列同一性。優選的是，活性類似物與SEQ ID NOs1或2之一的結構相似性具有至少80％的同一性，更優選的是至少90％的同一性，更優選的是，至少95％的同一性。所述肽不包括膠原XIII。
還可以將針對這些肽的至少一個或針對α1β1整聯蛋白製備的中和抗體用於破壞膠原XIII結合α1β1整聯蛋白的能力。還可以使用小的抑制性RNAs(SiRNAs)，其被遞送到內皮細胞，導致膠原XIII轉錄物的細胞內破壞，並因此防止翻譯的膠原XIII蛋白到達內皮細胞表面。
這些試劑可以單獨使用或者組合使用，以便部分或完全抑制整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞/淋巴細胞跨內皮遷移到慢性發炎組織的間質間隙中。
所述抑制劑在本文中被稱作「活性劑」，重要的是，所述活性劑能夠作為藥物或飲食(例如營養物)添加劑單獨或者以多種組合施用於患者(例如，包括人在內的動物)，其劑量足以在患者的全身，在特定組織位點，或在組織的集合(器官)中產生所希望的作用。
本文所描述的多肽(例如，包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的胺基酸的多肽)可以以它們的游離酸形式存在，或者這些多肽可以在C-末端酸基上被醯胺化。
正如上文所討論的，本發明還包括SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的多肽的類似物，這些類似物包括具有結構類似性的多肽。這些多肽還可以形成更大肽的一部分。多肽的「類似物」包括所述多肽的至少一部分，其中，所述部分含有一個或多個鄰接的或不鄰接的胺基酸的缺失或添加，或含有一個或多個胺基酸替代。因此，「類似物」包括位於上面所列多肽一端或兩端的額外的胺基酸。用於本發明多肽的胺基酸的替代優選是保守替代，這些替代選自所述胺基酸所屬類型的其他成員。例如，蛋白生物化學領域中眾所周知的是，屬於具有特定大小或特徵(如電荷、疏水性和親水性)的胺基酸類別的胺基酸通常可以替代為另一種胺基酸，而不會明顯改變多肽的結構。
對於本發明來說，保守性胺基酸替代被定義為是由於改變來自以下殘基類別之一的胺基酸殘基的互換所導致的I類Ala，Gly，Ser，Thr，和Pro(代表小的脂族側鏈和羥基側鏈)；II類Cys，Ser，Thr和Tyr(代表包括-OH或-SH基團的側鏈)；III類Glu，Asp，Asn和Gln(含有羧基的側鏈)IV類His，Arg和Lys(代表鹼性側鏈)；V類Ile，Val，Leu，Phe和Met(代表疏水性側鏈)；和VI類Phe，Trp，Tyr和His(代表芳族側鏈)。以上類別還包括相關的胺基酸，如I類中的3Hyp和4Hyp；II類中的高半胱氨酸；III類中的2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、γ-羧基穀氨酸、β-羧基天冬氨酸、和相應胺基酸醯胺；IV類中的鳥氨酸、高精氨酸、N-甲基賴氨酸、二甲基賴氨酸、三甲基賴氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、高精氨酸、肌氨酸和羥賴氨酸；V類中的取代的苯丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、2-氨基辛酸、2-氨基庚酸，statine和β-纈氨酸；以及VI類中的萘基丙氨酸、取代的苯丙氨酸，四氫異喹啉-3-羧酸和滷化酪氨酸。
正如上面所指出的，活性類似物包括具有結構相似性(即，序列同一性)的多肽。結構相似性通常是通過比對兩個胺基酸序列的殘基以便沿它們的序列長度最優化相同胺基酸的數目確定的；在進行比對時，允許在一個或兩個序列上存在缺口，以便最優化相同胺基酸的數目，不過，在每一個序列中的胺基酸仍然要保持它們的正確順序。優選的是，採用BLAST 2檢索算法的NCBI BLASTB，2.2.6版來比較兩種胺基酸序列。優選的是，將BLAST 2的所有檢索參數的默認值稍微改變地用於ProteinsSearch for Short Nearly ExactMatches，其可以從以下網址獲得
http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi？CMD＝WebLAYOUT＝TwoWindowsAUTO_FORMAT＝SemiautoALIGNMENTS＝50ALIGNMENT_VIEW＝PairwiseCLIENT＝webDATABASE＝nrDESCRIPTIONS＝100ENTREZ_QUERY＝％28none％29EXPECT＝20000FORMAT_OBJECT＝AlignmentFORMAT_TYPE＝HTMLGAPCOSTS＝9+1I_THRESH＝0.005MATRIX_NAME＝PAM30NCBI_GI＝onPAGE＝ProteinsPROGRAM＝blastpSERVICE＝plainSET_DEFAULTS.x＝24SET_DEFAULTS.y＝10SHOW_OVERVIEW＝onWORD_SIZE＝2END_OF_HTTPGET＝YesSHOW_LINKOUT＝yesGET_SEQUENCE＝yes包括矩陣＝PAM30；開放缺口罰分(open gap penalty)＝10，延長缺口罰分(extension gap penalty)＝1，預期值(expect)＝20000，字符大小(wordsize)＝3，以及過濾器開(filter on)＝低複雜性。在用BLAST檢索算法比較兩種胺基酸序列時，結構相似性被稱作「同一性」。
所述肽抑制劑可以是天然來源的(優選分離的和純化的)，如通過噬菌體展示或用以鑑定相互作用的蛋白的酵母雙雜交方法產生，或者這些肽抑制劑可以是使用已知的肽聚合技術合成構建的。無論是天然存在的或合成構建的，這些肽在本文中都被稱作「分離的」。例如，本發明的肽可以是通過固相合成方法採用基於叔-丁氧基羰基(BOC)或9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)保護基團的標準方法合成的。該方法描述於以下文獻中G.B.Fields等，參見SyntheticPeptidesA User′s Guide，W.M.Freeman Company，New York，NY，77-183頁(1992)。
在本發明的方法中所使用的肽能夠以單價狀態(即游離的肽或與載體分子偶聯的單一肽片段)使用。還可以將所述肽用作綴合物，其具有結合在一個載體分子上的一個以上(相同或不同)肽片段。所述載體可以是生物載體分子(例如，粘多糖、蛋白聚糖、清蛋白等)或合成聚合物(例如，聚亞烷基二醇或合成的層析支持物)。通常，將卵清蛋白、人血清清蛋白、其他蛋白、聚乙二醇等用作載體。所述修飾可以提高肽的表觀親和力和/或改變肽的穩定性。與每一種載體結合或連接的肽片段的數目可改變，不過在標準偶聯條件下，通常獲得的是每個載體分子大約4-8個肽。
例如，可以通過用諸如碳二亞胺的偶聯劑處理肽和載體分子的混合物來製備肽/載體分子綴合物。所述偶聯劑能夠激活所述肽或載體分子上的羧基，從而所述羧基能夠與所述肽/載體分子的另一成員上的親核物質(例如，氨基或羥基)反應，導致所述肽和所述載體分子的共價連接。例如，可以通過將等量的冷凍乾燥的肽和卵清蛋白溶解在少量水中製備肽與卵清蛋白偶聯的綴合物。在第二個試管中，將1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC；為肽用量的10倍)溶解在少量水中。將所述EDC溶液添加到所述肽/卵清蛋白混合物中，並且讓它們反應數小時。然後透析該混合物(例如，透析到磷酸緩衝的鹽溶液中)，以便獲得肽/卵清蛋白綴合物的純化溶液。通過這種方法製備的肽/載體分子綴合物通常含有每個卵清蛋白分子大約4-5個肽。
本發明還提供了能夠特異地結合與包括SEQ ID NO1或SEQ IDNO2的胺基酸的肽具有至少70％(更優選至少80％，更優選至少90％，且更優選至少95％)的序列同一性的肽的抗體。在一種實施方案中，所述抗體是單克隆抗體，在另一種實施方案中，所述抗體是多克隆抗體。在另一種實施方案中，所述抗體是抗體片段，其包括在所使用的術語抗體的含義內。所述抗體可以從小鼠、大鼠、人或兔獲得。製備針對肽的抗體的方法為本領域技術人員所熟知。在優選實例中，所述抗體可以是來自人的、來自大鼠的、來自小鼠的、或來自兔的。結合蛋白的抗體片段和嵌合片段同樣是公知的，並且在本發明的範圍內。
本發明還提供了包括本發明的一種或多種活性劑和一種或多種載體，優選藥學上可接受的載體的組合物。本發明的方法包括對患者(即，受試者)，優選哺乳動物，更優選人施用，或在皮膚上施用能產生所希望的效果的有效量的本發明組合物。本發明的活性劑被製備成用於經腸施用(例如，經口、直腸等)或腸胃外施用(注射、內部泵(internal pump)等)。所述施用可以通過直接注射到組織，關節間注射，靜脈間注射或其他內在施用方法，如通過使用植入的泵或通過讓所述組合物與黏膜接觸，該組合物存在於用於促進所述組合物通過黏膜轉移而設計的載體中，如栓劑、滴眼劑、吸入劑，或其他類似的施用方法或以糖漿、液體、藥丸、膠囊、凝膠包衣的片劑形式經口施用，或其他類似的經口施用方法。所述活性劑可以摻入粘性藥膏、貼劑、樹膠等，或者可以膠囊化，或摻入用於控釋的可生物腐蝕的基質中。
用於內部施用的載體可以是常用於促進組合物的內部施用的任何載體，如血漿、無菌鹽溶液、IV溶液等。用於通過黏膜施用的載體可以是本領域眾所周知的任何載體。用於經口施用的載體可以是本領域所熟知的任何載體。
所述製劑可適宜地以單位劑量形式存在，並且可以通過藥劑學領域的任何眾所周知的方法製備。所有方法包括使所述活性劑與載體結合的步驟，所述載體構成了一種或多種輔助成分。一般，所述製劑是通過讓所述活性劑與液態載體、細碎的固態載體，或這兩者均勻地並且緊密地結合而製備，然後如果必要的話，將所述產品成型成所希望的製劑。
適合腸胃外施用的製劑適宜地包括所述活性劑的無菌含水製劑，或所述活性劑的無菌粉末的分散體，該含水製劑或分散體優選是與受者的血液等滲的。所述液體製劑中可以包含的等滲劑包括糖、緩衝液、和氯化鈉。所述活性劑的溶液可以用水製備，任選地與無毒的表面活性劑混合。所述活性劑的分散體可以用水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、和液態聚乙二醇等)、植物油、甘油酯，以及它們的混合物製備。最終的劑型是無菌的、流體的，並且在生產和保存條件下是穩定的。必須的流動性可以通過以下方式獲得，例如，通過使用脂質體，對於分散體來說採用合適的粒度，或者通過使用表面活性劑。液體製劑的滅菌可以通過任何方便的方法實現，該方法能保存所述活性劑的生物活性，優選通過過濾滅菌。製備粉末的優選方法包括所述無菌注射液的真空乾燥和冷凍乾燥。使用各種抗微生物劑可以防止隨後的微生物汙染，這些抗微生物劑為例如，抗細菌劑、抗病毒劑和抗真菌劑，包括對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。所述活性劑的長期吸收可以通過包含延遲試劑實現，該延遲試劑為例如，一硬脂酸鋁和明膠。
本發明的適合經口施用的製劑能夠以不連續的單位存在，如片劑、錠劑、膠囊、糖錠、薄片(water)、或扁膠劑(cachet)，各自含有粉末或顆粒狀的預定數量的活性劑，含有所述活性劑的脂質體，或存在於含水液體或無水液體中的溶液或懸浮液，如糖漿、酏劑、乳劑或頓服藥(draught)。活性劑的用量是這樣的，所述劑量水平能在受試者體內有效產生所希望的的結果。
鼻噴霧製劑包括所述活性劑的純化的水溶液，含有防腐劑和等滲劑。優選將所述製劑調節到pH和等滲狀態與鼻黏膜相容。直腸或陰道施用的製劑能夠以栓劑形式存在，使用合適的載體，如可可油、或氫化脂肪或氫化脂肪羧酸。
眼科製劑是通過與鼻噴霧劑類似的方法製備的，所不同的是，優選將pH和等滲因素調節到與眼睛匹配。
局部製劑包括溶解或懸浮在一種或多種介質中的該活性劑，該介質為如礦物油、DMSO、多羥基醇、或用於局部藥物製劑的其他基質。
所述活性劑的有用劑量可以通過比較它們的體外活性和在動物模型體內的活性確定。用小鼠和其他動物中的有效劑量外推至人的方法為本領域所公知。
片劑、錠劑、藥丸、和膠囊等還可以含有下列一種或多種成分粘合劑，如西黃蓍膠、阿拉伯樹膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑，如磷酸二鈣；崩解劑，如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；增甜劑，如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；以及天然或人工增香劑。當所述單位劑型是膠囊時，它還可以含有液態載體，如植物油或聚乙二醇。各種其他材料能夠以塗層形式存在，或以其他方式改變所述固體單位劑型的物理形式。例如，片劑、藥丸、或膠囊可以用明膠、蠟、蟲膠、或糖等塗覆。糖漿或酏劑可以含有一種或多種增甜劑，防腐劑，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯，延緩所述糖結晶的試劑，增加任何其他成分的溶解度的試劑，如多元醇，例如甘油或山梨醇、染料，和增香劑。用於製備任何單位劑型的材料是在所採用的用量下大體上無毒的。所述活性劑可以整合在緩釋製劑和裝置中。
通過以下實施例對本發明的目的和優點作進一步說明，不過，在這些實施例中所提到的具體材料及其用量以及其他條件和細節不應當被理解成是對本發明的不適當限制。
實施例前言為了了解整聯蛋白α1在阿爾波特間質病中起作用的機理，採用Affymetrix基因晶片方法對基因表達進行總體分析。所述實驗描述於以下文獻中Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001)。將7周齡的阿爾波特小鼠與7周齡的DKO(雙重剔除小鼠，整聯蛋白α1和膠原α3(IV)都是無效的)進行比較。使用Adams等Nature，377，3-174(1995)的分類方案對上調或下調的基因進行分類，並且採用GENE CLUSTER和TREEVIEW程序對這些基因歸類。在所進行的觀察中，發現了在阿爾波特小鼠中出現了多種單核細胞/巨噬細胞-特異轉錄物。這些轉錄物包括巨噬細胞化學引誘蛋白1(MCP-1)、巨噬細胞可誘導蛋白(IP-10)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬細胞甘露糖受體、和F4/80。與對照同窩崽相比，在阿爾波特小鼠中所有轉錄物都提高了6-24倍。在來自7周齡DKO小鼠的腎臟中，所有上述基因的表達都恢復到野生型水平。這些研究導致我們得出以下結論整聯蛋白α1對阿爾波特腎小管間質病的作用可能是通過組織單核細胞介導的。用單核細胞特異性標記(CD11b)免疫染色證實了以上推測，因為很明確的是，在DKO小鼠中存在很少的單核細胞，而這種細胞在阿爾波特小鼠的間質中大量存在(Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001))。在阿爾波特腎臟纖維化中，T-細胞和B-細胞實際上是缺乏的(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))。
業已顯示阻斷α1β1整聯蛋白能減緩其他慢性炎性疾病模型的發展，這些疾病包括類風溼關節炎、實驗性結腸炎，和新月體性腎小球腎炎。業已推測這種影響可能涉及白細胞向組織中轉移的抑制；不過，驅動這種推測的影響的機制尚不清楚。最近業已顯示，所述單核細胞介導與阿爾波特小鼠模型中腎臟的漸進性炎症相關的細胞破壞(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))，強調了間質單核細胞積累在與慢性炎性疾病相關的病理中的重要性。
在這裡，顯示骨髓中少數單核細胞能表達α1β1整聯蛋白，並且阿爾波特小鼠的腎小管間質中的單核細胞是α1β1整聯蛋白陽性的。將單核細胞運輸測定用於顯示與阿爾波特小鼠相比，α1β1-無效阿爾波特小鼠中單核細胞流出顯著減少，並且實際上所有在阿爾波特小鼠中新流出的單核細胞都能表達α1β1整聯蛋白。使用Alexa-綴合的純化的α1β1整聯蛋白，證實了整聯蛋白能結合阿爾波特小鼠而不是正常小鼠的血管內皮細胞，並且，注射純化的整聯蛋白能抑制單核細胞流出。另外，移植到α1整聯蛋白-無效阿爾波特小鼠體內的來自正常小鼠的標記的單核細胞比來自整聯蛋白α1無效小鼠的單核細胞更有效地流入皮質間質空間。總之，這些數據強烈暗示了α1β1整聯蛋白的可誘導的配體在腎臟血管內皮上的存在，該配體能介導α1β1整聯蛋白-陽性單核細胞流入血管內皮。使用內皮細胞-來源的噬菌體展示文庫與「生物淘選(biopanning)」方法結合，鑑定膠原XIII是α1β1整聯蛋白的內皮細胞配體。α1β1整聯蛋白在單核細胞上的相互作用介導單核細胞向慢性炎性疾病的間質間隙中的轉移。在早期研究中，提供了引人注目的證據，即單核細胞造成與纖維化過程相關的腎小管間質損傷(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003)。因此，內皮細胞-特異性配體的鑑定可以提供重要的治療靶標。用中和抗體或肽抑制劑封閉所述配體可能單獨使用或與封閉外周血單核細胞上的α1β1整聯蛋白聯合使用。該策略可用於治療其他慢性炎性疾病。
方法Alexa 568葡聚糖複合體方案按照Luby-Phelps描述的方法(Methods in Cell Biology，卷29，第4章，59-73頁，(1989))製備螢光葡聚糖。簡單地講，將1mg螢光探針，Alexa 568(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)與39mg葡聚糖(分子量大約144,000)在吡啶、二甲基亞碸(DMSO)、和二月桂酸錫(Sigma-Aldrich Co.St.Louis，MO)存在下混合。用95％乙醇沉澱標記過的葡聚糖，在玻璃-蒸餾水中透析並且冷凍乾燥。然後，將乾燥的產物以500微克(μg)等分試樣置於乾燥器中-20℃下避光保存。
用50μg在100微升(μL)Hanks平衡鹽溶液(pH 7.2)中重構的Alexa 568標記的葡聚糖經尾靜脈注射雄性野生型129SV和129SVJ小鼠(4-12周齡)和膠原IVα3(-/-)(阿爾波特5-8周齡)和膠原IVα3(-/-)/整聯蛋白α1(-/-)雙剔除(DKO8-12周齡)小鼠。在注射三天之後，給這些動物注射致死劑量的阿佛丁(averitin)(0.55克/千克(g/kg)體重；腹膜內(ip))，然後用冰冷的PBS進行心臟灌注。取出腎臟，並且浸泡在濃度增加的冰冷的蔗糖(最大30％)溶液中，然後包埋在Tissue Tek OCT封固劑(Sakura Finetek USA，Inc.，Torrence，CA)中，並且在-80℃下保存。
用新鮮冰凍的組織切片(4μm)在2％低聚甲醛中固定5分鐘，並且在4℃下乾燥過夜，然後在-20℃下長時間保存，或用大鼠單克隆抗體α-CD11b(Cedar Lane laboratories，Hornby，Ontario)和山羊抗大鼠Alexa 488(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)抗體分別以1∶100和1∶200的稀度對單核細胞進行免疫組織化學檢測。用vectorshield封固劑(Vector Corp.Burlingme，CA)對切片蓋片。對三個切片中的每一個進行大約10次拍照，拍照點間隔至少100微米(μm)，該拍照使用Olympus BH2-RFCA顯微鏡，安裝了綠色和紅色濾光片。用Image Pro Plus軟體(MediaCybernetics，Inc.Silver Spring，MD)來測量綠色螢光以及測定共同定位的雙重螢光。
ADC568標記的單核細胞移植物給7周齡的DKO小鼠靜脈內注射從α1整聯蛋白缺陷型或野生型小鼠骨髓中分離的Alexa 568綴合的葡聚糖(ADC568)標記的單核細胞。通過用補充了2％胎牛血清(FCS)和青黴素/鏈黴素的Dulbecco氏改進的Eagle培養基(DMEM)衝洗股骨和脛骨的骨髓腔收集骨髓。用1x磷酸緩衝的鹽溶液(PBS)(或Hanks氏平衡鹽溶液(HBSS))洗滌細胞2次。用氯化銨(20mM Tris，140mM NH4Cl，pH 7.2)除去紅細胞，然後，在含有2％FCS的DMEM中洗滌2次，最後用HBSS洗滌。細胞在補充了2％FCS、青黴素/鏈黴素的DMEM中，在37℃下，在潮溼的具有5％CO2的室中培養24小時。用HBSS洗滌細胞2次，並且添加125μg ADC568/ml新鮮培養基。將洗滌過的細胞重新懸浮在ADC568溶液中，並且在37℃下，在具有5％CO2的潮溼室中培養24小時(儘量使長時間接觸光線最小化)。用HBSS洗滌細胞3次。對細胞進行計數，並且製備細胞樣品，以便用螢光顯微鏡證實ADC568標記。通過尾靜脈注射將標記的單核細胞注射到受體DKO小鼠體內(用等量的α1整聯蛋白-無效或野生型單核細胞注射小鼠)。在尾靜脈注射72小時之後，從受體小鼠收穫腎臟。製備新的冰凍塊，並且切成4μm的不連續切片，以便用螢光顯微鏡觀察，並且用ImagePro Plus分析。
α1β1整聯蛋白/CD31 cDNA文庫和噬菌體展示製備重組VLA1塗覆的金屬珠按照生產商的方案，用重組蛋白對M450金屬珠(DYNAL Inc.，Lake Success，NY)進行塗覆。簡單地講，使用磁性小室，在磷酸緩衝液(0.26g NaH2PO4，1.44gNa2HPO4，溶解在100mL ddH2O中，pH 7.4)中洗滌1×108個珠子。將珠子(/107珠/5mg蛋白)與50μg純化的人α1β1整聯蛋白(Chemicon International，Inc.，Temecula CA)混合，並且放置在章動器(nutator)上，在37℃下放置16小時。將珠子在4℃下緩衝液D{PBS0.88g NaCl，0.26g NaH2PO4，1.44g Na2HPO4，溶解在100ml ddH2O中，pH 7.4，含有0.1％BSA}中洗滌2次，5分鐘，在37℃下緩衝液E{0.2M Tris pH 8.5，含有0.1％ BSA}中洗滌1次，4小時。珠子在+4℃下緩衝液D中保存。在4℃下，在補充了1mm MgCl2和1mm CaCl2的緩衝液D中將細胞與α1β1整聯蛋白塗覆的珠子一起溫育30分鐘。
製備抗-CD31磁珠用磷酸緩衝液洗滌連接鏈親和素的金屬珠(DNA酶I識別結構域接頭)(DYNAL Inc.，Lake Success，NY)，並且將該金屬珠與生物素化的抗-CD31抗體(ABCAM，Ltd.，Cambridgeshire英國)合併，比例為1.0μg該抗體/1×107個珠子。將所述金屬珠/抗-CD31混合物放置在章動器上，在室溫下保持30分鐘。溫育後，用磷酸緩衝液洗滌珠子2次，然後將珠子在緩衝液D中再洗滌1次。珠子在4℃下保存。
從VLA1結合的小鼠腎臟內皮細胞中分離mRNA對10周齡的四隻DKO小鼠提供致死劑量的阿佛丁。用冰冷的PBS灌注動物。收穫腎臟，並且將其馬上放置在冰上的HBSS(Gibco BRL)中。切碎腎臟，並且將其用20mL的(4個切碎的腎臟在20mL膠原酶A中消化)的1毫克/毫升(mg/mL)膠原酶A(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)HBSS溶液在37℃下消化45分鐘，輕微攪拌。消化的材料通過70μm的尼龍網孔過濾，並且收集到50mL錐形管中。
從消化物中回收細胞(在室溫下以1000轉/分鐘(rpm)的速度離心5分鐘(min))，並且用PBS洗滌2次，然後最終用緩衝液D洗滌。對於每20mL的膠原酶A，將來自組織消化液的產物重新懸浮在6mL緩衝液D中。將一毫升(1mL)的細胞懸浮液與1×107抗-CD31金屬珠合併，並且在4℃下，在章動器上混合30分鐘。將蓮座細胞(rosetted cell)用含有0.1％ BSA的PBS洗滌4次。通過在室溫下，在DNA酶溶液(釋放緩衝液)中溫育蓮座細胞15分鐘，從分離的內皮細胞釋放金屬珠。將內皮細胞重新懸浮在含有0.1％ BSA的PBS中，與VLA1綴合的金屬珠合併，然後保持在4℃下章動30分鐘。用含有0.1％ BSA的PBS洗滌蓮座細胞4次。保留每一次的洗滌液，並且使未結合的內皮細胞沉澱，重新懸浮在裂解緩衝液(AmbionInc.，Austin TX)中，並且從該內皮細胞提取mRNA。最後洗滌後，將蓮座細胞重新懸浮在裂解緩衝液(Ambion Inc，Austin TX)中。在室溫下5分鐘之後，除去金屬珠，並且從VLA1結合的內皮細胞中提取mRNA。
使用Orient express(Novagen，Inc.，Madison WI)在T7選擇噬菌體中製備cDNA文庫Superscript III(Invitrogen，Corp.，Carlsbad CA)逆轉錄酶和甲基化的dNTPs與HIND III隨機引物(Novagen，Inc.，Madison W)一起用於製備可以用限制酶消化的cDNA。利用標準dNTPs和T4 DNA聚合酶在甲基化的cDNA上產生足夠可消化的平端，並且連接到EcoRI/HIND III接頭上，然後用HINDIII和EcoRI限制酶消化。消化產物通過大小分級柱(Novagen，Inc.，Madison WI)過濾，並且收集大於300個鹼基對(bp)的cDNA。然後將收集的cDNA連接到T7選擇載體臂上，以便利用T7選擇噬菌體包裝提取物(Novagen，Inc.，Madison WI)製備噬菌體文庫，並且通過利用細菌菌株BLT5403(Novagen，Inc.，Madison WI)進行的噬斑測定確定重組體的數量。在噬斑測定之後，通過平板裂解液擴增來擴增噬菌體文庫，將噬菌體文庫用提取緩衝液(20毫摩爾(mM)Tris-HCL，pH 8.0，100mM NaCl，6mM MgSO4)洗脫，滴定，並且通過添加0.1倍體積的無菌80％甘油準備在-70℃下長期保存。
通過PCR證實CD31/VLA1 cDNA噬菌體文庫的完整合成，該PCR使用T7選擇引物和以下製劑10μL噬菌體裂解液；5μL含有MgCl2的10×NOVATAQ緩衝液(Novagen)；1μL T7選擇上引物(GGAGCTGTCGTATTCCAGTC(SEQ ID NO3))；1μL T7選擇下引物(AACCCCTCAAGACCCGTTTA(SEQ ID NO4))；1μL dNTP混合物(各10mM)；1.25U NOVATAQ DNA聚合酶(Novagen)；並用PCR級水補足到50μL。將反應液加熱到80℃保持兩分鐘，然後為30個循環，其中每個循環為94℃保持50秒(sec)，50℃保持1分鐘，和72℃保持1分鐘。最終的延伸在72℃下進行6分鐘。
VLA1結合表達蛋白序列的生物淘選用存在於塗覆緩衝液(0.035M NaHCO3，0.015M Na2CO3)中的5μg/mL的重組人α1β1整聯蛋白(VLA1)在4℃下塗覆96孔高結合塑料平板過夜。在用VLA1塗覆之後，用1×20mM Tris-Cl(pH 7.4)-0.5M NaCl(TBS)洗滌孔3次，將孔用5％脫脂乳TBS緩衝液封閉，然後用蒸餾水洗滌5次。根據擴增的噬菌體文庫的計算的效價，將8×108(VLA1-CD31)和5.9×108(CD31)噬菌體製劑添加到VLA1塗覆的孔中的200μl生物淘選緩衝液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，0.15M NaCl，0.1％ Tween-20，1mM MgCl2，1mM CaCl2)中，並且在室溫下保持45分鐘。用生物淘選緩衝液洗滌孔5次，並且用洗脫緩衝液(20mM Tris，中性pH，1.0％SDS)洗脫結合的噬菌體20分鐘。然後將BLT5403細菌細胞添加到所述塗覆的孔中，以便回收高親和力噬菌體，這些噬菌體有可能還沒有收集到所述洗脫液中。將百分之九十(90％)洗脫的噬菌體與50ml細菌細胞培養物(OD600＝0.5)合併，並且在37℃下振蕩擴增3小時。剩餘10％被用於測定從每一輪生物淘選中回收的噬菌體的數量。通過噬斑測定滴定來自每一輪生物淘選的擴增的噬菌體。用1×108噬菌體/VLA1塗覆的孔重複所述生物淘選過程3次，並且對用於每一種文庫的不超過2個塗覆孔進行篩選，一共進行4輪生物淘選。
VLA1選擇的噬斑的PCR和測序對在第四輪生物淘選之後收集的經擴增噬菌體文庫進行充分稀釋以便得到不超過100pfu/平板。刮取12個獨立的噬斑，並且為每個文庫收集刮取的每一個噬斑的塊。將一毫升噬菌體提取緩衝液添加到每一個塊中，並且在4℃下保存。將通過用移液管頭刮頂層瓊脂糖收集的噬斑分散到100μL的10mM EDTA，pH 8.0中，渦旋攪拌，並且在65℃下保持10分鐘。將樣品冷卻到室溫，並且以14000×g離心3分鐘。
用以下試劑進行PCR2μL澄清的噬菌體裂解液；5μL 10×TAQGold緩衝液(Perkin Elmer)；5μL 25mM MgCl2；1μL T7選擇上引物(GGAGCTGTCGTATTCCAGTC(SEQ ID NO3))；1μL T7選擇下引物(AACCCCTCAAGACCCGTTTA(SEQ ID NO4))；1μL dNTP混合物(各10mM)；0.5μL TAQ Gold DNA聚合酶(Perkin Elmer)；和用PCR級水將體積補足到50μl。將反應物與DNA聚合酶一起加熱到94℃保持2分鐘，然後為30個循環，其中每個循環為94℃50秒，50℃1分鐘，和72℃1分鐘。最終的延伸在72℃下進行6分鐘。
在用TAE(40mM Tris，10mM EDTA，20mM冰醋酸)和EtBr(10μg/ml)製備的1％瓊脂糖凝膠上對十微升(10μL)的PCR反應物進行電泳。用蒸餾水將剩餘的PCR反應物補足到150μL。將該反應物轉移到MANU 030平板上，並且將該平板真空乾燥20分鐘。通過添加40μL納米純淨水到所述平板的合適的孔中回收所述PCR產物。將五微升(5μL)產物與1μL正向或反向引物，2μL ReadyReaction Mix(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)和2μL 5倍緩衝液(Applied Biosystems Inc)混合。
在循環測序之後，添加40μL70％乙醇(EtOH)，並且將混合物在室溫下溫育15分鐘。然後以3400轉/分鐘將該混合物離心30分鐘。除掉PCR試管的蓋子，將試管顛倒，並且1000轉/分鐘的速度短時間(1分鐘)離心。讓沉澱的產物乾燥30分鐘至1小時。將產物重懸在加入甲醯胺的染料溶液中，在96℃下溫育該混合物3分鐘，在冰上放置2分鐘，然後，在添加甲醯胺溶液15分鐘之內將樣品加樣到測序凝膠上。
內皮細胞MCP-1 H2O2實驗用抗-CD31塗覆的金屬珠從野生型小鼠腎臟分離原代內皮細胞。在含有20％FCS的內皮細胞培養基(DMEM/F12，50μg/ml內皮有絲分裂原，1％青黴素/鏈黴素，20mM L-穀氨醯胺，和1U/mL剛製備的未經過濾的肝素)中培養細胞。在無菌PBS中的1％明膠塗覆的96孔板中，32個孔具有5×104細胞/孔。將細胞保持在含有20％FCS的內皮細胞培養基中，直到細胞匯合。用HBSS洗滌匯合的細胞，然後將細胞用無血清內皮細胞培養基覆蓋，用量為200μL/孔，並且將細胞在潮溼的室中在37℃，5％CO2中保持。24小時之後添加無血清的新鮮內皮細胞培養基，在進行細胞結合α1β1整聯蛋白的測定之前24或48小時添加各種濃度的MCP-1和H2O2，如下面的表1所示。
表1
免疫沉澱讓內皮細胞培養物生長到匯合，並且放入無血清的內皮細胞培養基中培養24小時。然後用1600皮克(pg)人重組MCP-1或200μM H2O2在無血清條件下處理細胞48小時。用冰冷的HBSS洗滌細胞2次，並且在冰上含有蛋白酶抑制劑的整聯蛋白裂解緩衝液(50mM HepespH 7.4，100mM NaCl，0.4％ Triton X-100，1mM CaCl2，1mM MgCl2，10％甘油)中對細胞進行超聲波處理(10次脈衝，每次15秒)。通過Bradford測定(BioRad)確定蛋白濃度。用A蛋白瓊脂糖珠預先澄清相等濃度的裂解液。將重組人VLA1(0.2μg)添加到預先澄清的裂解液中，並且在4℃下溫育1小時，然後添加兔抗VLA1抗體(Chemicon)和A蛋白瓊脂糖珠。在章動條件下在4℃下溫育樣品過夜。在4℃下用整聯蛋白裂解緩衝液和蛋白酶抑制劑洗滌珠6次，然後與50μl 6×Laemmli樣品緩衝液合併，並且煮沸5分鐘，並且保持在冰上。
樣品在10％ SDS PAGE凝膠上電泳，並且轉移到PVDF膜(BioRad)。在4℃下將膜與膠原XIII抗體一起溫育過夜，所述抗體是在兔子體內針對NC3結構域的合成肽產生的，該抗體由TainaPihlajaniemi博士提供(Hagg等，J.Biol.Chem.273，15590-15597)，其中該抗體已經以1∶2000的比例在1％BSA、0.05％Tween20、20mM Tris.Cl(pH 7.4)，0.5M NaC(TTBS)中稀釋。用TTBS洗滌所述膜若干次，並且與以1∶25000的比例在1％BSA TTBS中稀釋的山羊抗兔-HRP一起溫育1小時。用化學發光檢測試劑盒(Amersham)和X-光片檢測帶。
RT-PCR按照生產商的說明書用Trizol(GibCo/BRL，Gaithersberg，MD)製備總RNA。通過使用第一股鏈cDNA合成試劑盒SuperScript III(GibCo BRL)對2微克總RNA進行逆轉錄。通過RT-PCR使用特異引物對膠原XIII mRNA轉錄物進行半定量分析。作為內標，還分析了甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)-一種細胞管家基因的表達。在PTC100(M.J.Research，Waltham，MA)中用amplitaq gold(AppliedBiosystems，Branchburg，NJ)進行PCR反應94℃2分鐘，1個循環，94℃60秒，60℃60秒，72℃90秒，30個循環，然後72℃10分鐘，然後保持在4℃下。在下面的表2中列舉了使用的寡核苷酸引物對。
表2
引物是根據公開的序列設計的。在2％瓊脂糖凝膠上分離擴增產物，在用溴化乙錠染色後通過UV透照儀顯示，並且照像。所有PCR實驗都包括對照反應，這些反應包括除了互補DNA之外的所有組分。在這些對照反應物中沒有可檢測的帶。所有PCR產物都是通過DNA測序證實的。
免疫螢光將四微米新鮮冰凍腎臟切片安裝在載玻片上，並且用冰冷的丙酮固定。通過免疫螢光顯微術檢查組織切片，使用對內皮細胞特異的第一抗體(抗-小鼠CD31，(Abcam))或對膠原XIII特異的第一抗體(由Taina Pihlajaniemi博士饋贈(Hagg等，J.Biol.Chem.273，15590-15597)，抗體濃度分別為以1∶100和1∶200在1％BSA，5％小鼠血清，1×PBS中的稀釋濃度。腎臟切片在第一抗體中溫育60分鐘，用1×PBS洗滌3次，然後與各個製備的抗-兔Alexa fluor 568(red-coIXIII)、抗-大鼠Alexa fluor 488(green-CD31)(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR，美國)一起溫育60分鐘，所述溫育在1％BSA，5％小鼠血清，1×PBS中進行，濃度為1∶200。用1×PBS洗滌3次之後，添加封固劑(0.1g N-沒食子酸丙酯，5ml 1XPBS，5ml甘油)，並且用蓋玻片蓋上樣品。
用Olympus BH2-RFCA螢光顯微鏡(Hitschfel InstrumentsInc.，St.Louis，MO)觀察免疫染色，並且拍照，放大倍數為200倍，該顯微鏡上安裝有SPOT-RT-Slider成像系統和軟體(DiagnosticInstraments Inc.，Sterling Heights，M1)。
結果單核細胞流入阿爾波特腎是通過整聯蛋白α1β1的內皮細胞表面配體介導的。
在早期的報導中(Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001))，存在於阿爾波特小鼠(它同樣是整聯蛋白α1β1無效的(DKO′s))的腎臟中的單核細胞和肌成纖維細胞的數量明顯少於在年齡匹配的阿爾波特小鼠中的數量。儘管這一數據明確表明了α1β1整聯蛋白在纖維化中的作用，但是它沒有清澄這一發現潛在的機理。儘管存在多種可能的解釋(例如，α1β1整聯蛋白通過管狀上皮細胞或延緩了的腎小球病理的下遊作用影響趨化因子/細胞因子表達)，但探討了α1β1整聯蛋白在單核細胞流入腎小管間質中的直接作用。阿爾波特腎小管間質中的單核細胞主要是α1β1整聯蛋白陽性的(圖1)。這可能反映了α1β1整聯蛋白-陽性單核細胞從外周血的募集，或在α1β1整聯蛋白進入腎小管間質之後在單核細胞中的表達被激活。
通過螢光激活細胞分類術(FACS)分析骨髓衍生的單核細胞，該分析使用針對CD11b(單核細胞的標記，監控到的螢光強度表示在圖2中的頻率分布圖的Y-軸上)的螢光標記的抗體和抗α1β1整聯蛋白的螢光標記的抗體(監控到的螢光強度表示為圖2中的頻率分布圖的X-軸上)。圖2中的結果表明骨髓中的一部分(大約10％)單核細胞能表達α1β1整聯蛋白。為了確定新流出的單核細胞是否表達α1β1整聯蛋白，用Alexa 568(購自Molecular Probes的紅色螢光標記)標記葡聚糖。由於單核細胞是外周血中的唯一的吞噬細胞，在將這些葡聚糖注射到尾靜脈中時，只有單核細胞被標記了。在注射三天之後，收穫腎臟，並且用FITC-綴合的(綠色)抗-CD11b抗體進行冰凍切片的免疫染色。圖3A和3B中的結果表明Alexa-標記的細胞是單核細胞。用FITC-綴合的抗α1β1整聯蛋白抗體對第二張切片進行免疫染色。圖3C和3D表明Alexa-標記的細胞是α1β1整聯蛋白免疫陽性的。總之，這些數據表明了標記的葡聚糖方法對監控單核細胞運輸到腎小管間質的特異性，並且表明了新流出的單核細胞表達α1β1整聯蛋白，支持了這種整聯蛋白在促進單核細胞進入腎小管間質間隙中的直接作用的可能性。
如果α1β1整聯蛋白介導單核細胞流出，那麼在阿爾波特小鼠中的流出速度應當比在α1β1-缺陷型阿爾波特(DKO)小鼠中的流出速度快。在時程研究中，用標記的葡聚糖注射這兩種模型。在注射三天之後，收穫腎臟，並且將其用FITC-綴合的抗-CD11b免疫染色。對間隔100μM的10個切片的20個視野進行標記的單核細胞計數。在每一個時間點上使用兩隻獨立的動物。圖4中的結果表明，在DKO小鼠中單核細胞流出的開始比在阿爾波特小鼠中的開始晚得多。更重要的是，與阿爾波特小鼠相比，DKO小鼠中單核細胞進入腎小管間質間隙的速度慢得多，這提供了α1β1整聯蛋白在介導單核細胞流入腎小管間質中的直接作用的進一步的證據。圖4中的線條表示標準誤，而不是標準差。由於單核細胞流出是不規則的，所以對代表縱向冰凍切片的整個外周腎皮質的視野進行成像和計數。
如果存在這種直接作用，在阿爾波特小鼠的腎皮質血管內皮上必然存在α1β1整聯蛋白的配體，這種配體在正常小鼠是缺乏的。為了檢驗所述配體的存在，用Alexa 568標記純化的α1β1整聯蛋白(從Chemicon，Temecula，CA購買)，並且將標記過的整聯蛋白注射到正常、阿爾波特和DKO小鼠的尾靜脈中。在注射24小時之後，收穫腎臟，並且檢查冰凍切片。圖5A中的結果表明在對照小鼠中缺少標記，而阿爾波特小鼠在血管內皮中表現出強烈標記(圖5B)。由於單核細胞能吞噬標記的葡聚糖，可被解釋為整聯蛋白可能是單核細胞中被吞噬的整聯蛋白。比較圖5B和5C發現單核細胞和Alexa-標記的整聯蛋白α1β1不共定位(因為在這兩幅圖片中沒有重疊的螢光)。這些數據表明，在阿爾波特血管內皮中存在α1β1整聯蛋白的配體。這種配體在年齡匹配的DKO小鼠中的存在進一步暗示α1β1整聯蛋白在這些小鼠中的缺乏可以解釋單核細胞流出速度的變慢。
為了提供對α1β1在單核細胞流入病變腎臟中的功能的更明確的試驗，將5μg純化的α1β1整聯蛋白每日一次注射到阿爾波特小鼠尾靜脈中，在注射標記的葡聚糖一天之前開始，並且在注射葡聚糖三天之後收穫腎臟。用Alexa-綴合的整聯蛋白α1β1進行初步研究，以便在阻斷實驗之前評估穩定性。發現純化的整聯蛋白能穩定至少72小時(數據未發表)。如果單核細胞跨內皮轉移到間質間隙是部分通過配體結合在內皮細胞上介導的，那麼與未處理過的年齡匹配的阿爾波特小鼠相比，應當觀察到在用α1β1整聯蛋白處理過的阿爾波特小鼠中標記的單核細胞減少，因為所述純化的整聯蛋白會佔據配體，使得可用於結合單核細胞的配體數量減少。圖4B中的結果表明，用純化的α1β1整聯蛋白處理過的小鼠的單核細胞流出減少的傾向。它表明了配體可能確實在單核細胞募集到阿爾波特腎的間質間隙中起作用。
為了進一步驗證α1β1整聯蛋白對外周血單核細胞的影響是否會促進單核細胞遷移到纖維化腎臟的間質間隙，採用了移植方法。已經證明輻射和化學肌部分切除術(myoloablation)策略在阿爾波特小鼠中有毒性，能加快纖維化。選擇被動移植方法，其中，來自正常對照或α1整聯蛋白無效小鼠的骨髓產生的單核細胞是通過在存在Alexa-568螢光染料-綴合的葡聚糖的條件下培養細胞而標記的。將標記過的細胞注射到整聯蛋白α1-缺陷型阿爾波特(DKO)小鼠體內，並且通過在移植三天之後統計間質中螢光細胞的數量評估跨內皮轉移速度。下面的表3顯示了5次獨立實驗的結果。儘管實驗組的動物數量彼此不同，但是在所有情況下，與用正常單核細胞移植的小鼠相比，在用整聯蛋白α1-缺陷型單核細胞移植的小鼠中遷移的單核細胞數量顯著減少。
表3
克隆並且鑑定整聯蛋白α1β1的血管內皮細胞配體膠原III。
迄今所提供的數據預測了α1β1整聯蛋白的配體是在漸進性纖維化期間在腎臟血管內皮細胞上表達的。儘管有多種方法被用於克隆所述配體，但是腎臟內皮細胞-特異的噬菌體展示文庫的生物淘選方法被成功地使用。利用與磁珠綴合的抗體從α1整聯蛋白缺陷型阿爾波特小鼠分離內皮細胞。將腎臟切碎，並且用膠原酶處理，以便從間質基質中釋放出細胞。將所述細胞與磁珠混合，所述磁珠與通過商業渠道獲得的對內皮細胞特異的抗體(抗-CD31)化學綴合。利用磁體將結合的細胞與未結合的細胞分離，並且洗滌若干次。所得到的細胞直接用於製備RNA或用與純化的α1β1整聯蛋白綴合的磁珠進一步選擇，然後用於RNA製備。對以上兩種不同的RNA製劑進行聚腺苷酸(PolyA)選擇，並且將聚腺苷酸+RNA用於構建絲狀噬菌體展示文庫。將所述絲狀噬菌體人工改造成能展示小部分克隆的cDNAs，作為位於所述絲的一端的肽展示。利用被稱為「生物淘選」的方法選擇特異相互作用肽。用要尋找其相互作用結合配偶體的蛋白對塑料微量滴定板進行塗覆(在這種情況下，該蛋白是純化的α1β1整聯蛋白)。然後讓所述噬菌體文庫與塗覆的平板在通常能促進整聯蛋白/配體相互作用的條件下反應。將不能反應的噬菌體洗掉，並且洗脫結合的噬菌體並且將其擴增。將該方法依次重複若干次，在經過三次或三次以上連續的結合和擴增步驟之後，導致能與用於對所述平板塗覆的蛋白特異相互作用的噬菌體被純化。在這種情況下，使用這種技術僅純化了其中所述一種噬菌體克隆。對插入片段進行的DNA序列分析發現所述噬菌體展示了膠原XIII的片段，膠原XIII是質膜結合膠原(Hagg等，J.Biol.Chem.，273，15590-15597，1998)。有趣的是，業已證實能結合膠原XIII的唯一的受體是α1β1整聯蛋白(Nykvist等，J.Biol.Chem.，275，8255-8261，2000)。
膠原XIII/α1β1相互作用的生物學功能是完全未知的，不過被認為與細胞/細胞粘附有關係。應當強調的是，由於噬菌體展示測定的原理，膠原XIII被鑑定為α1β1整聯蛋白的內皮細胞配體。由於插入噬菌體的與膠原XIII同源的DNA的小的尺寸，業已鑑定了α1β1整聯蛋白的結合位點。這是一個重要事實，因為它使得能夠測定包含該胺基酸序列的肽抑制劑的效力。所述克隆片段(即，與α1β1整聯蛋白結合有關的膠原XIII的部分)的胺基酸序列如下GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)。
在來自慢性炎性腎臟的血管內皮細胞上誘導了膠原XIII。
利用上述正常和7周齡阿爾波特(晚期纖維化)腎臟製備內皮細胞聚腺苷酸+mRNA，並且通過RT-PCR分析膠原XIII表達。如圖6所示，相對正常小鼠而言，在阿爾波特腎的血管內皮細胞中誘導了膠原XIII的表達。將平行反應擴增的GAPDH(一種管家基因)用作對照。在兩個樣品中GAPDH轉錄物是非常類似的。
以前業已證實了與對照腎相比，在阿爾波特腎中顯著誘導了單核細胞化學引誘蛋白-1(MCP-1)(Sampson等，J.Biol.Chem.，276，34182-34188(2001))。有大量文獻記載了這種有效的趨化因子能夠促進單核細胞和淋巴細胞遷移到發炎組織的間質(參見Conti等的綜述，Allergy Asthma Proc.，22，133-7(2001))。該遷移被認為主要是通過誘導粘附分子和/或它們的各自配體誘導的(Kim，J.Neurol.Sci.，137，69-78(1996))。基於這一發現，用各種濃度的重組MCP-1處理原代腎內皮細胞培養物，並且測量該內皮細胞與Alexa-568-綴合的α1β1整聯蛋白的粘附。圖7表示α1β1整聯蛋白對用MCP-1預處理的內皮細胞的粘附和與未處理的細胞的粘附相比顯著增強了。這種增強的粘附依賴於時間和劑量。
除了趨化因子之外，氧化應激與炎性組織的內皮細胞中的細胞因子、基質蛋白、金屬蛋白酶、和細胞粘附分子的誘導相關(Yoon等，2002 J.Biol.Chem.，277，30271-30282)；Roebuck，Int.J.Mol.Med.，4，223-30(1999))。在體內，這主要是由於內皮氧化氮合成酶(eNOS)和可誘導的氧化氮合成酶(iNOS)的表達增強造成的，該表達的增強導致了過氧化氫的產生(Heeringa等，J.Pathology，193，224-32(2001))。在圖8中，示出了過氧化氫促進Alexa-綴合的α1β1整聯蛋白與培養的原代腎內皮細胞結合。這種作用是依賴濃度和時間的。
為了確定α1β1整聯蛋白在培養的血管內皮細胞上的結合活性是否確實是膠原XIII，進行了間接共免疫沉澱測定。在存在或缺乏MCP-1的條件下培養內皮細胞48小時。在整聯蛋白結合緩衝液中裂解細胞，並且將純化的整聯蛋白α1β1添加到澄清的混合物中。在溫育之後，添加抗-整聯蛋白α1-特異抗體，並且用A蛋白瓊脂糖珠使複合物免疫沉澱。通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分級分離免疫沉澱的材料，並且使用抗-膠原XIII抗體通過蛋白印跡進行分析。圖9中的結果表明一條帶具有XIII型膠原的適宜的分子大小(85-95kDa)，與早先的報導吻合(Hgg等，J.Biol.Chem.273，15590-15597(1998)；Hgg等，Matrix Biology，19，727-742(2001))。
為了確定是否在體內在血管內皮上誘導了膠原XIII，使用對膠原XIII和CD31(一種特異的內皮細胞標記)特異的抗體對來自正常和阿爾波特小鼠的腎冷凍切片進行雙重免疫螢光分析。圖10中的數據表明了在阿爾波特腎皮質中膠原XIII和CD31明顯共定位的區域(加框的區域)。在對照中沒有觀察到了這兩種蛋白的共定位。
討論以前的研究業已證實，與具有相同近親交配背景(129 Sv)的阿爾波特小鼠相比，整聯蛋白α1無效阿爾波特(DKO)小鼠中間質纖維化的發展明顯變慢(Cosgrove等，Am.J.Path.，157，1649-1659(2000)；Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))。該項研究工作擴展到使用整聯蛋白α1無效小鼠模型(Gardner等，Dev.Biol.，175，301-313(1999))和中和抗體方法的相關研究中，所述研究能有效延緩包括類風溼關節炎(De Fougerolles等，The Journal of Clinical Investigation，105，721-729(2000))、新月體性腎小球腎炎(Cook等，Am.J.Path.，161，1265-1272(2002))、和實驗性結腸炎(Krieglstein等，J.Clin.Invest.，110，1173-1782(2002))在內的其他炎性疾病的發展速度。儘管在所有場合下整聯蛋白α1β1中和作用的有益效果是顯著的，但是導致這些觀察結果的機理尚屬未知。
為了確定單核細胞和肌成纖維細胞在間質破壞中的相關作用而進行的研究得出的壓倒性的結論是，所述組織單核細胞介導腎細胞的細胞凋亡，促進了與漸進性腎臟纖維化相關的組織破壞(Rodgers等，Kidney Int.，63，1338-1355(2003))。在這裡，證實了與阿爾波特小鼠相比，整聯蛋白α1-無效阿爾波特小鼠中間質單核細胞的積累顯著減少了。這種積累速度的減慢可能是由於單核細胞流入間質間隙的速度降低和/或對間質單核細胞增殖的影響。在本申請中，通過注射螢光染料綴合的葡聚糖證實了，與阿爾波特小鼠相比，在整聯蛋白α1-缺陷型阿爾波特小鼠中單核細胞流入間質間隙的速度明顯變慢。實際上，在本測定中在阿爾波特間質中觀察到的螢光染料-標記的單核細胞主要是整聯蛋白α1β1-陽性細胞。利用來自野生型和整聯蛋白α1-缺陷型小鼠的骨髓的螢光染料標記的培養的單核細胞進行移植研究證實了該單核細胞在注射到α1整聯蛋白-缺陷型阿爾波特小鼠體內時流出速度顯著降低，直接證實了外周血單核細胞上的整聯蛋白α1β1能提高這些單核細胞跨內皮轉移到慢性炎性腎臟的間質間隙中的速度。
由於上述原因，以及其他支持性證據，推測在發生活性纖維化的阿爾波特腎的內皮細胞表面上必然存在α1β1整聯蛋白的配體。將螢光染料-綴合的純化的α1β1整聯蛋白注射到阿爾波特、整聯蛋白α1-缺陷型阿爾波特和正常對照小鼠的尾靜脈中，證實了所述整聯蛋白附著在病變小鼠，而不是正常小鼠的血管內皮上。通過用於鑑定相互作用蛋白的噬菌體展示方法(Ruoslahti等，Cancer Biology，10，435-442(2000)；Laakkonen等，Nature Medicine，8，751-755(2002))將膠原XIII鑑定為α1β1-陽性外周血單核細胞的內皮細胞受體。膠原XIII是一種質膜膠原(Hgg等，J.Biol.Chem.，273，15590-15597(1998))。業已確定膠原XIII為α1β1整聯蛋白的特異配體(Nykvist等，J.Biol.Chem.，275，8255-8261(2000))，不過相互作用的功能性作用尚不清楚。有趣的是，在我們的噬菌體展示測定中鑑定的膠原XIII肽的胺基酸序列與A類清除受體(scavenger receptor)的膠原結構域同源(在胺基酸序列上具有67％的同一性)，這業已被確定為巨噬細胞附著在膠原上的機制(Gowen等，J.Leuk.Biol.，69，575-582(2001)；Kosswig等，J.Biol.Chem.，278，34219-34225(2003))。
以前的報導提示結合整聯蛋白α1β1和α2β1的膠原參與了活化T-細胞遷移到炎性組織，不過，沒有研究介導這種作用的細胞機制(Andreasen等，J.Immunol.，171，2804-2811(2003))。在關節炎患者中，發現整聯蛋白α1β1-陽性淋巴細胞是引發與IV型膠原粘附的T-細胞亞群(Bank等，Clinical Immunol.，105，247-258(2002))，表明了α1β1-陽性淋巴細胞在促進人體慢性炎症中的特殊作用。
本文所提供的研究將這些觀點綜合在一起，提供了對發炎的組織如何選擇循環單核細胞和淋巴細胞的該亞群的解釋。不過，選擇這些細胞用於遷移的生物學原因還是一個謎。可能的原因是，通過α1β1整聯蛋白信號傳導對這些細胞的激活賦予了對解決炎性狀態通常有益的特徵。業已發現，儘管炎症相關的單核細胞對TGF-β1是免疫陽性的，而定居的(resident)單核細胞則不是(Rodgers等，KidneyInt.，63，1338-1355(2003))。儘管單核細胞急劇升高可能有利於解決炎性狀態，但是單核細胞持續接觸升高的TGF-β是已知具有破壞性的(Border等，Nature(London)，346，371-374(1990))。
儘管有關這種機制的生物學原因尚不清楚，根據本申請所描述的研究，阻斷α1β1整聯蛋白-介導的淋巴細胞/單核細胞的遷移對於控制與慢性炎性失調相關的組織破壞的潛在治療益處是顯而易見的。本申請提供的移植數據表明，α1β1中和對單核細胞遷移到入腎間質具有重要的，儘管是微弱的作用。顯然存在驅動單核細胞滲入這種慢性炎性模型中的其他機制。目的在於限制淋巴細胞/單核細胞遷移的定向治療方案在延緩慢性炎性疾病的發展方面是有效的，這些疾病為諸如人類的牛皮癬、炎性腸病和多發性硬化(Harlan等，Crit.Care Med.，30，S214-9(2002))。某些業已充分表徵的方法通常涉及到利用中和性單克隆抗體阻斷所述受體以及它的配體。業已將這種方法成功地應用在LFA-1/ICAM-1相互作用(抑制白細胞流入炎性組織)和VLA-4/VCAM-1相互作用(抑制淋巴細胞和單核細胞流入炎性組織)(Yusuf-Makagiansar等，Med.Res.Rev.，22，146-67(2002))。最近，發現在內皮細胞上表達的一種新的粘著分子-血管粘著蛋白(VAP-1)在與慢性肝炎相關的淋巴細胞的粘附和遷移方面發揮關鍵作用(Lalor等，J.Immunol.，169，983-92(2002))。綜上所述，這一類研究強調了影響炎性細胞結合、激活、和流入慢性發炎組織的位點中機制的多樣性。
根據本文所提供的證據，顯而易見的是，整聯蛋白α1β1/膠原XIII相互作用在介導單核細胞流入慢性發炎腎臟方面起著重要作用。採用α1β1整聯蛋白-特異的中和抗體和/或整聯蛋白α1-缺陷型小鼠進行的研究表明，該機制與類風溼關節炎、新月體性腎小球腎炎、和實驗性結腸炎相關。這種治療方法有可能提供對任何與α1β1整聯蛋白-陽性淋巴細胞/單核細胞相關的慢性炎性疾病的治療益處。
本文所引用的所有專利、專利申請、出版物的完整的公開，以及包括例如GenBank登錄號和EMBL登錄號在內的核酸和蛋白資料庫條目被收作本文參考，就如同被單獨收作本文參考一樣。在不背離本發明範圍和精神的前提下，對本發明進行的多種修改和改變對本領域技術人員來說是顯而易見的，並且應當理解的是，本發明並不過分局限於本文所提供的說明性實施方案。
無序列文本SEQ ID NO1肽SEQ ID NO2肽SEQ ID NO3引物SEQ ID NO4引物SEQ ID NO5引物SEQ ID NO6引物SEQ ID NO7引物SEQ ID NO8引物SEQ ID NO9引物SEQ ID NO10引物序列表110Boys Town National Research HospitalCosgrove，Dominic120α1β1整聯蛋白的可誘導的配體和用途130249.0007 010114010/698,1211412003-10-3115060/423,2971512002 11-0116010170PatentIn version 3.221012118212PRT213人工序列220
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223寡核苷酸引物40010tgggggcctg cttgtcctgt ct 2權利要求
1.一種用於治療患有慢性炎性疾病的患者的方法，該方法包括對所述患者施用阻斷劑，以便中和膠原XIII與α1β1整聯蛋白結合的能力。
2.權利要求1的方法，其中所述慢性炎性疾病以由浸潤性單核細胞、淋巴細胞或這兩者導致的漸進性病理為特徵。
3.權利要求1的方法，其中所述慢性炎性疾病是腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化、類風溼關節炎、牛皮癬、實驗性結腸炎、或新月體性腎小球腎炎。
4.權利要求1的方法，其中所述阻斷劑是肽。
5.權利要求1的方法，其中所述阻斷劑是中和抗體。
6.權利要求1的方法，其中所述阻斷劑能阻斷外周血單核細胞和/或淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與慢性發炎組織的血管內皮上的膠原XIII的相互作用。
7.一種用於治療患有炎性疾病或其他狀況的受試者的方法，在該疾病或狀況中，觀察到整聯蛋白α1β1-陽性間質單核細胞和/或淋巴細胞的積累，該方法包括給所述受試者施用能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的活性劑。
8.權利要求7的方法，其中，所述活性劑阻斷膠原XIII和α1β1整聯蛋白的結合。
9.權利要求8的方法，其中，所述阻斷劑是肽。
10.權利要求8的方法，其中，所述阻斷劑是抗體。
11.權利要求7的方法，其中，所述炎性疾病或其他狀況是腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化、類風溼關節炎、牛皮癬、實驗性結腸炎，或新月體性腎小球腎炎。
12.權利要求7的方法，其中，所述活性劑能阻斷外周血單核細胞和/或淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與慢性發炎組織血管內皮上的膠原XIII的相互作用。
13.一種減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質的方法，該方法包括將外周血單核細胞和/或淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與幹擾膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的活性劑接觸。
14.權利要求13的方法，其中，減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質包括讓α1β1整聯蛋白與能特異結合α1β1整聯蛋白的具有膠原XIII的至少一部分胺基酸序列的肽接觸。
15.權利要求13的方法，其中，減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質包括在能有效封閉膠原XIII的結合位點的條件下與抗體接觸，該抗體結合發炎組織血管/毛細血管內皮細胞的細胞表面上膠原XIII配體的抗體。
16.權利要求13的方法，其中，減弱整聯蛋白α1β1-陽性單核細胞選擇性流入慢性發炎組織的間質包括在能有效防止膠原XIII蛋白在細胞表面上表達的條件下，讓所述血管內皮與小的抑制性RNAs接觸。
17.一種降低單核細胞和/或淋巴細胞流入慢性發炎組織的間質間隙的速度的方法，該方法包括阻斷膠原XIII與α1β1整聯蛋白的結合。
18.權利要求17的方法，其中，所述阻斷包括阻斷所述膠原XIII配體。
19.權利要求17的方法，其中，所述阻斷包括阻斷α1β1整聯蛋白。
20.權利要求17的方法，其中，阻斷包括讓所述整聯蛋白與包含α1β1整聯蛋白的結合位點的膠原XIII的肽片段接觸。
21.權利要求17的方法，其中，阻斷包括讓所述膠原XIII配體與單特異性抗體接觸。
22.一種降低單核細胞和/或淋巴細胞流入慢性發炎組織的間質間隙的速度的方法，該方法包括阻斷膠原XIII與α1β1整聯蛋白的結合。
23.一種阻斷外周血單核細胞和/或淋巴細胞上的α1β1整聯蛋白與慢性發炎組織血管內皮上的膠原XIII相互作用的方法，該方法包括讓單核細胞和/或淋巴細胞、血管內皮、或這兩者與能佔據α1β1整聯蛋白上的膠原XIII結合位點或封閉膠原XIII上的α1β1結合位點的試劑接觸。
24.權利要求23的方法，其中，佔據α1β1整聯蛋白上的膠原XIII結合位點的試劑是肽抑制劑。
25.權利要求23的方法，其中，封閉膠原XIII上的α1β1結合位點的試劑是中和性單克隆抗體。
26.一種鑑定能抑制單核細胞流入模型的間質間隙的試劑的方法，在該模型中，涉及到間質單核細胞或淋巴細胞，該方法包括鑑定能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的試劑。
27.權利要求26的方法，其中，所述試劑能抑制Alexa-綴合的純化α1β1整聯蛋白與MCP-1處理的原代內皮細胞的結合。
28.權利要求26的方法，其中，所述試劑是抗體，該抗體能阻斷Alexa-綴合的純化α1β1整聯蛋白與培養的MCP-1處理的血管內皮細胞之間的相互作用。
29.一種分離的肽，具有序列GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)，其中，所述肽能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用。
30.權利要求29的分離的肽，其具有序列GEKGAEGSPGLL(SEQ IDNO2)。
31.權利要求29的分離的肽，其具有8-16個胺基酸。
32.權利要求31的分離的肽，其具有12-16個胺基酸。
33.一種分離的肽，其由GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)組成。
34.一種分離的肽，其由GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO2)組成。
35.一種分離的肽，其具有與GAEGSPGL(SEQ ID NO.1)具有至少70％序列同一性的胺基酸序列，其中，所述肽破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用。
36.一種分離的肽，其具有與GEKGAEGSPGLL(SEQ ID NO.2)具有至少70％的序列同一性的胺基酸序列，其中，所述肽破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用。
37.權利要求29的肽的抗體。
38.權利要求30的肽的抗體。
39.權利要求33的肽的抗體。
40.權利要求34的肽的抗體。
41.權利要求35的肽的抗體。
42.權利要求36的肽的抗體。
全文摘要
本發明涉及能破壞膠原XIII和α1β1整聯蛋白之間的相互作用的試劑，特別是肽和單克隆抗體的鑑定和用途。
文檔編號C07K16/28GK1826137SQ200380108181
公開日2006年8月30日 申請日期2003年10月31日 優先權日2002年11月1日
發明者D·科斯格羅夫 申請人:博伊斯鎮國家研究醫院