糖鏈配體絡合物和利用該配體絡合物的蛋白質的分析方法
2023-08-11 15:15:16
專利名稱：糖鏈配體絡合物和利用該配體絡合物的蛋白質的分析方法
技術領域：
本發明涉及向連接子化合物導入具有還原末端的糖鏈的新型配體絡合物和將該配體絡合物聚集固定在利用金或銀、銅等金屬塗布表面的晶片上而得到的配體載體。此外，本發明還涉及利用上述配體絡合物的蛋白質的分析方法。
背景技術：
存在於體內的各種糖在維持生物的活動或生命的機制中起著重要的作用。為了精確地闡明這種糖的功能，必須基於糖的複雜結構分析那些構能。對於糖的功能分析，使用以下技術利用闡明結構的糖鏈，重現糖結構的每個部分，從而清楚糖的整體結構與功能的關係。
作為上述糖的功能分析的技術，例如，公開了表面等離子體激元共振(以下記作SPR)。即，在傳感晶片的表面上導入含模擬糖的一部分的寡聚糖而構成的配體絡合物，利用導入該配體絡合物而構成的傳感晶片，指定與糖發生特別的相互作用的蛋白質等物質。通過這樣能夠進行基於寡聚糖的結構的生物活性的正確評價。
但是，僅僅1分子的寡聚糖的活性沒那麼高，因此，當評價寡聚糖的生物活性時，需要使寡聚糖聚集在傳感晶片上。即，使用聚集的寡聚糖，通過分析與蛋白質的相互作用，可以進行寡聚糖的生物活性的評價。
因此，到目前為止，本發明者得到了分子內具有可以固定於傳感晶片表面的部位和可以導入寡聚糖的部位的連接子化合物，得到了向該連接子化合物導入1個單元或2個單元的寡聚糖而形成的配體絡合物。並且發現通過利用該配體絡合物，能夠在傳感晶片上聚集，並導入寡聚糖(例如，參照專利文獻1、非專利文獻1等)。
特開2003-83969號公報(2003年3月19日公開)[非專利文獻1]《日本化學會第79次春季年會—演講初稿II》，社團法人日本化學會，2001年3月15日，第1042頁然而，在記載於上述各文獻的配體絡合物中，導入的糖鏈(寡聚糖)僅限於本發明者合成的硫酸化糖，並不清楚是否能夠導入市售的具有還原末端的麥芽糖、乳糖等寡聚糖而晶片化。另外，迄今為止，雖然提到過過將固定上述文獻記載的配體絡合物固定而得到的傳感晶片用於使用SRP的測定之後，用於與晶片上的糖鏈結合的蛋白質的鑑定的方法，但是尚不存在數據上令人滿意的方法。
本發明是鑑於上述問題而作出的，其目的在於提供導入市售的具有還原末端的糖而形成的新型配體絡合物和能夠用於鑑定蛋白質的配體載體。
發明內容
本申請發明者為了解決上述課題進行精心的研究，結果使在先申請(申請號2003-190568，公開號特開2004-157108(
公開日2004年6月3日)、在本申請優先權日(2004年2月18日)當日未公開)記載的連接子化合物(都是本申請發明者發現的)與市售的麥芽糖或乳糖反應，分別合成末端具有α吡喃葡萄糖、β吡喃半乳糖的配體絡合物。此外，本申請發明者製造使這些配體絡合物固定在塗金的晶片上的糖晶片(配體載體)。而且，還發現為了利用這些糖晶片研究與蛋白質的相互作用，在通過SRP測定確認相互作用後，將該糖晶片直接用於MALDI-TOF/MS，能夠鑑定與各糖晶片結合的蛋白質，從而完成了本發明。
即，本發明的配體絡合物，其特徵在於具備以通式(1) (式中，p，q各自分別為0～6的整數)表示的結構，作為上述X，具備末端存在芳香族氨基，同時含1條或2條或3條主鏈還可以具有碳—氮鍵的烴衍生鏈而形成的結構，作為上述Y，具備硫原子或含硫原子的烴結構，作為上述Z，具有連接子化合物與具有還原末端的糖通過上述芳香族氨基連接的結構，其中，所述連接子化合物具備含碳—碳鍵或碳—氧鍵的直鏈結構。
上述烴衍生鏈是指在由碳和氫構成的烴鏈中，部分碳或烴還可以被取代成其他原子或取代基的鏈。即，上述烴衍生鏈是指末端具有芳香族氨基，作為烴鏈主鏈結構的部分碳—碳鍵(C-C鍵)還可以被取代成碳—氮鍵(C-N鍵)、碳—氧鍵(C-O鍵)、醯胺鍵(CO-NH鍵)的鏈。
另外，所謂上述含硫原子的烴結構是指在碳和氫構成的烴結構中，部分碳被取代成硫的結構。另外，該含硫原子的烴結構可以是鏈狀(包括直鏈、支鏈)，也可以是環狀，另外，還可以同時包含鏈狀結構和環狀結構。
在本發明的配體絡合物中，對於上述連接子化合物，作為上述Y，還可以是具備含S-S鍵或SH基的烴結構。即，在上述含硫原子的烴結構中，還可以含有二硫鍵(S-S鍵)或者巰基(SH基)。
在本發明的配體絡合物中，上述X具備以通式(2) (式中，m1、m2、m3各自分別是0～6的整數。R』是氫(H)或R)表示的結構，上述R還可以是源自糖鏈的化合物。
在本發明的配體絡合物中，上述X具備以通式(3) (式中，m4、m5各自分別是0～6的整數。R』是氫(H)或者R)表示的結構，上述R還可以是源自糖鏈的化合物。
在本發明的配體絡合物中，上述X具備以通式(1)
(式中，R』是氫(H)或R)表示的結構，上述R還可以是源自糖鏈的化合物。
在本發明的配體絡合物中，上述Z還可以具備以式(5)或式(6) (式中，n1，n2各自是1～6的整數)表示的結構。
另外，本發明涉及的配體絡合物的製備方法，其特徵在於利用具備以通式(7) (式中，m1、m2、m3分別各自是0～6的整數，n1是1以上，6以下的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(8) (式中，m4，m5分別各自是0～6的整數，n1是0～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(9)
(式中，n1，q分別各自是0～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(10) (式中，n2是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(11) (式中，n1是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物與具有還原末端的糖，進行還原氨基化反應。
另外，本發明涉及的蛋白質載體的特徵在於使上述任何配體絡合物固定在表面具有金屬的載體上而形成。而且，上述配體絡合物還可以用於分析蛋白質。
另外，本發明涉及的蛋白質的分析方法，其特徵在於由下列工序構成通過使上述任何配體絡合物與支撐體接觸，製造使該配體絡合物固定在載體上的配體載體的工序、和使上述配體載體與蛋白質溶液接觸後，進行分子間相互作用的測定的工序、在上述分子間相互作用的測定後，進行質量分析，鑑定與上述配體載體結合的蛋白質的工序。
附圖的簡要說明
圖1是表示利用本發明的配體絡合物的蛋白質分析方法的步驟的示意圖。
圖2(a)是表示利用固定具有2分子α-吡喃葡萄糖的配體絡合物的傳感晶片測定ConA的結合行為的結果的圖表。
圖2(b)是表示利用固定具有2分子α-吡喃葡萄糖的配體絡合物的傳感晶片測定PSA的結合行為的結果的圖表。
圖2(c)是表示利用固定具有2分子α-吡喃葡萄糖的配體絡合物的傳感晶片測定LCA的結合行為的結果的圖表。
圖3(a)是表示利用固定具有3分子α-吡喃葡萄糖的配體絡合物的傳感晶片測定ConA的結合行為的結果的圖表。
圖3(b)是表示利用固定具有3分子α-吡喃葡萄糖的配體絡合物的傳感晶片測定PCA的結合行為的結果的圖表。
圖3(c)是表示利用固定具有3分子α-吡喃葡萄糖的配體絡合物的傳感晶片測定LCA的結合行為的結果的圖表。
圖4(a)是表示利用固定具有2分子β-吡喃半乳糖的配體絡合物的傳感晶片測定RCA的結合行為的結果的圖表。
圖4(b)是表示利用固定具有2分子β-吡喃半乳糖的配體絡合物的傳感晶片測定PNA的結合行為的結果的圖表。
圖5(a)是表示利用固定具有3分子β-吡喃半乳糖的配體絡合物的傳感晶片測定RCA的結合行為的結果的圖表。
圖5(b)是表示利用固定具有3分子β-吡喃半乳糖的配體絡合物的傳感晶片測定PNA的結合行為的結果的圖表。
圖6(a)是表示對與傳感晶片結合的ConA進行質量分析的結果的圖表。
圖6(b)是表示對與傳感晶片結合的PNA進行質量分析的結果的圖表。
圖7是配體絡合物(化合物30)的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖8是配體絡合物(式(36))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖9是配體絡合物(式(37))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖10是配體絡合物(式(38))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖11是配體絡合物(式(39))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖12是配體絡合物(式(40))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖13是配體絡合物(式(41))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖14是配體絡合物(式(42))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖15是配體絡合物(式(43))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖16是配體絡合物(式(44))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖17是配體絡合物(式(45))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖18是配體絡合物(式(46))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖19是配體絡合物(式(47))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖20是配體絡合物(式(48))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖21是配體絡合物(式(49))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖22是配體絡合物(式(50))的1H-NMR光譜測定圖譜。
圖23是配體絡合物(式(51))的1H-NMR光譜測定圖譜。
實施方式下面詳對本發明進行詳細的說明。
本發明的配體絡合物是固定於表面等離子體激元共振(SPR)的傳感晶片或親和色譜法的載體等蛋白質分析用支撐體而使用，由能夠與支撐體表面結合的連接子化合物和能夠與作為分析對象的蛋白質等發生特別的相互作用的糖鏈構成。上述SPR或親和色譜法的目的在於指定或分離與糖分子發生特別的相互作用的蛋白質等物質。因此，上述配體絡合物必需是不引起與蛋白質等物質引起未特別相互作用的物質。
因此，本發明的配體絡合物含有具備以上述通式(1)表示的結構的連接部分(連接子化合物)。在該結構中以Y表示的結構中，含有硫原子(S)，該硫原子(S)例如與塗布於蛋白質分析用的支撐體表面的金屬(例如Au)形成金屬—硫鍵(例如，Au-S鍵)，從而能夠牢固地與支撐體結合。
另外，對於上述連接子化合物，作為上述X，具備末端存在芳香族氨基，同時含1條或2條或3條主鏈還可以具有碳—氮鍵的烴衍生鏈而形成的結構。通過這樣，對於上述連接子化合物，能夠在蛋白質分析用的支撐體表面聚集排列糖分子，而且，通過末端具有芳香族氨基，能夠容易地導入糖分子。
另外，對於上述連接子化合物，作為上述通式(1)的Z，具備含碳—碳鍵或碳—氧鍵的直鏈結構。更具體地講，為了便於製備化合物，Z優選具有以上式(5)或式(6)表示的結構。另外，在上述通式(1)中，p，q分別各自為0以上、且6以下的整數，而沒有特殊限制。另外，上式(5)的n1和式(6)的n2分別各自為1以上、且6以下的整數，而沒有特殊限制。
此外，作為上述連接子化合物，在上述通式(1)中，可以列舉p為4，q為1，Y具備含S-S鍵的環烴結構，Z具有上式(5)的結構的化合物。作為上述連接子化合物，例如，還可以是具備以通式(1)
表示的結構的化合物。該連接子化合物可以把硫辛酸作為原料進行合成。
另外，作為上述連接子化合物，在上述通式(1)中，可以列舉p為4，q為1，Y具備含S-S鍵的環烴結構，Z具有上式(6)的結構的化合物。作為上述連接子化合物，例如，還可以是具有以通式(13) 表示的結構的化合物。該連接子化合物可以把硫辛酸作為原料進行合成。
另外，作為上述連接子化合物，在上述通式(1)中，可以列舉p為0，q為0，Y具有硫原子(S)，Z是上式(5)或上式(6)的結構形成二聚體的化合物。作為上述連接子化合物，例如，還可以是具有以通式(14) 表示的結構的化合物。
以上述通式(12)、通式(13)以及通式(14)表示的連接子化合物含有二硫鍵(S-S)鍵，該S-S鍵中的硫(S)例如能夠與塗布於蛋白質分析用的支撐體表面的金屬(例如Au)形成金屬—硫鍵(例如Au-S鍵)而牢固地與支撐體結合。另外，作為上述Y，並不限於以通式(12)、通式(13)或通式(14)表示的化合物，根據能夠容易地形成金屬—硫鍵(Au-S鍵)的觀點，優選含S-S鍵或SH基的烴結構。
而且，本發明的配體絡合物可以向上述連接子化合物的芳香類氨基導入具有還原末端的糖鏈而製備。換言之，本發明的配體絡合物具有上述連接子化合物與具有還原末端的糖通過芳香族氨基結合的結構。該糖的導入例如能夠通過上述連接子化合物的芳香族氨基的氨基(-NH2)與糖的還原氨基化反應而進行。即，通過糖中的平衡產生的醛基(-CHO基)或酮基(-CRO基，R是烴基)與上述連接子化合物具有的氨基發生反應。而且，通過繼續還原該反應形成的席夫鹼，能夠容易地向芳香氨基導入糖。
在本發明中，尤其作為具有上述還原末端的糖，並不是上述在先申請記載的由本發明者合成的硫酸化糖，而是使用市售的糖或通過分解市售的多糖而製備的糖。另外，上述「具有還原末端的糖」是指端基異構碳原子不被取代的單糖或寡聚糖。即，上述具有還原末端的糖是指還原糖。
作為上述具有還原末端的糖，具體地列舉麥芽糖、乳糖、潘糖、纖維二糖、蜜二糖、甘露糖、殼木糖、昆布寡糖等，但並不限於這些糖。像這樣，具有麥芽糖或乳糖等寡聚糖的配體絡合物與具有以前的硫酸化糖的配體絡合物相比，具有對於蛋白質測定應用範圍廣的優點。
作為本發明的配體絡合物，具體地可以列舉具有以下所述結構的絡合物向具有以通式(7) (式中，m1，m2，m3分別各自是0～6的整數，n1是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或具有以通式(8) (式中，m4，m5各自分別是0～6的整數，n1是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或具有以通式(9)
(式中，n1，q各自分別是0～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具有以通式(10) (式中，n2是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具有以通式(11) (式中，n1是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物的芳香氨基導入具有還原末端的糖而得到的結構。
上述配體絡合物，例如，可以通過利用具有以通式(7)～(11)表示的結構的連接子化合物與具有還原末端的糖，進行還原氨基化反應而進行製備。
具有以上述通式(7)表示的結構的連接子化合物即為具有3條烴衍生鏈的化合物，末端具有芳香族氨基的3條烴衍生鏈通過與1個碳(C)結合而形成分支結構。另外，在上述通式(7)中，m1，m2，m3是0～6的整數而沒有特殊限制，n1是1～6的整數而沒有特殊限制，還可以是相互不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。根據製造時的簡易程度，上述m1～m3優選為相同的整數，特別優選為2。
具有以上述通式(8)表示的結構的連接子化合物即為具有2條烴衍生鏈的化合物，末端具有芳香族氨基的2條烴衍生鏈通過與1個氮(N)結合而形成分支結構。在上述通式(8)中，m4，m5是0～6的整數而沒有特殊限制，n1是1～6的整數而沒有特殊限制，還可以是相互不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。其中，根據製造時的簡易程度，上述m4，m5優選為相同的整數，特別優選為2。
上述具有以通式(9)表示的結構的連接子化合物是具有1條烴鏈的化合物。而且，在上述通式(9)中，n1，q是0～6的整數而沒有特殊限制，可以是相互不同的整數，也可以是相同的整數。
上述具有以通式(10)表示的結構的連接子化合物是具有1條烴鏈的化合物。另外，在上述通式(9)中，n2是1～6的整數而沒有限制。
上述具有以通式(11)表示的結構的連接子化合物是具有1條烴鏈的化合物形成二聚體的物質。另外，在上述通式(11)中，n1是1以上，6以下的整數，而沒有特殊限制。
如上述通式(7)或通式(8)那樣，上述X是具備如下所述結構的基團通過碳或氮等原子，結合多個上述烴衍生鏈形成支鏈結構的多支鏈部位的結構。另外，當上述X含有多個烴衍生鏈時，優選全部相同，但是，如果末端具有芳香族氨基，還可以是相互不同的結構。
上述那樣，本發明的配體絡合物所含的連接子化合物具有能夠與蛋白質分析用的支撐體結合的硫原子和能夠與寡聚糖鏈等糖分子結合的氨基。因此，例如，通過Au-S鍵等金屬—硫鍵，上述連接子化合物被固定在蛋白質分析用支撐體上，因而，通過上述連接子化合物，能夠使糖分子牢固、且簡單地結合在上述支撐體上。
另外，上述連接子化合物還可以具有多分支部位，此時，在該多分支部位的各末端具有芳香族氨基。因此，通過使用在上述連接子化合物中導入具有還原末端的糖的本發明的配體絡合物，能夠更有效地使糖分子聚集在上述支撐體表明上。
此外，上述連接子化合物幾乎能夠忽略與蛋白質的非特別的相互作用的影響。因此，通過使用具有上述連接子化合物的本發明的配體絡合物，可以重現性良好地評價上述糖與蛋白質的相互作用。
上述連接子化合物例如通過以下所示的製造方法製造。即，以上述通式(7)、(8)(9)或(10)表示的連接子化合物通過以下步驟製造進行硫辛酸與芳香族氨基末端受保護基保護的胺化合物的縮合反應，並且對上述芳香族氨基末端的保護基進行脫保護。另外，以上述通式(11)表示的連接子化合物通過以下步驟製備進行γ-巰基丁酸的二聚體與2分子的芳香族氨基末端受保護基保護的胺化合物的縮合反應，並且對上述芳香族氨基某端的保護基進行脫保護。
上述硫辛酸具備以下述通式(15) 表示的結構。
另外，上述胺化合物只要是具有被保護基保護的芳香族氨基末端的化合物，就沒有特別限制。
上述保護基是芳香族氨基的氨基通過上述縮合反應不反應而導入的取代基。這樣的保護基沒有特別地限制，例如，可以列舉叔丁氧基羰基(-COOC(CH3)3基；記作Boc基)、苄基、氨基甲酸烯丙酯(-COOCH2CH＝CH3，Alloc基)等。
作為上述胺化合物，例如，可以列舉具有以下述通式(16)
表示的結構的伯胺化合物。另外，在上述通式(16)中的m1～m3分別各自為0～6的整數，n1為1～6的整數。通過通式(16)表示的胺化合物與硫辛酸的縮合反應、以及之後進行的芳香族氨基末端的保護基的脫保護而得到的連接子化合物是以上述通式(7)表示的連接子化合物。
另外，作為上述胺化合物的其他例子，例如，可以列舉具有下述通式(17) 表示的結構的仲胺化合物。另外，在上述通式(17)中的m4、m5各自分別是0～6的整數，n1是1～6的整數。通過通式(17)表示的胺化合物與硫辛酸的縮合反應、以及之後進行的芳香族氨基末端的保護基的脫保護而得到的連接子化合物是以上述通式(8)表示的連接子化合物。通過下列實施例，詳細描述這些胺化合物的合成方法。
通過上述硫辛酸或者γ-巰基丁酸與胺化合物的縮合反應，縮合硫辛酸或γ-巰基丁酸的羧基(-COOH基)與胺化合物的氨基(-NH2基)，形成醯胺鍵。然後，對芳香族氨基末端的保護基進行脫保護，除去保護基，形成芳香族氨基，從而能夠製得上述連接子化合物。
本發明的配體絡合物是向上述製造的連接子化合物導入具有還原末端的麥芽糖或乳糖等寡聚糖而得到的化合物。作為本發明的配體絡合物，具體地可以列舉以下所示的化合物。
對於第1號配體絡合物，在以上述通式(12)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(2)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入具備以下式(18) 表示的結構的麥芽糖而形成的基團。
對於第2號配體絡合物，在以上述通式(12)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(2)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入具備以下式(19) 表示的結構的麥芽糖而形成的基團。
對於該第1，2號配體絡合物，各自向具有3條烴衍生鏈的連接子化合物導入1個寡聚糖，從而在末端具有3個單元的寡聚糖。換言之，上述第1號配體絡合物在末端具有3個單元的α-吡喃葡糖，上述第2號配體絡合物在末端具有3個單元的β-吡喃半乳糖。另外，在上述通式(2)中，m1～m3為0～6的整數而沒有特殊限制，可以是不同的整數，也可以是部分或完全相同的整數。另外，在上述通式(12)中，n1是1～6的整數而沒有特殊限制。
另外，對於第3號配體絡合物，在以上述通式(12)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(3)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入具備以上式(18)表示的結構的麥芽糖而形成的基團。
對於第4號配體絡合物，在以上述通式(12)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(3)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入具備以上式(19)表示的結構的麥芽糖而形成的基團。
該第3、4號配體絡合物是各自向具有2條烴衍生鏈的連接子化合物導入1個寡聚糖，從而在末端具有2個單元的寡聚糖。換言之，上述第3號配體絡合物在末端具有2單元的α-吡喃葡糖，上述第4號配體絡合物在末端具有2個單元的β-吡喃半乳糖。另外，在上述通式(3)中，m4、m5是0～6的整數而沒有限制，還可以是不同的整數，也可以是部分或全部相同的整數。另外，在上述通式(12)中，n1是1～6的整數而沒有特殊限制。
對於第5號配體絡合物，在以上述通式(13)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入麥芽糖而形成的基團。另外，在上述通式(13)中，n2是1～6的整數而沒有特殊限制。
對於第6號配體絡合物，在以上述通式(13)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入麥芽糖而形成的基團。另外，在上述通式(13)中，n2是1～6的整數而沒有特殊限制。
對於第7號配體絡合物，在以上述通式(14)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入麥芽糖而形成的基團。另外，在上述通式(14)中，n1是1～6的整數而沒有特殊限制。
對於第8號配體絡合物，在以上述通式(14)表示的結構中，作為上述X，是具備以上述通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，並向R導入麥芽糖而形成的基團。另外，在上述通式(14)中，n1是1～6的整數而沒有特殊限制。
此外，作為本發明的配體絡合物的具體例子，可以列舉向具有以上述通式(9)表示的結構的連接子化合物分別導入下述組(20)
表示的17種糖鏈而得到的17種配體絡合物。
上述配體絡合物都是含有連接子化合物與糖分子而形成，通過連接子化合物內的S-S鍵，利用金屬—硫(S)鍵，例如金—硫(Au-S)鍵能夠與蛋白質分析用的支撐體表面的金屬結合。通過這樣，能夠提供通過該Au-S鍵，使糖分子聚集、固定在上述支撐體表面而形成的配體載體。作為上述支撐體表面的金屬，除了上述Au之外，還可以使用Cu、Ag、Pt等金屬，特別優選使用Au。
另外，如下面實施例1所示，證實了上述各配體絡合物表現出與蛋白質的不同的相互作用。因此，可以認為能夠有效地用於鑑定未知的蛋白質。
另外，導入本發明的配體絡合物的上述寡聚糖可以是由相同的單糖分子構成的單一寡聚糖，也可以是由各種單糖分子或其衍生物構成的複合糖。另外，上述寡聚糖都是從自然界分離、精製而得到的各種天然糖，還可以是人工合成的糖。另外，上述寡聚糖也可以是分解多糖而製得的。
另外，通過金屬—硫鍵使上述那樣的本發明配體絡合物固定在表面具有金屬的支撐體上而構成的配體載體也包括在本發明範圍內。該配體載體並不限於蛋白質分析的用途，為了研究與糖分子的相互作用，還可以用於分析蛋白質以外的物質。
對於上述配體載體，通過使含該配體絡合物的配體絡合物溶液與表面具有金屬膜的支撐體接觸，配體絡合物的S-S鍵的各S原子通過金屬—硫鍵與支撐體表面的金屬結合，在支撐體表面導入上述配體絡合物。具體地講，通過在規定時間內將蛋白質分析用支撐體浸漬在上述配體絡合物液體中或者向上述支撐體注入配體絡合物溶液(使配體絡合物溶液流淌在支撐體表面)，將上述配體絡合物(配體絡合物所含的連接子化合物)的S-S鍵轉換成與上述支撐體表面的金等的Au-S鍵，從而能夠將上述配體絡合物固定在支撐體表面上。
作為用於配體絡合物溶液的溶劑，沒有特別限制，例如，可以列舉甲醇、水、二甲基乙醯胺(DMAc)或它們的混合溶劑等。另外，浸漬時間可以是0.2小時～12小時，注入濃度可以是1μM～1mM。
像這樣，本發明的配體絡合物具有S-S鍵，因而能夠簡單地固定於蛋白質分析用的支撐體表面，能夠簡單地在上述支撐體上導入糖分子。
本發明的配體載體可以用於分析糖分子與例如蛋白質等其他物質的相互作用。具體地講，上述配體載體能夠應用於SRP測定、親和色譜法等。
例如，作為蛋白質分析，可以按照如下步驟進行SRP測定。即，如果使用在蒸鍍金屬膜等金屬薄膜的支撐體上固定本發明的配體絡合物而形成的配體載體，使該配體載體與蛋白質接觸，並通過常規方法利用表面等離子體激元共振裝置測定共振角度，就能夠觀測該配體載體與蛋白質的結合行為。另外，作用用於SPR測定的的支撐體(傳感晶片)，例如，能夠使用玻璃、塑料等，特別合適地使用玻璃。另外，配體載體和蛋白質的接觸，例如可以通過如下步驟進行將蛋白質溶解在運行緩衝劑中得到溶液，並將所得溶解流淌在該配體載體的表面。作為該運行緩衝劑，例如，可以列舉磷酸緩衝溶液等。
另外，如後面的實施例所示，證實了本發明的配體載體表現出與各種蛋白質不同的相互作用，因而能夠用於蛋白質的鑑定。即，通過利用本發明的配體載體分析未知的蛋白質，能夠容易地判斷該蛋白質是否是糖結合性蛋白質，或者該蛋白質是哪種蛋白質。另外，如果製造含有在分別固定上述配體絡合物的配體載體中的至少2種作為1個組合的晶片組合，能夠更簡便地鑑定蛋白質(特別是糖鏈結合性的蛋白質)，因而是有用的。
下面描述本發明的配體載體的利用方法。本發明的配體載體能夠作為傳感晶片用於測定分子間相互作用的測定(例如，如下的SPR測定)。即，利用第1配體絡合物固定在支撐體表面而形成的第1的傳感晶片和與上述第1的配體絡合物種類不同的第2的配體絡合物固定在支撐體表面而形成的第2傳感晶片，檢測出利用第1傳感晶片得到的SRP測定的檢測結果與利用第2傳感晶片得到的SPR測定的檢測結果之差，能夠觀測糖分子的相互作用。對於這些傳感晶片，可以使用固定的糖分子不同的配體絡合物或者固定的糖分子不同，但連接子化合物部分不同的配體絡合物。作為該種類不同的配體絡合物，例如，可以列舉上述各種配體絡合物。而且，在上述配體絡合物中，優選選擇連接子化合物部分具有相同結構，但寡聚糖部分具有不同結構的化合物(例如，上述第1號配體絡合物與第2號配體絡合物的組合、或者上述第3號配體絡合物與第4號配體絡合物的組合)。
對於上述SPR測定，利用特異地作用於第1傳感晶片的糖分子的蛋白質等，測定條件保持恆定，使上述2個傳感晶片起作用，觀測兩者的共振角度。通過檢測該兩者的共振角度之差，能夠作為糖分子於蛋白質等特異的相互作用進行測定。
另外，觀測與糖分子的相互作用的物質並不限於蛋白質。
如上所述，同時測定2個種類的傳感晶片，並不限於這些，可以測定2種以上的傳感晶片，也可以同時測定。另外，還可以使用不向至少1個傳感晶片導入糖分子的晶片。例如，還可以使用只固定連接子化合物的晶片。
如果進行上述那樣的SPR測定，能夠利用糖分子以外具有相同結構的配體絡合物的至少2個傳感晶片進行測定，因而能夠觀測到由糖分子引起的至少2個傳感晶片相互作用之差。因此，如果利用上述測定方法，能夠降低糖分子以外的部分與其他物質的非特異的相互作用，能夠觀測糖分子與其他物質的特異的相互作用。
另外，還可以利用使糖分子相同、連接子化合物部分結構不同的配體絡合物固定的2種傳感晶片進行上述SPR測定。此時，能夠測定由傳感晶片上的糖分子的聚集度不同而引起的蛋白質的結合行為。作為這樣的傳感晶片的組合，能夠列舉上述第1號配體絡合物與第3號配體絡合物的組合。
此外，通過上述的SPR測定證實糖分子與其他物質的特異的相互作用後，如果直接將用於SPR測定的蛋白質結合的配體載體供質量分析使用，能夠鑑定與傳感晶片結合的蛋白質。可以使用母體支持型雷射脫離./飛行時間型質量分析儀(MALDI-TOF/MS)等以前公知的質量分析儀，並根據以前公知的方法進行上述質量分析。
如果利用上述步驟，能夠使用本發明的配體絡合物進行蛋白質的分析。即，本發明的蛋白質的分析方法由以下工序構成通過使上述本發明的配體絡合物與表面具有金屬的支撐體接觸，製造支撐體上固定該配體絡合物的配體載體的工序、使上述配體載體與含作為分析對象的蛋白質接觸，並相互作用後，進行例如SPR那樣的分子間相互作用的測定工序、在上述分子間相互作用測定後進行質量分析，鑑定與上述配體載體結合的蛋白質的工序。
該蛋白質的分析方法如上所述利用固定多種不同的配體絡合物的2種以上的配體載體，分別進行蛋白質的分析，比較研究各自的結構，能夠分析各個蛋白質的特性。
實施例
下面更詳細地描述本發明的配體絡合物的合成。另外，本實施例利用合成的配體絡合物進行SPR測定與質量分析，進行蛋白質的分析。並同時描述這些內容。
本實施例合成實施方式描述的各自分為第1～4號配體絡合物的4個配體絡合物。
(1)第1號配體絡合物(化合物1)的合成按照以下步驟合成具有如下所述結構的配體絡合物(化合物1)作為上述第1號配體絡合物之一的、在上述通式(12)表示的結構中，n1是1，X具備以通式(2)表示的結構，R是氫(H)，向R導入以上式(18)表示的麥芽糖，m1，m2，m3是2。
作為上述配體絡合物(化合物1)的合成前階段，首先，合成具有3條芳香族氨基末端受保護基保護的支鏈的連接子化合物A。
首先，如下式(21)所示，在60℃-70℃的二甲氧基乙烷中，在氫氧化苄基三甲基銨的存在下，相對硝基甲烷(化合物5)麥可加成3個單元的丙烯酸叔丁酯(化合物6)，以91％的產率製得化合物7。接著，在氫氣氣氛下(6kg/cm2)、50℃的乙醇中，利用雷尼鎳(Raney Ni)，還原上述化合物7的硝基，以98％的產率製得化合物8。
然後，在CH2Cl2中，在1.1當量的1-羥基-7-氮雜苯並三唑(式中，HOAt)、1.1當量的水溶性碳二亞胺鹽酸鹽(式中，EDC·HCl)的存在下，使上述化合物8與1.1當量的Z-甘氨酸縮合，以85％的產率製得Z-甘氨酸(化合物9)。
更詳細地講，上述化合物8根據文獻(G..R.Newkome等，OPPI BRIEFS，28卷，p.495，1996)的進行製備，首先，在50mL1，2-二甲氧基乙烷溶解硝基甲烷(12.2g，200mmol)，加熱至65-70℃，添加40％的氫氧化苄基三甲基銨—甲醇溶液(2ml)，製成硝基甲烷溶液。接著，使該硝基甲烷溶液的溫度上升至75℃，緩慢滴加丙烯酸叔丁酯(90.8mL，620mmol)後，一邊將溶液溫度保持在70-75℃，一邊分4次每次添加1mL40％的氫氧化苄基三甲基銨—甲醇溶液，攪拌2.5小時，製得硝基甲烷/丙烯酸叔丁酯反應溶液。通過傾析除去該硝基甲烷/丙烯酸叔丁酯反應溶液中的不溶物，進行濃縮，將所得殘渣溶於二乙醚，利用水冷的10％的鹽酸水溶液、飽和碳酸氫鈉溶解和水，分2次進行洗滌，製得殘渣溶液。之後，利用無水硫酸鈉作為乾燥劑，乾燥該殘渣溶液，利用C礦除去該乾燥劑，進行減壓濃縮後，將濃縮殘渣溶解於乙醇，進行重結晶，製得白色針狀晶體化合物7(81.8g，91％)。
接著，在50ml無水乙醇中，添加化合物7的晶體(10g，22.4mmol)和T-1雷尼鎳(6.0g)，在6kg/cm2的氫氣氣氛下，在50℃下進行23小時的攪拌後，利用C礦過濾T-1雷尼鎳，減壓濃縮所得化合物7反應溶液。通過矽膠色譜(溶劑氯仿/甲醇＝20/1)精製通過該化合物反應的減壓濃縮得到的濃縮殘渣，製得白色固體化合物8(產量9.2g，收率98％)。
更具體地講，將Z-甘氨酸(1.26g，6.62mol)和HOAt(0.90g，6.62mmol)、EDC·HCl(1.27g，6.62mmol)溶解在無水二氯甲烷(28mL)，得到Z-甘氨酸溶液，將化合物8(2.50g，6.02mmol)溶於無水二氯乙烷(2mL)得到化合物8溶液，在0℃的溫度條件下，在上述Z-甘氨酸溶液中添加上述化合物8溶液，在氬氣氣氛下，在室溫下攪拌36小時，製得Z-甘氨酸/化合物8反應溶液。在該Z-甘氨酸./化合物8反應溶液中添加二氯甲烷和10％檸檬酸水溶液，利用二氯甲烷進行提取，依次利用水、飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗滌有機層1次，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑進行乾燥後，過濾該乾燥劑進行減壓濃縮。利用矽膠色譜法(溶劑氯仿)精製通過該減壓濃縮得到的濃縮殘渣，製得白色固體化合物9(產量3.09g，收率85％)。
進行所得上述化合物9的ESI-MS(positive)測定(飛行時間型質量分析儀測定)，結果m/z(質量/電荷比)629.4[(M+Na)+]。另外，進行核磁共振(1H-NMR，400MHz，CDCl3)測定，結果為
δ7.37-7.26(5H，m，Ph)，6.43(1H，bs，CONHC)，5.38(1H，bs，Gly-NH)，5.13(2H，s，CH2Ph)，3.78(2H，d，J＝7.7Hz，Gly-CH2)，2.20(6H，t，J＝7.7Hz，CCH2CH2)，1.96(6H，t，J＝7.7Hz，CCH2CH2)，1.44(27H，s，CH3)。
通過這樣能夠證實化合物9的結構。另外，化合物9的分子質量為606.35。
接著，如下式(22)所示，在CH2Cl2/H2O＝10/1的混合溶劑中，利用三氟乙酸(以下稱為TFA)，對上述化合物9的叔丁氧基羰基(-COOC(CH3)3基；式(22)中，tBu)，以收率95％製得化合物10。
然後，在4.5當量的五氟苯基磷酸二苯酯(式中，FDPP)、11當量的二異丙基異胺(式中，DIPEA)、N，N-二甲基甲醯胺(DMF)的存在下，使上述化合物10與通過Boc基保護氨基的間苯二胺衍生物(化合物11、10當量)縮合，以收率99％製得N-Boc胺衍生物(化合物12)。接著，在甲醇(式中，MeOH)中，在Pd/C(活性炭負載鈀)存在下，進行接觸氫還原，對縮合成化合物12的Z-甘氨酸的苄氧羰基(式中，Z基)進行脫保護，以收率79％製得化合物13。
為了製得上述化合物10～13，具體地進行以下操作。
即，為了製得化合物10，將化合物9(2.98g，4.90mmol)溶解於二氯甲烷(15mL)，在-10℃下添加TFA(15mL)和水(1.5mL)後，在室溫下攪拌1.5小時，製得化合物9反應溶液。在減壓濃縮該化合物9反應溶液後，在水浴中向濃縮殘渣添加10％氫氧化鈉水溶液，使得pH為5，此外，添加濃鹽酸，使pH為2，使白色固體析出。利用水洗滌所得白色固體，製得白色固體化合物10(產量2.04g，收率95％)。
進行所得上述化合物10的ESI-MS(negative)測定，結果為m/z437.1[(M-H)]。另外，進行核磁共振(1H-NMR，400MHz，d6-DMSO)測定，結果為
δ7.34-7.30(6H，m，Ph，CONHC)，7.15(1H，s，Gly-NH)，5.01(2H，s，CH2Ph)，3.55(2H，d，J＝5.9Hz，Gly-CH2)，3.33(3H，brs，CO2H)，2.11(6H，m，CCH2CH2)，1.81(6H，m，CCH2CH2)。
通過這樣，能夠證實化合物10的結構。另外，化合物10的分子質量是438.16。
另外，為了製得化合物11，將間苯二胺(0.50g，4.62mmol)溶於甲醇(35mL)，在0℃下添加(Boc)2O(1.06mL，4.62mmol)和三乙胺(0.65mL，4.65mmol)之後，在室溫下攪拌24小時，進行減壓濃縮。通過矽膠色譜(溶劑氯仿/丙酮＝10/1)精製通過該減壓濃縮得到的濃縮殘渣，製得白色固體化合物11(產量665mg，收率68％)。
進行上述化合物11的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z231.2[(M+Na)+]。另外，進行1H-NMR(400MHz，CDCl3)測定，結果為δ7.02(1H，t，J＝8.0Hz，aromatic)，6.95(1H，bs，aromatic)，6.54(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.0Hz，aromatic)，6.41(1H，bs，CONH)，6.35(1H，dd，J＝2.2Hz，J＝7.9Hz，aromatic)，3.66(2H，bs，NH2)，1.50(9H，s，t-butyl)通過這些能夠證實化合物11的結構。另外，化合物11的分子質量是208.12。
另外，為了製得化合物12，將上述化合物10(100mg，228μmol)、上述化合物11(475mg，2.28mmol)、FDPP(394mg，1.03mmol)和二異丙基乙胺(447μL，2.57mmol)溶於無水二甲基甲醯胺(2mL)，在氬氣氣氛下，在室溫下攪拌29小時後，添加乙酸乙酯和水，利用乙酸乙酯進行提取，分別利用0.5N鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水洗滌一次有機層，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑，進行乾燥，製得乾燥反應溶液。從製得的乾燥反應溶液過濾乾燥劑，進行減壓濃縮，利用矽膠色譜(溶劑氯仿/丙酮＝3/1)精製濃縮殘渣，製得白色固體化合物12(產量228mg，收率99％)。
進行上述化合物12的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z1009.5[(M+H)+]。另外，進行1H-NMR(400MHz，CDCl3)測定，結果為
δ8.75(3H，s，NHCO2tBu)，7.67(3H，s，CONHPh)，7.30-6.95(15H，m，aromatic，CH2CONH)，6.52(1H，bs，Gly-NH)，(2H，s，CH2Ph)，3.71(2H，d，J＝5.0Hz，Gly-CH2)，2.23(6H，m，CH2CH2CO)，1.97(6H，m，CH2CH2CO)，1.47(27H，s，t-butyl)。
通過這些，能夠證實化合物12的結構。另外，化合物12的分子質量是1008.50。
另外，化合物13具體地按照以下步驟製得。即，將化合物12(200mg，198μmol)溶解於甲醇(3mL)，添加10％Pd/C(62.3mg)，在氫氣氣氛下，在室溫下攪拌15小時後，過濾上述Pd/C，進行減壓濃縮。利用矽膠色譜(溶劑氯仿/甲醇＝8/1)精製通過該減壓濃縮製得的濃縮殘渣，製得白色固體化合物13(產量136mg，收率78％)。
進行上述化合物13的ESI-MS(positive)測定，m/z875.5[(M+H)+]。另外，進行1H-NMR(400MHz，CDCl3)測定，結果為δ9.00(3H，s，NHCO2tBu)，7.57(2H，s，NH2)，7.35(1H，bs，Gly-NH)，7.14-7.00(15H，m，aromatic，CH2CONH)，3.21(2H，s，Gly-CH2)，2.26(6H，m，CH2CH2CO)，2.04(6H，m，CH2CH2CO)，1.45(27H，s，t-butyl)。
通過這些，能夠證實化合物13的結構。另外，化合物13的分子質量為874.46。
此外，如下式(23)所示，在CH2Cl2中，使1.0當量的EDC·HCl、1.0當量的1-羥基苯並三唑(式(23)中，HOBt)、上述化合物13與1.0當量的硫辛酸(化合物14)，以收率75％製得硫辛酸衍生物(化合物15)。
在CH2Cl2中，在三甲基氯化癸烷(式中，TMSCl)、苯酚(PhOH)的存在的酸性條件下，對上述得到的化合物15脫保護上述Boc基，形成含3條具有芳香族氨基烴衍生鏈而形成的連接子化合物，製得化合物A(收率32％)。
具體地講，為了製得化合物15和化合物A，進行以下操作。
即，為了製得化合物15，將化合物14(23.6mg，114mol)和HOBt(15.4mg，114mmol)溶於無水二氯甲烷(2.3mL)，在0℃的溫度條件下，添加化合物13(2.50mg，6.02mmol)，在氬氣氣氛下進行遮光，在室溫下，攪拌36小時後，添加10％的檸檬酸水溶液，然後利用氯仿進行提取，利用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層，使用無水硫酸鈉作為乾燥劑進行乾燥。之後，過濾該乾燥劑，進行減壓濃縮，利用矽膠色譜(溶劑氯仿/甲醇＝40/1)進行濃縮殘渣，製得白色固體化合物15(產量91.0mg，產率75％)。
進行上述化合物15的ESI-MS(positive)測定，m/z1085.5[(M+H)+]。
另外，進行1H-NMR(400MHz，CDCl3)測定，結果為
δ9.01(3H，bs，NHCO2tBu)，7.67(3H，s，CONHPh)，7.31(1H，bs，CONHCH2)，7.27-7.00(12H，m，aromatic)，3.71(2H，bs，Gly-CH2)，3.64-3.39(1H，m，SSCH)，3.12-2.99(2H，m，CH2SS)，2.33(1H，m，CH2CH2SS)，2.32(6H，m，CCH2CH2CO)，2.20(2H，m，CH2CONHCH2)，2.04(6H，m，CCH2CH2CO)，1.82-1.73(1H，m，CH3CH2SS)，1.62-1.47(4H，m，CH2(CH2)2CONH，(CH2)2CH2CH2CONH)，1.47(27H，s，t-butyl)，1.39-1.25(2H，m，CH2CH2(CH2)2CONH)通過這些，能夠證實化合物15的結構。另外，化合物15的分子質量為1062.49。
另外，為了製得化合物A，將三甲基氯化矽烷(0.25mL，2.64mmol)溶解於二氯甲烷(0.49mL)，添加把苯酚(549mg，5.83mmol)溶解於二氯甲烷(1.46mL)的苯酚溶液，進行攪拌後，進而添加化合物15(34.7mg，32.6μmol)，在室溫下，進行遮光，攪拌1.5小時，製得化合物15反應溶液。接著，向該化合物15反應溶液添加氯仿，利用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層，析出黃色固體。將析出的黃色固體溶於乙酸，冷卻至4℃，過濾凝聚的固體，製得白色固體化合物A(產量7.9mg，收率32％)。
進行上述化合物A的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z763.6[(M+H)+]。另外，進行1H-NMR(400MHz，CDCl3)測定，結果為δ9.57(3H，m，CONHPh)，7.97(1H，m，CONHCH2)，6.87(6H，m，aromatic)，6.67(3H，d，J＝7.7Hz，aromatic)，6.21(3H，d，J＝7.7Hz，aromatic)，4.98(6H，bs，NH2)，3.67(2H，d，J＝5.1Hz，Gly-CH2)，3.56(1H，m，SSCH)，3.16-3.04(2H，m，CH2SS)，2.36(1H，m，CH2CH2SS)，2.25(6H，m，CCH2CH2CO)，2.19-2.07(2H，m，CH2CH2CONHCH2)，1.93(6H，m，CCH2CH2CO)，1.83(1H，m，CH2CH2SS)，1.50(4H，m，CH2(CH2)3CONH，(CH2)2CH2CH2CONH)，1.33(2H，m，CH2CH2(CH2)2CONH)。
通過這些，能夠證實化合物A的結構。另外，化合物A的分子質量為762.33。
接著，利用這樣製得的連接子化合物A，按照下式(24)的步驟，合成在上述以通式(12)表示的結構中，具有n1為1，X是以通式(2)表示，m1，m2，m3是2的結構的配體絡合物(化合物1)。
如式(24)所示，在H2O/二甲基乙醯胺(式中，DMAC)/乙酸(AcOH)＝1/1/0.1的混合溶劑中溶解所得連接子化合物A和以上式(18)表示的作為寡聚糖的市售麥芽糖水合物(4.5當量)，在pH4~4.5，37℃下，形成席夫鹼之後，向溶劑添加AcOH，添加10當量的95％的NaBH3CN，在pH3~4.5，37℃下，進行還原氨基化反應。然後，利用Sephadex G-50(Phamarcia Biosystem公司製造)，通過凝膠過濾色譜精製所得化合物，進一步進行除鹽處理，作為末端含3個單元的α-吡喃葡糖而構成的配體絡合物製得化合物1。通過MALDI-TOF/MS和NMR鑑定上述化合物1。
MALDI-TOF/MS的結果是m/z1764.4[(M+Na)+]。另外，進行1H-NMR(600MHz，D2O)測定，結果為
δ7.01(3H，dd，J＝8.2，8.2Hz，aromatic)，6.70(3H，s，aromatic)，6.58(3H，d，J＝8.2Hz，aromatic)，6.44(3H，d，J＝8.2Hz，aromatic)，4.90(3H，d，J＝3.4Hz，H-1』×3)，3.79-3.73(6H，m，H-2×3，H-5×3)，3.71-3.66(6H，m，H-3×3，H-5』×3)，3.64(3H，dd，J＝2.1，12.4Hz，H-6a』×3)，3.59(3H，dd，J＝4.8，12.4Hz，H-6b』×3)，3.59-3.52(3H，m，H-6a×3)，3.54-3.51(6H，m，H-4×3，H-3』×3)，3.43(3H，dd，J＝6.9，12.4Hz，H-6b×3)，3.39-3.34(1H，m，CH2CH(CH2-)(S-))，3.37(3H，dd，J＝3.4，9.6Hz，H-2』×3)，3.25(3H，dd，J＝9.6，9.6Hz，H-4』×3)，3.11(3H，dd，J＝4.8，13.7Hz，H-1a×3)，3.01(3H，dd，J＝7.7，13.7Hz，H-1b×3)，2.98-2.86(2H，m，-SCH2-)，2.27-2.23(6H，m，-CH2CH2CO-×3)，2.19-2.14(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，2.10(2H，t，J＝7.6Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.98-1.94(6H，m，-CH2CH2CO-×3)，1.72-1.65(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，1.43-1.36(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.39-1.29(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.19-1.13(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)。
根據這些結果能夠證實化合物1的結構。另外，該化合物1的分子質量為1740.70。
(2)第2號配體絡合物(化合物2)的合成按照以下步驟合成具有如下所述結構的配體絡合物(化合物2)作為上述第2號配體絡合物之一的、在上述通式(12)表示的結構中，n1是1，X具備以通式(2)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入以上式(18)表示的麥芽糖，m1，m2，m3是2。
在上述配體絡合物(化合物2)的合成中，首先，按照與上述第1號配體絡合物的合成的步驟相同的步驟合成連接子化合物A。
接著，利用所得的連接子化合物A，並按照下式(25)的步驟，合成具有如下結構的配體絡合物(化合物2)在上述通式(12)表示的結構中，n1是1，X具備以通式(2)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入以上式(18)表示的麥芽糖，m1，m2，m3是2。
如式(25)所示，在H2O/二甲基乙醯胺(式中，DMAC)/乙酸(AcOH)＝1/1/0.1的混合溶劑中溶解上述方法得到的連接子化合物A和以上式(19)表示的作為寡聚糖的市售麥芽糖水合物(4.5當量)，在pH4~4.5，37℃下，形成席夫鹼之後，向溶劑添加AcOH，添加10當量的95％的NaBH3CN，在pH3~4.5，37℃下，進行還原氨基化反應。然後，利用Sephadex G-50(Phamarcia Biosystem公司製造)，通過凝膠過濾色譜精製所得化合物，進一步進行除鹽處理，作為末端含3個單元的β-吡喃半乳糖而構成的配體絡合物製得化合物2。通過MALDI-TOF/MS和NMR鑑定上述化合物2。
MALDI-TOF/MS的結果是m/z1766.92[(M+Na)+]。另外，進行1H-NMR(600MHz，D2O)測定，結果為
δ6.99(3H，dd，J＝7.9，8.2Hz，aromatic)，6.70(s，3H，aromatic)，6.61(3H，d，J＝7.9Hz，aromatic)，6.43(3H，d，J＝8.2Hz，aromatic)，4.27(3H，d，J＝7.6Hz，H-1』×3)，3.90-3.85(3H，m，H-2×3)，3.74-3.70(3H，m，H-5』×3)，3.69-3.66(3H，m，H-4×3)，3.68-3.62(3H，m，H-6a』×3)，3.65-3.62(3H，m，H-3×3)，3.57(3H，br，H-4』×3)，3.53(3H，dd，J＝5.8，11.7Hz，H-6b』×3)，3.47-3.43(6H，m，H-6×3)，3.41(3H，m，J＝3.1，10.0Hz，H-3』×3)，3.38(3H，brt，J＝5.8Hz，H-5×3)，3.35(3H，dd，J＝7.6，10.0Hz，H-2』×3)，3.36-3.29(1H，m，CH2CH(CH2-)(S-))，3.12(3H，brd，J＝10.7Hz，H-1a×3)，2.91(3H，dd，J＝7.6，12.0Hz，H-1b×3)，2.90-2.83(2H，m，-SCH2-)，2.23-2.16(6H，m，-CH2CH2CO-×3)，2.18-2.10(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，2.06(2H，t，J＝5.8Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.95-1.89(6H，m，-CH2CH2CO-×3)，1.68-1.59(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，1.41-1.30(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.32-1.22(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.15-1.08(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)。
根據這些結果能夠證實化合物2的結構。另外，該化合物2的分子質量為1740.70。
(3)第3號配體絡合物(化合物3)的合成按照以下步驟合成具有如下所述結構的配體絡合物(化合物3)作為上述第3號配體絡合物之一的、在上述通式(12)表示的結構中，n1是1，X具備以通式(3)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入以上式(18)表示的麥芽糖，m4，m5是2。
作為上述配體絡合物(化合物3)的合成的前階段，首先，合成芳香族氨基末端受保護基保護的具有2條支鏈的連接子化合物B。
如下式(26)所示，利用HOBt和EDC-HCl，縮合以Boc基保護氨基安息香酸(B-1)的氨基的氨基安息香酸衍生物(B-2)和二亞乙基三胺(B-3)，以79％的收率製得二醯胺(B-4)。在DMF中，利用FDPP作為縮合劑，使二醯胺(B-4)與Z基保護氨基的甘氨酸(Z-Gly)反應，以75的收率製得(B-5)。通過接觸氫還原除去Z基，形成(B-6)後，與硫辛酸(B-7)縮合，以97％的收率製得(B-8)。最後通過TFA除去Boc基，以95％的收率製得具有2個單元芳香族氨基的連接子化合物B。
更具體地講，對於上述化合物B-2，使4-氨基安息香酸(B-1)(2.00g，14.6)溶解於140mL甲醇中，添加(Boc)2O(6.7mL，29.1mmol)和三乙胺(3.06mL，21.9mmol)，在室溫下攪拌16小時。減壓濃縮反應溶液，向殘渣添加己烷和飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)，提取水層。向該水層添加10％檸檬酸鈉水溶液，使得pH＝4，析出白色固體。使所得固體溶解於乙酸乙酯，利用水進行洗滌後，進行減壓濃縮。利用乙酸乙酯—己烷對殘渣進行重解決，製得無色晶體化合物B-2(3.25g，收率91.3％)。
進行所得上述化合物B-2的1H-NMR(270MHz，CD3OD)測定，結果為δ9.24(1H，s，NH)，7.96(2H，d，J＝8.9Hz，aromatic)，7.55(2H，d，J＝8.6Hz，aromatic)，1.56(9H，s，t-butyl)。
另外，進行上述化合物B-2的ESI-MS(negative)測定，m/z236.20[(M-H)-]。通過這樣能夠證實化合物B-2的結構。另外，該化合物B-2的分子質量為237.25。
接著，使上述化合物B-2(1.30g、5.46mmol)、HOBt(0.738g、5.46mmol)和EDC·HCl(1.05g，5.46mmol)溶解於無水二氯甲烷(30mL)，在氬氣氣氛下，在0℃下攪拌50分鐘。向該溶液添加二亞乙基三胺(B-3)(0.283mL，2.60mmol)，在遮光下，在室溫下進行整夜攪拌，製得白色晶體。過濾該白色晶體，通過甲醇進行重結晶，製得白色晶體化合物B-4(1.23g，收率87.4％)。
進行所得上述化合物B-4的1H-NMR(400MHz，CD3OD)測定，結果為δ7.77-7.74(4H，d，J＝8.67Hz，aromatic)，7.50-7.48(4H，d，J＝8.57Hz，aromatic)，3.70-3.66(4H，m，J＝5.19Hz，NCH2CH2NHCO)，3.34-3.28(4H，m，J＝5.61Hz，NCH2CH2NHCO)，1.53(18H，s，t-butyl)另外，進行上述化合物B-4的ESI-MS(positive)測定，m/z542.64[(M+H)+]。通過這樣能夠證實化合物B-4的結構。另外，該化合物B-4的分子質量為541.60。
接著，將上述化合物B-4(1.03g，1.85mmol)、Z-甘氨酸(0.430g，2.04mmol)和FDPP(1.07mg，2.78mmol)溶解於無水二甲基甲醯胺(8mL)後，添加二異丙基異胺(0.36mL，2.78mmol)，在氬氣氣氛下，在室溫下攪拌20小時。將減壓濃縮該反應溶液的殘渣溶解於氯仿，依次利用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層後，利用無水硫酸鈉進行乾燥，過濾乾燥劑，進行減壓濃縮。利用矽膠色譜(50g，氯仿∶丙酮＝1∶2)精製濃縮殘渣，製得白色固體化合物B-5(1.02g，收率75.0％)。
進行所得上述化合物B-5的1H-NMR(400MHz，CDCl3)測定，結果為δ7.88(1H，bs，NHCOPh)，7.73-7.66(10H，m，NHCOPh，aromatic)，7.56(1H，bs，NHCOPh)，7.38(4H，d，J＝8.4Hz，COPhNH)，7.34-7.29(8H，m，aromatic)，5.37(1H，bs，Gly-NH)，5.00(2H，s，PhCH2)，3.64(4H，m，NCH2CH2NH，NCH2CH2NH)，3.49，3.47(4H，m，NCH2CH2NH)，3.43，3.27，3.17(6H，bt，bt，bt，NCH2CH2NH)，1.50，1.49(36H，s，s，t-butyl)。
另外，進行上述化合物B-5的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z755.36[(M+Na)+]。通過這樣能夠證實化合物B-5的結構。另外，該化合物B-5的分子質量是732.32。
接著，將上述化合物B-5(0.193g，0.264mmol)溶解於甲醇(3mL)，添加10％Pd/C(120mg)，在氫氣氣氛下，在室溫下攪拌3小時後，過濾Pd/C，進行減壓濃縮，製得白色固體化合物B-6(0.230g，收率94.4％)。
進行所得上述化合物B-6的1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)測定，結果為δ9.54(4H，d，J＝9.5Hz，COPhNH)，8.58，8.53，8.46(4H，bs，bs，bs，NHCOPh)，8.10(2H，bs，NH2)，7.56(1H，bs，NHCOPh)，7.76-7.73(8H，m，aromatic)，7.53-7.48(8H，m，aromatic)，4.39，4.24(4H，bs，bs，CONCH2)，3.80(2H，bs，CH2NH2)，3.42-3.33(16H，m，NCH2CH2NH，NCH2CH2NH)，1.46，1.45(36H，s，s，t-butyl)。
另外，進行上述化合物B-6的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z599.33[(M+H)+]。通過這樣能夠證實化合物B-6的結構。另外，該化合物B-6的分子質量為598.39。
接著，將硫辛酸(B-7)(41.0mg，0.200mmol)、HOBt(35.0mg，0.200mmol)和EDC·HCl(42.1g，0.200mmol)溶解於二甲基甲醯胺(3mL)，在氮氣氣氛下，進行遮光，在0℃下攪拌1.5小時。接著，將上述化合物B-6(0.1g，0.167mmol)溶解於二甲基甲醯胺(2mL)，滴入上述二甲基甲醯胺溶液後，在室溫下攪拌19小時。向反應溶液添加氯仿，提取有機層，利用10％檸檬酸水溶液和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌該有機層，利用無水硫酸鈉進行乾燥後，過濾乾燥劑，進行減壓濃縮。利用矽膠色譜(50g，氯仿∶甲醇＝7∶1)精製濃縮殘渣，製得白色固體化合物B-8(0.128g，收率97.0％)。
進行所得上述化合物B-8的1H-NMR(400MHz，CDCl3)，結果是δ7.76-7.69(11H，m，NHCOPh，aromatic)，7.55(1H，bs，NHCOPh)；7.45-7.35(9H，m，aromatic，COPhNH)，7.13，7.00，6.97(3H，bs，bs，bs，COPhNH)，5.83(1H，bs，Gly-NH)，4.04(2H，bs，Gly-CH2)，3.73-3.66(4H，m，CONCH2)，3.54-3.46(11H，m，NCH2CH2NH，NCH2CH2NH，SSCHCH2)，3.41，3.29，3.22(6H，bs，bs，bs，NCH2CH2NH)，3.16-3.03(2H，m，CH2SSCH)，2.39(1H，m，CH2CH2SS)，2.02(2H，t，J＝6.9Hz，CH2CH2CH2CONH)，1.84(1H，m，CHCH2SS)，1.58-1.52(4H，m，CH2CH2CH2CONH，CH2CH2CH2CONH)，1.51，1.49(18H，s，s，t-butyl)，1.35(2H，m，CH2CH2CH2CH2CONH)。
另外，進行上述化合物B-8的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z809.33[(M+Na)+]。通過這樣能夠證實化合物B-8的結構。另外，該化合物B-8的分子質量為787.30。
將上述化合物B-8(0.128g，0.16mol)溶解於二氯甲烷(1mL)，添加TFA(2mL)，在遮光下，在0℃下攪拌1.5小時後，進行減壓濃縮，將所得殘渣溶解於甲醇，通入Dowex Marathon(OH-form)的柱，進行中和，進行減壓濃縮，製得黃色固體化合物B(89.3mg，收率95.2％)進行所得上述化合物B的1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)測定，結果為
δ8.20，8.07(2H，m，NHCOPh)，7.83(1H，t，J＝5.5Hz，Gly-NH)，6.51-6.48(8H，m，aromatic)，5.57(8H，d，J＝14.3Hz，PhNH2)，4.34，4.12(4H，bs，bs，CONCH2)，3.82(2H，bs，Gly-CH2)，3.64-3.55(1H，m，SSCHCH2)，3.50-3.32(16H，band，NCH2CH2NH，NCH2CH2NH)，3.18-3.04(2H，m，CH2SSCH)，2.38(1H，m，CH2CH2SS)，2.02(2H，t，J＝7.1Hz，CH2CH2CH2CONH)，1.85(1H，m，CH2CH2SS)，1.57-1.47(4H，m，CH2CH2CH2CONH，CH2CH2CH2CH2CONH)，1.35(2H，m，CH2CH2CH2CONH)。
另外，進行上述化合物B的ESI-MS(positive)測定，m/z587.24[(M+H)+]。通過這樣能夠證實化合物B的結構。另外，該化合物B的分子質量為586.24。
接著，利用所得連接子化合物B，按照下式(27)的步驟合成具有如下所述結構的配體絡合物(化合物3)在上述通式(12)表示的結構中，n1是1，X具備以通式(3)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入以上式(18)表示的麥芽糖，m4，m5是2。
如式(27)所示，在H2O/二甲基乙醯胺(式中，DMAC)/乙酸(AcOH)＝1/1/0.1的混合溶劑中溶解上述方法得到的連接子化合物B和以上式(18)表示的作為寡聚糖的市售麥芽糖水合物(4.5當量)，在pH4~4.5，37℃下，形成席夫鹼之後，向溶劑添加AcOH，添加10當量的95％的NaBH3CN，在pH3~4.5，37℃下，進行還原氨基化反應。然後，利用Sephadex G-50(Phamarcia Biosystem公司製造)，通過凝膠過濾色譜精製所得化合物，進一步進行除鹽處理，作為末端含2個單元的α-吡喃葡糖而構成的配體絡合物製得化合物3。通過MALDI-TOF/MS和NMR鑑定上述化合物3。
MALDI-TOF/MS的結果是m/z1239.36[(M+H)+]。另外，進行1H-NMR圖譜(600MHz，D2O)，結果是δ7.39(2H，d，J＝8.2Hz，aromatic)，7.38(2H，d，J＝8.2Hz，aromatic)，6.56(2H，d，J＝8.2Hz，aromatic)，6.55(2H，d，J＝8.2Hz，aromatic)，4.91(2H，d，J＝3.4Hz，H-1』×2)，3.84(2H，s，-NHCOCH2NH-)，3.83-3.78(2H，m，H-2×2)，3.75(2H，dd，J＝4.1，6.9Hz，H-5×2)，3.72(2H，dd，J＝2.7，4.8Hz，H-3×2)，3.69(2H，dd，J＝4.1，4.8Hz，H-4×2)，3.69-3.66(2H，m，H-5×2)，3.64(2H，dd，J＝2.1，12.4Hz，H-6a』×2)，3.58(2H，dd，J＝4.8，12.4Hz，H-6b』×2)，3.55-3.51(2H，m，H-6a×2)，3.53(2H，dd，J＝8.9.9.6Hz，H-3』×2)，3.47-3.40(8H，m，-CONHCH2CH2N-×2)，3.44-3.41(2H，m，H-6b×2)，3.37(2H，dd，J＝3.4，9.6Hz，H-2』×2)，3.37-3.30(1H，m，CH2CH(CH2-)(S-))，3.23(2H，dd，J＝8.9，10.3Hz，H-4』×2)，3.20(3H，dd，J＝4.8，13.7Hz，H-1a×2)，3.12(2H，dd，J＝8.2，13.7Hz，H-1b×2)，3.00-2.89(2H，m，-SCH2-)，2.22-2.15(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，1.98(2H，t，J＝6.9Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.72-1.64(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，1.45-1.37(1H，m，-COCH2CH2CH2CH2(1H)-)，1.35-1.23(3H，m，-COCH2CH2CH2CH2-，-COCH2CH2CH2CH2(1H)-)，1.09-1.02(2H，m，-COCH2CH2CH2CH3-)。
通過這些結果能夠證實化合物3的結構。另外，該化合物3的分子質量是1238.48。
(4)第4號配體絡合物(化合物4)的合成按照以下步驟合成具有如下所述結構的配體絡合物(化合物4)作為上述第4號配體絡合物之一的、在上述通式(12)表示的結構中，n1是1，X具備以通式(3)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入以上式(19)表示的麥芽糖，m4，m5是2。
作為上述配體絡合物(化合物4)的合成的前階段，首先，按照上述步驟合成芳香族氨基末端受保護基保護的具有2條支鏈的連接子化合物B。接著，利用所得連接子化合物B，按照下式(28)的步驟合成具有如下所述結構的配體絡合物(化合物4)在上述通式(12)表示的結構中，n1是1，X具備以通式(3)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入以上式(19)表示的麥芽糖，m4，m5是2。
如式(28)所示，在H2O/二甲基乙醯胺(式中，DMAC)/乙酸(AcOH)＝1/1/0.1的混合溶劑中溶解上述方法得到的連接子化合物B和以上式(19)表示的作為寡聚糖的市售麥芽糖水合物(4.5當量)，在pH4~4.5，37℃下，形成席夫鹼之後，向溶劑添加AcOH，添加10當量的95％的NaBH3CN，在pH3~4.5，37℃下，進行還原氨基化反應。然後，利用Sephadex G-50(Phamarcia Biosystem公司製造)，通過凝膠過濾色譜精製所得化合物，進一步進行除鹽處理，作為末端含2個單元的β-吡喃半乳糖而構成的配體絡合物製得化合物4。通過MALDI-TOF/MS和NMR鑑定上述化合物4。
MALDI-TOF/MS的結果是m/z1261.15[(M+Na)+]。另外，進行1H-NMR圖譜(600MHz，D2O)，結果是δ7.40(2H，d，J＝8.9Hz，aromatic)，7.39(2H，d，J＝8.9Hz，aromatic)，6.59(2H，d，J＝8.9Hz，aromatic)，6.58(2H，d，J＝8.9Hz，aromatic)，4.30(d，1H，J＝7.6Hz，H-1』)，4.29(1H，d，J＝7.6Hz，H-1』)，3.93-3.89(2H，m，H-2×2)，3.84(2H，s，-CONHCH2NH-)，3.74-3.71(2H，m，H-5』×2)，3.71-3.69(4H，m，H-4×2，H-4』×2)，3.69-3.66(2H，m，H-3×2)，3.65(2H，dd，J＝3.0，11.7Hz，H-6a』×2)，3.53(2H，dd，J＝5.5，11.7Hz，H-6b』×2)，3.48-3.42(12H，m，H-5×2，H-3』×2，-CONHCH2CH2N-×2)，3.41-3.39(4H，m，H-6×2)，3.37-3.32(1H，m，CH2CH(CH2-)(S-))，3.35(2H，dd，J＝7.6，8.9Hz，H-2』×2)，3.23(2H，dd，J＝4.1，13.7Hz，H-1a×2)，3.04(2H，dd，J＝7.6，13.7Hz，H-1b×2)，3.01-2.90(2H，m，-SCH2-)，2.23-2.16(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，1.99(2H，t，J＝6.9Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.73-1.66(1H，m，-SCH2CH2(1H)-)，1.46-1.39(1H，m，-COCH2CH2CH2CH2(1H)-)，1.35-1.30(1H，m，-COCH2CH2CH2CH2(1H)-)，1.32-1.26(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.11-1.04(2H，m，-COCH2CH2CH2CH2-)。
通過這些結果能夠證實化合物4的結構。另外，該化合物4的分子質量是1238.48。
實施例2利用實施例1製造的各種配體絡合物(化合物1～4)，通過SPR測定和質量分析與蛋白質的糖鏈的結合特性。下面描述其步驟。
圖1按照工序1～工序12表示本實施例的蛋白質的分析步驟。在圖1中，工序1～工序7是使各配體絡合物(化合物1～4)固定在用金(Au)包覆的支撐體表面，製造配體載體(傳感晶片)的工序。而且，在使上述配體載體與含作為分析對象的蛋白質的溶液接觸的工序8之後實施的工序是進行SRP測定的工序。此外，在利用水洗滌支撐體表面的工序10之後實施的工序是通過質量分析(MS)鑑定蛋白質的工序。
在本實施例中，SPR測定是利用日本雷射電子公司製造的SPR-8B進行的。另外，質量分析是利用作為アプライドバイォ公司製造的母體支持型雷射脫離/飛行時間型質量分析儀(MALDI-TOF/MS)的Voyager RP-DE進行的。
對於用於分析的蛋白質，作為吡喃葡糖結合性的乳糖蛋白質是ConcanavalinA(簡稱ConA)、PSA、LCA，以及作為吡喃半乳糖結合性的乳糖蛋白質是RCA、PNA5種。而且，利用牛血清白蛋白(BSA)作為負對照組。
首先，基於圖1所示的工序1～工序7，製造分別固定上述化合物1～4的4種配體載體。接著，分別將上述5種乳糖蛋白質和BSA溶解於PBS緩衝液中，製造蛋白質溶液。然後，進行圖1所示的工序8，分別使各配體絡合物與各蛋白質溶液接觸，使它們進行相互作用。接著，進行SPR測定，進行配體載體與蛋白質的結合測定。
利用固定α-吡喃葡糖的配體載體(傳感晶片)的乳糖蛋白質的結合行為的結果示於圖2、圖3以及表1。圖2表示固定化合物(雙鍵型)的配體絡合物的傳感晶片的結果，圖3表示固定化合物1(三鍵型)的配體絡合物的傳感晶片的結果。在圖2和圖3中，(a)表示ConA的結合行為結果，(b)表示PSA的結合行為結果，(c)表示LCA的結合行為結果。
KD解離常數(μM)Ka結合速度常數(M-1s-1×104)Kd解離速度常數(s-1×101)
由圖2和圖3可知對於ConA和PSA，表現出不隨配體絡合物的連接部分的結構不同而變化的同樣的結合行為。但是，對於LCA，表現出與作為具有3個單元的糖分子的配體絡合物的化合物1結合，但是表現出沒有與具有2個單元的糖分子的配體絡合化合物3結合。雖然圖中未示出，但表明作為負面控制的BSA沒有與固定化合物1或3的晶片結合。
另外，表1匯集了各種蛋白質的結合行為。對於α葡萄糖結合性的乳糖蛋白質，觀測到特異的結合，耦合常數也可以計算。可知利用三鍵配體絡合物的情況計算得到的理解常數(Kp)與使用雙鍵配體絡合物的情況相等或更小，通過增加每個配體絡合物的糖鏈數，能夠提高結合活性。
利用固定β-吡喃半乳糖的配體絡合物(傳感晶片)的乳糖蛋白質的結合行為的結果示於圖4、圖5和表2。圖4表示固定化合物4(雙鍵型)的配體絡合物的傳感晶片的結果，圖5表示固定化合物2(三鍵型)的配體絡合物的傳感晶片的結果。在圖4和圖5中，(a)表示RCA的結合行為結果，(b)表示PNA的結合行為結果。
KD解離常數(μM)Ka結合速度常數(M-1s-1×104)Kd解離速度常數(s-1×101)*1不取決於蛋白質濃度，觀測到非特異性如圖4和圖5可知RCA和PNA表現出不隨配體絡合物的連接部分的結構不同而變化的同樣的結合行為。雖然圖中未示出，但表明作為負面控制的BSA沒有與固定化合物2或4的晶片結合。
另外，表2匯總了各種蛋白質的結合行為。對於β半乳糖結合性的乳糖蛋白質，觀測到特異的結合，還可以計算耦合常數。另外，對於ConA，在利用化合物2製造的晶片中，觀測到不依賴於蛋白質濃度的非特異的結合行為。可知利用三鍵配體絡合物的情況計算得到的理解常數(Kp)與使用雙鍵配體絡合物的情況相等或更小，通過增加每個配體絡合物的糖鏈數，能夠提高結合活性。
以上結果表明隨著糖鏈的聚集度不同，對於蛋白質的糖鏈的結合活性也不同，乳糖蛋白質的糖鏈結合特性也嫩構通過該體系進行測定。
此外，在進行工序9和工序10之後，將供該SPR測定的配體載體中的已經證實與蛋白質結合的物質提供至質量分析儀，鑑定與配體載體結合的蛋白質。另外，在進行質量分析時，在進行結合測定的部分放置母液(飽和αCHCA或芥子酸)，乾燥之後提供至質量分析儀，進行分子質量的測定。
在上述一系列的工序中，在證實配體載體和蛋白質的結合行為之後，在工序11中分離配體載體與蛋白質的結合，然後，在工序12中利用PBS緩衝液進行洗滌。然後，利用其他蛋白質溶液，再次反覆進行工序8～工序10，進行SPR測定和質量分析。針對各種配體載體和各種蛋白質，重複進行該操作。質量分析的結果示於圖6和表3。圖6(a)表示ConA的分析結果，圖6(b)表示PNA的分析結果。
根據圖6(a)和圖6(b)，可以明顯觀測到相當於構成每個蛋白質的子單元的分子質量的1價和2價的離子峰。
另外，在表3中還匯總了其他乳糖蛋白質的結果。與各種乳糖蛋白質的子單元的1價或2價的分子質量接近的離子峰。但是，對於RCA，由於子單元的分子質量為3萬道爾頓以上，因此不能利用所用的質量分析儀檢測其離子峰。如果利用性能更高的MALDI-TOF/MS儀器，就可以檢測。
根據該質量分析的結果，除了RCA以外，觀測到相當於結合的各種乳糖蛋白質的分子量，能夠鑑定乳糖蛋白質。
如上所述，本實施例的結果證實如果利用本發明涉及的配體絡合物進行SPR測定和質量分析，從而進行蛋白質的分析，能夠精確地鑑定蛋白質。另外，本實施例的結果證實即使是末端具有相同糖鏈的配體載體，隨著糖鏈的聚集度的差異，與蛋白質的結合活性也不同。即，可以認為本發明的蛋白質的分析方法還能夠應用於分析糖鏈的聚集度和蛋白質的結合活性之間的關係。對於這種糖鏈的聚集度於蛋白質的結合活性之間的關係的分析來說，現有的方法是不能進行判斷的，因此可以認為進一步提高了本發明的實用性。
在本實施例中，合成分為實施方式描述的第5號和第6號配體絡合物的配體絡合物。即，按照以下步驟合成具有如下所述結構的配體絡合物(化合物21)作為上述第5個配體絡合物的、在上述通式(13)表示的結構中，n2是4，X具備以通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入麥芽糖；以及具有如下所述結構的配體絡合物(化合物22)作為上述第6個配體絡合物的、在上述通式(14)表示的結構中，n2是4，X具備以通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入麥芽糖。
對於1H-NMR圖譜的測定，利用JEOL-Delta600分光計。對於化學位移，在CDCl3的情況下，以四甲基矽烷(0.00ppm)為標準物質，利用δ值進行表示。在D2O的情況下，以DHO(4.65ppm)為標準物質，以δ值進行表示。質量分析利用PerSeptive Biosystem MarinerTMBiospectrometry Workstation進行測定。矽膠色譜法利用Silicagel 60(Merck，0.040-0.063mm)進行測定。薄層色譜法利用Precoated Silicagel 60F254(Merck，0.5mm)。所有試劑、脫水試劑都購買關東化學株式會社生產的試劑而使用。
(1)化合物16的合成下面描述式(29)。
首先，按照以下步驟合成式(29)的化合物16將雙[2-(2-羥基乙氧基)乙基]醚(14.57ml，80mmol)和BF3·Et2O(252ml，2mmol)溶解於50ml無水二氯甲烷，在0℃下滴加重氮乙酸乙酯(1.8ml，17.35mmol)後，在室溫下攪拌70分鐘。向反應溶液添加20ml飽和氯化銨水溶液，利用二氯甲烷進行提取，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾乾燥劑，進行減壓濃縮，利用色譜(600g，己烷∶乙酸乙酯＝1∶3)精製濃縮殘渣，製得無色液體乙基化物(2.26g，產率47％)。
將上述乙基化物(2.15g，7.66mmol)和DMAP(41.7mg，337mmol)溶解於8ml無水吡啶。在0℃下，向該溶液滴入對甲苯磺酸氯(1.75g，9.19mmol)溶解於8ml無水二氯甲烷製得的溶液，在室溫下攪拌3小時。在反應溶液添加二氯甲烷和冰水，利用二氯甲烷進行提取。分別利用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水洗滌有機層1次，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾乾燥劑，進行減壓濃縮，利用色譜(100g，氯仿∶丙酮＝4∶1)精製濃縮殘渣，製得黃色液體甲苯磺醯化合物(2.59g，產率78％)。
將上述甲苯磺醯化合物(1.01g，2.31mmol)和疊氮化鈉(1.53g，2.31mmol)溶解於50ml無水二甲基甲醯胺，進行遮光，在120℃下，在氮氣氣氛下，攪拌10小時。利用氯仿提取反應溶液，分別利用水、飽和食鹽水洗滌有機層1次，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾乾燥劑，進行減壓濃縮，利用色譜法(10g，氯仿∶丙酮＝2∶1)精製濃縮殘渣，製得黃色液體疊氮化合物(638mg，產率90％)。
將24ml甲醇溶於上述疊氮化合物(614mg，2.01mmol)，在遮光下，添加1N NaOH4.3ml後，在室溫下攪拌21小時。對反應溶液進行減壓濃縮，向濃縮殘渣添加氯仿後，添加1N HCl，直到pH＝2，利用氯仿進行提取。利用飽和食鹽水洗滌有機層1次，利用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾除去乾燥劑，進行減壓濃縮，製得無色液體化合物(549mg，收率90％)。
針對該化合物16進行1H-NMR(400MHz，CDCl3)測定，結果為δ6.19(1H，bs，CO2H)，4.16(2H，s，OCH2CO2H)，3.75-3.64(12H，m，OCH2CH2O)，3.68(2H，m，N3CH2CH2)，3.41(2H，t，J＝5.1Hz，N3CH2)。
另外，進行上述化合物6的ESI-MS(negative)測定，結果為m/z328.14[(M+Na)+]。通過這些能夠證實化合物6的結構。另外，該化合物16的分子質量是277.13。
(2)化合物17的合成將化合物16(228mg，0.823nmol)溶解於無水二氯甲烷(4ml)，在室溫下，在0℃下依次添加HOBt(135mg，0.987mmol)、EDC·HCl(192mg，0.987mmol)、化合物11(205mg，0.987mmol)，在遮光下攪拌20小時。對該反應溶液進行減壓濃縮，利用氯仿提取濃縮殘渣，分別利用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層1次，利用無水硫酸鎂作為乾燥劑進行乾燥後，過濾除去乾燥劑，進行減壓濃縮。利用矽膠色譜(80g，氯仿∶甲醇＝10∶1)精製通過減壓濃縮得到的濃縮殘渣，製得黃色油狀物質化合物17(367mg，收率95％)。進行該化合物17的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z490.24[(M+Na)+]。通過這樣能夠證實化合物3的結構。另外，該化合物17的分子質量是467.24。
(3)化合物18的合成將化合物17(29mg，0.062mmol)溶解於甲醇(3ml)，添加10％Pd/C(5.0mg)，在氫氣氣氛下，在室溫下攪拌9時間。過濾上述Pd/C，減壓濃縮濾液。利用矽膠色譜(1.5g，氯仿∶甲醇＝7∶1)精製所得濃縮殘渣，製得黃色油狀物質化合物18(22mg，收率82％)。進行該化合物18的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z442.27[(M+H)+]。通過這些能夠證實化合物18的結構。另外，該化合物18的分子質量是C21H35N3O7441.25。
(4)化合物19的合成。
將硫辛酸(12.6mg，0.061mmol)溶解於無水二甲基甲醯胺(2ml)，在氬氣氣氛下，依次添加HOBt(8.3mg，0.061mmol)、EDC·HCl(11.8mg，0.061mmol)，在遮光下，返回至室溫下，攪拌2小時。將化合物18(22.4mg，0.051mmol)溶解於無水二甲基甲醯胺(2ml)，在室溫下，在遮光下攪拌1天。向反應液添加甲苯，進行濃縮，依次利用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層，利用無水硫酸鎂進行乾燥後，過濾除去乾燥劑，進行減壓濃縮。利用矽膠柱色譜(3g，氯仿∶甲醇＝10∶1)精製所得的濃縮殘渣，製得黃色油狀物的化合物19。產量是27mg(84％)。進行該化合物19的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z652.28[(M+Na)+]。通過這樣能夠證實化合物19的結構。另外，該化合物19的分子質量是629.28。
(5)化合物20的合成。
將化合物19(31mg，0.050mmol)溶解於二氯甲烷(2ml)，在0℃下添加TFA(147μl)，在相同溫度下攪拌3小時。濃縮反應溶液後，利用甲苯進行共沸。將所得的濃縮殘渣溶解於二氯甲烷，添加三乙胺水溶液，使水相的pH為8之後，利用無水硫酸鎂乾燥有機相後，過濾除去乾燥劑，進行減壓濃縮。利用矽膠柱色譜(10mg，氯仿∶甲醇＝5∶1)精製所得的濃縮殘渣，製得黃色油狀物化合物20。產量是26.1mg(59％)。針對該化合物20進行1H-NMR圖譜(600MHz，CDCl3)測定，結果為δ7.17(s，1H，aromatic)，7.1(dd，1H，J＝8.6，8.3Hz aromatic)，6.91(d，1H，J＝8.2Hz aromatic)6.45(d，1H，J＝8.2Hzaromatic)4.1(s，2H，-OCH2CONH-)，3.78-3.49(m，15H，ethyleneglycol chain，CH2CH(CH2-)(S-))，3.41(q，2H，J＝5.5Hz，-CONHCH2CH2O-)，3.16(m，1H，-SCH2(1H)-)，3.08(m，1H，-SCH2(1H)-)，2.46-2.44(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，2.13-2.10(t，2H，J＝7.6Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.92-1.88(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，1.43-1.40(m 4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.26-1.24(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)。
另外，進行化合物20的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z552.31[(M+Na)+]。根據以上結構能夠證實化合物20的結構。另外，該化合物20的分子質量為529.23。
(6)配體絡合物(化合物21)的合成下面描述式(30)。
將化合物20(15.5mg，29.3μmol)和葡萄糖(5.8mg，32.2μmol)溶解於DMAc/水(1∶1，1ml)，添加乙酸(200μl)，在37℃下放置2天。向反應液添加氰氫化硼鈉(5.5mg，87.9μmol)，在37℃下進一步放置6天。濃縮反應液。通過ODS柱色譜(Chromatorex ODS，30g，甲醇/水＝50/50)精製所得殘渣。製得白色固體化合物21。產量是4.54mg(22％)。
針對該化合物21進行1H-NMR圖譜(600MHz，D2O)測定，結果為δ7.17(s，1H，aromatic)，7.1(dd，1H，J＝8.6，8.3Hz aromatic)，6.91(d，1H，J＝8.2Hz aromatic)6.45(d，1H，J＝8.2Hz aromatic)4.1(s，2H，-OCH2CONH-)，3.80-3.76(m，1H，H-2)，3.68-3.35(m，19H，ethylene glycol chain，H-3，H-6a，H-5，H-4，H-6b)，3.20-3.10(m，2H，H-1-a，CH2CH(CH2-)(S-))，3.05-2.94(m，1H，H-1b，-SCH2)，2.28-2.23(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，2.13-2.10(t，2H，J＝7.6，6.9Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.78-1.69(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，1.53-1.36(m 4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.20-1.10(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)。
進行MALDT-TOF-MS測定，結果是m/z694.66[(M+H)+]。通過這些能夠證實化合物21的結構。另外，該化合物21的分子質量是693.30。
(7)配體絡合物(化合物22)的合成下面描述式(31)
將化合物20(9.0mg，17μmol)和麥芽糖(5.8mg，17.0μmol)溶解於甲醇/水(1∶1，1ml)，添加乙酸(50μl)，在37℃下放置24小時。向反應液添加乙酸(450μl)和氰氫化硼鈉(3.2mg，51μmol)，在37℃下進一步放置120小時。濃縮反應液。通過ODS柱色譜(Chromatorex ODS，30g，甲醇/水＝50/50)精製所得殘渣。製得白色固體化合物22。產量是2.36mg(16％)。
針對該化合物22進行1H-NMR圖譜(600MHz，D2O)測定，結果為
δ7.07-7.04(t，1H，J＝8.2，Hz，aromatic)，6.76(s，1H，aromatic)，6.63(d，1H，J＝8.2Hz，aromatic)，6.48(dd，1H，J＝2.1，6.2Hz，aromatic)，4.91(d，1H，J＝4.1Hz，H-1)，4.1(s，2H，-OCH2CONH-)，3.82-3.78(m，1H，H-2)，3.75-3.34(m，24H，ethylene glycol chain H-2』，H-5』，H-5，H-6』a，H-6』b，H-6a，H-6b，H-3，H-3』，H-4』)3.25(m，1H，CH2CH(CH2-)(S-))，3.18-3.11(m，3H，H1』b，-CONHCH2CH2O-)，3.07-2.93(m，3H，H1』a，-SCH2)，2.29-2.20(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，2.05-1.96(t，2H，J＝7.6，6.9Hz，-NHCOCH2CH2-)，1.76-1.69(m，1H，-SCH2CH2(1H)-)，1.52-1.31(m4H，-COCH2CH2CH2CH2-)，1.18-1.10(m，2H，-COCH2CH2CH2CH2-)進行MALDT-TOF-MS測定，結果是m/z878.39[(M+Na)+]。通過這些能夠證實化合物22的結構。另外，該化合物22的分子質量是855.35。
在本實施例中，合成分為實施方式描述的第7號和第8號配體絡合物的配體絡合物。即，按照以下步驟合成作為上述第7個配體絡合物的作為上述第5個配體絡合物的具有如下所述結構的配體絡合物(化合物26)在上述通式(14)表示的結構中，n1是3，上述X具備以通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入葡糖糖；以及作為上述第8個配體絡合物的具有如下所述結構的配體絡合物(化合物27)在上述通式(14)表示的結構中，n1是3，上述X具備以通式(4)表示的結構，R』是氫(H)，向R導入麥芽糖。
另外，測定方法、試劑等與上述實施例3記載的內容相同。
(1)化合物24的合成下面描述式(32)。
將γ-巰基丁酸二聚體(化合物23)(344mg，1.44mmol)溶解於無水二氯甲烷(25ml)，在室溫下，在氬氣氣氛下，在0℃下，依次添加HOBt(359mg，2.64mmol)、EDC·HCl(508mg，2.64mmol)、N-Boc-苯二胺(化合物11)(502mg，2.4mmol)，在遮光下，攪拌17小時。減壓濃縮該反應溶液，利用氯仿提取所得的濃縮殘渣，分別利用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層1次，使用無水硫酸鎂作為乾燥劑進行乾燥後，過濾除去乾燥劑，進行減壓蒸餾。利用矽膠色譜(50g，甲苯∶乙酸乙酯＝5∶1)精製通過減壓濃縮得到的濃縮殘渣，製得黃色油狀物的化合物27(220mg，產率30％)。進行該化合物24的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z641.25[(M+Na)+]。通過這些能夠證實化合物24的結構。另外，該化合物24的分子質量是618.25。
(2)化合物25的合成將化合物24(103mg，11.67mmol)溶解於二氯甲烷(2ml)，在0℃下添加TFA(247μl)，在相同溫度下攪拌1小時。濃縮反應溶液後，利用甲苯進行共沸。將所得濃縮殘渣溶解於乙酸乙酯，添加三乙胺水溶液，使水相的pH為8之後，利用無水硫酸鎂乾燥有機相後，過濾除去乾燥劑，進行減壓濃縮。利用矽膠柱色譜(5mg，氯仿∶甲醇＝5∶1)精製所得的濃縮殘渣，製得黃色油狀物化合物25。產量是46.8mg(67％)。針對該化合物25進行1H-NMR圖譜(600MHz，CDCl3)測定，結果為δ6.93-6.89(m，2H，aromaric)，6.71-6.68(d，1H，J＝8.4Hz，aromaric)，6.37-6.35(d，1H，J＝8.4Hz，aromaric)，2.66(t，2H，J＝6.6Hz，O＝C-CH2)，2.36(t，2H，J＝7.2Hz，CH2-S)，1.98-1.94(m，2H，J＝6.6Hz，14.4Hz，CH2CH2CH2)。
另外，進行化合物25的ESI-MS(positive)測定，結果為m/z419.06[(M+H)+]。根據以上結構能夠證實化合物25的結構。另外，該化合物25的分子質量為418.15。
(3)配體絡合物(化合物26)的合成下面描述式(33) 將化合物25(5.04mg，12μmol)和葡萄糖(4.79mg，26.0μmol)溶解於甲醇/水(1∶1，1ml)，添加乙酸(50μl)，在37℃下放置4小時。向反應液添加乙酸(950μl)、甲醇/水(1∶1，1ml)和氰氫化硼鈉(5.14mg，72μmol)，在37℃下進一步放置72小時。濃縮反應液。通過利用LLH-20的柱色譜(50g，甲醇/水＝50/50)精製所得殘渣。製得白色固體化合物26。產量是2.58mg(29％)。
針對該化合物26進行1H-NMR圖譜(600MHz，D2O)測定，結果為δ6.94(t，1H，J＝7.8Hz，aromaric)，6.66(s，1H，aromaric)，6.55(d，1H，J＝8.4Hz，aromaric)，6.37(d，1H，J＝9.6Hz，aromaric)，3.714-3.707(m，1H，J＝4.2Hz)，3.58-3.51(m，3H)，3.44-3.37(m，2H，)，3.10-3.07(m，2H，J＝8.4Hz，13.8Hz)，2.56-2.50(m，2H，O＝C-CH2)，2.24(t，2H，J＝3.6Hz，CH2-S)，1.83-1.81(m，2H，CH2CH2CH2)。
進行MALDT-TOF-MS測定，結果是m/z747.21[(M+H)+]。通過這些能夠證實化合物26的結構。另外，該化合物26的分子質量是746.29。
(4)配體絡合物(化合物27)的合成下面詳細描述式(34)。
將化合物25(5.1mg，12μmol)和麥芽糖(9.2mg，26.0μmol)溶解於甲醇/水(1∶1，1ml)，添加乙酸(50μl)，在37℃下放置4小時。向反應液添加乙酸(950μl)、甲醇/水(1∶1，1ml)和氰氫化硼鈉(5.22mg，72μmol)，在37℃下進一步放置120小時。濃縮反應液。通過利用LLH＝20的柱色譜(50g，甲醇/水＝50/50)精製所得殘渣。製得白色固體化合物27。產量是2.74mg(21％)。
針對該化合物27進行1H-NMR圖譜(600MHz，D2O)測定，結果為δ7.04(t，1H，J＝4.2Hz，aromaric)，6.77(s，1H，aromaric)，6.64(d，1H，J＝7.8Hz，aromaric)，6.54(d，1H，J＝8.4Hz，aromaric)，4.93(d，1H，J＝3.6Hz)，3.82-3.78(m，2H)，3.75-3.70(m，3H)，3.63-3.56(m，3H)，3.48(dd，1H，J＝6.6Hz，11.4Hz)，3.41-3.39(m，1H)3.27(t，1H，J＝9.0Hz)，3.18(s，3H)，3.08-3.06(m，1H)，2.65(t，2H，4.8Hz，O＝C-CH2)，2.34(t，2H，J＝7.2Hz，CH2-S)，1.91(t，2H，J＝7.2Hz，CH2CH2CH2)進行MALDT-TOF-MS測定，結果是m/z1093.27[(M+Na)+]。通過這些能夠證實化合物27的結構。另外，該化合物22的分子質量是1070.39。
合成在上述以通式(19)表示的結構中，n1和q是0，導入以上述組(20)表示的糖鏈的配體絡合物。另外，測定方法、試劑等與上述實施例4相同。
(1)配體絡合物(化合物30)的合成按照式(35)描述配體絡合物(化合物30)的合成步驟。
將化合物28(2.47mg，8.24μmol)和含氰酸的三糖(化合物29，5.11mg，7.57μmol)溶解於二甲基乙醯胺/水(1∶1，1.0ml)，添加乙酸(100μl)，在37℃下放置10小時。向反應液添加氰氫化硼鈉(1.55mg，24.7μmol)，進一步在37℃下放置72小時。向反應液添加3ml丙酮，使未反應的氰氫化硼鈉淬火後，進行濃縮。依次利用使用Chromatorex ODSde柱色譜、HPLC(柱DAISOSP-120-5-ODS-BP)、使用Sephadex G-25的色譜精製所得的殘渣。製得白色固體化合物30。產量是2.31mg(32％)。
進行該化合物30的1H-NMR圖譜(600MHz，D2O)測定。得到圖7所示的圖表。另外，進行MALD-TOF-MS測定，結果是m/z977.5[(M+Na)+]。通過這些能夠證實化合物30的結構。另外，該化合物30的分子質量是954.34。
(2)配體絡合物(式(36))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(36)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖8。通過這些能夠證實以式(36)表示的配體絡合物的結構。
(3)配體絡合物(式(37))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(37)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖9。通過這些能夠證實以式(37)表示的配體絡合物的結構。
(4)配體絡合物(式(38))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(38)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖10。通過這些能夠證實以式(38)表示的配體絡合物的結構。
(5)配體絡合物(式(39))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(39)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖11。通過這些能夠證實以式(39)表示的配體絡合物的結構。
(6)配體絡合物(式(40))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(40)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖12。通過這些能夠證實以式(40)表示的配體絡合物的結構。
(7)配體絡合物(式(41))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(41)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖13。通過這些能夠證實以式(41)表示的配體絡合物的結構。
(8)配體絡合物(式(42))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(42)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖14。通過這些能夠證實以式(42)表示的配體絡合物的結構。
(9)配體絡合物(式(43))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(43)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖15。通過這些能夠證實以式(43)表示的配體絡合物的結構。
(10)配體絡合物(式(44))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(44)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖16。通過這些能夠證實以式(44)表示的配體絡合物的結構。
(11)配體絡合物(式(45))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(45)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖17。通過這些能夠證實以式(45)表示的配體絡合物的結構。
(12)配體絡合物(式(46))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(46)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖18。通過這些能夠證實以式(46)表示的配體絡合物的結構。
(13)配體絡合物(式(47))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(47)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖19。通過這些能夠證實以式(47)表示的配體絡合物的結構。
(14)配體絡合物(式(48))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(48)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖20。通過這些能夠證實以式(48)表示的配體絡合物的結構。
(15)配體絡合物(式(49))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(49)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-MR圖譜，所得圖表示於圖21。通過這些能夠證實以式(49)表示的配體絡合物的結構。
(16)配體絡合物(式(50))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(50)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖22。通過這些能夠證實以式(50)表示的配體絡合物的結構。
(17)配體絡合物(式(51))的合成按照與上述(1)同樣的步驟合成以式(51)表示的配體絡合物。
測定該配體絡合物的1H-NMR圖譜，所得圖表示於圖23。通過這些能夠證實以式(51)表示的配體絡合物的結構。
另外，實施發明的最佳方式完成的具體實施方式
只不過是使本發明的技術內容清楚明了而列舉的例子，而並不應該狹義地理解為局限於那樣的具體例子，在本發明的宗旨和下面記載的權利要求的範圍內，能夠進行各種變換而實施。
工業實用性如上所述，本發明涉及的配體絡合物能夠在一個配體絡合物內導入多個糖分子，因而能夠避免上述配體絡合物聚集在支撐體表面，而且能夠使糖分子聚集。通過利用本發明的連接子化合物，可以重現性良好地評價上述糖分子與蛋白質之間的相互作用。
另外，本發明涉及的配體載體起到能夠用於鑑定未知蛋白質的效果。此外，通過利用本發明涉及的蛋白質的分析方法，能夠進行未知蛋白質的鑑定。
本發明提供能夠有效地用於蛋白質的功能分析的新型的配體絡合物或配體載體等。如果作為糖鏈或蛋白質的功能分析的工具而開發固定寡聚糖的配體載體(晶片)，不僅有助於分析與寡聚糖鏈相關的生命現象，而且還期待成為藥物開發的重要技術。因而可以認為本發明的實用性很高。
權利要求
1.一種配體絡合物，其特徵在於具備以通式(1) (式中，p，q各自分別為0～6的整數)表示的結構，作為上述X，具備末端存在芳香族氨基，同時含1條或2條或3條主鏈還可以具有碳-氮鍵的烴衍生鏈而形成的結構，作為上述Y，具備硫原子或含硫原子的烴結構，作為上述Z，具有通過上述芳基結合具有具備含碳-碳鍵或碳-氧鍵的直鏈結構的化合物、與具有還原末端的糖的結構。
2.權利要求1所述的配體絡合物，其特徵在於上述Y是含S-S鍵或SH基的烴結構。
3.權利要求1或2所述的配體絡合物，其特徵在於上述X具備以通式(2) (式中，m1、m2、m3各自分別是0～6的整數，R』是氫(H)或R)表示的結構，上述R是源自糖鏈的化合物。
4.權利要求1或2所述的配體絡合物，其特徵在於上述X具備以通式(3) (式中，m4、m5各自分別是0～6的整數，R』是氫(H)或R)表示的結構，上述R是衍生化合物。
5.權利要求1或2所述的配體絡合物，其特徵在於上述X具備以通式(4) (式中，R』是氫(H)或R)表示的結構，上述R是源自糖鏈的化合物。
6.權利要求1或2所述的配體絡合物，其特徵在於上述Z具備以通式(5)或通式(6) (式中，n1、n2分別是1以上、6以下的整數)表示的結構。
7.一種配體絡合物的製備方法，其特徵在於利用具備以通式(7) (式中，m1、m2、m3分別各自是0～6的整數，n1是1以上，6以下的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(8) (式中，m4，m5分別各自是0～6的整數，n1是0～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(9) (式中，n1，q分別各自是0～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(10) (式中，n2是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物、或者具備以通式(11) (式中，n1是1～6的整數)表示的結構的連接子化合物與具有還原末端的糖，進行還原氨基化反應。
8.一種配體載體，其特徵在於其通過在表面具有金屬的支撐體上固定權利要求1～6任一項所述的配體絡合物而構成。
9.權利要求8所述的配體載體，其特徵在於用於蛋白質分析。
10.一種蛋白質的分析方法，其特徵在於由下列工序構成通過使權利要求1～6任一項所述的配體絡合物與支撐體接觸，製造使該配體絡合物固定在載體上的配體載體的工序；和使上述配體載體與蛋白質溶液接觸後，進行分子間相互作用的測定的工序；在上述分子間相互作用的測定後，進行質量分析，鑑定與上述配體載體結合的蛋白質的工序。
全文摘要
本發明提供能夠有效應用於蛋白質的功能分析的新型配體絡合物、配體載體以及蛋白質的分析方法。一種配體絡合物，其特徵在於具備以通式(1)，(式中，n，q各自分別為0～6的整數)表示的結構，作為上述X，具備末端存在芳香族氨基，同時含1條或2條或3條主鏈還可以具有碳—氮鍵的烴衍生鏈而形成的結構，作為上述Y，具備硫原子或含硫原子的烴結構，作為上述Z，具有連接子化合物與具有還原末端的糖通過上述芳香族氨基連接的結構，其中，所述連接子化合物具備含碳—碳鍵或碳—氧鍵的直鏈結構。
文檔編號C07D339/04GK1930179SQ20058000518
公開日2007年3月14日 申請日期2005年2月18日 優先權日2004年2月18日
發明者隅田泰生 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構, 國立大學法人鹿兒島大學