抗gdf-8的中和抗體及其用途的製作方法

2023-07-27 21:09:06

專利名稱：：抗gdf-8的中和抗體及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明
技術領域：
涉及抗生長分化因子-8(GDF-8)的抗體，具體地，涉及人抗體，以及抗體片段，特別是在體外和/或體內抑制GDF-8活性的那些。該
技術領域：
進一步涉及診斷、預防或治療肌肉或骨退行性障礙，或胰島素代謝失調。技術背景生長分化因子-8(GDF-8)，也稱為肌肉生長抑制素(myostatin)，是一種分泌蛋白，還是結構相關的生長因子一轉化生長因子-P(TGF-p)超家族的一員，所有結構相關的生長因子都具有生理學上重要的生長調節和形態發生活性(Kingsley等.(1994)GenesDev.，8:133-146;Hoodless等.(1998)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.,228:235-272)。類似於TGF-p，人GDF-8被合成為375個胺基酸長的前體蛋白。該前體GDF-8蛋白形成同型二聚體，在加工過程中，氨基末端前肽在Arg-266處裂解。該裂解前肽，稱為"潛在性相關肽"(LAP),可與上述同型二聚體保持非共價結合，因此使該複合體失活(Miyazono等.(1988)J.Biol.Chem.，263:6407-6415;Wakefield等.(1988)J.Biol.Chem.，263:7646-7654;Brown等.(1990)GrowthFactors,3:35-43;和Thies等.(2001)GrowthFactors,18:251-259)。成熟GDF-8與前肽的複合體通常稱為"小潛在性複合體"(smalllatentcomplex)(Gentry等.(1990)Biochemistry,29:6851-6857;Derynck等.(1995)Nature,316:701-705;和Massague(1990)Ann.Rev.CellBiol.，12:597-641)。也已知其他蛋白能結合成熟GDF-8並抑制其生物活性。上述抑制性蛋白包括卵泡抑素和卵泡抑素相關蛋白(Gamer等.(1999)Dev.Biol.，208:222-232)。來自於不同物種推斷的胺基酸序列的比對表明GDF-8在進化過程中高度保守(McPherron等.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94:12457-12461)。事實上，人、小鼠、大鼠、豬和雞GDF-8序列的C末端區域是100H同一的，而在狒狒、牛和綿羊中僅有3個胺基酸不同。斑馬魚(zebrafish)GDF-8差異最大；然而與人仍具有88%同一性。該高度保守暗示GDF-8具有重要功能。GDF-8在發育和成熟的骨骼肌中高表達，並發現與肌肉中及骨發生中關鍵生物學過程的調節相關。例如，GDF-8敲除轉基因小鼠表現為明顯肥大和骨骼肌過度增生(McPherron等.(1997)Nature,387:83-90)以及改變的骨皮質結構(Hamrick等.(2000)Bone，27(3):343-349)。在牛的GDF-8自發突變中也明顯出現類似的骨骼肌質量增加(Ashmore等.(1974)Growth,38:501-507;Swatland等.(1994)J.Anim.Sci.，38:752-757;McPherron等.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94:12457-12461;和Kambadur等.(1997)GenomeRes.，7:910-915)。已有研究指出與HIV感染相關的肌肉萎縮伴隨著GDF-8表達的增加(Gonzalez-Cadavid等.(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，95:14938-14943)。GDF-8也與肌肉特異性酶(如，肌酸激酶)的產生和成肌細胞的增殖相關(W000/43781)。除了其生長調節和形態發生特性外，GDF-8被認為也與許多其他生理過程相關，包括n型糖尿病發展中葡萄糖內穩態，葡萄糖耐量降低，代謝症候群(如X症候群)，諸如燒傷或氮失調的創傷誘導的胰島素抗性和脂肪組織病(如，肥胖症)(Kim等.(2001)BBRC，281:902-906)。許多人和動物病症與肌肉組織機能上受損相關，如，肌肉營養不良(包括Duchenne氏肌肉營養不良)，肌萎縮性側索硬化(ALS)，肌肉萎縮，器官萎縮，虛弱，充血性阻塞性肺，少肌症(sarcopenia)，惡病質和由其他疾病和病症引發的肌肉萎縮症候群。迄今，極少可靠的或有效的療法已被發展用於治療這些病症。也有許多病症與骨質損失相關，包括骨質疏鬆症症和骨關節炎，特別是在老年人和/或絕經後的婦女中。此外，代謝性骨病和骨障礙包括由於長期糖皮質激素治療導致的低骨量，生殖腺早衰，雄激素遏抑，維生素D缺乏，繼發性甲狀旁腺功能亢進症，營養缺乏和神經性厭食。當前用於這些病症可行的療法是通過抑制骨再吸收作用而進行的。對於這些療法而言，促進新骨生成的療法將是所需的可選療法。因此，特別地在人中，存在發展促使肌肉質量和/或強度和/或骨密度全面增加的新療法的需要。
發明內容本發明的目的之一是提供用於肌肉和/或骨相關病症的安全及有效的治療方法。本發明的另一目的是提供在脊推動物中增加肌肉質量和/或骨強度和/或密度的方法。本發明的另一目的是提供在體內安全及有效的GDF-8抑制劑。本發明的另一目的是提供具有高特異性和親和力的結合GDF-8的人抗體及其片段。因此，提供了用於治療肌肉和骨退行性障礙的方法。該方法也用於正常動物中以增加肌肉質量和骨密度。也提供了新的人抗GDF-8抗體，稱為Myo29,Myo28和Myo22,以及由其衍生的抗體和抗原結合片段。本發明的抗體具有許多用途。首先，所述抗體能夠以高親和力結合成熟GDF-8。其次，所披露的抗體在體外和體內都抑制GDF-8活性，已通過例如ActRIIB結合的抑制和報導基因測定而證實。最後，所披露的抗體可抑制與骨骼肌質量及骨密度負調節相關的GDF-8活性。本發明的某些實施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的Fv片段的Vh和/或l區。另外的實施方案包含一或更多這些L和Vl區的任一互補決定區(CDR)。其他的實施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的VH區的H3片段。本發明其他方面提供了含有本發明抗體或它們抗原結合片段的組合物，以及它們在抑制或中和GDF-8的方法中的用途，包括治療人或動物的方法。本發明的抗體也用於治療或預防所需增加肌肉組織或骨密度的病症，例如，本發明所披露的抗體可用於治療修補損傷的肌肉，如心肌、隔膜等。疾病和病症的實例包括諸如肌肉營養不良(包括Duchenne氏肌肉營養不良)的肌肉和神經肌肉障礙；肌萎縮性側索硬化；肌肉萎縮；器官萎縮；虛弱；腕管症候群；充血性阻塞性肺病；少肌症；惡病質和其他肌肉萎縮症候群；脂肪組織病(如，肥胖症)；n型糖尿病；葡萄糖耐量降低；代謝症候群(如X症候群)；諸如燒傷或氮失調的創傷誘導的胰島素抗性；和骨退行性疾病(如，骨關節炎和骨質疏*>症)。此外，本發明所披露的抗體可用作在生物樣品中定量或定性檢測GDF-8或其片段的診斷工具.所檢測到的GDF-8的存在或數量與上述所列的一或多種醫學疾病相關。本發明的另一發麵提供了一種分離的核酸，其包含編碼來自Myo29,Myo28或Myo22的Fv片段的VH或^區的序列。也披露了一種分離的核酸，其包含編碼來自本發明所披露的任一Vh和^區的至少一個CDR的序列.另一方面提供了包含上述核酸的宿主細胞。還在本發明的另一方面提供了產生衍生自Myo29，Myo28或Myo22的Vb或Vl區的新的Vb和Vl區和/或包含上述區域的全部或部分的功能性抗體的方法.本發明另外的目的將在下列描述中部分提出，以及部分在該描述中顯而易見，或通過本發明的實踐可被得知。依靠在附屬權利要求中特別指出的要素和組合可認識到並獲得本發明的各種目的、方面和優點。可以理解前述一般描述和隨後詳細描述僅是示範性和解釋性的，並不限制本發明權利要求的保護範圍。圖1顯示了生物素化的GDF-8和BMP-ll結合ActRIIB受體，它們分別具有15ng/ml和40ng/ml的ED5。。圖2顯示了通過本發明scFv片段抑制GDF-8和ActRIIB受體結合。如圖，Myo29，Myo28和Myo22的scFv的IC5o分別為2.4nM，1.7nM和60nM。圖3A和3B顯示了在ActRIIB結合測定中Myo29與10ng/ml生物素標記的GDF-8或BMP-ll預溫育抑制了GDF-8或BMP-ll與ActRIIB的結合，其具有O.2-0.4nM的ICs。。圖4B和4C描述了pGL3(CAGA)i2報告基因測定的結果，其中測試了Myo29。圖4A顯示了基線條件，即，GDF-8、BMP-ll和活化素誘導的報告基因活性。圖4B和4C顯示了Myo29以劑量-響應方式減少GDF-8活性，其具有15-30ng/ml的IC5。，並以同樣的程度抑制BMP-11的生物活性。圖4D闡明了在該測定中Myo29並不影響活化素的活性。圖5顯示Myo22，Myo28和Myo29表位作圖的結果。Myo29的表位定位在成熟GDF-8的胺基酸72到胺基酸88;對於Myo22，定位在胺基酸1到胺基酸44;對於Myo28，定位在胺基酸1到胺基酸98。圖6顯示了Myo29表位取代分析的結果。對於Myo29結合GDF-8而言，成熟GDF-8中殘基Lys-78，Pro-81和Asn-83似乎起重要作用。圖7描述了用Myo29和Myo28進行免疫沉澱試驗的結果。來自表達GDF-8的CH0細胞的條件培養液用Myo29或Myo28進行免疫沉澱，該CH0細胞用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸進行放射性標記。接著通過還原條件下的SDS-PAGE分析免疫沉澱。凝膠上的條帶被鑑定為成熟GDF-8，GDF-8前肽和未被加工的GDF-8。圖8描述了C57B6/SCID小鼠接受作為單次靜脈內(IV)或腹膜內(IP)給藥的1mg/kg劑量的Myo29的藥物代謝動力學研究結果。Myo29顯示了大約一周的延長的終末半衰期和約lml/hr/kg的低清除率。在腹膜內UP)注射後吸收率約為77%。圖9顯示了用不同劑量Myo29(60，10和lmg/kg)或載體(PBS)每周一次處理的雄性C57B6/SCID小鼠中四頭肌質量的比較結果。用Myo"在10和60mg/kg劑量水平下處理四周導致肌肉質量在統計學上分別顯著增加19%和23%。圖10A和10B顯示了用不同劑量Myo29(10，5，2.5和1mg/kg)或PBS每周一次持續四周處理的雌性CB17SCID小鼠中腓腸肌和四頭肌質量。與對照載體相比，用Myo29處理的小鼠中肌肉質量增加了10-20%。圖11A和11B分別顯示了用不同劑量Myo29(10,5，2.5和1mg/kg)或PBS每周一次持續十二周處理的雌性CB17SCID小鼠中腓腸肌和四頭肌肌肉質量，用Myo29處理的小鼠顯示肌肉質量增加了12-28°/i。圖12顯示了用Myo29(10和5mg/kg)或PBS每周一次持續十二周處理的雌性CB17SCID小鼠中，通過握力計測定的前肢肌肉強度。用Myo29在5mg/kg和10mg/kg下處理的小鼠中前肢強度分別增加了17%和23%。發明詳述I.定義在本文中使用的術語"抗體"指免疫球蛋白或其部分，並包含任何含有抗原結合位點的多肽，與其來源、由來物種、生產方法以及特性無關。作為一個非限制性實例，術語"抗體"包括人、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊和雞抗體。所述術語包括但不限於多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變和CDR移植抗體。對於本發明目的而言，除非另有說明，其也包括諸如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb的抗體片段，和其他保留抗原結合功能的抗體片段。例如，可通過傳統的雜交瘤才支術(Kohler和Milstein(1975)Nature,256:495-499)，重組DNA技術(美國專利第4，816，567號)或使用抗體文庫的噬菌體展示技術(Clackson等.(1991)Nature,352:624-628;Marks等.(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597)製備抗體。關於不同的其他抗體生產技術，參見Antibodies:ALaboratoryManual,eds.Harlow等.，ColdSpringHarborLaboratory,1988。術語"抗原結合區"指抗體分子的一部分，其包含與抗原的部分或全部特異性結合或互補的區域。其中抗原較大，抗體僅結合該抗原的特定部分。"表位"或"抗原決定簇"是抗原分子的一部分，其負責與抗體的抗原結合區特異性相互作用。一或多個抗體可變區可提供一個抗原結合區(如，所謂的由Vb區紐成的Fd抗體片段)。一個抗原結合區包含一個抗體輕鏈可變區(Vl)和一個抗體重鏈可變區(VH)。術語"庫(repertoire)"指遺傳學上不同的核苷酸集合，如全部或部分衍生自編碼表達免疫球蛋白的序列的DNA序列。所述序列通過體內重排產生，如對於H鏈而言，重排V，D和J片段和如對於L鏈而言，重排V和J片段。可選地，所述序列可通過體外刺激和響應重排發生而產生自細胞系。可選地，所述序列的部分或全部可獲得自通過組合如未重排的V片段與D和J片段，通過核苷酸合成、隨機誘變和其他披露於美國專利第5，565，332號的方法。術語"特異性相互作用"或"特異性結合"或類似術語指兩個分子形成的在生理條件下相對穩定的複合體。所述術語也適用於，如特異於特定表位的抗原結合區，該表位為許多抗原所攜帶，在這種情況下，帶有抗原結合區的抗體可結合帶有該表位的各種抗原。因此，例小如，只要抗體能結合BMP-ll和GDF-8兩者所帶有的表位，其就可特異性結合BMP-ll和GDF-8。特異性結合的特點在於高親和力和低至中容量。非特異性結合通常具有低親和力和中至高容量。通常，當親和常數K,高於1061^或優選高於108JT時，認為結合是特異性的。必要時，通過改變結合條件減少非特異性結合而基本上不影響特異性結合。上述條件為本領域所公知，且本領域技術人員使用常規技術就可選擇合適的條件。所述條件通常用抗體濃度、溶液離子強度、溫度、供結合時間、非相關分子(如，血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等來限定。條件的實例列於實施例4、7和10中。短語"基本上如……所述"指相應的CDR、Vb或l區與本文所述序列的指定區域是同一的或是高度相似的。例如，上述取代包括從CDR(Hl，H2，H3，Ll，L2或L3)序列的任意5個胺基酸中取代1或2個。術語"TGF-p超家族"指結構相關的生長因子家族。有關的生長因子家族為本領域所公知(Kingsley等，(1994)GenesDev.，8:133-146;Hoodless等.(1998)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.，228:235-72)。TGF-p超家族包括骨形成蛋白(BMP)、活化素、抑制素、苗勒氏抑制物質、膠質細胞衍生的神經營養因子和數量上仍在增加的諸如GDF-8(肌肉生長抑制素)的生長分化因子(GDF)。許多上述蛋白在結構上和/或功能上與GDF-8相關。例如，也稱為GDF-11的人BMP-ll在胺基酸水平上與GDF-8具有90%的一性(Gamer等.(1999)Dev.Biol.208，222-232;Nakshima等.(1999)Mech.Dev.,80:185-189)。術語"GDF-8"指特定的生長分化因子-8以及，合適時，在結構上或功能上與GDF-8相關的因子，例如，BMP-ll和其他屬於TGF-p超家族的因子。該術語指GDF-8全長未加工的前體形式，也指翻譯後裂解產生的成熟和前肽形式。該術語也指GDF-8的任一片段和變體，所成熟GDF-8相關的生物活'i「人成熟GDF-8胺基酸序列提供於SEQIDNO:49。本發明涉及的GDF-8來自所有的脊推動,物，包括但不限於，人、牛、雞、小鼠、大鼠、豬、綿羊、火雞、狒狒和魚(關於序列信息，參見如，McPherron等.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，94:12457-12461)。術語"成熟GDF-8"指來自於被裂解的GDF-8前體蛋白的羧基末端區的蛋白。成熟GDF-8可以單體、同型二聚體或以GDF-8潛在性複合體的形式存在。基於此情形，成熟GDF-8可在這些不同形式的任一或全部之間建立平衡。在其生物活性形式中，成熟GDF-8也稱為"活性GDF-8"。術語"GDF-8前肽"指來自於淨皮裂解的GDF-8前體蛋白的氨基末端區的多肽。GDF-8前肽能與成熟GDF-8上的前肽結合區結合.術語"GDF-8潛在性複合體"指在成熟GDF-8同型二聚體和GDF-8前肽之間形成的蛋白複合體。據信兩個GDF-8前肽與同型二聚體中兩分子成熟GDF-8結合形成失活的四聚複合體。該潛在性複合體可包括取代GDF-8前肽的其他GDF抑制劑，或除一種或多種該GDF-8前肽之外的其他GDF抑制劑。術語"GDF-8活性"指與活性GDF-8蛋白相關的一種或多種生理學上生長調節或形態發生活性。例如，活性GDF-8是一種骨骼肌質量的負調節劑。活性GDF-8也能調節肌肉特異性酶(如，肌酸激酶)的產生，刺激成肌細胞增殖以及調節前脂肪細胞分化為脂肪細胞.在體內及體外測定GDF-8活性方法的實例列於實施例2、3、6和13中，術語"GDF-8抑制劑"包括任何能抑制GDF-8活性、表達、加工或分泌的試劑。上述抑制劑包括蛋白質、抗體、肽、肽模擬物、核酶、反義寡核苷酸、雙鏈RNA和其他能特異性抑制GDF-8的小分子。上述抑制劑被認為"抑制"、"中和"或"減少"GDF-8的生物活性。術語"中和"、"抑制"和它們的同源詞指相對於在缺乏該相同抑制劑條件下的GDF-8活性，通過GDF-8抑制劑減少了GDF-8的活性。所述活性減少優選至少約m，20%,30%,40%,50%，60%，70%，80%，90%或更高。術語"處理"在本文中可與術語"治療方法"可交換地使用，並指治療性處理及預防/預防性措施。那些需要處理的可包括已經患特定的醫學疾病的個體和最終患該病症的那些(即，那些需要預防性措施的)。術語"分離的"指基本上不含有其天然周圍介質的分子.例如，分離的蛋白基本上不含有細胞物質或來自衍生其的細胞或組織源的其他蛋白。該術語用於製劑時，其中分離的蛋白是足夠地純以作為治療組合物給藥，或至少70'/4-809i(w/w)純，更優選地，至少80%-90%(w/w)純，甚至更優選地，90-95%純；以及，最優選地，至少95%,96%,97%，98%,99%或100%(w/w)純。術語"哺乳動物"指照此分類的任何動物，包括人、馴養和從事畜牧的動物、動物園動物、從事體育活動的動物或寵物，如狗、馬、貓、綿羊、豬、牛等。術語"有效劑量"或"有效量"指引起患者症狀改善或所需生物學結果(如，增加骨骼肌質量和/或骨密度)的化合物的數量。上述數量應足夠以減少與骨骼肌質量和骨密度負調節相關的GDF-8活性。以下章節中描述了測定有效量的方法。II.抗GDF-8抗體和抗原結合片段A.人抗體Myo29,Myo28和Myo22本發明所公開的內容提供了新的抗GDF-8抗體及其抗原結合片段。上述抗體的非限制性例證的實施方案命名為Myo29，Myo28和Myo22。這些例證的實施方案以人IgGi抗體的形式提供。本發明的抗體具有獨特及有益的特性。首先，這些結合成熟GDF-8的抗體具有高親和力。其次，本發明的抗體可在體外和體內抑制GDF-8活性，例如通過ActRIIB結合抑制和受體基因測定來證實。本發明的抗體也能特異性結合和/或抑制BMP-ll的活性，例如，通過ActRIIB結合抑制和受體基因測定來證實.最後，本發明所披露的抗體可抑制與骨骼肌質量和骨密度負調節相關的GDF-8活性。在一個例證的實施方案中，本發明所披露的抗體能特異性結合GDF-8和BMP-11。據推測該抗體也可與其他蛋白反應，例如，那些屬於TGF-p超家族的，諸如苗勒氏抑制物質、膠質細胞衍生的神經營養因子或除了GDF-8之外的生長和分化因子。在某一實施方案中，Myo29與包含與SEQIDNO:49的胺基酸72至88同一的序列的蛋白反應.在另一個實施方案中，Myo29結合包含序列Lys-Xaal-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn(SEQIDNO:54)的蛋白，其中Xaal，Xaa2和Xaa3分別是任意胺基酸。在另一個實施方案中，至少符合下列條件之一(l)Xaal-Met，(2)Xaa-Ser和(3)Xaa3=Ile;所有的條件彼此互相獨立。在其他實施方案中，Myo22識別成熟GDF-8序列中起始的44個N末端胺基酸(SEQIDNO:49的胺基酸1-44)中的表位。本領域普通技術人員可認識到本發明的抗體可用於檢測、測定和抑制與那些上述規定所不同的蛋白。一般而言，本發明的抗體可用於包含與列於SEQIDNO:49的GDF-8成熟形式序列中至少100,80，60，40或20個連續胺基酸的任一序列具有至少約70%,80%,90%,95%或更多同一性的序列的任何蛋白。上述蛋白非限制性實例包括GDF-8序列，其衍生自在本發明說明書中所述的不同物種。通過標準的比對算法測定同一性百分數，例如，Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.，215:403-410描述的局部相似性基本查詢工具(BLAST)，Needleman等.(1970)J.Mol.Biol.，48:444-453描述的算法，或Meyers等.(1988)Comput.Appl.Biosci.,4:11—17描述的算法。B.可變區也稱為免疫球蛋白的完整抗體通常是由每條大約25kDa的兩條輕(L)鏈和每條大約50kDa的兩條重(H)鏈組成的糖基化蛋白四聚體。在抗體中存在兩種類型的輕鏈，稱為k和K。基於重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可分為五種主要類型A，D，E，G和M,以及其中一些可進一步分為亞型(同種型)，如Igd，IgG2，IgG3，IgG4，IgA,和IgA2。不同類型免疫球蛋白的亞基結構和三維構象為本領域眾所周知。關於抗體結構的綜述，參見Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,eds.Harlow等.，1988。簡單而言，每條輕鏈都由N-末端可變(V)區(VJ和恆定(C)區(CJ組成。每條重鏈都由N-末端V區，三或四個C區以及鉸鏈區組成。最接近Vh的"區被指定為CB1。Vb和、區包括四個稱為骨架區的相對保守的序列區域(FR1，FR2，FR3和FR4)，其形成三個超變序列區(互補決定區，CDRs)的支架。CDR包含最多的負責與抗原特異性相互作用的殘基。CDR是指CDR1，CDR2和CDR3。因此，重鏈上的CDR組件稱為Hl，H2和H3，這時輕鏈上的CDR組件稱為Ll，L2和L3。在抗體結合位點中CDR3是分子多樣性最大的來源.例如，H3可短至兩個胺基酸殘基或長於26個殘基。最小的抗原結合片段是Fv,其由Vb和^區組成。Fab片段(抗原結合片段)由VB-CJ和Vi"「區通過在恆定區之間的二硫鍵共價連接組成。當在宿主細胞中共表達時，為克服Fv中VB和l區非共價連接導致的解離趁向，可構建通常稱作為單鏈(sc)Fv片段(scFv),其中在Vh的C-末端與^的N-末端之間或在W的C-末端與Vb的N-末端之間存在柔性的和足夠長的多肽接頭。最常用的接頭是具有15個殘基(Gly4Ser)3的肽，但其他接頭也為本領域所公知。通過編碼不同區域的多胚系基因的使用以及多種體細胞事件形成了抗體多樣性。體細胞事件包括可變基因片段與多樣性(D)和連接(J)基因片段重排產生完整的VH區以及可變和連接基因片段重排產生的完整Vl區。其自身的重排過程是不精確的，導致在V(D)J連接處缺失或添加胺基酸。在發育的B細胞中這些多樣性機制出現在抗原暴露前。在抗原刺激後，在B細胞中表達抗體的基因經歷了體細胞突變。基於估計的胚系基因片段的數目，這些片段的隨機重排，以及隨機V廣Vl配對，可產生1.6xl07個不同的抗體(FundamentalImmunology,第3版，ed.Paul,RavenPress,NewYork,NY，1993)。當考慮到其他有助於抗體多樣性的加工(如體細胞突變)時，預計能有超過lxl(T個不同抗體產生(ImmunoglobulinGenes,第2版.，eds.Jonio等.，AcademicPress,SanDiego,CA，1995)。因為i午多加工與抗體多樣性產生相關，所以獨立得到的具有相同抗原特異性的單克隆抗體不太可能具有同樣的胺基酸序列。因此，本發明進一步提供了新的衍生自人免疫球蛋白基因文庫的CDRs。帶有本發明CDR的結構通常是抗體重鏈或輕鏈序列或它們的實質部分，其中CDR位於相應於天然存在的Vb和Vl的CDR的位置。可通過SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDepartmentofHealthandHumanServices,eds.Kabat等.，1991中所描述的方法來測定免疫球蛋白可變區的結構和位置。本發明所披露的抗體、它們的scFV片段、Vb和Vl區和CDR的DNA和胺基酸(AA)序列列於序列表中並在表l中列舉。為了方便起見，Vb和Vt區中每個CDR的位置列於表2中。鑑定了在Myo29，Myo28和Myo22中除了Vh和VL區之外的重鏈和輕鏈序列。tableseeoriginaldocumentpage16本發明披露了可進一步包含抗體恆定區或其部分的抗體。例如，l區的c-末端可附著在抗體輕鏈恆定區末端上，該輕鏈恆定區包括人CK或a鏈，優選a鏈。同樣地，基於i區的特異性抗原結合片段的c-末端可附著在免疫球蛋白重鏈的全部或部分的末端上，該免疫球蛋白重鏈衍生自任一同種型抗體，如IgG，IgA，IgE和IgM，以及該同種型的任一亞型，特別是Igd和IgG4。在例證的實施方案中，抗體包含人IgGa的重鏈和輕鏈C-末端片段。輕鏈入的C-末端片段的DM和胺基酸序列分別列於SEQIDNO:50和SEQIDNO:51中。IgG!重鏈C-末端片段的DNA和胺基酸序列分別列於SEQIDNO:52和SEQIDNO:53中。本發明的某些實施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的Fv片段的Vb和/或VL區。另外的實施方案包含一個或多個這些VH和VL區任一的互補決定區(CDR)。一個實施方案包含Myo29，Myo28或Myo22的VB區的一個H3片段。在某些實施方案中，本發明的l和l區是胚系的，即使用常規的分子生物學技術改造這些區的骨架區(FR)以與人胚系基因產物的連續胺基酸序列相匹配。在另一個實施方案中，骨架序列仍保留與胚系的差異。C.修飾的抗體及其片段本發明另一方面提供了一種用於獲得特異於GDF-8的抗體結合區的方法。本領域技術人員應理解本發明的抗體不限於表1中所陳列的l和V,的特定序列，但也包括這些仍保留抗原結合活性序列的變體。這種變體可衍生自使用本領域公知4支術提供的序列。在FR或CDR中可進行胺基酸取代、缺失或添加。雖然在骨架區中的改變通常意在改善抗體穩定性和減少免疫原性，但是在CDR中的改變通常意在增加抗體對其目標的親和力。上述親和力增加的改變通常是通過以經驗為主的改變CDR區和測試抗體來確定。上述改變可根據描述於AntibodyEngineering,第2版，ed.Borrebaeck，OxfordUniversityPress,1995中的方法來進行。製備是本文所述的L區的胺基酸序列變體的Vb區的方法包含在本發明所披露的L區胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個或多個胺基酸，任選地將這樣提供的VH區與一種或多種Vt區組合，並測試l區或Vb/Vl組合或組合物與GDF-8的特異性結合，任選地，測試上述抗原結合區中和GDF-8活性的能力。VL區可具有基本上如本文所述的胺基酸序列。一種類似的方法可應用於本文所披露的l區的一種或多種序列變體與一種或多種Vb區的結合。本發明另一方面提供了一種製備與GDF-8特異性反應的抗原結合片段的方法。該方法包括(a)提供編碼Vh區核酸的起始庠，該Vb區包括要被取代的CDR3或缺失CDR3編碼區；(b)將該庫與編碼基本上如本文中所述的VHCDR3(即，H3)胺基酸序列的供體核酸結合，使得該供體核酸插入該庫的CDR3區中，以致提供了一種編碼VB區核酸的產物庫；(c)表達該產物庫的核酸；(d)篩選特異於GDF-8的特異性抗原結合片段；和(e)收集該特異性抗原結合片段或編碼其的核酸。此外，一種類似的方法可用於將本發明的VlCDR3(即，L3)與編碼Vl區核酸的庫結合，該Vl區包括要被取代的CDR3或缺失CDR3編碼區。使用重組DNA技術，可將編碼本發明CDR(如，CDR3)的序列導入缺失CDR(如，CDR3)的可變區庫中。例如，Marks等.(Bio/Technology(199"10:779-783)描述了產生抗體可變區庫的方法，其中定向於或鄰近可變區5'末端的通用引物被用於通用引物與人Vb基因的第三骨架區的連接，以提供缺失CDR3的V^可變區庫。該庫可與特定抗體的CDR3結合。使用類似技術，本發明CDR3衍生序列可與缺失CDR3的Vb或l區的庫混合，並且該混合的完整Vb或Vl區可與同源Vl或Vb區結合以提供本發明的特異性抗原結合片段。接著，該庫在諸如W092/01047的噬菌體展示系統的適合的宿主系統中展示，使得可篩選合適的抗原結合片段。類似的混合或組合淨支術也披露於Stemmer(Nature(1994)370:389-391)中，其描述了與p-內醯胺酶基因相關的技術，但據觀察，該方法可用於抗體的製備。另一種可選方法是使用隨機誘變一或多種選定的Vb和/或Vl基因以產生在整個可變區範圍中的突變，來產生帶有本發明CDR衍生序列的新的Vh或Vl區。該4支術描述於Gram等.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89:3576-3580)中，其使用了易錯聚合酶鏈式反應。另一種可使用的方法是直接誘變V^或Vl基因的CDR區。該技術披露於Barbas等.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)91:3809-3813)和Schier等.(J.Mol.Biol.(1996)263:551-567)中。同樣地，一或多個，或所有三個CDR可移植入Vh或l區的庫中，接著篩選特異於GDF-8的特異性結合配體或結合片段。免疫球蛋白可變區的主要部分至少包含CDR區以及任選地，它們之間的骨架區，該骨架區來自如在本文中所述的scFv片段。該部分也包括至少約50%的FR1和FR4任一或全部，該50X是FR1C-末端的50%和FR4N-末端的50%。在該可變區N-末端或C-末端添加的殘基可以是通常與天然存在的可變區不相關的那些，例如，通過重組DNA技術產生的本發明的特異性抗原結合片段的結構可導致編碼接頭的N-或C-末端殘基導入，該接頭的導入有利於克隆或其他操作步驟。其他操作步驟包括在本發明可變區與其他蛋白序列包括免疫球蛋白重鏈、其他可變區(如，在雙體產生中)或如下更詳細討論的蛋白標記的連接處導入接頭。儘管在實施例中說明的實施方案包含VH和Vl區的"匹配"對，本發明也包含含有單一可變區的結合片段，該單一可變區衍生自任一VH或Vl區序列，特別是Vh區。就任一單鏈特異性結合區而言，這些區可用於篩選能結合GDF-8的可形成雙區特異性抗原結合區的互補區.可通過使用在W092/01047中披露的稱為分級雙重組合法的噬菌體展示篩選方法進行篩選，在該方法中含有任一H或L鏈克隆的單獨克隆被用於感染編碼其他鏈(L或H)的克隆的完整文庫，以及篩選所產生的雙鏈特異性抗原結合區，與諸如那些在參考文獻中描述的噬菌體展示技術是一致的。該技術也披露於Marks等.，同上。可通過化學方法將抗體與放射性核素、藥物、大分子或其他試劑連接或將其用於產生包含一或多個本發明的CDR的融合蛋白。在含有V廣VL對的抗體融合蛋白中這些鏈(通常為VB)之一和其他蛋白被合成為單一的多肽鏈。在不同於抗體的這些產物類型中，通常具有額外的功能元件；小分子的活性部分，或綴合的或融合的大分子的主要分子結構特徵。除了上述胺基酸序列改變之外，抗體也可被糖基化、聚乙二醇化或連接上白蛋白或非蛋白質聚合物.例如，本發明所披露的抗體可連接多種非蛋白質聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，這些方法列於美國專利第4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4，791，192或4，179，337號中。例如，通過共價連接聚合物化學修飾抗體可增加它們的循環半衰期。聚合物的實例和方法以及它們所^修飾的肽也示於美國專利笫4,766,106;4,179,337;4，495，285和4，609，546號中在其他實施方案中，可修飾抗體以具有改變的糖基化類型(即，改變原始的或天然的糖基化類型)。在本文中使用的"改變"意指一或多個碳水化合物部分缺失、和/或添加一或多個糖基化位點到原始抗體上。通過改變胺基酸序列以包含糖基化位點共有序列來實現在本發明所披露的抗體上添加糖基化位點是本領域眾所周知的。其他增加抗體上碳水化合物部分數量的方法是通過化學或酶偶聯糖苷到抗體的胺基酸殘基上。這些方法描述於WO87/05330中，以及於Aplin和Wriston(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.，22:259-306中。可通過在Hakimuddin等.(1987)Arch.Biochem.Biophys.，259:52;和Edge等.(1981)Anal.Biochem.，118:131和Thotakura等.(1987)Meth.ENZYMOL.，138:350中所描述的化學或酶方法來實現除去抗體上出現的任一碳水化合物部分。本發明的抗體也可標記有可檢測的或功能性標記。可檢測的標記包括諸如131I或"Tc的放射性標記，使用本領域公知的常規化學反應可將其連接在本發明的抗體上。也包括諸如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶的酶標記。還包括諸如生物素的化學部分，其通過與諸如標記的抗生物素蛋白的特定相關的可檢測部分結合而被檢測。其中CDR序列與列於SEQIDNO:n中，其中n為2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，31，32，33，34，35，36，37，38,39，40，41，42，43，44，45,46，47或48的那些僅具有非實質性差異的抗體也包括在本發明的範圍中。非實質性差異包括較少的胺基酸改變，這樣的取代即在CDR序列的任意5個胺基酸中取代1或2個胺基酸。通常，胺基酸為具有相似電荷、疏水性或立體化學特性的相關胺基酸所取代。這樣的取代應為本領域的公知常識。不像在CDR中，在結構骨架區(FR)中可進行更實質性的改變而不會對抗體結合特性產生不利影響。FR的改變，包括但不限於，人源化非人源骨架區或工程化某些對抗原接觸或對穩定結合位點起重要作用的骨架區殘基，如改變恆定區的類型或亞型，該改變可改變諸如Fc受體結合的效應子作用的特定胺基酸殘基(Lund等.(1991)J.Immun.147:2657-2662和Morgan等.(1995)Immunology86:319-324)，或改變恆定區所衍生自的物種。抗體在重鏈的CH2區中可具有突變以減少或改變效應子作用，如，Fc受體結合和補體激活。例如，抗體可具有諸如在美國專利第5,624,821和5，648，260號中所描述的那些突變。例如，在Igd或IgG2重鏈中，上述突變可在SEQIDNO:53的胺基酸殘基117和120上產生，這些殘基代表了IgGiFc的一部分(這些殘基相應於IgG,或IgG2全長序列中胺基酸234和237)。抗體也可具有突變以穩定免疫球蛋白兩條重鏈之間的二硫鍵，如披露於Angal等.(1993)Mol.Immunol.30:105-108中的在IgG4絞鏈區中的突變。D.核酸、克隆和表達系統本發明還提供了一種分離的編碼本發明抗體或結合片段的核酸。根據本
發明內容的核酸可包含DNA或RNA，並且可以是全合成或部分合成的。除非上下文另有要求，本文中所提及的核苷酸序列包含具有特定序列的DM分子，以及包含其中U取代了T的具有特定序列的RNA分子。本發明的核酸包含如本文中所列出的本發明的CDR或Vb或l區的編碼序列。本發明也提供了以質粒、載體、轉錄或表達盒形式的構建體，其包含至少一種上述本發明的核酸。本發明也提供了一種宿主細胞，其包含一或多種上述構建體。在本文中提供的編碼任一CDR(H1，H2，H3，Ll，L2或L3)、Vb或Vl區、或特異性抗原結合片段的核酸作為本發明的一方面，也提供了一種生產編碼產物的方法。該方法包括編碼核酸的表達。可通過在合適的條件下培養含有核酸的重組宿主細胞實現表達。接著，使用任意合適的技術分離和/或純化通過表達產生的Vh或l區、或特異性抗原結合片段，然後在適當時使用。可提供分離的和/或純化的根據本
發明內容的特異性抗原結合片段、Vb和/或^區、以及編碼核酸分子和栽體，如從它們的天然汙染物中分離和/或純化，以基本上純或均一的形式提供，或就核酸而言，除編碼具有所需功能多肽的序列外，不含有或基本上不含有其他來源的核酸或基因。在多種不同宿主細胞中克隆和表達多肽的系統是眾所周知的，合適的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞和酵母及杆狀病毒系統。在本領域中可獲得用於表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、NS0小鼠黑色素瘤細胞和許多其他細胞。常用的細菌宿主是大腸桿菌。關於適合產生抗體的細胞，參見GeneExpressionSystems,eds.Fernandez等.，AcademicPress,1999。任何與本發明相容的細胞可用於產生本發明所披露的抗體。可選擇或構建設合適的載體，該載體含有合適的調節序列，包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和其他合適的序列。載體可以是質粒或病毒，如合適的噬菌體或噬菌粒。為了解詳情，參見例如，MolecularCloning:aLaboratoryManual:第2版.，Sambrook等.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989。例如，在製備核酸構建體、_漆變、測序、DNA導入細胞和基因表達、以及分析蛋白中，用於處理核酸的許多公知的技術和方案詳細描述於CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2版.，Ausubel等.eds.，JohnWiley&Sons,1992。因此，本發明另一方面提供了一種包含本文所披露的核酸的宿主細胞。還在另一方面提供了一種包括將上述核酸導入宿主細胞的方法。所述導入可使用任何可獲得的技術。對於真核細胞而言，合適的技術包括磷酸鈣轉染、二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)、電穿孔、脂質體介導的轉染和使用逆轉錄病毒或其他病毒的轉導，如牛痘，或對於昆蟲細胞而言，杆狀病毒。對於細菌細胞而言，合適的技術可包括氯化鈣轉化、電穿孔和使用噬菌體的轉染。在導入後可接著促使或允許核酸的表達，如，通過在適合於表達該基因的條件下培養宿主細胞。E.生物保藏編碼非胚系scFv的Myo29，Myo28或Myo22的喧菌粒載體pCANTAB6單獨轉化的大腸桿菌培養物於2002年10月2日保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC)，保藏號分別為PTA-4741,PTA-4740和PTA-4739,保藏單位的地址是108O1UniversityBlvd，Manassas,VA20110，U.S.A。II.治療疾病的方法和其它用途本發明的抗體可用於預防、診斷或治療人或動物中不同的醫學疾病。該抗體可用於抑制或減少一或多種與GDF-8或相關蛋白有關的活性。最優選地，相對於GDF-8不與抗體結合的情況，該抗體抑制或減少一或多種GDF-8的活性。在某些實施方案中，相對於不結合一或多種本發明所披露抗體的成熟GDF-8蛋白活性，當結合一或多種本發明所披露抗體時，GDF-8活性被抑制至少50%，優選至少60，62，64，66，68，70，72，72，76，78，80，82，84，86或88%,更優選至少90，91,92，93或94%,以及甚至更優選至少95%到100%。在pGL3(CAGA)12報告基因測試(RGA)或ActRIIB受體測試中可測定對GDF-8活性的抑制，才艮告基因測試描述於Thies等.(GrowthFactors(2001)18:251-259)中以及闡述於實施例2和9中，受體測試闡述於實施例3和6中。由本發明抗體診斷、治療或預防的醫學疾病是肌肉或神經肌肉障礙；諸如肥胖症的脂肪組織障礙；n型糖尿病；葡萄糖耐量降低；代謝症候群(如X症候群);諸如燒傷或氮失調的創傷誘導的胰島素抗性；或諸如骨質疏鬆症的骨退行性疾病。其他由本發明所披露的抗體診斷、治療或預防的醫學疾病是與骨質丟失相關的疾病，包括骨質疏鬆症，特別是在老年人和/或絕經後的婦女中，糖皮質激素誘導的骨質疏^^症，骨質減少、骨關節炎，和骨質疏鬆症相關的骨折。其他作為目標的代謝性骨病和骨障礙包括由於長期糖皮質激素治療導致的低骨量，生殖腺早衰，雄激素遏抑，維生素D缺乏，繼發性曱狀旁腺功能亢進症，營養缺乏和神經性厭食。本發明抗體優選用於預防、診斷或治療哺乳動物中，特別是在人類中的上述醫學疾病。本發明的抗體或抗體組合物以治療有效量的形式給予。一般而言，治療有效量可隨著患者的年齡、身體狀況和性別，以及所患有的醫學疾病的嚴重程度而改變。劑量可決定於醫師，如需要，可調整以與所觀察到的療效相適應.上述化合物的毒性和療效可通過在細胞培養或試驗動物中執行標準的藥學方法來測定，如，測定1^5。(試驗對象50%致死劑量)和EDs。(試驗對象50%有效劑量)治療指數指毒性和療效之間的劑量比，可表示為LD5。/ED5。。優選具有大的治療指數的抗體。獲得自細胞培養試驗和動物研究的數據可用於計算在人體中使用的劑量範圍。上述化合物的劑量優選處於循環濃度的範圍內，包括具有很少毒性或無毒性的ED5。。在該範圍內劑量基於所採用的劑型和給藥途徑可改變。對於本發明所使用的任何抗體而言，治療有效劑量可最初從細胞培養試驗中確定。在動物模型中可計算劑量以獲得循環血漿濃度範圍，包括在細胞培養試驗中測定的IC5D(即達到症狀的半最大抑制的受試抗體濃度)。例如，通過高效液相色譜可測定血漿水平。通過合適的生物測定可檢測任何特定劑量的效果。合適的生物測定的實例包括DNA複製測定、基於轉錄的測定、GDF-8蛋白/受體結合測定、肌酸激酶測定、基於前脂肪細胞分化的測定、基於脂肪細胞中葡萄糖攝取的測定，和免疫測定。一般而言，試用組合物使得抗體或它們結合片段以ljig/kg-150mg/kg、1[ig/kg-100mg/kg、lfig/kg-50mg/kg、ljig/kg-20mg/kg、lfig/kg-10mg/kg、lpg/kg-lmg/kg、10jig/kg-lmg/kg、10(ig/kg-100jig/kg、100jig/kg-lmg/kg、以及500jig/kg—1mg/kg的劑量給予。優選地，抗體以快速濃注劑形式給予，以達到服藥後最大時間長度內抗體循環水平最大化的目的。在以快速濃注劑給藥後也可採用連續輸注。用本發明所披露的抗體治療、診斷或預防上述醫學疾病的方法中也可使用TGF-(5超家族中其他蛋白。許多這些蛋白在結構上與GDF-8相關，如BMP-11。因此，另外的實施方案提供了治療上述疾病的方法，該方法通過單獨給予患者能抑制BMP-11或活化素的抗體或與諸如抗GDF-8中和抗體的其他TGF-p抑制劑聯合給予。本發明的抗體也可用於治療與BMP-ll相關或由其介導的疾病或病症。參見，如美國專利第5，639，638和6，437，111號。本發明的抗體也用於在體內或體外檢測屬於諸如BMP-ll和GDF-8的TGF-p超家族蛋白的存在。通過把這些蛋白的存在或水平與醫學疾病相聯繫，本領域技術人員可診斷相關的醫學疾病。所述的醫學疾病可通過上述本發明所披露的抗體來診斷。上述檢測方法在本領域眾所周知，包括ELISA、放射性免疫測定、免疫印跡、蛋白質印跡、免疫螢光檢驗法、免疫沉澱法和其他類似的技術。抗體可進一步以包括一或多種這些技術的診斷試劑盒形式提供來檢測蛋白(如，GDF-8)。該試劑盒可含有其他組分、包裝、說明書或其他有助於檢測蛋白和使用該試劑盒的物質。如果抗體意在診斷目的，可能需要對其進行修飾，例如，用配體(如生物素)或可檢測的標記基團(如焚光基團、放射性同位素或酶)修飾。若有要求，該抗體(無論是多克隆的還是單克隆的)可使用常規技術標記。合適的標記包括螢光團、發色團、放射性原子、高電子密度試劑、酶和含有特異性結合配體的配體。通常可檢測酶的活性。例如，可通過用分光光度計定量檢測辣根過氧化物酶將四甲基聯苯胺(TMB)轉化為藍色素的能力。其他合適的標記可包括生物素和抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素、IgG和蛋白A，以及本領域已知的許多受體-配體對。其他修飾或可能進行的修飾為本領域普通技術人員所顯而易見，且被認為與本發明的範圍等同.還在本發明另一方面提供了一種鑑定用於治療肌肉和骨疾病的治療劑的方法。合適的篩選方法，如基於ELISA的鑑定法，為本領域所公知。在上述篩選方法中，通過將本發明的抗體與諸如GDF-8、BMP-11、活化素的配體結合形成第一結合混合物；並測定第一結合混合物(Mo)中配體和抗體之間的結合量。通過將抗體、配體和要被篩選的化合物或試劑結合形成第二結合混合物，並測定第二結合混合物(Mt)中配體和抗體之間的結合量.接著比較第一和第二結合混合物的結合量，例如，通過計算MjMo比值。如果與所觀察到的笫一結合混合物比較，在第二結合混合物中結合減少了，那麼認為該化合物或試劑能抑制GDF-8活性。結合混合物的配方和最優化為本領域所顯而易見的，上述結合混合物也可含有所需用於增強或優化結合的緩衝液和鹽類，以及在本發明的篩選方法中可包括額外的對照試驗。若發現化合物能減少抗體-配體結合至少約10%(即，M7M。〈0.9),優選地大於約30%,則該化合物可得到鑑定，接著，如果需要，在諸如ActRIIB結合測定(實施例2)和其他基於細胞以及描述於實施13、15和16中的體內測定的其他鑑定法中再次篩選具有抑制GDF-8活性的化合物。III.藥物組合物及給藥方法本發明提供了包含本發明所披露抗體的組合物。上述組合物可適於製藥用途及給患者施用。該組合物通常包含一或多種本發明的抗體和藥學上可接受的賦形劑。本文中使用的術語"藥學上可接受的賦形劑"包括與藥物施用相容的溶劑、分散劑、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等的任一或全部。使用上述介質和試劑作為藥學上活性物質為本領域眾所周知。該組合物也含有其他能提供補充、額外或增強的治療功能的活性化合物.該藥物組合物也可與指導施用的說明書一起包含於容器、包裝或分配器中。本發明的藥物組合物可配製與其所需的給藥途徑相容。實現給藥的方法為本領域普通技術人員所公知。也有可能獲得可局部或經口給藥或能通過黏膜傳遞的組合物。例如，該給藥方式可以是靜脈內、腹膜內、肌內、腔內、皮下或經皮給藥。用於皮內或皮下應用的溶液或懸浮液通常包括一或多種下列組分諸如注射用水的無菌稀釋劑、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；諸如節醇或尼泊金甲酯的抗細菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉的抗氧化劑；_渚如乙二胺四乙酸的螯合劑；諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽的緩衝液；和諸如氯化鈉或葡萄糖的用於調節張力的試劑。可用諸如鹽酸或氫氧化鈉的酸或鹼調節pH。上述製劑可包裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料製成的多劑量管形瓶中。適於注射的藥物組合物包括無菌含水溶液或分散液以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。對於靜脈內給藥而言，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorTMEL(BASF,Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝液(PBS)。在所有情況下，組合物應為無菌並且其流動性應當達到容易注射的程度。在生產和儲存的條件下它必須是穩定的，並且必須防止諸如細菌和真菌的微生物的汙染作用。所述載體可以是溶劑或分散劑，例如含有水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，可通過包被諸如卵磷脂的包衣劑、保持分散液所需的粒度以及通過使用表面活性劑保持合適的流動性.可通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，對鞋基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等實現抑制微生物的作用。在#~多場合中，優選在所述組合物中包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露糖醇、山梨醇的多元醇和氯化鈉。可通過在組合物中加入延長吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和凝膠，延長可注射組合物的吸收時間。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可裝在凝膠膠嚢中或壓成片劑。為了達到口服治療給藥的目的，所述抗體可與賦形劑混合併以片劑或膠嚢形式使用。藥學上相容的接合劑和/或佐劑材料可添加作為所述組合物的一部分。所述片劑、丸劑、膠嚢等能包含以下成分中的任意一種或包含具有相似性質的化合物諸如微晶纖維素的粘合劑，黃蓍膠或明膠；諸如澱粉或乳糖的賦形劑；諸如藻酸、PrimogerM或玉米澱粉的分散劑；諸如硬脂酸鎂或SterotesTM的潤滑劑；諸如膠狀二氧化矽的滑動劑；諸如蔗糖或糖精的甜味劑；或諸如薄荷、水楊酸甲酯或檸檬香劑的香味劑。為了通過吸入給藥，抗體以氣溶膠噴霧形式從壓力容器或分液器或噴霧器中遞送，所述壓力容器或分液器包括合適的推進劑，例如，諸如二氧化碳的氣體。也可通過黏膜或經皮方式全身給藥。例如，在抗體包含Fc部分的情況下，組合物可經FcRn受體介導途徑(美國專利第6，030，613號)通過黏膜(如，腸、口腔或肺)傳遞。例如，通過使用錠劑、鼻腔噴霧劑、吸入器或栓劑可實現經黏膜給藥。為達到經皮給藥的目的，活性化合物可配製為本領域的軟膏劑、油膏劑、凝膠或霜劑。為達到經黏膜或經皮給藥目的，在該製劑中使用適合穿透屏障的滲透劑。所述滲透劑為本領域所普遍公知，並包括，例如去汙劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物本發明所披露的抗體可與載體一起製備，所述載體能保護該化合物免於從體內快速清除，諸如控制釋放製劑，包括植入和微膠嚢化遞送系統.可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，諸如亞乙基乙烯乙酸酯、聚酐、聚甘油酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。製備上述試劑的方法對本領域技術人員來說是顯而易見的。含有於此所披露的抗體的脂質體懸浮液也可用作為藥學上可接受載體。根據本領域技術人員公知的方法，例如美國專利笫4，522,811號所述的，可製備這些脂質體懸浮液.為了便於給藥以及劑量的一致性，以劑量單位形式配製口服或腸胃外組合物是有利的.本文所用的劑量單位指適合作為要被治療患者的單位劑量的、在物理上獨立的單位；每個單位含有預定數量的活性化合物，它是計算出能與必需的藥物栽體一起產生所需療效的用量。有關本發明劑量單位形式的規定，是由活性化合物的特性和要獲得的特定療效，以及本領域中在將上述活性化合物用於治療個體所固有的局限性而決定的，並且直接取決於這些因素。下列實施例提供了本發明的例證性實施方案而不以任何方式限制本發明.本領域普通技術人員應認識到許多其他實施方案也包含於本發明的範圍中。在本申請全文中所有引用的參考文獻、專利以及公開的專利申請的全部內容在此引用作為參考。具體實施方式實施例實施例1:GDF-8的純化將來自選定的表達重組人GDF-8蛋白(成熟GDF-8和GDF-8前肽)細胞系的條件培養液酸化至pH6.5，然後先上80x50mmP0R0STMHQ陰離子交換柱，再上80x50mmP0R0STMSP陽離子交換柱(PerSeptiveBiosystems，FosterCity,CA)。流出液調至pH5.0,然後上75x20mmPOROSTMSP陽離子交換柱(PerSeptiveBiosystems)並用NaCl梯度洗脫。收集由SDS-PAGE證實的含有GDF-8潛在性複合體的級分，用三氟乙酸(TFA)酸化至pH2-3，然後加入200ml0.1%TFA以減低粘度。接著，將該收集級分上250x21.2mmC5柱(Phe謹enex，Torrance,CA)，在該柱前有60x21.2mm的保護柱(Phenomenex)，並用TFA/乙腈梯度洗脫以將成熟GDF-8與GDF-8前肽分離.含有成熟GDF-8的所收集級分通過凍幹法濃縮以除去乙腈並添加20ml0.1%TFA。然後，將該樣品上加熱至60。C的250x10mmCs柱(Phenomenex)以便於分離。重複該步驟直至不再得到更多的分離物。接著收集含有成熟GDF-8的級分，並加入40%乙腈，然後上600x21.2BioSepTMS-3000體積排阻柱(Phenomenex)，在該柱前有60x21.2的保護柱。收集含有純化的成熟GDF-8級分並濃縮用於隨後的試驗中。在SDS-PAGE中，純化的成熟GDF-8作為一條寬帶在非還原條件下移動至25kDa處並在還原條件下移動至13kDa處。鼠GDF-8相似的SDS-PAGE圖諳已報導於McPherron等.(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1997)94:12457-12461)中，並反映出成熟蛋白的二聚體特性。以類似的方法將活性成熟BMP-ll二聚體從來自表達重組人BMP-ll細胞系的條件培養液中純化。將活性成熟BMP-ll從來自表達重組人GDF-8前肽/成熟BMP-ll嵌合蛋白細胞系的條件培養液中純化。在50mMTrispH8.0，lMNaCl中的該條件培養液以lml/min的速度加栽於10mlTALONTM柱上(Clonetech，PaloAlto,CA)。結合的蛋白用50mMTrispH8.0，1MNaCl，500mM咪喳洗脫。含有GDF-8前肽/BMP-ll潛在性複合體的收集級分用10%TFA酸化至pH為3。接著，將該收集級分上250x4.6mmJupiterC4柱(Phenomenex,Torrance,CA)，將該柱子加熱至60。C以為更好地分離成熟BMP-ll和GDF-8前肽，並用TFA/乙腈梯度洗脫。含有成熟BMP-ll的收集級分通過凍幹法濃縮。在SDS-PAGE中，純化的成熟BMP-11在非還原條件下移動至25kDa處並在還原條件下移動至12kDa處。實施例2:純化的重組人GDF-8的生物活性為闡明GDF-8的活性，使用表達螢光素酶的報告載體pGL3(CAGA)u開發報告基因測定法(RGA)。先前報導CAGA序列是位於TGF-p誘導基因PA1-1啟動子中的TGF-p響應序列(Denner等.(1998)EMB0J.，17:3091-3100)。用鹼性螢光素酶報告質粒pGL3(Promega，Madison,WI)製備含有12CAGA盒的報告載體。將來自腺病毒主要晚期啟動子(-35/+10)的TATA盒和轉錄起始位點插入BgIII與HindIII位點之間。含有12個CAGA盒AGCCAGACA重複的寡核苷酸退火併克隆入Xhol位點，用FuGENETM6轉染試劑(BoehringerManheim，Germany)將pGL3(CAGA)12瞬間轉染人橫紋肌肉瘤細胞系A204(ATCCHTB-82).在轉染後，在48孔培養板上細胞在補充有2mM穀氨醯胺、100U/ml鏈黴素、100Hg/ml青黴素和10%胎牛血清的McCoy's5A培養液中培養16小時。接著，細胞於37。C在含有穀氨醯胺、鏈黴素、青黴素和lmg/ml牛血清白蛋白的McCoy's5A培養液中用或不用10ng/mlGDF-8處理6小時。使用螢光素酶測定系統(Promega)定量測定受試細胞中的螢光素酵。圖4A顯示了GDF-8最多活化報告構建體10倍，具有10ng/ml的ED50，表明純化的重組GDF-8具有生物活性。BMP-ll和活化素具有類似的生物反應。實施例3:在ActRIIB結合測定中純化的GDF-8的結合特性在冰上以20摩爾EZ-Link碌基-NHS-生物素(Pierce,Rockford，Illinois,Cat.No.21217)對1摩爾GDF-8複合體的比率生物素化GDF-8潛在性複合體2小時。使用0.5%TFA降低pH值以終止反應，並將該複合體上C4Jupiter250x4.6mm層析柱(Phenomenex)以使成熟GDF-8與GDF-8前肽分離。收集TFA/CH3CN梯度洗脫的生物素化成熟GDF-8級分，將該級分濃縮並使用MicroBCATM蛋白質測定試劑盒(Pierce,Rockford，IL，Cat.No.23235)定量。生物素化成熟BMP-ll以上述同樣的方式製備自BMP-11潛在性複合體。在96孔平底測定培養板(Costar，NY，Cat.No.3590)上包被重組ActRIIB-Fc嵌合體(R&DSystems,Minneapolis,MN，Cat.No.339-RB/CF),於4。C在1[ig/ml0.2M碳酸鈉緩衝液中反應過夜。然後，用1mg/ml牛血清白蛋白封閉培養板，接著根據下列ELISA方案進行洗滌100pi不同濃度的生物素化GDF-8或BMP-ll的等分試樣加入到封閉的ELISA培養板上，溫育l小時，洗滌，以及通過抗生物素蛋白鏈菌素一辣根過氧化物酶(SA-HRP，BDPharMingen,SanDiegoCA，Cat.No.13047E)再接著添加TMB(KPL，Gaithersburg，MD，Cat.No.50-76-04)來檢測GDF-8或BMP-ll的結合量。比色法用MolecularDevices酶標儀在450nm下進行。如圖1所示，結合ActRIIB,，惟定的GDF-8II型受體，的生物素化GDF-8和BMP-ll分別具有15和40ng/ml的ED5fl，表明對於GDF-8和BMPll,在體外結合測定中ActRIIB結合測定是敏感的。實施例4:通過GDF-8scFv噬菌體文庫淘選分離Myo22使用作為所述的1.38xlo"文庫(Vaughan等.(1996)NatureBiotech.，14:309-314)發展版本的scFv噬菌體文庫篩選特異於GDF-8的抗體。可溶的GDF-8蛋白(10(ig/ml，在50mM，pH9.6的碳酸鈉緩衝液中)包被於微量培養板的孔上，於4。C反應過夜。用PBS洗滌孔，並於37。C在MPBS(含3%Marvel脫脂奶粉的PBS)中封閉2小時。在1001的3%MPBS中的純化的噬菌體(10"轉導單位(tu))加入封閉的孔中並在室溫下溫育1小時。先用PBST(含0.1%v/vTweenTM20)洗孑L10次，再用PBS洗孑L10次。用100pi100mM三乙胺在室溫下洗脫結合的噬菌體顆粒IO分鐘，然後馬上用50filIMpH7.4Tris-HC1中和。用洗脫的噬菌體感染10ml指數式生長大腸杆茵TGI.感染的細胞在2TY肉湯培養基中於37°C固定培養30分鐘，接著於37。C通風30分鐘後，然後在2TYAG培養板上劃線接種並於30。C溫育過夜。從培養板中挖出的克隆置於10ml2TY肉湯培養基中並添加15%甘油，儲存於-70。C。用輔助噬菌體重感染來自第一輪淘選育種的甘油儲用培養物，並對之拯救以提供用於第二輪淘選的scFv抗體表達噬菌體顆粒。用這種方法總共進行三輪淘選。實施例5:從scFv文庫中淘選Myo28和Myo29使用生物素化GDF-8蛋白(bioGDF-8)篩選可溶供選物。BioGDF-8^使用濃度為1pg/ml。^使用實施例4所述的scFv文庫。純化的scFv噬菌體(1012tu)在100jil3%MPBS中封閉30分鐘，然後加入生物素化抗原並在室溫下溫育1小時。噬菌體/抗原添加到50jilDynalTMM280抗生物素蛋白鏈菌素磁珠中，該磁珠已於37。C在1ml3%MPBS中封閉1小時並在室溫下再溫育15分鐘。使用磁性網架(magneticrack)捕獲磁珠並在含有0.1%(v/v)TweenTM20的1ml3%MPBS中洗滌四次，然後在PBS中洗滌三次。在最後一次PBS洗滌後，磁珠懸浮於100piPBS中並用於感染5ml指數式生長的大腸桿菌TG-l細胞。細胞和噬菌體於37。C溫育1小時(30分鐘固定，30分鐘以250轉/分搖動)，接著在2TYAG培養板上鋪開。培養板於30°C溫育過夜，第二天可見克隆。從培養板上刮下克隆產物並按如上所述拯救噬菌體。按如上所述進行第二輪可溶性供選物的篩選，實施例6:ActRIIB受體抑制測定和篩選在含有100jil2TYAG的96孔培養板中挑選如實施例4和5所述獲得的克隆產物。通過在指數式生長的培養物上清液中添加lmMIPTG誘導scFv產生，並於30。C溫育過夜。基本上如實施例3所述，篩選具有抑制bioGDF-8結合ActRIIB能力的含有scFv培養物上清液的粗提物。對該測定進行輕微改良，其中在時間分辨螢光測定法(TRF)中使用銪標記的抗生物素蛋白鏈菌素並使用DELFIATM試劑盒(PerkinElmerLifeSciences,Boston,MA)檢效'JbioGDF-8的結合。挑選與不相關克隆比較顯示了更強抑制結合信號的陽性克隆並測定以確證活性。在上述抑制測定中測試純化的scFv，該scFv通過受體抑制篩選鑑定來自陽性克隆。scFv濃度滴定法用於確定克隆效價，在該測定中效價通過ICs。值測定。圖2顯示了試驗結果。當在這些試驗中測定時，Myo29，Myo28和Myo22的scFv，sICso分另'J為2.4nM、1.7nM和60nM。因此，這些抗體是GDF-8活性的有效抑制劑。實施例7:通過噬菌體ELISA鑑定特異性為測定抗體的特異性，對於來自ActRIIB篩選的抗GDF-8陽性克隆和不相關蛋白進行噬菌體ELISA。單獨含有噬菌粒的大腸桿菌克隆在每孔含有100jil2TYAG培養液的96孔培養板中溫育。添加M13K07輔助噬菌體進行冪為10的指數式生長培養物的重複感染(moi)，並且培養板在於37°C溫育超過1小時。培養板在臺式離心機中以2000轉/分離心10分鐘。除去上清液並將細胞沉澱再懸浮於100jil2TYAK中，然後於30°C搖動溫育過夜。第二天，培養板以2000轉/分離心10分鐘，將每個孔的100nl含有噬菌體的上清液轉移入新鮮的96孔培養板中。在進行ELISA前，噬菌體樣品在室溫下在終濃度為3°/4MPBS中封閉1小時。ljig/ml的GDF-8或不相關蛋白在96孔微量培養板上於4°C包被過夜。包被後，從孔中除去溶液，接著培養板在室溫下在3%MPBS中封閉1小時。用PBS衝洗培養板，然後在每個孔中添加50jil的預封閉的噬菌體。培養板在室溫下溫育1小時，然後用3次更換的PBST洗滌，接著用3次更換的PBS洗滌。在每個孔中，加入50jU1:5000抗-M13-HRP綴合物(Pharmacia)稀釋液，並將培養板在室溫下溫育1小時。每塊培養板先用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次。在每個孔中加入50jil的TMB底物並溫育直至顯色。添加25jil0.5MH2S04停止反應。使用酶標儀測讀450nm處吸收率以測定所產生的信號。證實了與GDF-8的特異性結合.實施例8:scFv測序、轉化為IgG以及胚系化(Gernlining)在2TYAG培養板上劃線接種中和scFv的大腸桿菌克隆，並於30°C溫育過夜。通過使用pCANTAB6載體序列寡核苷酸擴增來自scFv克隆的Vb和l區，對來自這些培養板的三份相同的克隆進行測序。scFv片段的DNA序列用於製備Myo29，Myo28和Myo22IgG's，這些DNA序列分別為SEQIDNO:13，SEQIDNO:7和SEQIDNO:1。使用PCR及特異性克隆引物擴增來自scFv克隆的重鏈和輕鏈V區。用合適的限制性內切酶消化PCR產物並將其亞克隆入含有人IgG,重鏈恆定區(對於l區)或含有合適的人入輕鏈恆定區(對於VL區)的載體。可通過對來自分離的大腸軒菌克隆的質粒DNA測序來檢驗質粒中V區的錯誤插入。質粒通過標準技術製備自大腸桿菌培養物，並使用標準技術將重鏈和輕鏈構建體共轉染入COS細胞中。使用蛋白A瓊月旨糖凝膠(Sepharose)(Pharmacia,Peapack，NJ)純化分泌的IgG並將緩衝液交換為PBS.使用scFv克隆的測序數據來鑑定對於每個克隆的重鏈和輕鏈而言最接近的胚系序列。合適的突變通過使用標準定向誘變技術以及適當的突變引物得到製備。通過測序分析確證scFv序列的突變。對於Myo28和Myo29而言，其胚系scFv以及Vb和Vl區序列分別列於SEQIDNO19和SEQIDNO:25。實施例9:抗體的生物活性圖3A顯示了Myo29與生物素化的GDF-8預溫育，如實施例3所述，在ActRIIB結合測定中Myo29在10fig/ml下抑制GDF-8與ActRIIB的結合，具有0.2-0.4nM的IC5。。類似地在圖3B中，Myo29抑制生物素化BMP-ll與ActRIIB結合，並具有相同的IC5。.在體外生物測定中Myo29也阻斷GDF-8活性。作為實例，當GDF-8與Myo29在室溫下預溫育1小時時，在基本上如實施例2所述進行的RGA測定中GDF-8生物活性減少了。圖4C顯示了在Myo29存在以及對GDF-8的EDs。為20ng/ml的條件下，pGL3(CAGA)12報告活性的誘導。Myo"減少GDF-8誘導是以劑量-響應的方式，具有15-30ng/ml(0.1-0.2nM)的IC5。。Myo29也能以同樣程度抑制BMP-11的生物活性(圖4B)。相反，在該測定中活化素並不受Myo29影響(圖4D)，推測是由於在GDF-8和活化素之間與GDF-8和BMP-11相比同源性相對較低的緣故。在RGA和ActRIIB結合測定中也測試了Myo22和Myo28。這兩個抗體都阻斷GDF-8和BMP-ll活性。例如對於Myo28，其I"為0.2-0.35nM。實施例10:Myo22，Myo28和Myo29表位作圖為定位抗體的確切表位，代表列於SEQIDNO:49的成熟GDF-8完整序列的48個重疊的13殘基肽使用斑點合成技術(Molina等.(1996)PeptideResearch,9:151-155;Frank等.(1992)Tetrahedron,48:9217-9232)在纖維素紙上直接合成。肽之間的重疊部分具有11個胺基酸。在該陣列中，絲氨酸殘基取代了半胱氨酸殘基以減少由於半胱氨酸存在而引發的新增的化學反應。纖維素膜用聚乙二醇修飾，Fmoc-保護的胺基酸購自Abimed(Lagenfeld，Germany),通過偶聯0-丙氨酸間隔分子將該陣列固定在纖維素膜上，並使用如前所述的標準DIC(二異丙基碳二亞胺)/H0Bt(羥基苯並三唑)偶聯化學反應來合成肽(Molina等.(1996)PeptideResearch,9:151-155;Frank等.(1992)Tetrahedron,48:9217-9232)。使用AbimedASP222機器人點樣活化的胺基酸。手工進行洗滌和脫保護步驟，並在最後一個合成循環後將肽N-末端乙醯化。在肽合成後，纖維素膜先在曱醇中洗滌10分鐘，再在阻斷劑(TBST(含有0.1%(v/v)TweenTM20)和1%(w/v)酪蛋白的Tris-緩衝鹽)中洗滌10分鐘。然後，將膜與2.5jig/ml的抗GDF-8抗體在阻斷劑中輕微搖動溫育1小時。在用阻斷劑洗滌3次，每次10分鐘後，膜與HRP-標記的二抗(在阻斷劑中含量為0.25jig/ml)溫育30分鐘。然後，膜先用阻斷劑洗滌3次，每次10分鐘，再用TBST洗滌2次，每次10分鐘。使用SuperSignalTMWest試劑(Pierce)和數位相機(AlphananotechFluoromager)使結合抗體可見。圖5顯示了結果。具體地，從圖5中可見，Myo29識別的表位定位於成熟GDF-8的胺基酸72與88之間。另一方面，Myo22識別成熟GDF-8序列起始的44個N末端胺基酸(SEQIDNO:49的胺基酸1-44)中的表位。最後，Myo28識別的表位包含了位於成熟GDF-8起始的98個N-末端胺基酸中的殘基。為進一步鑑定Myo29識別的表位，使用點合成進行缺失與取代分析。在取代分析中，肽的每個殘基用除了半胱氨酸外20個天然胺基酸單獨取代。如上所述進行合成反應及結合測定。結果示於圖6，在第一行中，起始兩列和最後三列代表野生型肽對照物。結果證明了當Lys-78，Pro-81和Asn-83分別單獨突變為其他胺基酸時，Myo29與肽的結合親和力明顯降4氐。因此，Myo29識別包含Lys-Xaal-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn(SEQIDN0:54)的序列，其中Xaal，Xaa2和Xaa3分別是任意胺基酸，或Xaal=Met,Xaa2=Ser以及Xaa3=lie,彼此互相獨立。實施例11:GDF-8的免疫沉澱反應為評估Myo29和Myo28與成熟GDF-8及GDF-8複合體的結合，進行免疫沉澱反應研究。表達GDF-8的CH0細胞用"S-曱硫氨酸和35S-半胱氨酸標記。來自這些細胞的含有GDF-8蛋白(成熟GDF-8和潛在性複合體)的100jil條件培養液與20jig/mlMyo29或Myo28於4°C溫育1小時。加入蛋白A-SepharoseTM並於4。C溫育過夜'收集免疫沉澱物，再懸浮於還原樣品緩衝液衝並用SDS-PAGE分析。固定凝膠，並用放射自顯影增強劑溶液增強，乾燥，以及進行放射自顯影。圖7顯示了Myo29和Myo28都能免疫沉澱成熟GDF-8、GDF-8潛在性複合體和未加工的GDF-8。通過蛋白質印跡測定，這兩個抗體在非還原條件下都能結合GDF-8二聚體。實施例12:藥物代謝動力學在以1mg/kg劑量的單次靜脈內(IV)或腹膜內(IP)給藥後，在C57B6/SCID小鼠中評估Myo29的藥物代謝動力學(PK)。給予該動物上列劑量的未標記的和1251-標記的Myo29混合物，並基於血清中1251放射性強度以測定血清濃度以及該注射劑量的特異性活性。圖8顯示了對於靜脈內或腹膜內施用Myo29而言，血清濃度對時間所作的圖。Myo29顯示了大約一周的延長的終末半衰期和約lml/hr/kg的低清除率。分布的初期容量(initialvolume)約為83ml/kg。分布的表觀容量(apparenvolume)約為227ml/kg。在注射後約6小時，Myo29達到峰值濃度。在腹膜內注射後吸收率約為77%。實施例13:Myo29對肌肉質量和強度的體內效應為確定Myo29是否在體內阻斷GDF-8活性，在成年SCID小鼠中測試Myo29。SCID小鼠具有嚴重聯合免疫缺陷，並因此在注射諸如Myo29的人抗體後無法產生免疫反應。在用Myo29處理的小鼠中，GDF-8活性用肌肉質量作為指示。稱重雄性C57B6SCID八周大小的小鼠，並根據體重均勻地分為8組。將處於PBS緩衝液中的Myo29以不同劑量(60，10和lmg/kg)每周一次注射入小鼠腹膜內。在第一周給予兩倍劑量，栽體(PBS)處理的或未處理的小鼠用作為對照。該處理持續四周。肌肉質量通過在處理後解剖並稱重腓腸肌和四頭肌來評估。在處理四周後，在所有用Myo29處理的組中肌肉質量增加了10-23%,用更高劑量處理的組能達到顯著性水平(圖9，p<0.01)。在另一個實例中，雌性CB17SCID小鼠用Myo29每周一次以不同劑量(10,5，2.5和1mg/kg)處理4或12周。再者，用Myo29處理4周可引起J^腸肌和四頭肌重量增加10%-20%(圖10A和10B)。更長時間的處理(12周)則引起肌肉質量更多的增加(12%-28%),在所有用Myo29處理的組中均達到統計學上顯著性水平(圖11A和11B)。為確定增加的肌肉質量是否導致更強壯的肌肉，用握力計測定前肢肌肉強度(1027csx型，ColumbusInstruments,Columbus,0H)。處理12周後，與栽體對照相比，用5mg/kg或10mg/kgMyo29處理的小鼠中前肢強度分別提高了17X和23W(p〈0.01，圖12)。該研究結果證明了Myo29在體內抑制GDF-8活性並導致肌肉質量和肌肉強度顯著增加.實施例14:治療代謝失調注入抑制性抗體的GDF-8抑制劑可用於治療代謝失調，如n型糖尿病、葡萄糖耐量降低、代謝症候群(如X症候群)、創傷誘導的胰島素抗性(如燒傷或氮失調)和脂肪組織病(如，肥胖症)。本發明的抗GDF-8抗體可用於治療疾病發作或具有確定的代謝病的患者。使用已公認的肥胖症、胰島素抗性和n型糖尿病鼠動物模型來確證抗GDF-8抗體用於治療代謝失調，如n型糖尿病和/或肥胖症的療效，該動物模型包括ob/ob，db/db和攜帶致死黃色突變的品系。也可通過給予包括C57BL/6J的某些品系的小鼠高脂肪或高卡路裡飲食以誘發胰島素抗性。類似於人，這些齧齒動物發展為胰島素抗性、高胰烏素血症、異常脂血症、以及葡萄糖內穩態的劣化所引發的高血糖症。可基於血清中葡萄糖、胰島素和脂質的測定結果來評估試驗結果.通過胰島素耐量測試和葡萄糖耐量測試來確定改善胰島素敏感度的手段。更多的敏感度技術可包括使用血糖正常的一高胰島素血症夾子(clamp)來評估甘油酯對照和胰島素敏感度的改善。此外，該夾子(clamp)技術可允許定量評估葡萄糖主要分布組織(肌肉、脂肪和肝臟)在改善的甘油酯對照試驗中所起的作用。在一研究中，用諸如Myo29(腹膜內注射)的抗GDF-8抗體或栽體處理1周至6個月。該處理方案可不同，可進行不同劑量和治療用藥法(如，每日一次、每周一次或每周兩次注射)的測試。與安慰劑處理的小鼠相比，可預計到用抗GDF-8抗體處理的小鼠具有更多的葡萄糖攝取、增加的糖酵解和糖原合成、更低的游離脂肪酸和血清甘油三酯。抗GDF-8抑制性抗體也用於預防疾病和/或用於減少疾病的嚴重程度和/或症狀。可預期抗GDF-8抗體可以皮下注射方式給予，經常地每天一次和偶爾地每月一次。治療持續時間從一個月到幾年。為測試在人體中抗GDF-8的臨床療效，鑑定患有或處於n型糖尿病危險中的受試者並隨機分入治療組。治療組包括安慰劑組和給予抗體(不同劑量)的一到三組。預期在一個月到三年後評估個體葡萄糖代謝的改變。可預期接受治療的個體將具有改善的症狀。抗體作為單一活性化合物給藥或與其他化合物或組合物聯合給藥。當作為單一活性化合物給藥或與其他化合物或混合物聯合給藥時，取決於症狀的嚴重程度和疾病的進展，劑量優選從約1jig/kg-20mg/kg。選擇用於臨床治療的合適的有效劑量範圍如下ljig/kg-20mg/kg、l|ig/kg-10mg/kg、ljig/kg-lmg/kg、10pg/kg-lmg/kg、10(ig/kg-100jig/kg、100pg/kg-lmg/kg以及500fig/kg-lmg/kg。治療用藥法和結果的實例概述於表3中。表3:臨床病例的實例tableseeoriginaldocumentpage38根據本說明書中所引用參考文獻的教導可最徹底地理解本說明書，所有參考文獻的全文在此引用作為參考。說明書中的實施方案提供了本發明實施方案的例證而不應解釋為限制本發明的範圍。本領域技術人員應認識到許多其他實施方案包括在本發明的權利要求中，且意在於說明書和實施例僅被認為是例證的，下列權利要求表明了本發明的真正範圍和精神。序列表〈110〉WyethCambridgeAntibodyTechnology〈120〉抗GDF-8的中和抗體及其用途〈130〉8702.020-304〈160>54〈170〉Patentln3.1版<210〉1〈211〉786〈212〉DNA〈213〉人〈400〉1gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactac180gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgagagaatgggg300ccctgtactggtggaagctgctacgacacccttggcaactggggccggggcaccctggtc360accgtctcgagtggaggcggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggaagtgca420cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatc480tcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcaa540cttccaggcgcggcccccaaactcctcatcaggggtaatggcaatcggccctcaggggtc600cctgaccgattctctgtctccaagtctggctactcagcctccctggccatcactgggctg660cagcctgccgatgagggtgtttattactgccagtcctatgacagcagtctgagtggttcg720aaggtgttcggccaagggaccaagctgaccgtcctaggtgcggccgcacatcatcatcac780C3tC3C2〈211〉262〈212〉PRT〈213〉人〈400〉2GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys786859095GluArgMetGlyProCysThrGlyGlySerCysTyrAspThrLeuGly100105110AsnTrpGlyArgGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGly115120125SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAlaGinSerValLeu130135140ThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGinArgValThrlie145150155160SerCysThrGlySerSerSerAsnlieGlyAlaGlyTyrAspValHis165170175TrpTyrGinGinLeuProGlyAlaAlaProLysLeuLeulieArgGly180185190AsnGlyAsnArgProSerGlyValProAspArgPheSerValSerLys195200205SerGlyTyrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeuGinProAlaAsp210215220GluGlyValTyrTyrCysGinSerTyrAspSerSerLeuSerGlySer225230235240LysValPheGlyGinGlyThrLysLeuThrValLeuGlyAlaAlaAla245250255HisHisHisHisHisHis2603gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactac180gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgagagaatgggg300ccctgtactggtggaagctgctacgacacccttggcaactggggccggggcaccctggtc360accgtctcgagt372〈210〉4〈211〉124〈212〉PRT〈213〉人〈400〉4GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlalieSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095GluArgMetGlyProCysThrGlyGlySerCysTyrAspThrLeuGly100105110AsnTrpGlyArgGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210〉5336〈212〉DNA〈213〉人〈400〉5cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatc60tcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatgatgtacactggtaccagcaa120cttccaggcgcggcccccaaactcctcatcaggggtaatggcaatcggccctcaggggtc180cctgaccgattctctgtctccaagtctggctactcagcctccctggccatcactgggctg240cagcctgccgatgagggtgtttattactgccagtcctatgacagcagtctgagtggttcg300aaggtgttcggccaagggaccaagctgaccgtccta336〈210〉6〈211〉112〈212〉PRT人〈400>6GinSerValLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin151015ArgValThrlieSerCysThrGlySerSerSerAsnlieGlyAlaGly202530TyrAspValHisTrpTyrGinGinLeuProGlyAlaAlaProLysLeu354045LeulieArgGlyAsnGlyAsnArgProSerGlyValProAspArgPhe505560SerValSerLysSerGlyTyrSerAlaSerLeuAlalieThrGlyLeu65707580GinProAlaAspGluGlyValTyrTyrCysGinSerTyrAspSerSer859095LeuSerGlySerLysValPheGlyGinGlyThrLysLeuThrValLeu100105110〈210〉7〈211〉774〈212〉DNA〈213〉人〈400〉7caggtcaccttgaaggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagtagatatgtcatcaactgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggaatgggtctcagctattagtgttactggtggtagcacggcctac180gcagactccgtgaggggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ttgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtacgaaaggacag300tgggaacggggaagttactactttgactactggggccggggaaccctggtcaccgtctcg360agtggaggcggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggaagtgcacagtctgtg420ctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtc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