抑制血管發生的組合物和方法
2023-08-13 07:19:51
專利名稱：抑制血管發生的組合物和方法
技術領域：
本發明普遍涉及醫藥領域，特別涉及應用包括但不限於I型、II型、III型、IV型、V型變性或蛋白水解形式膠原蛋白的拮抗劑來抑制組織中血管發生或檢測血管發生的方法和組合物。
背景每年腫瘤生長和轉移威脅到大多數人的健康。實際上，據估計僅在美國一國下一年度所要診斷出的癌症新病例約為600000多例(Varner，J.A.，Brooks，P.C.，和Cheresh，D.A.，(1995)細胞粘附通訊3,367-374)。更為重要的是，大多數研究表明所有的實體瘤的生長需要新血管生長以使腫瘤持續擴張(Varner等，1995；Blood，C.H.，Zetter，B.R.(1990)，生物化學和生物物理學報，1995，103289-118；Weidner，N等(1992)，國立癌症研究所期刊，841875-1887；Weidner，N等(1991)，新英格蘭醫學期刊，3241-7；Brooks，P.C.等(1995)，臨床投資期刊，961815-1822；Brooks，P.C.等(1994)，細胞，791157-1164；Brooks，P.C.等(1996)，細胞，85683-693；Brooks，P.C.等(1998)，細胞，92391-400)。值得注意的是，多數其它人類疾病也以不受調控的血管發展為特徵，包括眼睛疾病例如斑點惡化和糖尿病視網膜病。此外，大多數炎症疾病也與失控的新血管形成有關，如關節炎和銀屑病(Varner等，1995)。血管發生是一種從現有血管發展出新血管的病理過程(Varner等，1995；Blood和Zetter，1990；Weidner等，1992)。這個複雜的過程需要許多分子包括生長因子、細胞粘附受體、基質降解酶和細胞外基質成分(Varner等，1995；Blood和Zetter，1990；Weidner等，1992)的協同作用。因此，旨在阻斷血管發生的治療能顯著影響實體瘤的生長。實際上，已經有證據清晰地表明阻斷腫瘤新血管發生能夠在各種不同的動物模型中抑制腫瘤生長，並且人體臨床數據也開始支持此論點(Varner，J.A.，Brooks，P.C.，和Cheresh，D.A.，(1995)細胞粘附通訊，3,367-374)。更為重要的是，許多研究表明所有實體瘤的生長需要新血管生長以使腫瘤持續擴張(Varner等，1995；Blood和Zetter，1990；Weidner等，1992；Weidner等，1991；Brooks等，1995；Brooks等，1994；Brooks等，1997)。
為了達到此目標，許多研究人員已經將他們抗血管發生的方法集中至起始血管發生的生長因子和細胞因子上(Varner等，1995；Blood和Zetter，1990；Weidner等，1992；Weidner等，1991；Brooks等，1995；Brooks等，1994；Brooks等，1997)。但是，有很多不同的生長因子和細胞因子能夠刺激血管發生。由於這種冗餘的情況，阻斷單一細胞因子的治療效果可能有限。但是，人們對其它的抗血管發生的目標很少注意。近來的研究已經表明，為了提供一個有益於新血管發展的微環境血管發生需要環繞在血管周圍的細胞外基質(ECM)的蛋白水解重塑(Varner等，1995；Blood和Zetter，1990；Weidner等，1992；Weidner等，1991；Brooks等，1995；Brooks等，1994；Brooks等，1997)。
已經提出抑制血管發生可能是一種限制腫瘤生長的有用的治療方法。已經提出可以通過下列途徑抑制血管發生(1)抑制「血管發生分子」如βFGF(成纖維生長因子)的釋放，(2)中和血管發生分子，例如通過使用抗βFGF抗體和(3)抑制內皮細胞對血管發生刺激的應答。後一種策略已經引起了人們的注意，並且Folkman等，癌症生物學，389-96(1992)，已經描述了幾種內皮細胞應答抑制劑，包括膠原蛋白酶抑制劑、基質膜翻轉抑制劑、制管張類固醇、真菌來源的血管發生抑制劑、血小板因子4、血小板反應蛋白、關節炎藥物如D-青黴胺和金thiomalate、維生素D3類似物、α幹擾素及其可以被用於抑制血管發生的類似物。關於其它提到的血管發生抑制劑，見Blood和Zetter，1990；Moses等(1990)，自然，2481408-1410；Ingber等(1988)，投資實驗室，5944-51和美國專利Nos.5092885，5112946，5192744和5202352。前述參考文獻所描述的血管發生抑制劑都不是以變性的或蛋白水解的膠原蛋白為靶的。
發明概述本發明提供了能夠抑制血管發生的變性的或蛋白水解的膠原蛋白的拮抗劑。拮抗劑特異性地與變性的或蛋白水解的膠原蛋白結合，但與天然形式的相同膠原蛋白結合的親和力顯著降低。拮抗劑可以是對任一變性的膠原蛋白特異的，包括變性的I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白或其組合。例如，在一個實施方案中，相對於天然的三螺旋形式的I型膠原蛋白而言，拮抗劑對變性的I型膠原蛋白是特異的，但對其它類型的變性的膠原蛋白如IV型膠原蛋白的親和性顯著降低。在另一個實施方案中，一種拮抗劑是對變性的IV型膠原蛋白特異的。拮抗劑也可以是對變性的I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白特異的。
拮抗劑可以是與變性的膠原蛋白發生免疫反應但與天然形式的膠原蛋白免疫反應程度顯著降低的抗體或其功能性片段。抗體可為單克隆或多克隆抗體。拮抗劑也可以是具有對變性的膠原蛋白而不是天然形式膠原蛋白的特異性的多肽或肽。拮抗劑也可以是非肽化合物如小的有機分子或寡核苷酸。
因此，本發明描述了抑制組織中血管發生的方法，包括給予組織包含血管發生抑制量的變性的/蛋白水解的膠原蛋白的拮抗劑的組合物。
待治療的組織可以是任何需要抑制血管發生治療的組織，例如正發生新血管化的疾病組織。典型組織包括炎症組織、實體瘤、轉移瘤、正經歷再狹窄的組織及類似組織。
本發明也提供了通過將本發明的拮抗劑與組織相接觸從而檢測血管發生的方法，這些方法適於回體(exvivo)或體內應用。
本發明也提供了通過回體或體內將本發明的拮抗劑與組織相接觸從而檢測腫瘤組織、轉移以及腫瘤侵入組織的方法。
本發明也提供了篩選可與變性的膠原蛋白特異性結合，但與天然形式的膠原蛋白親和力顯著下降並能抑制血管發生的拮抗劑。
附圖的簡要說明
圖1顯示了在固相ELISA中HUI77單抗與細胞外基質成分的反應性。用細胞外基質成分包括天然的I型和IV型膠原蛋白、變性的I型和IV型膠原蛋白、玻連蛋白、纖連蛋白和纖維蛋白原包被微量滴定板(96孔)，每種成分的濃度為10ug/ml。37℃用溶於PBS中的1％BSA封閉微孔板微孔1小時。向孔中加入HUI77單抗至濃度為1ug/ml，並在37℃孵育2小時。孵育完後，通過與過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗孵育檢測免疫反應性。免疫反應性是用鄰苯二胺作為底物在490納米波長下用ELISA微板讀數儀測量的。Coll-I(天然的三螺旋形式的I型膠原蛋白)，變性的Coll-I(變性的I型膠原蛋白)，Coll-IV(天然的三螺旋形式的IV型膠原蛋白)，變性的Coll-IV(變性的IV型膠原蛋白)，VN(玻連蛋白)，FN(纖連蛋白)，FB(纖維蛋白原)。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。
圖2顯示了HUI77單抗與不同基因類型膠原蛋白的反應性。用濃度為10ug/ml的不同形式的膠原蛋白包被微量滴定板。37℃用溶於PBS中的1％BSA封閉微孔板各孔1小時，用過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗孵育檢測免疫反應性。免疫反應性是用ELISA微板讀數儀在490納米波長下測量光密度值而測定的。Coll-I；天然的三螺旋形式的I型膠原蛋白。Den Coll-I；變性的I型膠原蛋白。Coll-II；天然的三螺旋形式的II型膠原蛋白。Den Coll-II；變性的II型膠原蛋白。Coll-III；天然的三螺旋形式的III型膠原蛋白。Den Coll-III；變性的III型膠原蛋白。Coll-IV；天然的三螺旋形式的IV型膠原蛋白。Den Coll-IV；變性的IV型膠原蛋白。Coll-V；天然的三螺旋形式的V型膠原蛋白。Den Coll-V；變性的V型膠原蛋白。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。
圖3顯示了用HUI77單抗體內鑑定環繞在人黑素瘤周圍的變性的膠原蛋白。變性的膠原蛋白在體內的產生和定位是通過間接免疫螢光研究來自人鼠嵌合模型以及人腫瘤活組織檢查的冷凍組織部分而完成的。來自人黑素瘤的冷凍組織部分在丙酮中固定，用1％BSA封閉並用HUI77單抗和針對表達在人黑素瘤上的αv整合蛋白的多克隆抗體共染色。抗體結合是通過與羊抗小鼠FITC標記的二抗和羊抗大鼠羅丹明標記的二抗孵育而檢測的。左圖表示人黑素瘤活檢組織標本(630×)。右圖表示在全厚人皮膚中生長的M21人黑素瘤細胞系(200×)。紅色表示αv整合蛋白的表達，綠色表示變性的膠原蛋白的表達，黃色表示αv整合蛋白和變性的膠原蛋白的共同定位。
圖4顯示了用HUI77單抗體內鑑定血管相關的環繞在人黑素瘤周圍的變性的膠原蛋白。變性的膠原蛋白是通過間接免疫螢光研究人黑素瘤活組織檢查的冷凍組織部分而定位的。來自人黑素瘤的冷凍組織部分在丙酮中固定，用1％BSA封閉，並用HUI77單抗和針對VIII因子，一個已知的血管標誌的多克隆抗體進行共染色。抗體結合是通過與羊抗小鼠FITC標記的二抗和羊抗大鼠羅丹明標記的二抗孵育而檢測的。左圖顯示對人黑素瘤活檢組織進行VIII因子染色(紅色)顯示出腫瘤血管。右圖顯示出環繞在人腫瘤相關的血管周圍的變性的膠原蛋白(綠色)。
圖5顯示了HUI77單抗對人內皮細胞粘附的效應。用濃度為10ug/ml的天然或變性的I型或IV型膠原蛋白包被微量滴定板(96孔)。37℃用溶於PBS中的1％BSA封閉微孔板各孔1小時。然後在存在或不存在純化的HUI77單抗(50ug/ml)或濃度為50ug/ml的同型匹配的對照抗體的情況下在包被孔中吸附人內皮細胞(HUVECs)30分鐘。洗滌去除未吸附的細胞，用結晶紫對吸附的細胞進行染色。細胞粘附是通過測量600納米波長下流出的染料的光密度值而測定的。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。數據是用對照的百分率來表示的。
圖6顯示了HUI77單抗對人內皮細胞遷移的效應。用濃度為25ug/ml的變性的I型或IV型膠原蛋白包被跨孔遷移室的膜。然後在存在或不存在純化的HUI77單抗或同型匹配的對照抗體(100ug/ml)的情況下人內皮細胞(HUVECs)遷移共6小時。去除仍停留在膜上部的細胞，然後用結晶紫對遷移到膜下部的細胞染色。通過用微量滴定板讀數儀測量600納米波長下流出的染料的光密度值(O.D.)而對細胞遷移進行定量測定。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。數據是用對照的百分率來表示的。
圖7顯示了系統給予純化的HUI77單抗後對血管發生的效應。將用βFGF浸泡過的濾紙片放置到10日齡雞胚的尿囊絨膜(CAMs)上，24小時後雞胚接受單一靜脈注射20ug HUI77單抗或對照。孵育3天後去除濾紙片以及周圍的CAM組織，血管發生是通過對濾紙片區域的血管分枝點計數而定量測定的。圖中顯示了來自一個典型試驗的CAM組織。
圖8顯示了用HUI77單抗進行血管發生試驗的定量測定。數據杆表示在每一種情況下5到10隻雞胚的平均值±標準誤。血管發生指數等於試驗處理的雞胚的分枝點數目減去不存在βFGF時CAMs上的分枝點數目。
圖9顯示了體內系統給予純化的HUI77單抗對腫瘤生長的效應。A)CS-1黑素瘤細胞(5×106)被接種到10日齡雞胚的尿囊絨膜(CAMs)上，24小時後雞胚接受單一靜脈注射100ug純化的HUI77單抗或對照。雞胚孵育7天，在7天孵育期結束之時，切除所得到的腫瘤然後測量其溼重。照片顯示了從用或不用HUI77處理的雞胚中得到的代表腫瘤。
圖10顯示了腫瘤溼重的定量測定。數據杆表示在每一種情況下5到12隻雞胚的腫瘤平均溼重±標準誤。
圖11顯示了在固相ELISA中HUIV26單抗與細胞外基質成分的反應性。用細胞外基質成分包被微量滴定板，每種成分的濃度為25ug/ml。A)加入HUIV26單抗至濃度為1ug/ml，1小時後加入過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG。在包被板子之前，變形的I型和IV型膠原蛋白是煮沸15分鐘而製備的。所有的數據都用任一個二抗的非特異性結合校正。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。B)用濃度為25ug/ml的三螺旋膠原蛋白包被微量滴定板，在存在或不存在EDTA、抑酶肽或二者的情況下，濃縮的(20×)HUVEC條件培養基被加入到孔中，然後孵育1、6和24小時。然後洗滌、封閉板子，用HUIV26單抗或對照抗體孵育。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。圖中使用了下列縮寫Coll-I，I型膠原蛋白；Coll-IV，IV型膠原蛋白。
圖12顯示了HUIV26單抗鑑定雞胚尿囊絨膜(CAM)中環繞在生血管血管周圍的變性的IV型膠原蛋白。變性的IV型膠原蛋白的產生和定位是通過間接免疫螢光研究來自βFGF和腫瘤誘生的血管發生的冷凍CAM組織而完成的。冷凍的CAM組織在丙酮中固定，用1％BSA封閉，然後用HUIV26單抗和針對於IV型膠原蛋白降解酶MMP-2或因子VIII的多克隆抗體進行共染色。通過與羊抗小鼠FITC標記的二抗和羊抗大鼠羅丹明標記的二抗孵育來測定抗體結合。上圖顯示了環繞在生血管血管周圍的變性的IV型膠原蛋白和MMP-2的共定位。下圖顯示了環繞在生血管血管周圍的變性的IV型膠原蛋白和因子VIII的共定位。左圖顯示了用βFGF刺激的CAM組織，右圖顯示了CS1黑素瘤在其中生長的CAM組織。上圖中的紅色表示MMP-2的表達，下圖中的紅色表示因子VIII的表達。上圖及下圖中的綠色表示變性的IV型膠原蛋白的表達，黃色表示其定位。
圖13顯示了HUIV26單抗鑑定環繞在人黑素瘤相關的血管周圍的變性的IV型膠原蛋白。變性的IV型膠原蛋白在體內的產生和定位是通過間接免疫螢光研究來自人黑素瘤活組織檢查的冷凍組織而完成的。人黑素瘤的冷凍組織在丙酮中固定，用1％BSA封閉，然後用HUIV26單抗和針對於已知的血管標誌因子VIII的多克隆抗體進行共染色。通過與羊抗小鼠FITC標記的二抗和羊抗大鼠羅丹明標記的二抗孵育來測定抗體結合。紅色表示因子VIII的表達並且標記上人血管，綠色表示與腫瘤相關的生血管血管特異性相關的變性的IV型膠原蛋白。
圖14顯示了HUIV26單抗對人內皮細胞粘附的效應。用天然或變性的IV型膠原蛋白包被微量滴定板(96孔)。37℃用溶於PBS中的1％BSA封閉微孔板各孔1小時。然後在存在或不存在純化的HUIV26單抗或濃度為100ug/ml的同型匹配的對照抗體的情況下在包被孔中吸附人內皮細胞30分鐘。洗滌去除未吸附的細胞，用結晶紫對吸附的細胞進行染色。細胞與10％的乙酸孵育，細胞粘附是通過測量600納米波長下流出的染料的光密度值而測定的。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。
圖15顯示了HUIV26單抗對人內皮細胞遷移的效應。用天然或變性的IV型膠原蛋白包被跨孔遷移室的膜。然後在存在或不存在純化的HUIV26單抗或同型匹配的對照抗體(100ug/ml)的情況下人內皮細胞(HUVECs)遷移至包被膜的底端共6小時。去除仍停留在膜上部的細胞，然後用結晶紫對遷移到膜下部的細胞染色。然後膜與10％的乙酸孵育，細胞遷移是通過用微量滴定板讀數儀測量600納米波長下流出的染料的光密度值(O.D.)而定量測定的。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。
圖16顯示了體內系統給予純化的HUIV26單抗後對血管發生的效應。將用βFGF浸泡過的濾紙片放置到10日齡雞胚的尿囊絨膜(CAMs)上，24小時後雞胚接受單一靜脈注射20ug HUIV26單抗或對照。孵育3天後去除濾紙片以及周圍的CAM組織，血管發生是通過對濾紙片區域內的血管分枝點計數而定量測定的。圖中顯示了來自一個典型試驗的CAM組織。
圖17顯示了用HUIV26單抗進行血管發生試驗的定量測定。數據杆表示在每一種情況下5到10隻雞胚的平均值±標準誤。血管發生指數等於試驗處理的雞胚的分枝點數目減去不存在βFGF時CAMs上的分枝點數目。
圖18顯示了體內系統給予純化的HUIV26單抗對腫瘤生長的效應。CS-1黑素瘤細胞(5×106)被接種到10日齡雞胚的尿囊絨膜(CAMs)上，24小時後雞胚接受單一靜脈注射20ug純化的HUIV26單抗或對照。雞胚孵育7天。照片顯示了從對照或用HUIV26處理的雞胚CAM組織中得到的代表腫瘤。
圖19顯示了切除的腫瘤大小的比較。在7天孵育期的末期，所產生的腫瘤被切除下來並且分析總大小和溼重。圖中顯示了從對照或用HUIV26處理的雞胚上切除的腫瘤大小的比較。
圖20顯示了腫瘤溼重的定量測定。數據杆表示每種情況下來自5到10隻雞胚的腫瘤溼重的平均值±標準誤。
圖21顯示了SCID小鼠模型系統中評價的HUIV26單抗對腫瘤生長的效應。對SCID小鼠皮下注射2×106M21人黑素瘤細胞。三天後開始一個為期24天的處理，每天腹腔內注射100ug HUIV26單抗或同型匹配的對照抗體，或是不加處理。通過測量直徑來監測腫瘤體積從而測定腫瘤大小。每組5隻小鼠。數據表示每一實驗條件下腫瘤體積的平均值±標準誤。在每一實驗條件下包括5到10隻小鼠的2個獨立的試驗也得到了類似的結果。
圖22顯示了HUIV26單抗與含有膠原蛋白多肽的RGD反應性的分析。用50ul含有膠原蛋白多肽(100ug/ml)的RGD(A)或變性的人IV型膠原蛋白(B)包被微量滴定板，用溶於PBS中的1％BSA封閉板子以減少非特異性結合。HUIV26單抗(1.0ug/ml，50ul/孔)與包被板37℃結合1小時。通過與過氧化物酶標記的二抗孵育來檢測HUIV26單抗的結合。通過微板讀數儀測量光密度值來定量測定免疫反應。A)純化的HUIV26單抗與含有膠原蛋白多肽的RGD的免疫反應性。B)在存在或不存在含有膠原蛋白多肽的可溶性RGD或變性的IV型膠原蛋白的情況下HUIV26單抗與靜止的變性的IV型膠原蛋白的免疫反應性。數據杆代表三個復孔的平均光密度值(O.D.)±標準偏差。
圖23顯示了在變性的I型膠原蛋白上內皮索的形成。用天然的或變性的人I型膠原蛋白包被柔軟的微孔膜。在不存在加入的生長因子或血清的情況下人內皮細胞(HUVECs)與膠原蛋白作用5小時。
圖24顯示了在I型膠原蛋白上人內皮細胞的存活分析。用天然的或蛋白水解的/變性的人人I型膠原蛋白包被微量滴定板。然後在不存在加入的生長因子或血清的情況下人內皮細胞(HUVECs)在孔中吸附5小時。在5小時孵育期結束之時，去除吸附的細胞、固定並且用ApopTaq試劑盒進行細胞編程性死亡染色並用流式細胞術分析。數據表示開始經歷細胞編程性死亡的人內皮細胞百分率的平均值±標準偏差。數據來自三個復孔。
圖25顯示了I型膠原蛋白的隱蔽區在內皮索的形成中的效應。對I型膠原蛋白的胺基酸序列以及三維結構的分析顯示成熟的三螺旋I型膠原蛋白中存在潛在的隱蔽區。對應於I型人膠原蛋白的5個這樣的潛在隱蔽區合成多肽。這些隱蔽區被固定在微量滴定板孔中。並且如上所述進行內皮索形成分析。如圖所示，裝板1小時以後，所有的5種膠原蛋白肽都支持內皮細胞粘附。但是，圖中人膠原蛋白2可以促進內皮索的形成並且在18小時後仍使內皮細胞存活，與此同時其它的肽在18小時以後很少顯示出活性。
圖25顯示了I型膠原蛋白的隱蔽區通過不同的整合蛋白受體支持內皮細胞粘附。代表人I型膠原蛋白的肽被固定在微量滴定板孔中。在存在或不存在針對特異性整合蛋白的功能性阻斷抗體的條件下內皮細胞吸附到肽上去。所有的肽都支持內皮細胞粘附，但水平變化很大。由於針對αVβ3的LM609單抗阻斷細胞粘附，細胞對所有5種多肽的粘附依賴於整合蛋白αVβ3的連接。令人驚奇的是，細胞對肽2的吸附也依賴於β1整合蛋白，由於細胞與這種肽的粘附也被針對於β1整合蛋白的P4C10單抗阻斷。
圖27顯示了與I型膠原蛋白的隱蔽區反應的單克隆抗體的生產。I型膠原蛋白的隱蔽區被用於生產單抗。這些單抗中名為XL313的單抗被用於進一步研究。I型膠原蛋白肽被固定在微量滴定板孔中並且評價XL313單抗的結合能力。如下所示，XL313單抗特異性識別人膠原蛋白肽2。此外XL313單抗特異性識別膠原蛋白肽4，但是，膠原蛋白肽4並不存在於成熟的I型膠原蛋白中。XL313與其它類似的I型膠原蛋白肽不發生反應。
圖28顯示了XL313單抗特異性識別變性的人I型膠原蛋白。用天然的或變性的I型或IV型人膠原蛋白包被微量滴定板。通過固相ELISA評價XL313單抗與天然的或變性的人I型膠原蛋白和變性的人IV型膠原蛋白結合的能力。XL313單抗特異性識別變性的人I型膠原蛋白而不是天然的I型膠原蛋白。此外，XL313單抗不能與天然的或變性的人IV型膠原蛋白結合。
圖29顯示了XL313單抗抑制雞胚中血管發生。用βFGF在10日齡雞胚CAMs上誘生血管發生。24小時後雞胚接受單一靜脈內注射50ug XL313單抗或同型匹配的對照抗體。三天後，通過測量濾紙片區域的血管分枝點數目來定量測定血管發生。A來自一典型試驗的CAM組織的代表例子。
圖30顯示了對圖29血管發生試驗的定量測定。數據杆表示每種情況下5到10隻雞胚的平均值±標準誤。
圖31顯示了系統給予XL313單抗對人成纖維瘤生長的效應。HT1080人成纖維瘤細胞(5×106)被接種到10日齡雞胚的尿囊絨膜(CAMs)上，24小時後雞胚接受單一靜脈內注射純化的XL313單抗，每雞胚50ug。孵育7天後切除腫瘤並測量其溼重。對溼重進行定量測定。數據杆表示每種情況下5到10隻雞胚的平均值±標準誤。
圖32顯示了MMP裂解位點突變的I型膠原蛋白體內抑制黑素瘤生長。I型膠原蛋白MMP裂解位點存在突變的轉基因小鼠被用於測定是否I型膠原蛋白的水解在腫瘤生長以及血管發生中起作用。Cola1轉基因小鼠具有一個抑制MMPs結合和裂解I型膠原蛋白的突變。Col a1 B6轉基因小鼠或野生型對照B6小鼠被皮下注射B16轉基因黑素瘤細胞。腫瘤生長11天後用卡鉗測量腫瘤直徑大小。如下所示，B16黑素瘤細胞在可以輕易蛋白水解I型膠原蛋白的小鼠體內形成了大的增生腫瘤。與此相反，在I型膠原蛋白水解受到抑制的B6 Cola1轉基因小鼠中B16黑素瘤細胞幾乎沒有形成腫瘤的能力。數據表示每一情況下5隻小鼠腫瘤體積的平均值±標準誤。
圖33顯示了XL313單抗在B6小鼠中抑制腫瘤生長。在野生型B6小鼠或Col a1轉基因小鼠中檢測路易斯肺癌。A；路易斯肺癌細胞皮下注射到野生型B6小鼠或B6 Col a1轉基因小鼠中。B；對野生型B6小鼠與Col a1 B6轉基因小鼠中路易斯肺癌的腫瘤生長進行比較。C；野生型B6對照小鼠注射路易斯肺癌細胞，24小時後用XL313單抗或同型匹配的對照抗體(100ug/每注射)系統處理小鼠。腫瘤生長11天後用卡鉗測量腫瘤直徑大小。數據表示每一情況下5隻小鼠腫瘤體積的平均值±標準誤。
本發明的描述膠原蛋白本發明的方法適於應用許多膠原蛋白分子，包括來自任何一種動物的膠原蛋白分子。在一個實施方案中膠原蛋白為人膠原蛋白。膠原蛋白也可以來自任何一種哺乳動物如大鼠、小鼠、豬、兔子等或來自鳥類如雞。通常情況下，膠原蛋白為含有[Gly-Xaa-Xaa]n序列的細胞外基質蛋白。膠原蛋白類型是本領域眾所周知的(見例如Olsen，B.R.(1995)現代細胞生物學論點，5720-727；Kucharz，E.J.膠原蛋白生物化學和病理生理學，SpringerVerlag，柏林，1992；Kunn，K.各型膠原蛋白的結構和功能，P.Mayne和R.E. Burgeson編著，科學出版社，奧蘭多)。人膠原蛋白為優選的膠原蛋白。變性的膠原蛋白指已經被處理不再包含天然三螺旋形式的膠原蛋白。可以通過加熱使膠原蛋白變性。在一個實施方案中，100℃加熱15分鐘使膠原蛋白變性。也可以通過用離液劑處理使膠原蛋白變性。合適的離液劑包括，例如胍鹽。膠原蛋白的變性可以通過以下方法監測，例如光學特性如光吸收度的光譜改變，蛋白螢光的圓二色性，核磁共振，拉曼光譜或任何一種合適的技術。變性的膠原蛋白指變性的全長膠原蛋白或膠原蛋白的片段。膠原蛋白的片段可以是任何比天然的膠原蛋白序列短的膠原蛋白序列。對於具有主要天然結構的膠原蛋白片段，變性可能會影響天然的全長膠原蛋白。片段也可以為不具有明顯的天然結構或不具有明顯的三螺旋形式天然結構的區域大小。這些片段的全部或部分變性不需要加熱或使用離液劑。變性的膠原蛋白這個術語包含蛋白水解的膠原蛋白。蛋白水解的膠原蛋白指被蛋白水解酶酶解為片段化的膠原蛋白。尤為特別的是，可以通過用膠原蛋白酶如MMP-1、MMP-2或MMP-9處理膠原蛋白，或通過用含有膠原蛋白降解活性的細胞外部分處理膠原蛋白或在組織中新血管發生的位點自發的膠原蛋白降解活性製備蛋白水解的膠原蛋白。
膠原蛋白內隱蔽的表位是在天然的膠原蛋白內不暴露不被識別，但是能被變性膠原蛋白的拮抗劑識別的一段序列。可以通過測定拮抗劑的特異性來鑑別隱蔽表位的序列。也可以通過例如檢測天然的三螺旋膠原蛋白的三維結構來鑑別侯選的隱蔽表位。在天然結構中不溶解暴露的或是部分溶解暴露的肽序列是潛在的隱蔽表位。
表位是能被本發明拮抗劑識別的一段胺基酸序列或序列。一個表位可以是線性的肽序列或是由非連續胺基酸序列所組成。一種拮抗劑可識別一或多種序列，因此，一種表位能夠確定多於一種的不同的胺基酸序列靶。拮抗劑識別的表位可以通過本領域熟練技術人員眾所周知的肽圖譜或序列分析技術測定。
拮抗劑本發明的拮抗劑與變性的膠原蛋白特異性結合，但是與天然形式膠原蛋白的親和力顯著下降。「顯著下降的親和力」是指比與變性的膠原蛋白的親和力低3倍左右，優選低5倍左右，更低10倍左右，最好低10倍以上。而且，當與相關親和力比較時，「顯著減少」意思是指親和力至少差3倍。拮抗劑優選是I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白及其組合形式特異性的拮抗劑。在一個實施方案中，一種拮抗劑與變性的I型膠原蛋白結合，但其與天然形式的I型膠原蛋白和變性的II型、III型、IV型、V型膠原蛋白的親和力顯著下降。在另一個實施方案中，一種拮抗劑與變性的IV型膠原蛋白結合，但其與天然形式的IV型膠原蛋白的親和力顯著下降。在另一個實施方案中，一種拮抗劑與變性的I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白結合，但其與天然形式的I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白的親和力顯著下降。
表觀親和力可以通過如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或其它本領域熟練技術人員所熟知的技術來測定。實際親和力可以通過本領域熟練技術人員所熟知的技術來測定。
在一個實施方案中，含有可被一種拮抗劑識別的表位的肽可被自身應用。在另一個實施方案中，由HUI77、HUIV26和XL313單抗所確定的表位可以自身用做抗生血管組合物。
本發明根據現有方法的應用也提供了鑑別侯選膠原蛋白拮抗劑的分析方法。利用這些分析方法評價侯選拮抗劑結合變性的和天然的膠原蛋白的能力，而且評價它們抑制組織中血管發生的能力。
結合分析酶聯免疫吸附分析第一個分析通過ELISA測定了拮抗劑與變性的或天然的膠原蛋白在固相中的結合。這種分析方法適用於多類型的膠原蛋白，例如這種分析方法可用於I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白以及其它細胞外基質成分。
這種分析方法也可被用於鑑別對變性的而不是天然形式的膠原蛋白表現出特異性的化合物。這種特異性分析是通過平行ELISAs進行的，同時在另一個單獨的分析板中篩選另一種可能的拮抗劑結合變性的和天然的膠原蛋白的能力。
變性膠原蛋白的拮抗劑也可以通過它們與本發明拮抗劑競爭結合的能力而被鑑別。例如，推定的拮抗劑可通過監測它們在一個結合分析如ELISA中對一個已知的拮抗劑如HUI77、HUIV26或XL313親和力的影響而篩選。這些拮抗劑很可能具有與HUI77相似的特異性，並且能夠識別同一個隱蔽的表位。通過這種篩選方法選擇出的推定的拮抗劑既能夠與膠原蛋白結合，又能夠與拮抗劑結合。可以通過傳統的結合分析以確定哪些與變性的膠原蛋白結合而不與已知的拮抗劑結合，從而從推定的拮抗劑中選擇出拮抗劑。
拮抗劑也可以通過它們具有與含有變性的膠原蛋白的固相基質結合的能力而被鑑別。改變溶液條件如鹽濃度、pH值、溫度等以後，這些推定的拮抗劑將被收集起來。這些推定的拮抗劑可以憑藉它們在適合的溶液條件下通過已經吸附有天然膠原蛋白的固相基質的能力而被進一步鑑別。
血管發生分析也可分析本發明的拮抗劑調控組織中血管發生的能力。任何一個適用的分析方法都可被本領域熟練技術人員用於監測這些效應。在此將描述幾種這樣的技術。
第二種分析方法是測量雞胚尿囊絨膜(CAM)中的血管發生，因此叫做CAM分析。其他研究者已經詳細描述了CAM分析方法，並且此方法已經被進一步用於測定腫瘤組織中的血管發生和新血管發生。見Ausprunk等，美國病理學期刊，79597-618(1975)和Ossonski等，癌症研究，402300-2309(1980)。
由於整個組織正在發生新血管發生，並且實際上雞胚血管正長入CAM或正長入CAM上正在生長的組織中，CAM分析是一種受到廣泛認可的用於體外血管發生的分析模型。
如下所述，CAM分析顯示了在新血管生長的數量和程度的基礎上對新血管發生的抑制。而且，很易於監測任何移植到CAM上的組織的生長，如腫瘤組織。最後，這個分析方法尤其有用，這是因為在分析系統中對毒性有一個內部控制。雞胚暴露於任何一種測試試劑中，因此雞胚的健康是毒性的指示劑。
第三種分析方法是在兔眼模型中體內測定血管發生，因此稱做兔眼分析。其他研究者已經詳細描述了兔眼分析方法，並且此方法已經被進一步用於測定生血管抑制劑如thalidomide存在的情況下的血管發生和新血管發生。見D』Amato等(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.，914082-4085。
兔眼分析是一種受到廣泛認可的用於體內血管發生的分析模型，這是因為新血管發生的過程，舉例說明如兔血管從眼角膜的邊緣長入眼角膜，易於通過天然透明的眼角膜顯現出來。此外，對新血管發生的刺激或抑制的程度和數量或新血管發生的衰退都可很容易地隨時間監測。
最後，兔子暴露於任何一種測試試劑中，因此兔子的健康是測試試劑毒性的指示劑。
第四種分析方法測定嵌合小鼠人小鼠模型中血管發生，因此稱做嵌合鼠分析。其他研究者已經詳細描述了這個分析方法，並且此方法在此被進一步用於測定血管發生、新血管發生和腫瘤組織的退化。見Yan等(1993)臨床投資期刊，91986-996。
嵌合鼠分析是一種有用的體內血管發生的分析模型，這是因為移植的皮膚在組織學上與正常的人皮膚很相像，在整個組織中新血管正在生成，其中正常的人血管從移植的皮膚生長進入移植的皮膚表面的人腫瘤組織中。新血管發生進入移植皮膚可以通過用人特異性的內皮細胞標誌對新維管結構進行免疫組化染色而顯示出來。
嵌合鼠分析在新血管生長衰退的程度和數量的基礎上顯示出新血管發生的衰退。而且，很容易對移植到嫁接皮膚上的任何組織如腫瘤組織的生長效應進行監測。最後，此分析方法很有用，這是因為分析系統內部有毒性控制。嵌合鼠暴露於任何一種測試試劑中，因此嵌合鼠的健康是毒性的指示劑。
抗體在一個實施方案中，本發明描述了可與變性的膠原蛋白結合但與天然形式膠原蛋白結合親和力顯著下降的抗體形式的變性膠原蛋白的拮抗劑。抗體拮抗劑也能抑制血管發生。本發明也描述了生產此抗體的細胞系，生產細胞系的方法和生產單克隆抗體的方法。
本發明的抗體可為單克隆或多克隆抗體。在一個實施方案中，所使用的抗體為單克隆抗體。本發明的單克隆抗體包含與分離出的變性的膠原蛋白發生免疫反應但與天然形式膠原蛋白免疫反應顯著降低的抗體分子。在一個實施方案中，本發明的一種抗體識別變性的I型膠原蛋白，其親和力是其與天然形式膠原蛋白親和力的優選至少3倍，較優選至少5倍，最好至少10倍。本發明的一種抗體也可優選結合至變性的IV型膠原蛋白，但其與天然IV型膠原蛋白的親和力顯著下降。本發明的抗體也可與I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白結合，但其與天然形式的I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白的親和力顯著下降。
優選的優先結合至變性的膠原蛋白的單克隆抗體包括具有HUI77、HUIV26和XL313單抗免疫反應特性的單克隆抗體。
可以根據本領域熟練技術人員所熟知的方法生產本發明的抗體拮抗劑。例如，可用變性的膠原蛋白或其片段免疫動物。然後從所產生的抗體中選擇與變性的蛋白水解的膠原蛋白結合但與同一天然形式的膠原蛋白親和力顯著下降的抗體。例如，可以通過「減法免疫」來生產抗體(見例如Brooks，P.C.等(1993)，細胞生物學期刊，1221351-1359)。
不同語法形式的「抗體或抗體分子」這個術語在此用做集合名詞，指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子免疫學活性的部分的群體，即含有免疫結合位點或抗原互補位的分子。
「抗體結合位點」是由重鏈和輕鏈可變區和高變區所組成的特異性結合抗原的一個抗體分子的結構部分。
本發明所舉例使用的抗體為完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和一個免疫球蛋白分子含有抗原互補位的那些部分，包括在本領域熟知的Fab，Fab』，F(ab』)2和F(v)，也指抗體片段。
在本發明的另一個實施方案中，本發明設想一個來自本發明單克隆抗體的含有一個Fab片段的截短的免疫球蛋白分子。缺少Fc受體的Fab片段是可溶的，並且在血清半衰期中具有治療價值，可溶性Fab片段可用於診斷。可溶性Fab片段的製備在免疫學領域是普遍熟知的並且可以通過許多方法完成。
例如，抗體的Fab和F(ab』)2部分(片段)可以通過眾所周知的方法用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解基本完整的抗體而製備。見例如授予Theofilopolous和Dixon的美國專利No.4342566。Fab』抗體部分也是眾所周知的，可以從F(ab』)2部分製備，先用巰基乙醇減少連接在兩條重鏈部分的二硫鍵，然後用試劑如碘乙醯胺對產物蛋白硫醇鹼基化。優選含有完整免疫球蛋白分子的抗體，並在此做舉例說明。
不同語法形式的「單克隆抗體」這個短語指只含有一個物種的抗體結合位點並且能夠與某一個特定表位發生免疫反應的抗體分子群。因此，一個單克隆抗體可能包含具有很多抗體結合位點的抗體分子，每一位點對不同表位是免疫特異性的，如雙特異性抗體。
單克隆抗體典型地由單細胞克隆所產生的抗體組成，此單細胞克隆稱做雜交瘤，僅分泌(產生)一種類型的抗體分子。雜交瘤由抗體生成細胞和骨髓瘤細胞或其它自身永生化的細胞系融合而成。這些抗體的製備首先由Kohler和Milstein所描述，自然256495-497(1996)，此描述引入本文做參考。在由CRC公司1987年出版的Zola所著的單克隆抗體技術手冊一書中描述了其它方法。可以篩選用此方法製備的雜交瘤細胞上清以尋找可與變性的膠原蛋白發生免疫反應的抗體分子。
簡言之，為了構成生產單克隆抗體組合物的雜交瘤，就要將骨髓瘤或其它自身永生化的細胞系與來自用變性的膠原蛋白超免疫的哺乳動物脾臟的淋巴細胞相融合。
用於製備雜交瘤的骨髓瘤優選與淋巴細胞來自同一物種。典型的是，129G1X.sup.+品系小鼠是優選的哺乳動物。本發明所使用的合適的小鼠骨髓瘤包括次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷敏感(HAT)的細胞系P3X63-Ag8.653和Sp2/0-Ag14，位於Rockville的美國典型培養物集藏中心有上述細胞，其說明分別為CRL1580和CRL1581。
具有代表性的是使用聚乙二醇(PEG)1500脾淋巴細胞與骨髓瘤的融合。融合的雜交瘤是根據它們對選擇生長培養基如HAT(次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷)培養基的敏感性而挑選出來的。生產本發明單克隆抗體的雜交瘤是使用在實施例中所描述的酶聯免疫吸附分析(ELISA)鑑別的。
本發明的單克隆抗體也可以通過起始由營養培養基構成的含有能夠分泌具有合適的特異性的抗體分子的雜交瘤的單克隆雜交瘤培養而產生。此培養物在合適的條件下培養足夠時間以使雜交瘤將抗體分子分泌到培養基中。然後收集含有抗體的培養基。然後通過眾所周知的技術進一步分離抗體分子。
用於製備這些組合物的培養基是本領域眾所周知的，並且商業上有產品出售，包括合成培養基、近親交配小鼠及其類似物。一種合成培養基的例子是含有4.5克/升葡萄糖、20nM穀氨醯胺和20％胎牛血清的Dulbecco’s基本培養基(DMEM；Dulbecco等，病毒學，8396，1959)。近親交配小鼠的例子是Balb/c小鼠。
生產單克隆抗體、雜交瘤細胞或雜交瘤細胞培養物的其它方法也是眾所周知的。例如，見由Sastry等(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci，美國，865728-5732；以及Huse等(1989)自然，2461275-1281中所描述的從免疫學所有組成成分中分離單克隆抗體的方法。
本發明也涉及雜交瘤細胞以及含有生產本發明單克隆抗體的雜交瘤細胞的培養物。特別優選分泌HUI77、HUIV26和XL313單克隆抗體的雜交瘤細胞。
在一個實施方案中，本發明也涉及具有HUI77、HUIV26和XL313單克隆抗體免疫反應性的一種單克隆抗體。
通過確定是否前者阻止後者與預先選定的靶分子結合從而確定是否一種單克隆抗體具有與本發明的單克隆抗體相當的特異性(免疫反應特性)是可能的。如果待測單克隆抗體與本發明的單克隆抗體競爭結合，如同在一個標準的競爭分析中表現出的本發明的單克隆抗體與固相中靶分子結合的降低。因此很可能這兩種單克隆抗體與同一表位或緊密相關的表位結合。
另外一個確定一種單克隆抗體是否具有本發明單克隆抗體特異性的方法是確定待測單克隆抗體CDR區的胺基酸殘基序列。CDR區具有相同的或功能上相當的胺基酸殘基序列的抗體分子也具有同樣的結合特異性。對多肽測序的方法是本領域眾所周知的，但這並不表明具有明顯不同的CDR區的抗體不能與同一表位結合。
抗體的免疫反應特異性、其與靶分子的結合能力以及抗體與表位的親和性都是通過與抗體發生免疫反應的表位而確定的。表位特異性至少部分由抗體免疫球蛋白分子的重鏈可變區的胺基酸殘基序列確定，部分由輕鏈可變區的胺基酸殘基序列確定。
「具有結合特異性」這一術語的應用指等效單克隆抗體表現出相同或相似的免疫反應(結合)特性並且與預先選定的靶表位競爭結合。
人源化單克隆抗體比鼠單克隆抗體更具有優勢，特別是它們可被用於人體治療。更為獨特的是，人抗體不像外源抗原那樣很快被循環所清除，並且不用與外源抗原和外源抗體同樣的方式激活免疫系統。製備人源化單克隆抗體的方法是本領域普遍眾所周知的，並且隨時可用於本發明的抗體之中。
因此，在一個實施方案中，本發明考慮到了本發明的一種單克隆抗體通過嫁接引入人免疫系統的成分並且基本不改變這種抗體結合抗原的能力而被人源化。
本發明的抗體也可以是完全的人抗體，例如那些從展示人單鏈或雙鏈抗體的抗體噬菌體展示文庫中挑選出來的抗體，Haard，H.J.等(1999)，生物化學期刊，27418218-30和Winter，G.等(1994)，免疫學年度評論，12433-55。
多肽變性的膠原蛋白的拮抗劑也可以是多肽或肽。多肽這個術語指相鄰胺基酸殘基的α-氨基和羧基通過肽鍵相連的3個以上的胺基酸序列。肽這個術語在本文中指如在多肽中兩個或更多彼此連接的線性系列。
在一個實施方案中，本發明考慮到了多肽形式的變性的膠原蛋白拮抗劑。變性的膠原蛋白多肽形式的拮抗劑可以是能與變性的膠原蛋白結合，但與天然形式膠原蛋白結合親和力顯著下降的任何肽或多肽。
具有變性的膠原蛋白選擇性的優選的變性膠原蛋白拮抗劑多肽可以通過典型的結合抑制分析如在實施例中描述的ELISA分析而被鑑別。
本領域熟練技術人員可以使用許多已知的技術生產肽和多肽拮抗劑。例如，雙雜交系統(例Fields，S.(1989)，自然，340245-6)使用膠原蛋白的一個片段作為從與膠原蛋白結合的文庫中選擇蛋白質拮抗劑的「誘餌」。潛在的拮抗劑庫可以來自如cDNA文庫。在另外一個實施方案中，潛在的拮抗劑是已知的膠原蛋白結合蛋白的突變體。這些蛋白質被隨機誘變、基因重排或使用其它可以技術以產生序列多樣性。
本發明的肽和多肽拮抗劑也可以通過分子進化技術生產。蛋白質庫可以通過誘變、基因重排或使用其它可以技術以產生分子多樣性。代表多種突變體的蛋白質庫可以通過它們與變性的膠原蛋白結合的能力被選擇出來。例如通過將這些蛋白質庫經過一個已經吸附有變性膠原蛋白的固相基質。用梯度鹽溶液洗脫可以得到純化的與變性的膠原蛋白具有親和力的突變體。陰性選擇步驟也包括在其中，這樣的蛋白質庫經過一個已經吸附有天然膠原蛋白的固相基質。濾液含有蛋白質庫中與天然形式膠原蛋白結合親和力下降的突變體。
本發明的肽和多肽拮抗劑也可以通過噬菌體展示技術生產。隨機的肽或蛋白質可以作為噬菌體衣殼蛋白的融合蛋白表達在噬菌粒的顆粒表面。單價噬菌體展示技術已經很普遍(見例如Lowman，H.B.等(1991)，生物化學，3010832-8)。將表達隨機多肽或蛋白質文庫的噬菌體經過一個已經吸附有天然膠原蛋白分子的固相基質。改變溶液條件或對於一個合適設計的構建物來說通過蛋白水解裂解噬菌體衣殼蛋白與隨機肽或蛋白質文庫連接的接頭區將結合的噬菌體從固相基質中分離出來。對分離出的噬菌體測序以確定所選擇的拮抗劑的均一性。
在另外一個實施方案中，本文顯示胺基酸序列的多肽包括多肽的類似物、片段或化學衍生物，只要此多肽是變性的膠原蛋白而不是天然膠原蛋白的拮抗劑。因此，現有的多肽可以經受各種對其應用提供某些優勢的改變、替換、插入和刪除。從這一點上來說，本發明的變性膠原蛋白拮抗劑多肽對應於，而不是等同於，一個已經存在一個或多個改變但仍然在下面所述的一種或多種分析中保持其作為一種變性膠原蛋白拮抗劑功能的複述的肽序列。
因此，多肽可以是任何一種肽衍生物形式的多肽，包括醯胺、與蛋白質結合、環化肽、聚合肽、類似物、片段、化學修飾的肽以及類似的衍生物。
其它拮抗劑本發明的拮抗劑也可以是小的有機分子，如那些天然產物，或者那些通過傳統的有機合成或組合有機合成技術合成的化合物。可以利用如上所述的柱結合技術來檢測化合物與變性的膠原蛋白結合的能力。利用一個類似的柱結合技術，與天然形式膠原蛋白結合親和力降低的化合物也可以被選擇出來。
本發明的拮抗劑也可以是非肽化合物。合適的非肽化合物包括例如寡核苷酸。在本文中所用的寡核苷酸指任何含有嘌呤、嘧啶和其它含有芳香族鹼基的雜聚物。如同糖(如2』鹼基化核糖)和骨架修飾(例如，硫代磷酸寡核苷酸)一樣，DNA和RNA寡核苷酸適於本發明應用。寡核苷酸可能包括普遍發現的嘌呤和嘧啶鹼基如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，以及在雜環環部分(如7』-deazaguanine)或環外位置受到修飾的鹼基。寡核苷酸也包括也具有芳香族鹼基但結構不同的雜聚物，包括聚胺核酸以及類似物。
本領域熟練技術人員可以使用許多已知的技術生產本發明的一種寡核苷酸類似物。在一個實施方案中，生產出了含有許多序列的寡核苷酸庫。例如可以在延伸階段使用單聚物的混合物通過固相合成技術生產寡核苷酸庫。將含有寡核苷酸庫的溶液經過已經吸附有變性的膠原蛋白及其片段的固相基質從而對寡核苷酸庫進行分類。庫內與變性的膠原蛋白結合的序列停留在固相基質上。用不同鹽濃度或pH值的溶液將這些序列洗脫下來。選擇出的序列經歷再次選擇步驟。選擇出的庫經過已經吸附有天然的膠原蛋白的第二固相基質。那些與天然膠原蛋白結合的序列停留在柱中。此庫可被擴增，並且如果需要的話可被誘變，並且重複此過程直至此庫顯示出本發明拮抗劑的特性。通常在將上述序列克隆入宿主如大腸桿菌之後對寡核苷酸庫中的成員進行測序來鑑別每一種拮抗劑。
疾病治療本發明普遍涉及發現某些表位連接至變性的膠原蛋白而不是天然的膠原蛋白能夠抑制血管發生。因為血管發生在一系列疾病進程中的作用，所以此發現非常重要。通過抑制血管發生，人們可以幹預疾病、減緩症狀和在某些情況下治癒疾病。
當新血管的生長是疾病相關的病理原因或有助於疾病相關的病理時，抑制血管發生將減輕疾病的危害效應。例如銀屑病、風溼性關節炎、糖尿病視網膜病、炎症疾病、再狹窄、斑點退化以及類似疾病。在需要新血管生長以支持受損組織生長的地方，抑制血管發生將減少對受損組織的血液供應，並且因此在血液供應需求的基礎上有助於組織物質的減少。例如包括腫瘤的生長，在腫瘤生長中腫瘤要超過幾毫米厚度並且建立實體瘤轉移新血管發生是持續需要的。
本發明的方法是部分有效的，這是因為治療是一個對血管發生高度選擇的過程，而不是其它生物學過程。正如在實施例中所示的，只有新血管的生長受到變性膠原蛋白拮抗劑的抑制，因此治療方法對成熟的血管沒有什麼不利影響。也正如在實施例中所示的，拮抗劑與腫瘤中的生血管位點結合，而不是與正常的周圍組織結合。
僅僅連接變性的膠原蛋白就可以有效抑制血管發生這一發現使得發展具有潛在的高特異性、相對低毒性的治療性組合物成為可能。因此，儘管本發明包括可以連接一個或多個變性的膠原蛋白的以抗體為基礎的拮抗劑的應用，人們仍然可以設計其它可與變性的膠原蛋白而不是天然的膠原蛋白特異性連接的拮抗劑。
在本發明的發現之前，人們並不知道可以通過應用識別膠原蛋白，即蛋白水解或變性的膠原蛋白而不是天然形式的同一膠原蛋白，隱蔽表位的試劑在體內抑制血管發生以及其它任何依賴於血管發生的過程。
抑制血管發生的方法本發明提供了抑制組織中血管發生的方法，和籍此抑制依賴於血管發生的組織的方法。通常來說，此方法包含給予組織一種含有血管發生抑制劑量的變性膠原蛋白拮抗劑的組合物。
如前所述，血管發生包括一系列涉及組織中新血管形成的過程包括「抽芽」、血管發生或血管擴張，所有上述血管發生過程涉及血管中膠原蛋白細胞外基質的破壞。但是創傷癒合、黃體形成和胚胎形成例外，據認為主要的血管發生過程與疾病進程相關，並且因此現有的治療方法對疾病是有選擇的。
有許多疾病其中血管發生被認為非常重要，這些疾病被稱為生血管疾病，其中包括但不限於炎症紊亂例如免疫和非免疫炎症、慢性風溼性關節炎和銀屑病，與不適合或不適宜血管侵入相關的紊亂如糖尿病視網膜病、新血管性青光眼、再狹窄、動脈粥樣硬化和骨質疏鬆中的毛細血管增生以及癌症相關的紊亂如實體瘤、轉移實體瘤、血管纖維瘤、晶狀體後纖維組織形成、血管瘤、卡波濟氏肉瘤和需要新血管形成以支持腫瘤生長的類似癌症。其它合適的腫瘤包括黑素瘤、癌、肉瘤、纖維瘤、神經膠質瘤和星形細胞瘤。
因此，抑制患病組織中血管發生的方法減緩了疾病症狀，並且根據疾病的情況可能有助於治癒疾病。在一個實施方案中，本發明構想抑制組織中血管發生。可以通過各種不同的方法評價組織中血管發生的程度以及由本方法所達到的抑制程度，如實施例中所描述的通過免疫組化方法檢測蛋白水解的或變性的膠原蛋白免疫反應陽性的未成熟或新生血管結構。
正如在本文中所描述的，任何一種組織或由有機組織構成的器官包括皮膚、肌肉、腸、結締組織、關節、骨和類似在生血管刺激下能被血管侵入的組織都能在患病條件下支持血管發生。組織，正如本文中所用的，也包含所有體液、分泌物以及類似物如血清、血液、腦脊髓液、胞漿、尿液、滑液、玻璃體。
因此，在一個相關的實施方案中，待治療的組織是炎性組織，並且待抑制的血管發生是炎性組織中新生成的血管。本發明的方法構想抑制關節炎組織中的血管發生，如患有慢性風溼性關節炎的病人，免疫或非免疫炎性組織、銀屑病組織或類似組織。
在本發明的許多實施方案中治療的患者優選是人，儘管我們要明白本發明的原理表明本發明對所有的哺乳動物都是有效的，這其中也包括術語「人」。在本文中，哺乳動物被認為包括任何需要對疾病相關的血管發生進行治療的動物物種，特別是農用動物物種和家畜。例如這樣的患者可以是豬、牛、馬、山羊、綿羊、騾子、驢、狗、貓、兔子、小鼠和大鼠。
在另一個相關的實施方案中，待治療的組織是糖尿病視網膜病、斑點惡化、新血管性青光眼患者的視網膜組織，並且待抑制的血管發生為視網膜組織中新生成血管。
在另外一個相關的實施方案中，待治療的組織是患有實體瘤、轉移瘤、皮膚癌、乳腺癌、血管纖維瘤、血管瘤以及類似癌症的患者的腫瘤組織，待抑制的血管發生為腫瘤組織中新生成血管。可被本發明的方法抑制的典型的實體瘤組織包括肺、胰腺、乳房、結腸、喉、子宮組織、卡波濟氏肉瘤以及類似組織。在實施例中舉例說明了腫瘤組織血管發生及其抑制。
抑制腫瘤組織血管發生是特別優選的實施方案，這是因為新血管發生在腫瘤生長中起重要作用。如果腫瘤組織中無新血管發生，腫瘤組織就會得不到所需要的營養，從而生長緩慢甚至停止生長、衰退，最終壞死導致腫瘤死亡。
換句話說，本發明根據現有的方法提供了通過抑制腫瘤血管發生而抑制腫瘤新血管發生的方法。相似地，本發明提供了實施抑制血管發生從而抑制腫瘤生長的方法。
本方法對抗轉移瘤的形成特別有效，這是因為(1)它們的形成需要原發腫瘤的新血管形成以使轉移的癌細胞能夠退出原發腫瘤；(2)它們在次發位點的建立也需要新血管發生以支持轉移瘤的生長。
在一個相關的實施方案中，本發明設想將此方法與其它治療方法如傳統的化療組合使用用於抗實體瘤或用於控制轉移瘤的建立。血管發生抑制劑通常在化療中或化療後應用，儘管優選在化療一段時間後當腫瘤組織通過誘導血管發生以恢復對腫瘤組織的血液和營養供應對毒性攻擊發生反應時抑制血管發生。此外，優選在手術切除實體瘤後為預防癌轉移而實施血管發生抑制方法。
目前為止，本發明方法應用於抑制腫瘤新血管形成，這些方法也可應用於抑制腫瘤組織生長、抑制轉移瘤的形成和抑制已經建立的腫瘤的惡化。
再狹窄是一個平滑肌細胞(SMC)在防礙了血管成形的經皮透明冠狀血管成形術位點遷移和增生的過程。再狹窄過程中血管相關的SMCs的遷移和增殖與受到本方法抑制的血管發生過程相關。因此，本發明也根據現有的方法設想在血管成形術後的病人體內通過抑制血管發生相關的過程而抑制在狹窄。為了抑制再狹窄，通常在實施血管成形術2到28天後給予變性的膠原蛋白拮抗劑，最典型的是在實施血管成形術14天後給予變性的膠原蛋白拮抗劑。
用於抑制組織中血管發生，並且因此也實施此方法用於治療血管發生相關疾病的方法包含將含有能與變性的蛋白水解的膠原蛋白而不是天然形式的膠原蛋白結合的治療學有效劑量的變性膠原蛋白拮抗劑的組合物與正發生血管發生的組織或正處於血管發生危險中的組織相接觸。因此，此方法包含給予病人生理學可接受的治療學上有效劑量的含有一種本發明變性膠原蛋白拮抗劑的組合物。
所給予的變性膠原蛋白拮抗劑的劑量範圍取決於拮抗劑的形式以及其作用能力，正如將要在本文中進一步描述的，並且劑量應該足夠大以產生我們所期望的效應，血管發生和由血管發生介導的疾病症狀被緩解。但是劑量不能太大以防止引起副反應，如粘滯性過高症狀、肺水腫、充血性心臟病以及類似反應。通常來說，劑量隨年齡、狀況、性別、患者的患病程度而變化，並且本領域熟練技術人員可確定劑量大小。在有併發症的情況下劑量可根據個人醫生的建議而調整。
治療學有效劑量是變性膠原蛋白拮抗劑在待治療組織中足以產生可檢測到的血管發生受到抑制的劑量。血管發生的抑制可以通過原位免疫組化方法，正如本文中所描述的，或本領域熟練技術人員已知的其它方法來測定。
變性膠原蛋白拮抗劑的作用能力可以通過一系列的方法包括在CAM分析中、在體內兔眼分析中、在體內嵌合鼠人模型分析以及類似的分析中抑制血管發生來測定。
本發明單克隆抗體形式的變性膠原蛋白拮抗劑的治療學有效劑量是指當給予生理學耐受的組合物時足以在血漿中獲得濃度為0.1ug/ml至100ug/ml，優選1ug/ml到5ug/ml，通常是5ug/ml的劑量。換一種說法，每天給予一次或多次劑量注射一天或幾天時，劑量可以從0.1mg/kg到300mg/kg，優選0.2mg/kg到200mg/kg，最優選0.5mg/kg到20mg/kg之間變化。
當拮抗劑採用單克隆抗體片段形式時，可以很容易地在相對於總抗體重量的片段重量的基礎上對劑量進行調整。用摩爾表示的優選的胞漿濃度是從2微摩爾(uM)到大約5毫摩爾(mM)，並且優選大約100微摩爾到1毫摩爾的抗體拮抗劑。
本發明多肽形式或小分子形式的變性膠原蛋白拮抗劑的治療學有效劑量是指多肽的劑量，當給予生理學耐受的組合物時足以在血漿中獲得從大約0.1ug/ml至大約200ug/ml，優選從大約1ug/ml到大約150ug/ml的濃度。根據每摩爾多肽大約等於500克的重量，優選的優選的胞漿濃度用摩爾數表示是從2微摩爾(uM)到大約5毫摩爾(mM)，並且優選大約100微摩爾到1毫摩爾的抗體拮抗劑。換一種說法，每天給予一次或多次劑量注射一天或幾天時，每公斤體重的劑量可以從0.1mg/kg到300mg/kg，優選0.2mg/kg到200mg/kg，最優選0.5mg/kg到20mg/kg之間變化。
本發明的單克隆抗體或多肽可以經腸道外途徑注射或隨時間逐漸灌輸。儘管可以通過全身給予的方法到達體內的待治療組織，但最經常的治療方法為靜脈內注射治療性組合物，當靶組織可能含有靶分子時，可以考慮其它的組織和運送途徑。因此，包括單克隆抗體、多肽及其衍生物的拮抗劑可以通過靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、腔內、經皮、局部、眼內、腫瘤內、鼻內途徑給予並且能通過蠕動的方法運送。
本發明含有單克隆抗體或多肽的治療性組合物通常採用靜脈內注射的方法，例如注射一個單位的劑量。「單位劑量」這個術語當用於本發明治療性組合物時是指物理學上分立的單位作為物體的單一劑量，每個單位含有預先確定數量的活性物質與稀釋液即載體或運送工具一起以產生期望的治療效應。
正如在實施例中所顯示的一個優選的實施方案中，靜脈內注射單一劑量的變性膠原蛋白的拮抗劑。
組合物是以一種與劑量配方相容的方式注射的，並且注射治療學有效劑量。注射劑量和時間取決於待治療的病人、病人的免疫系統利用活性成分的能力以及所期望的治療效果如何。需要注射的活性成分的精確的劑量取決實踐者的判斷並且每個人都有所不同。但是，本文中說明了全身應用的合適的劑量範圍，並且此劑量範圍取決於注射途徑。合適的注射策略也是不同的，但以首次注射間隔一或數小時後再次注射或其它給藥方法為典型。另外，持續靜脈內灌輸足以維持血液中的濃度範圍，特別用於體內治療。
正如本實施例所顯示的，在開始接觸拮抗劑7天後血管發生受到抑制並且腫瘤退化。附加的或延長的暴露於拮抗劑的時間優選7天到6周，最好是14到28天。
治療性組合物本發明設想治療性組合物可用於實施本文所描述的治療方法。本發明的治療性組合物包含與一個生理學耐受的載體一起的變性或蛋白水解的膠原蛋白的拮抗劑，正如本文所描述的拮抗劑溶於或分散於其中作為一種活性成分。在一個優選的實施方案中，當為了治療的目的將變性膠原蛋白的拮抗劑組合物被注射入哺乳動物或患病的人體內時，它是沒有免疫原性的。
如同早本文中所用的，「藥物學上認可的」、「生理學上耐受的」術語及其變化的語法形式，當它們是指組合物、載體、稀釋液和試劑時，可以互換使用並且表明此物質可被注射給哺乳動物。
含有溶於或分散於其中的活性成分的藥物學組合物的製備是本領域熟練技術人員眾所周知的，並且不能根據配方而受到限制。典型的是這些組合物被製備為可注射的液體溶液或懸液的形式，但是也可以製備適於溶液或懸液的使用前的固體形式的製備物。製備物也可被乳化。
活性成分可以適於本文所描述的治療方法的劑量與藥物學上認可的並且與活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑有例如水、鹽溶液、右旋葡萄糖、甘油、乙醇以及類似物及其組合形式。此外，如果需要的話，組合物可以含有少量的輔助物質如加溼劑或乳化劑、pH緩衝劑以及類似的能夠增加活性成分有效性的物質。
本發明的治療性組合物可包括藥物學上認可的鹽成分。藥物學上認可的鹽成分包括由無機酸組成的加酸鹽(和多肽的自由氨基基團組成)，例如，鹽酸或磷酸，或如醋酸、酒石酸、苦杏仁酸以及類似的有機酸。和自由的羧基基團組成的鹽也可以衍生自無機鹽基例如鈉、鉀、銨、鈣或氧化鐵，和如異丙基胺、三甲胺、2-巰基乙醇、組胺、普魯卡因以及類似的有機鹽基。特別優選的鹽是TFA和HCL。
生理學耐受的載體是本領域眾所周知的。液相載體的例子如無菌的水溶液除了活性成分和水以外不含任何物質，或者在生理pH值、生理鹽溶液或二者時含有一種緩衝劑如磷酸鈉，例如磷酸緩衝的鹽溶液。更進一步，液相載體可含有一種以上緩衝鹽，和例如氯化鈉和氯化鉀的鹽以及右旋葡萄糖、聚乙二醇和其它溶質。
液體組合物也可以含有除了水以外的液相溶劑。這些另外的液相溶劑的例子有甘油、植物油如棉籽油和水油乳劑。
含有本發明血管發生抑制劑量的變性膠原蛋白拮抗劑的治療性組合物，典型地配製成拮抗劑的重量百分比至少佔總治療性組合物重量的0.1％以上。重量百分比是抑制劑重量與組合物總重量的百分比。因此，例如0.1重量百分比即每100克總組合物中有0.1克抑制劑。
抗體可與細胞毒素、細胞毒性試劑構成結合物以運送到正經歷血管發生的腫瘤組織或其它組織中。可以與溶細胞素或外毒素形成這樣的結合物，例如白喉毒素A，或假單胞菌外毒素及其片段。細胞毒性試劑也可以是用放射性同位素標記的以將毒性劑量的放射活性運送給生血管組織。
也可以應用本發明的拮抗劑將酶運送到靶組織，其中此酶能夠將前藥物轉變成為藥物的活性形式。即抗體引導酶激活的前藥物治療(ADEPT)(見例如Syrigos，K.N.(1999)抗腫瘤研究，19605-13)。簡言之，本發明的拮抗劑與能夠將非毒性或無活性的前藥物轉變成為毒性或活性的藥物的酶如內醯胺酶、蛋白酶或酯酶結合。因為本發明的拮抗劑定位至血管發生的位點，並且特別是定位至腫瘤或轉移瘤位點，所以毒性藥物可以定向作用於靶組織。
檢測方法本發明的拮抗劑也適用於檢測組織中的血管發生。
例如，當拮抗劑為抗體時，拮抗劑可被用於免疫組化技術體外對組織染色。例如在受體結合技術，分子生物學中的方法，106，M.Keen編，Humana出版社，1999；Brooks等(1998)細胞，92391-400；Brooks等(1996)細胞，85683-693和Brooks等(1993)細胞生物學期刊，1221351-1359中描述了免疫學技術如免疫染色和ELISA。
本發明的拮抗劑，一旦與靶組織結合就能通過直接或間接方法檢測出來。當拮抗劑含有一個可檢測到的標記如螢光染料、放射性標記、順磁性重金屬或診斷染料時可通過直接方法檢測到。
另外，也可以通過第二次交互作用而檢測。例如，一種識別拮抗劑的帶有可檢測標記的抗體被用於使拮抗劑的位置顯現出來。例如，如果拮抗劑是小鼠來源的單克隆抗體時，可以使用合適標記的山羊抗小鼠的抗體。例如，實施例中描述了過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體的應用。本領域熟練技術人員能夠確定各種拮抗劑的合適二抗。
對於體內檢測，優選應用一種帶有可檢測標記的拮抗劑。標記的拮抗劑通過靜脈內、肌肉內等途徑被注射到患者體內，適於在病人體內檢測的標記是特別優選的。例如，順磁性標記可以通過磁共振成像而檢測出來。放射性標記的拮抗劑也可以被檢測出來。
實施例實施例1HUI77單克隆抗體本實施例描述了一種變性膠原蛋白特異性單克隆抗體HUI77的生產。
HUI77單克隆抗體是通過一種名為減法免疫的免疫學技術而生產和分離出來的。
減法免疫技術使得人們能夠實驗操縱小鼠的免疫系統以選擇性增強在一個普遍高抗原性混合物內針對稀有或低豐度表位的免疫應答。簡言之，BALB/c雌鼠腹腔內注射天然的三螺旋形式的I型或IV型膠原蛋白。注射三螺旋形式膠原蛋白24和48小時以後，給小鼠注射耐受試劑環磷醯胺以殺死產生針對天然三螺旋形式I型和IV型膠原蛋白普通優勢表位的抗體的活化的B細胞。注射耐受試劑以後，給小鼠注射熱變性的I型或IV型膠原蛋白以刺激針對熱變性所暴露出來的表位發生免疫應答。膠原蛋白是煮沸15分鐘而變性的。間隔3周注射熱變性的I型和IV型膠原蛋白，共注射4至5次。檢測每隻小鼠血清與天然的三螺旋形式和變性的膠原蛋白的免疫反應性。與三螺旋形式膠原蛋白相比，對變性的膠原蛋白顯示最高滴度反應性的小鼠被用於生產雜交瘤。所選擇的小鼠的脾細胞使用標準技術與骨髓瘤細胞融合。檢測每個雜交瘤克隆產生的抗體是針對三螺旋形式I型和IV型膠原蛋白還是針對變性的I型和IV型膠原蛋白。與天然三螺旋形式I型和IV型膠原蛋白相比，對變性的I型和IV型膠原蛋白顯示出高反應性的抗體生成雜交瘤克隆被選擇出來。通過標準技術純化單克隆抗體。
如圖1所示，HUI77單克隆抗體特異性識別變性的I型和IV型膠原蛋白，但與天然的三螺旋形式的I型和IV型膠原蛋白的結合親和力顯著下降。尤其特別的是，通過ELISA方法檢測出HUI77單克隆抗體與變性的I型膠原蛋白結合親和力明顯要比其與天然的I型膠原蛋白的結合親和力高10倍以上。此外，HUI77單克隆抗體基本上不與其它基質成分如層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白或纖維蛋白原結合，因此表明其特異性識別I型和IV型膠原蛋白的隱蔽表位。
HUI77單克隆抗體對其它變性的膠原蛋白也是特異的，但與天然形式的這些膠原蛋白的結合親和力顯著下降。如圖2所示，通過ELISA方法檢測出HUI77單克隆抗體與變性的III、IV、V型膠原蛋白結合的親和力是其與天然形式的這些膠原蛋白結合親和力的大約7倍，大約8倍和大約10倍以上。
實施例2實體瘤的檢測本實施例顯示本發明的拮抗劑可被用於檢測腫瘤組織中變性的膠原蛋白。實施例1所描述的HUI77單克隆抗體被用於對正常組織和腫瘤組織進行間接免疫染色。如圖3所示，使用HUI77單克隆抗體對人黑素瘤腫瘤活檢組織以及生長在人全厚皮膚上的M21黑素瘤進行間接免疫螢光分析表明在體內變性形式的膠原蛋白的生成與人黑素瘤相關。更重要的是，在無腫瘤的正常組織中幾乎未檢測到變性的膠原蛋白，表明變性的膠原蛋白可能是實體瘤的特異性標誌。
實施例3檢測人腫瘤中的血管發生本實施例表明本發明的拮抗劑可被用於檢測人腫瘤中的血管發生。
如圖4所示，對人黑素瘤腫瘤活檢組織的間接免疫螢光分析顯示了在人腫瘤相關的血管周圍的變性形式的膠原蛋白在體內的產生和定位。更重要的是，在無腫瘤的正常血管周圍用HUI77單克隆抗體幾乎未檢測到變性的膠原蛋白，這表明變性的膠原蛋白可能是生血管腫瘤相關的血管的特異性標誌。
實施例4
抑制內皮細胞粘附和遷移的拮抗劑本實施例表明本發明的某些拮抗劑能夠抑制人內皮細胞粘附至變性的膠原蛋白上。
與對照抗體相比，HUI77單克隆抗體顯示出能夠抑制大約40％的人內皮細胞粘附至I型膠原蛋白上的能力。這些發現，在圖5中進行了概括，表明HUI77單克隆抗體與I型膠原蛋白的一個至少部分涉及內皮細胞粘附至變性I型膠原蛋白的隱蔽表位結合。由於內皮細胞粘附過程被認為在腫瘤生長以及血管發生中起重要作用，這種功能阻斷抗體可能影響到體內腫瘤生長和血管發生。
如圖6所示，與未經處理或對照抗體相比，HUI77單克隆抗體顯示出能夠抑制大約80％的人內皮細胞遷移至I型膠原蛋白的能力。這些發現表明與I型膠原蛋白隱蔽表位結合的HUI77單克隆抗體在內皮細胞遷移至變性I型膠原蛋白過程中起重要作用，並且在惡性腫瘤細胞和生血管血管中均檢測到了變性的膠原蛋白，這種功能阻斷抗體可能對體內血管發生和腫瘤生長具有顯著影響。
實施例6利用HUI77單克隆抗體抑制血管發生本實施例表明本發明的拮抗劑能夠在雞胚CAM分析中有效抑制血管發生。
而且，與對照相比，系統給予HUI77單克隆抗體抑制由βFGF誘導的大約90％的血管發生(圖7和8)。通過在雞胚CAM分析中對血管枝點進行計數從而測量生血管指數(圖8)。更重要的是，在分析期間，沒有發現對雞胚具有毒副作用。而且此單克隆抗體對正常的人靜息血管幾乎沒有什麼影響。有可能應用較低濃度的單克隆抗體也會導致相似的效果。這些發現表明HUI77單克隆抗體是一種強效的抗血管發生物質，可能具有顯著的臨床應用價值。
實施例7
HUI77單克隆抗體抑制腫瘤生長本實施例表明本發明的拮抗劑能夠在體內有效抑制黑素瘤的生長。
與對照相比，系統給予HUI77單克隆抗體抑制大約53％的黑素瘤的生長，如圖9和10所示。更重要的是，在分析期間，沒有發現對雞胚具有毒副作用。而且此單克隆抗體對周圍組織幾乎沒有什麼影響。有可能應用較低濃度的單克隆抗體也會導致相似的效果。這些發現表明HUI77單克隆抗體是一種強效的抗腫瘤物質，可能具有顯著的臨床應用價值。
實施例8HUIV26單克隆抗體HUIV26單克隆抗體也是通過實施例1中所述名為減法免疫(S.I.)的免疫學技術而生產的。如圖11所示，HUIV26單克隆抗體特異性識別變性的IV型膠原蛋白但是並不與天然的三螺旋形式的I型IV型膠原蛋白結合。此外，HUIV26單克隆抗體不與其它基質成分如層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白或纖維蛋白原結合，因此表明其特異性識別IV型膠原蛋白的隱蔽表位。
如圖11B所示，HUIV26單克隆抗體特異性識別的IV型變性膠原蛋白的隱蔽表位在暴露至HUVEC條件培養基後顯示出來。24小時後檢測發現與HUIV26單克隆抗體的反應性增強。這表明這些內皮細胞分泌產生了一種能夠暴露由HUIV26單克隆抗體識別的IV型膠原蛋白的隱蔽表位的蛋白酶。由HUVEC所產生的能夠暴露IV型膠原蛋白的隱蔽表位的蛋白酶受到螯合劑EDTA的抑制(圖11B)。這表明一種金屬蛋白酶負責起始對IV型膠原蛋白中隱蔽表位的暴露。如圖12所示，金屬蛋白酶，MMP-2，與和HUIV26單克隆抗體發生反應的IV型膠原蛋白隱蔽表位共同定位至CAM組織的生血管位點。絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑蛋白酶肽，與HUVEC條件培養基孵育1小時後對暴露IV型膠原蛋白的隱蔽表位沒有什麼效果(圖11B)。在第6小時和第24小時，抑蛋白酶肽分別阻斷了在沒有蛋白酶抑制劑時所觀察到的反應性的40％和70％。這表明在稍微晚一點的時間點上，絲氨酸蛋白酶有助於暴露IV型膠原蛋白的隱蔽表位。
實施例9用HUIV26檢測血管發生和腫瘤本實施例表明一種拮抗劑可被用於檢測組織內的血管發生過程。
如圖12所示，對雞胚CAM組織的間接免疫螢光分析顯示了與βFGF或腫瘤誘導的生血管血管相關的變性的IV型膠原蛋白在體內的產生和定位。更重要的是，在無βFGF或腫瘤的正常組織中未檢測到變性的IV型膠原蛋白，這表明變性的IV型膠原蛋白在體內是生血管血管的特異性標誌。
如圖13所示，對人黑素瘤腫瘤活檢組織的間接免疫螢光分析顯示了在人腫瘤相關的血管周圍的變性形式的膠原蛋白在體內的產生和定位。更重要的是，在無腫瘤的正常血管周圍幾乎未檢測到變性的膠原蛋白，這表明變性的膠原蛋白可能是生血管腫瘤相關的血管的特異性標誌。
實施例10HUIV26單克隆抗體抑制細胞粘附和遷移本實施例表明單克隆抗體拮抗劑能夠抑制內皮細胞粘附和遷移。
與對照抗體相比(圖14)，HUIV26單克隆抗體顯示出能夠抑制大約70％的人內皮細胞粘附至變性的IV型膠原蛋白上的能力。這些發現表明HUIV26單克隆抗體與IV型膠原蛋白的一個至少部分涉及內皮細胞粘附至變性IV型膠原蛋白的隱蔽表位結合。考慮到IV型膠原蛋白的組織分布和內皮細胞粘附過程被認為在腫瘤生長以及血管發生中起重要作用這個事實，這種功能阻斷抗體可能顯著影響到體內腫瘤生長和血管發生。
與未經處理或對照抗體相比，HUIV26單克隆抗體顯示出能夠抑制大約70％的人內皮細胞遷移至變性的IV型膠原蛋白的能力。這些發現表明HUIV26單克隆抗體與I型膠原蛋白隱蔽表位的結合在內皮細胞遷移至變性IV型膠原蛋白過程中起重要作用。考慮到細胞遷移在腫瘤轉移和血管發生中起重要作用，並且在生血管血管中檢測到了變性的膠原蛋白，這種功能阻斷抗體可能對體內血管發生、腫瘤生長和轉移具有顯著影響。
實施例11系統給予HUIV26抑制血管發生如圖16和17所示，與對照相比，系統給予HUIV26單克隆抗體抑制由βFGF誘導的大約90％的血管發生。更重要的是，在分析期間，沒有發現對雞胚具有毒副作用。而且此單克隆抗體對正常的靜息血管幾乎沒有什麼影響。有可能應用較低濃度的單克隆抗體也會導致相似的效果。這些發現表明HUIV26單克隆抗體是一種強效的抗血管發生物質，可能具有顯著的臨床應用價值。
實施例12抑制腫瘤生長與對照相比，系統給予HUIV26單克隆抗體抑制大約80％的黑素瘤的生長(圖18)。更重要的是，在分析期間，沒有發現對雞胚具有毒副作用。而且此單克隆抗體對周圍組織幾乎沒有什麼影響。由於有可能應用較低濃度的單克隆抗體也會導致相似的效果，因此正在進行另外的實驗以確定IC50值。這些發現表明HUIV26單克隆抗體是一種強效的抗腫瘤物質，可能具有顯著的臨床應用價值。
系統給予HUIV26單克隆抗體在SCID小鼠中抑制黑素瘤生長。治療24小時之後，接受HUIV26單克隆抗體治療的小鼠的平均腫瘤體積要比用對照抗體或未經治療的小鼠的腫瘤體積低5％。
實施例13HUIV26的表位特異性本實施例表明HUIV26單克隆抗體不與變性的膠原蛋白內的RGD序列結合。
如圖22所示，HUIV26單克隆抗體不能和含有變性的IV型膠原蛋白肽的固定的RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)反應(表1)。研究發現6中不同的含有膠原蛋白肽的可溶性RGD都不能阻斷HUIV26單克隆抗體對固定的變性的IV型膠原蛋白的識別(圖22)。這些數據表明HUIV26單克隆抗體並不識別在IV型膠原蛋白中發現的RGD序列。
表1人IV型膠原蛋白的RGD功能區SEQ ID NO 胺基酸序列 在人IV型膠原蛋白中的位置1 C-PGSRGDTGP-Cα1(IV)鏈(594-602)2 C-SGPRGDPGL-Cα1(IV)鏈(914-922)3 C-KGSRGDPGT-Cα1(IV)鏈(965-973)4 C-KGARGDPGF-Cα2(IV)鏈(359-367)5 C-PGPRGDAGV-Cα2(IV)鏈(781-789)6 C-PGDRGDPGD-Cα2(IV)鏈(865-873)7 C-SGDRGDAGF-Cα2(IV)鏈(886-894)8 C-KGSRGDPGP-Cα2(IV)鏈(967-975)9 C-IGSRGDKGA-Cα2(IV)鏈(1066-1074)10C-PGERGDPGE-Cα2(IV)鏈(1245-1253)11C-PGFRGDEGP-Cα2(IV)鏈(1489-1497)實施例14XL313單克隆抗體XL313單克隆抗體是通過用合成肽免疫而生產的，合成肽的序列來自人I型膠原蛋白。之所以選擇此序列是因為其深埋在I型膠原蛋白的三維結構內。所使用的合成肽的11個胺基酸殘基序列如下SEQ ID NO 12CysGlnGlyProArgGlyAspLysGlyGluCys研究發現KGE(賴氨酸-甘氨酸-穀氨酸)對XL313單克隆抗體的識別非常重要。XL313單克隆抗體特異性地與SEQ ID NO1的肽結合，但是與KGE序列已經被突變的肽(序列如下)的結合親和力顯著下降SEQ ID NO 13CysGlnGlyProArgGlyAspAlaAlaAlaCysXL313單克隆抗體是與蛋白水解的/變性的I型膠原蛋白反應的高特異性抗體。更重要的是，XL313不與天然三螺旋形式的I型膠原蛋白反應。如圖27所示，XL313單克隆抗體識別人I型膠原蛋白的隱蔽功能區，但不識別其它類似的肽。這些數據表明XL313單克隆抗體可能是一種非常有用的用於在血管發生和腫瘤生長中評價由人膠原蛋白肽2確定的隱蔽膠原蛋白功能區的作用的試劑。如圖28所示，XL313單克隆抗體特異性識別人I型膠原蛋白的在天然三螺旋形成過程中並不暴露出來的的隱蔽功能區。而且，由於XL313單克隆抗體不與天然三螺旋形式的IV型膠原蛋白交叉反應，這種隱蔽區似乎是I型膠原蛋白特異性的。
實施例15XL313單克隆抗體抑制細胞粘附和遷移如圖23所示，孵育HUVECs5小時後使得其粘附至天然的I型膠原蛋白形成了一個匯合的單層。與此相反，粘附至變性的膠原蛋白的HUVECs開始遷移並且形態上重新形成索狀結構。這些數據表明深埋在人I型膠原蛋白三維結構中在天然三螺旋狀態下不可估價的隱蔽區可能在內皮細胞成形和索形成中起重要作用。
實施例16變性的膠原蛋白抑制細胞編程性死亡如圖24所示，與天然的I型膠原蛋白或懸浮的內皮細胞相比，人內皮細胞與蛋白水解的膠原蛋白的交互作用抑制了細胞編程性死亡。這些數據表明深埋在人I型膠原蛋白三維結構中在天然三螺旋狀態下不可估價的隱蔽區可能在內皮細胞存活中起重要作用。
實施例17XL313所識別的表位如圖25所示，似乎人膠原蛋白隱蔽肽2支持內皮細胞存活和索形成，而存在於人I型膠原蛋白中的相似的肽則無此效應。這些數據表明由肽2所確定的I型膠原蛋白隱蔽區可能在體內血管發生和腫瘤生長中起重要作用。
實施例18整合蛋白的作用如圖26所示，整合蛋白αvβ3似乎在介導細胞與所檢測的I型膠原蛋白的所有隱蔽肽區的相互作用中起重要作用。非常有趣的是，肽2也依賴於β1整合蛋白的相互作用。這些數據表明肽2通過2種不同的整合蛋白支持細胞相互作用。
實施例19XL313單克隆抗體抑制血管發生和腫瘤生長如圖29和30所示，與對照相比，系統給予XL313單克隆抗體抑制雞胚CAM模型中大約95％的血管發生。這些數據表明由XL313單克隆抗體所確定的I型膠原蛋白隱蔽區在血管發生中起重要作用。
如圖31所示，XL313單克隆抗體可以在體內抑制HT1080成纖維肉瘤的生長。這些數據表明由XL313單克隆抗體所確定的隱蔽區在調控體內腫瘤生長中起重要作用。
實施例20膠原蛋白的水解對腫瘤生長非常重要如圖32所示，在本實驗中應用了I型膠原蛋白的MMP裂解位點引入突變的轉基因小鼠，因為這些小鼠裂解它們的I型膠原蛋白的能力受到損害。更重要的是，與野生型對照小鼠相比，B16黑素瘤細胞在I型膠原蛋白水解受到損害的小鼠體內幾乎沒有形成腫瘤的能力。這些數據表明I型膠原蛋白的水解在體內腫瘤生長中起重要作用。
如同用B16黑素瘤細胞所顯示的結果，當注射入I型膠原蛋白水解能力也受到損害的Col a1 B6轉基因小鼠體內時，路易斯肺癌細胞也幾乎沒有形成腫瘤的能力，與此同時路易斯肺癌細胞在對照B6小鼠體內形成了大的快速生長的腫瘤(圖33)。更重要的是，特異性針對於I型膠原蛋白隱蔽區的並且只有在蛋白水解後才暴露出來XL313單克隆抗體抑制了大約80％的在野生型B6小鼠中生長的路易斯肺癌。這些發現表明體外蛋白水解暴露I型膠原蛋白的隱蔽區可能在腫瘤生長中起重要作用。而且，這些數據表明XL313單克隆抗體是一種體內血管發生和腫瘤生長的特異性抑制劑。
所有下列引用在本發明說明中的著作全部引入本文做參考。
還應理解的是前述本發明的描述僅是為了舉例說明和解釋，而非本發明僅僅局限於本文中的具體實施方式
。因此，本領域熟練技術人員可在本發明的精神內作出改變，本發明的範圍應由書限定。
權利要求
1.一種特異性結合一種或多種變性的膠原蛋白但與所述膠原蛋白的天然三螺旋形式結合的親和力顯著降低的拮抗劑。
2.如權利要求1的拮抗劑，其中所述降低的親和力比與所述變性的膠原蛋白結合的親和力低大約3倍。
3.如權利要求1的拮抗劑，其中所述降低的親和力比與所述變性的膠原蛋白結合的親和力低大約5倍。
4.如權利要求1的拮抗劑，其中所述降低的親和力比與所述變性的膠原蛋白結合的親和力低大約10倍。
5.如權利要求1的拮抗劑，其中所述的拮抗劑抑制血管發生。
6.如權利要求1的拮抗劑，其中所述的變性的膠原蛋白是變性的I型膠原蛋白、變性的II型膠原蛋白、變性的III型膠原蛋白、變性的IV型膠原蛋白或變性的V型膠原蛋白。
7.如權利要求6的拮抗劑，其中所述的變性的膠原蛋白是變性的I型膠原蛋白。
8.如權利要求6的拮抗劑，其中所述的變性的膠原蛋白是變性的I型膠原蛋白和變性的IV型膠原蛋白。
9.如權利要求7的拮抗劑，其中所述的變性的膠原蛋白是變性的II型膠原蛋白、變性的III型膠原蛋白和變性的V型膠原蛋白。
10.如權利要求6的拮抗劑，其中所述的拮抗劑是一種單克隆抗體。
11.如權利要求8的拮抗劑，其中所述的單克隆抗體是具有單克隆抗體HUI77、HUIV26或XL313D結合特異性的單克隆抗體。
12.如權利要求6的拮抗劑，其中拮抗劑是一種多克隆抗體。
13.如權利要求6的拮抗劑，其中拮抗劑是一種多肽、線性肽或環肽。
14.如權利要求6的拮抗劑，其中拮抗劑是一種非肽化合物。
15. 如權利要求6的拮抗劑，其中拮抗劑是一種寡核苷酸。
16. 如權利要求6的拮抗劑，其中拮抗劑是一種人源化或化學修飾的單克隆抗體。
17. 如權利要求6的拮抗劑，其中拮抗劑是單克隆抗體的片段。
18. 如權利要求6的拮抗劑，其中拮抗劑與細胞毒性或細胞生長抑制劑結合。
19. 一種抑制組織中血管發生的方法，包括給予權利要求1-17任何一項權利要求的拮抗劑。
20. 如權利要求19的方法，其中所述的拮抗劑通過靜脈內、經皮、滑膜內、肌肉內、腫瘤內、眼內、鼻內、鞘內、局部或口服途徑給予。
21. 如權利要求19的方法，其中所述的拮抗劑與化療結合在一起施用。
22. 如權利要求19的方法，其中所述的拮抗劑與放射結合在一起施用。
23. 如權利要求19的方法，其中組織是炎性組織且正在血管發生。
24. 如權利要求23的方法，其中組織是哺乳動物組織。
25. 如權利要求24的方法，其中組織是關節炎組織、眼組織、視網膜組織或血管瘤。
26. 一種抑制組織中腫瘤生長或轉移的方法，包括給予權利要求1-17任何一項權利要求的拮抗劑。
27. 如權利要求26的方法，其中所述的拮抗劑通過靜脈內、經皮、滑膜內、肌肉內、腫瘤內、眼內、鼻內、鞘內、局部或口服途徑給予。
28. 如權利要求26的方法，其中所述的拮抗劑與化療結合在一起施用。
29. 如權利要求26的方法，其中所述的拮抗劑與放射結合在一起施用。
30. 如權利要求26的方法，其中腫瘤或轉移瘤是黑素瘤、癌、肉瘤、纖維瘤、神經膠質瘤和星形細胞瘤。
31. 一種抑制組織中銀屑病、斑點退化或再狹窄的方法，通過給予權利要求1-17任何一項權利要求的拮抗劑。
32. 如權利要求31的方法，其中所述的拮抗劑通過靜脈內、經皮、滑膜內、肌肉內、腫瘤內、眼內、鼻內、鞘內、局部或口服途徑給予。
33. 如權利要求31的方法，其中所述的拮抗劑與化療結合在一起施用。
34. 如權利要求31的方法，其中所述的拮抗劑與放射結合在一起施用。
35. 一種檢測組織中血管發生的方法，其是通過將權利要求1-17任何一項權利要求的拮抗劑與所述組織接觸而進行。
36. 如權利要求35的方法，其中所述的組織為回體組織。
37. 如權利要求35的方法，其中所述的組織為體內組織並且所述的拮抗劑通過靜脈內、經皮、滑膜內、肌肉內、腫瘤內、眼內、鼻內、鞘內、局部或口服途徑給予。
38. 如權利要求35的方法，其中所述的拮抗劑與螢光染料、放射性標記、順磁性重金屬、診斷染料或酶綴合。
39. 一種檢測組織中腫瘤或腫瘤侵入的方法，其通過給予權利要求1-17任何一項權利要求的拮抗劑而進行。
40. 如權利要求39的方法，其中所述的組織為回體組織。
41. 如權利要求39的方法，其中所述的組織為體內組織並且所述的拮抗劑通過靜脈內、經皮、滑膜內、肌肉內、腫瘤內、眼內、鼻內、鞘內、局部或口服途徑給予。
42. 如權利要求39的方法，其中所述的拮抗劑與螢光染料、放射性標記、順磁性重金屬或診斷染料綴合。
43. 一種篩選變性膠原蛋白拮抗劑的方法，包括a)提供一種推定的拮抗劑；b)測定所述的推定的拮抗劑與選自I型、II型、III型、IV型和V型膠原蛋白的一種變性膠原蛋白的第一親和力；c)測定所述的推定的拮抗劑與選自I型、II型、III型、IV型和V型膠原蛋白的一種天然膠原蛋白的第二親和力，其中所述所選擇的天然膠原蛋白是所選擇的變性膠原蛋白的天然形式；d)如果所述的第二親和力顯著低於所述的第一親和力，那麼選擇所述推定的拮抗劑作為變性膠原蛋白的拮抗劑。
44.如權利要求43的方法，其中所述的推定拮抗劑是非肽化合物。
45.如權利要求44的方法，其中所述的非肽化合物是小分子有機化合物。
46.如權利要求44的方法，其中所述的非肽化合物是一種寡核苷酸。
47.如權利要求43的方法，其中所述的推定拮抗劑是一種多肽，線性肽或環肽。
48.如權利要求43的方法，其中所述的推定拮抗劑是一種抗體。
49.如權利要求48的方法，其中所述的抗體是單克隆抗體。
50.如權利要求48的方法，其中所述的抗體是多克隆抗體。
51.如權利要求43的方法，其中所述的第一和第二親和力是通過酶聯免疫吸附分析方法而測定的。
52.如權利要求43的方法，其中所述的第二親和力比第一親和力大約低3倍。
53.如權利要求43的方法，其中所述的第二親和力比第一親和力大約低5倍。
54.如權利要求43的方法，其中所述的第二親和力比第一親和力大約低10倍。
55.一種篩選變性膠原蛋白拮抗劑的方法，包括選擇一種具有與權利要求11的拮抗劑競爭結合變性膠原蛋白上表位的拮抗劑。
56.包含編碼能被權利要求1的拮抗劑識別的表位的序列的肽。
57.如權利要求56的肽，其中所述的拮抗劑是單克隆抗體。
58.如權利要求57的肽，其中所述的抗體是HUI77、HUIV26或XL313。
59.如權利要求58的肽，其中所述的肽是SEQ ID NO12的肽。
全文摘要
本發明描述了通過給予一種特異性地與蛋白水解的或變性的膠原蛋白結合而不與天然的三螺旋形式的膠原蛋白結合的拮抗劑而抑制組織中血管發生的方法。本發明的拮抗劑能夠以例如變性的I型、II型、III型、IV型、V型膠原蛋白及其組合作為目標。本發明描述了應用這些拮抗劑治療腫瘤生長、腫瘤轉移或再狹窄的方法,本發明也描述了體內或回體(ex vivo)應用這些拮抗劑作為正常或患病組織的血管發生的診斷標誌的方法。拮抗劑包括稱為HUI77、HUIV26和XI313的單克隆抗體。
文檔編號A61P17/02GK1345331SQ00802601
公開日2002年4月17日 申請日期2000年1月6日 優先權日1999年1月6日
發明者彼得·布魯克斯, 埃裡克·珀蒂克萊克, 徐勁松 申請人:南加利福尼亞大學