C型肝炎病毒疫苗組合物的製作方法

2023-08-01 16:50:21

專利名稱：C型肝炎病毒疫苗組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及C型肝炎病毒疫苗組合物。
背景技術：
C型肝炎病毒Ofepatitis C virus ；下文有時簡稱「HCV」)是作為非甲非B型肝炎的主要致病病毒被發現的(非專利文獻1)。HCV是具有約9. 6kb的單股正鏈RNA作為基因組的RNA病毒，該基因組編碼翻譯後由來自宿主的信號肽酶或來自HCV的蛋白酶切割為 10 種病毒蛋白 G^l>、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A&NS5B)的前體蛋白。其中， 核心、E1、E2及p7蛋白被分類為結構蛋白，NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B蛋白被分類為非結構蛋白。HCV還根據基因組核苷酸序列的不同，被分類為10種以上的基因型(例如 la、Ib、加、2b、3a及3b)(非專利文獻2 4)，可通過HCV抗體檢測、HCV核心抗原檢測或者核酸擴增檢測來判定基因型。已知HCV通過血液由人傳染給人，感染者約60 80%引起慢性肝炎，在不實施適當治療置之不理的情況下，感染後約20 30年左右引起肝硬化或肝癌。因此，希望早期檢測出HCV的感染，以預防慢性肝炎的發病，同時希望發病後進行早期治療。作為C型肝炎的主要治療方法，幹擾素的單獨給予或者幹擾素與利巴韋林的聯合療法是很普遍的，但最近明確，幹擾素的治療效果因HCV基因型的不同而有著較大的差異， 對基因型為Ia或Ib的HCV難以發揮作用(非專利文獻5和6)。而且，即使在幹擾素的效果被認為較好的基因型為加的HCV與2b的HCV之間，也逐漸明確幹擾素的抗病毒作用的強度存在差異，並且暗示與2b的HCV相比，對加的HCV的作用更強(非專利文獻7)。因此，希望開發出一種HCV疫苗，其能預防感染HCV後尚未發生慢性肝炎的病毒攜帶者發生慢性肝炎，或者在慢性肝炎發病後增強自身免疫而排除HCV。然而，獲得具有感染性的HCV顆粒(下文有時簡稱「感染性HCV顆粒」)和測試HCV 的感染抑制效果較為困難，同時，找出增強發揮感染抑制效果所必需的體液免疫和細胞免疫的佐劑與抗原的組合也較為困難，因此尚未開發出具有足夠感染抑制活性的HCV疫苗組合物。—般來說，佐劑根據物理性質，可以分為粒狀佐劑和非粒狀佐劑。粒狀佐劑可舉例如鋁鹽、油包水型乳劑、水包油型乳劑、免疫刺激複合物、脂質體以及納米和微粒子，單獨與抗原混合使用的情況居多。其中，氫氧化鋁(下文有時簡稱 「Alum」)作為炎性低的佐劑用於醫藥用途。然而，已知Alum在與抗原效價為中位至低位的抗原組合時，不能增強發揮感染抑制效果所必需的體液免疫和細胞免疫，不適合用作佐劑。另一方面，非粒狀佐劑可舉例如胞壁醯二肽(由分枝桿菌提取的肽聚糖的佐劑活性成分)、非離子性嵌段共聚物、皂角苷(從Quillaja saponaria樹的樹皮提取的三萜系化合物的複合混合物)、脂質A (帶有長度一般為C12 C16的5個或6個脂肪酸鏈和2個磷酸根(phosphate radicals)的葡糖胺的二糖類)、細胞因子、核酸、碳水化合物聚合體、 衍生化多糖類以及細菌毒素(例如霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩定毒素)，和粒狀佐劑並用的情況居多。作為被用作佐劑的核酸，含有未經甲基化修飾的CpG 二核苷酸基序(motif)的寡脫氧核苷酸(下文有時簡稱「CpG-ODN」)(非專利文獻8)和雙股RNA(下文有時簡稱 「dsRNA，，)是已知的。據報導，在CpG-ODN中，含有由6鹼基迴文結構基序構成的CpG基序的CpG-ODN誘導強的細胞毒活性，其中5，-AACGTT-3，、5，-AGCGCT-3，以及5，-GACGTC-3，這三個序列特別強地誘導細胞毒活性(非專利文獻9)。現在，明確了 CpG-ODN是TLR9的配體，並且判明了 CpG-ODN通過活化TLR9來誘導免疫應答。代表性的dsRNA可舉例如多核糖肌苷酸(polyl)和多核糖胞苷酸(polyC)雜交而獲得的多核糖肌苷酸-多核糖胞苷酸(下稱「polyl :C」)，還已知polyl :C與聚L賴氨酸、羧甲基纖維素的複合體polyICLC (非專利文獻10)；以及polyl C的C部分被U取代的 polyI:PolyC12U(其中，每12個C被1個U取代)為毒性少的dsRNA(非專利文獻11)。已經明確polyl :C為I型幹擾素的誘導劑，並且為TLR3的配體。作為HCV疫苗開發中使用的抗原蛋白的候選，報導了重組蛋白(專利文獻1和2)、 合成肽(專利文獻幻、病毒樣顆粒(專利文獻4)、裸DNA (專利文獻幻、病毒顆粒(專利文獻6和7)。專利文獻1中公開了通過將HCV的結構蛋白即El和E2蛋白作為抗原，將MF59(亞微粒的水包油型乳劑)和CpG-ODN作為佐劑混合，抗El和E2蛋白的抗體效價上升，但沒有明確由此所產生的抗體的HCV感染抑制活性。專利文獻2中公開了通過將HCV的El和E2蛋白作為抗原，將polyl:C作為佐劑混合，抗El和E2蛋白的抗體產生量增加，然而，與專利文獻1同樣，沒有公開抗體的HCV的感染抑制活性。專利文獻6和7中記載了以HCV顆粒本身作為抗原的疫苗，但沒有關於佐劑的記載，或者只是例示了一般的佐劑，另外完全沒有公開由該疫苗引起的抗體產生能和抗體的 HCV的感染抑制活性。非專利文獻12中公開了通過將HCV的核心蛋白、NS3蛋白、NS4蛋白和NS5蛋白作為抗原，將Alum和CpG-ODN作為佐劑混合，抗核心蛋白、NS3蛋白、NS4蛋白和NS5蛋白的抗體產生量增加，但與專利文獻1和2同樣，未公開抗體的HCV的感染抑制活性。現有技術文獻專利文獻專利文獻1專利文獻2專利文獻3專利文獻4專利文獻5專利文獻6專利文獻7非專利文獻非專利文獻1 =Choo 等，Science, 1989 年，244 卷，359 362 頁日本特表2005-502611號公報 日本特許第4286138號說明書 日本特表2009-513542號公報 日本特表2001-504337號公報 日本特開2009-183^5號公報 國際公開第05/080575號 國際公開第06/022422號
非專利文獻2 =Simmonds 等，H印atology，1994 年，10 卷，1321 1324 頁非專利文獻3 =Okamoto 等，J. Gen. Virol.，1992 年，73 卷，73 679 頁非專利文獻4 =Mori 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，1992 年，183 卷，334 342頁非專利文獻5 =Fried 等，N. Engl. J. Med.，2002 年，347 卷，975 982 頁非專利文獻6 =Lusida 等，J. Clin. Microbiol.，2001 年，39 卷，3858 3864 頁非專利文獻7 =Murakami 等，Hepatology, 1999 年，30 卷，1045 1053 頁非專利文獻8 Yamamoto 等，Jpn, J. Cancer Res. 1988 年，79 卷，866-873 頁非專利文獻9 =Yamamoto 等，J. Immunol. 1992 年，148 卷，4072-4076 頁非專利文獻10 =Nakamura 等，J. Interferon Res. 1982 年，2 卷，1-4 頁非專利文獻11 =Laurence 等，J. Clin. Invest. 19878 年，80 卷，1631-1639 頁非專利文獻12 =Vajdy 等，J. Gen. Virol. 2006 年，87 卷，2253-2262 頁

發明內容
發明要解決的課題本發明的課題在於找出誘導具有HCV感染抑制活性的抗體的HCV抗原和最適合該抗原的佐劑的組合，提供有效的HCV疫苗組合物。解決課題的手段以HCV顆粒粘附和感染細胞所需的包膜蛋白即E2蛋白作為抗原對小鼠進行免疫， 評價其血清中抗E2蛋白的抗體效價時，顯示為高值。以往，人們一直認為抗E2蛋白的抗體效價和抗體的感染抑制活性相關，而本發明人的研究結果卻驚人地發現這一說法未必正確。也就是說，如本說明書的實施例所示，本發明人證實將用Alum和CpG-ODN作為佐劑的、含E2蛋白的疫苗對小鼠進行接種時，血清中抗E2蛋白的抗體效價上升，但HCV感染抑制活性卻不上升。因此，為了探索誘導具有感染抑制活性的抗體的HCV抗原和佐劑的組合，在細胞培養系中產生感染性HCV顆粒、純化、滅活，然後製作與各種佐劑組合的疫苗組合物，並給予小鼠。測定給予後各小鼠血清中的抗HCV E2蛋白的抗體效價和HCV的感染抑制活性時， 發現如上所述，即使使用對HCV E2蛋白顯示高抗體效價的佐劑，HCV感染抑制活性也未必為高值；通過使用滅活HCV顆粒+Alum+CpG-ODN的疫苗組合物，不僅抗E 1蛋白和E2蛋白的抗體效價，而且HCV的感染抑制活性也呈高值，從而完成了本發明。即，本申請的發明包含以下內容。本發明提供C型肝炎病毒疫苗組合物，其包含滅活病毒顆粒、序列表的SEQ ID NO 5記載的含非甲基化CpG的寡核苷酸以及氫氧化鋁，所述滅活病毒顆粒如下獲得由包含編碼來自C型肝炎病毒的JFHl株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B 蛋白的序列的C型肝炎病毒基因組製作感染性C型肝炎病毒顆粒，將其滅活。優選該感染性C型肝炎病毒基因組為包含編碼來自C型肝炎病毒的J6CF株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白以及P7蛋白的序列的上述C型肝炎病毒疫苗組合物。還優選該感染性C型肝炎病毒基因組為包含編碼來自C型肝炎病毒的J6CF株的 NS2蛋白的N末端胺基酸殘基至第16位胺基酸殘基的序列，以及編碼來自C型肝炎病毒的JFHl株的NS2蛋白的始自N末端的第17位胺基酸殘基至C末端的胺基酸殘基的序列的上述C型肝炎病毒疫苗組合物。本發明還提供C型肝炎病毒疫苗組合物，其包含滅活病毒顆粒、序列表的SEQ ID NO :5記載的含非甲基化CpG的寡核苷酸以及氫氧化鋁，所述滅活病毒顆粒通過將包含來自C型肝炎病毒的JFHl株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B蛋白的感染性C型肝炎病毒顆粒滅活獲得。優選該感染性C型肝炎病毒為包含來自C型肝炎病毒的 J6CF株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白以及p7蛋白的上述C型肝炎病毒疫苗組合物。還優選該感染性C型肝炎病毒為NS2蛋白為嵌合蛋白，且上述NS2蛋白的N末端的胺基酸殘基至第16位胺基酸殘基來自J6CF株、上述NS2蛋白的始自N末端的第17位胺基酸殘基至C末端的胺基酸殘基來自JFHl株的上述C型肝炎病毒疫苗組合物。本發明還提供C型肝炎病毒疫苗組合物，其包含滅活的基因型加的C型肝炎病毒顆粒、序列表的SEQ ID NO :5記載的含非甲基化CpG的寡核苷酸(CpG-ODN)以及氫氧化鋁。優選該基因型加的C型肝炎病毒顆粒具有基因型加的C型肝炎病毒的結構蛋白，特別是來自J6CF株的結構蛋白(核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白)。優選該基因型加的C型肝炎病毒顆粒具有基因型加的C型肝炎病毒的E2蛋白，特別是來自J6CF株的E2 蛋白。還優選該基因型加的C型肝炎病毒顆粒為通過表達具有分別編碼來自C型肝炎病毒的至少1種毒株的NS2蛋白、來自JFHl株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B蛋白的核苷酸序列的HCV基因組而產生的病毒顆粒。還優選該基因型加的C型肝炎病毒顆粒為通過表達包含下述核苷酸序列的嵌合HCV基因組而產生的病毒顆粒，所述核苷酸序列包含分別編碼來自J6CF株的結構蛋白(核心蛋白、El蛋白、E2蛋白以及p7蛋白)、來自J6CF株和JFHl株的嵌合蛋白即NS2蛋白(NS2蛋白的N末端的胺基酸殘基至第 16位胺基酸殘基來自J6CF株，且上述NS2蛋白的始自N末端的第17位胺基酸殘基至C末端的胺基酸殘基來自JFHl株)、以及來自JFHl株的NS2以外的非結構蛋白(NS3蛋白、NS4A 蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白以及NS5B蛋白)的核苷酸序列；5』非翻譯區以及3』非翻譯區。本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本專利申請2009-2^145號的說明書和/或附圖所記載的內容。發明效果通過本發明，可以提供有效預防C型肝炎病毒感染的疫苗組合物。


[圖1]以J6E2Fc蛋白(5μ g或20 μ g)作為抗原，以及以Alum或Mod87s單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠2次。最終給予10天後採集血清，稀釋1000倍、3000倍、 10000倍，用EIA測定抗J6E2蛋白的抗體效價，顯示其結果。[圖2]以J6E2Fc蛋白(20μ g)作為抗原，以及以Alum+Mod87s作為佐劑，間隔2 周給予小鼠2次，將最終給予10天後採集的血清樣品稀釋100倍，測定J6CF HCVpp的感染抑制活性，顯示其結果。[圖3]以滅活J6/JFH1-HCV顆粒(2pmol)作為抗原，以及以Alum、Mod87s或者 polyI:C單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠4次，將最終給予1周後採集的血清樣品稀釋3000倍，測定抗El蛋白的抗體效價。圖中的Mline(鹽水)表示僅給予了生理鹽水的小鼠的血清。[圖4]以滅活J6/JFH1-HCV顆粒(2pmol)作為抗原，以及以Alum、Mod87s或者 polyI:C單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠4次，將最終給予1周後採集的血清樣品稀釋3000倍，測定抗E2蛋白的抗體效價。圖中的Mline(鹽水)表示僅給予了生理鹽水的小鼠的血清。[圖5]以滅活J6/JFH1-HCV顆粒(2pmol)作為抗原，以及以Alum、Mod87s或者 polyI:C單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠4次，將最終給予1周後採集的血清樣品稀釋100倍，測定J6CF HCVpp(基因型2a)的感染抑制活性，顯示其結果。圖中的Mline (鹽水)表示僅給予了生理鹽水的小鼠的血清。[圖6]以滅活J6/JFH1-HCV顆粒(2pmol)作為抗原，以及以Alum、Mod87s或者 polyI:C單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠4次，將最終給予1周後採集的血清樣品稀釋100倍，測定H77HCVpp(基因型la)的感染抑制活性，顯示其結果。圖中的Mline (鹽水)表示僅給予了生理鹽水的小鼠的血清。[圖7]以滅活J6/JFH1-HCV顆粒(2pmol)作為抗原，以及以Alum、Mod87s或者 polyI:C單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠4次，將最終給予1周後採集的血清樣品稀釋100倍，測定TH HCVpp(基因型lb)的感染抑制活性，顯示其結果。圖中的Mline(鹽水)表示僅給予了生理鹽水的小鼠的血清。[圖8]以滅活J6/JFH1-HCV顆粒(2pmol)作為抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyl C單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠4次，將最終給予1周後採集的血清樣品稀釋100倍，測定J6/JFHlHCVcc (基因型加)的感染抑制活性，顯示其結果。圖中的 Saline (鹽水)表示僅給予了生理鹽水的小鼠的血清。[圖9]以滅活J6/JFH1-HCV顆粒(2pmol)作為抗原，以及以Alum、Mod87s或者polyl:C單獨或組合作為佐劑，間隔2周給予小鼠4次，將最終給予1周後採集的血清樣品稀釋100倍，測定TH/JFH1HCVCC(基因型lb)的感染抑制活性，顯示其結果。圖中的 Saline (鹽水)表示僅給予了生理鹽水的小鼠的血清。
具體實施例方式下面詳細說明本發明。本發明涉及疫苗組合物，其包含優選將產自特定的HCV基因組的HCV顆粒(優選感染性HCV顆粒)滅活，以此作為抗原製造的適於誘導抑制HCV感染的抗體的佐劑以及該抗原。本發明可以使用在該領域技術範圍內的分子生物學和免疫學的現有技術進行實施。這種技術已在文獻中充分說明。參照例如Sambrook等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (第 3 版，2001) ；Ed Harlow 等， Antibodies :ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。本說明書中引用的所有刊物、專利和專利申請都作為參考，整體援引到本說明書中。(I)HCV顆粒的製作可用於生成可用於本發明的HCV疫苗組合物的抗原的感染性HCV顆粒的HCV基因組的例子具體有基因型加的JFHl株的病毒基因組RNA，該RNA從5』 一側向3』 一側順序由5』非翻譯區、核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、E2蛋白編碼區域、p7蛋白編碼區域、 NS2蛋白編碼區域、NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域以及3』非翻譯區的核苷酸序列構成。或者，該HCV基因組也可以是由2種以上的HCV株的病毒基因組RNA構成的嵌合RNA。例如，從5』一側向3』一側順序由JFHl株以外的HCV株的5』非翻譯區、核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、E2蛋白編碼區域及P7蛋白編碼區域JFHl株以外的HCV株或者JHll株的NS2蛋白編碼區域；以及JFHl株的NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域以及3』非翻譯區的核苷酸序列構成的嵌合RNA。或者，該HCV基因組還可以是從5』 一側向3』 一側順序由JFHl株以外的HCV株的5』非翻譯區、核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、E2蛋白編碼區域及p7蛋白編碼區域；以及來自一個以上的HCV 株的嵌合NS2蛋白編碼區域、NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、 NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域及3』非翻譯區的核苷酸序列構成的嵌合RNA。因此，為製作本發明中使用的感染性HCV顆粒而使用的HCV基因組的1個優選方案至少含有分別編碼JFHl株的非結構蛋白即NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、 以及NS5B蛋白的核苷酸序列。這樣，將保有JHll株的全長或JHll株的基因組的一部分、 獲得了自主複製能力、病毒產生能力的病毒稱為「來自JFHl的病毒」。本發明中優選的1個方案的HCV基因組的例子為從5』 一側向3』 一側順序由來自基因型加的JFHl株的全長基因組(例如，具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的基因組； 關於RNA，SEQ ID NO :1所示核苷酸序列中的「Τ(胸腺嘧啶)」改讀為「U(尿嘧啶)」。本說明書中，關於其他核苷酸序列，以下也同樣)構成的HCV基因組。或者為從5』 一側向3』 一側順序由來自基因株的5』非翻譯區、核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、 E2蛋白編碼區域、p7蛋白編碼區域及NS2蛋白編碼區域的N末端至16位胺基酸殘基；以及JFHl株的NS2蛋白編碼區域的始自N末端的17位胺基酸殘基至C末端、NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域以及 3』非翻譯區的核苷酸序列構成的嵌合基因組。該特別優選的例子為克隆到由SEQ ID NO 2的核苷酸序列構成的J6/JFH1中的核酸。在本發明特別優選的方案中，上述HCV(嵌合)基因組為由SEQ ID NO :1或2所示核苷酸序列構成的核酸。在本發明的感染性HCV顆粒的製造中可以使用HCV基因組RNA或者HCV基因組DNA。本發明還優選的1個方案的HCV基因組的例子為JFH1株的5』非翻譯區；基因型 Ib 的 TH 株(ffakita,T.等，J. Biol. Chem.，269，14205-14210，1994，日本特開 2004-179)的核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、E2蛋白編碼區域及p7蛋白編碼區域；以及JFHl株的 NS2蛋白編碼區域、NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域及3』非翻譯區的核苷酸序列按該順序連接而成的HCV嵌合基因組，優選為來自JFHl株的5』非翻譯區；TH株的核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、 E2蛋白編碼區域、p7蛋白以及NS2蛋白編碼區域的編碼N末端至33位胺基酸殘基的區域； 以及JFHl株的NS2蛋白編碼區域的編碼始自N末端的34位胺基酸殘基至C末端的區域， NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域以及3』非翻譯區的核苷酸序列按該順序連接而成的HCV嵌合基因組。該特別優選的例子為克隆到SEQ ID NO 3的核苷酸序列所示TH/JFHl中的核酸。本發明特別優選的方案中，上述HCV嵌合基因組為由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列構成的核酸。在本發明的感染性HCV顆粒的製造中可以使用HCV基因組RNA或者HCV基因組DNA。S卩，本發明是以如下HCV顆粒作為抗原的疫苗，得自從5』 一側向3』 一側順序由 HCV的J6CF株的5』非翻譯區、核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、E2蛋白編碼區域及p7 蛋白編碼區域；以及JFHl株的NS2蛋白編碼區域、NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、 NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域及3』非翻譯區的核苷酸序列連接而成的HCV嵌合基因組的HCV顆粒，優選得自從5』 一側向3』 一側順序由J6CF株的 5』非翻譯區、核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、E2蛋白編碼區域、p7蛋白編碼區域及 NS2蛋白編碼區域的編碼N末端至16位胺基酸殘基的序列；以及Ji7Hl株的NS2蛋白編碼區域的編碼始自N末端的17位胺基酸殘基至C末端的區域、NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域、NS5B蛋白編碼區域以及3』非翻譯區的核苷酸序列連接而成的HCV嵌合基因組的HCV顆粒。本發明中優選的其他方案的HCV基因組的例子為用於製作本發明中使用的感染性HCV顆粒而使用的HCV基因組至少含有分別編碼基因型加的J6CF株的結構蛋白即核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白的核苷酸序列。上述感染性HCV顆粒可以如下製作由將上述完全長度的HCV基因組RNA的cDNA 克隆到轉錄啟動子下遊的載體(例如，在T7啟動子的控制下克隆HCV基因組DNA的載體) 合成RNA，將該RNA導入細胞中。以在T7啟動子的控制下克隆了 HCV cDNA的核酸作為模板，在體外製作RNA的方法可以用MEGAscript T7試劑盒(Ambion公司)等合成。導入RNA 的細胞只要是容許形成HCV顆粒的細胞即可，可舉例如Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞等培養細胞，更優選的例子有Huh7細胞等來自肝臟的培養細胞，更為合適的有Huh7細胞、以及Huh7細胞的衍生細胞即Huh7. 5細胞、Huh7. 5. 1細胞。還可以舉出Huh7細胞、!fepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞或者293細胞中表達CD81基因和/或 Claudinl基因的細胞，其中優選使用Huh7細胞或者Huh7細胞的衍生細胞。本發明中「衍生細胞」是指由該細胞誘導的細胞株。作為將RNA導入細胞的方法，可以使用公知的任意方法。這種方法有磷酸鈣共沉澱法、DEAE葡聚糖法、脂質轉染法、顯微注射法、電穿孔法，優選脂質轉染法和電穿孔法，更優選電穿孔法。細胞的病毒顆粒產生能力可以使用針對構成釋放到培養液中的HCV病毒顆粒的要素(例如核心蛋白、El蛋白或E2蛋白)的抗體來檢測。還可以通過使用特異性引物的 RT-PCR法將培養液中的HCV病毒顆粒所含有的HCV基因組RNA擴增而檢測，從而間接地檢測HCV病毒顆粒的存在。製作的病毒顆粒是否具有感染能力可以如下判斷培養用上述方法導入了 HCV RNA的細胞，將獲得的上清液處理(添加)到HCV感染感受性細胞(例如Huh7)中，例如在 48小時後用抗核心抗體對細胞進行免疫染色，對感染細胞數進行計數，或者將細胞的提取物通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行電泳，用蛋白質印跡法檢測核心蛋白。
本說明書中，將由來自JHll株的全長基因組製作的病毒顆粒稱為「JFH1-HCV」，由 J6/JFH1基因組製作的病毒顆粒稱為「J6/JFH1-HCV」，由TH/JFHl基因組製作的病毒顆粒稱為「TH/JFH1-HCV」。這些顆粒是來自JFHl的病毒。本發明中，基因型加的C型肝炎病毒顆粒，如下面所述，也可以根據需要進行純化、並且進行滅活，用作本發明的疫苗組合物的抗原。作為基因型加的C型肝炎病毒顆粒， 優選具有基因型加的C型肝炎病毒的結構蛋白，特別是來自J6CF株的結構蛋白(核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白)的病毒顆粒。優選該基因型加的C型肝炎病毒顆粒為具有基因型加的C型肝炎病毒的E2蛋白，特別是來自J6CF株的E2蛋白的病毒顆粒。作為由來自J6CF株的結構蛋白即核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白構成的多蛋白區域，優選由通過SEQ ID NO :2所示序列上的341位 2779位核苷酸序列所編碼的胺基酸序列構成的區域。再有，從具有感染性及自主複製性的觀點來看，優選該基因型加的C型肝炎病毒顆粒為通過表達含有分別編碼來自C型肝炎病毒的至少1種毒株的NS2蛋白，以及來自 JFHl株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列的HCV基因組而產生的病毒顆粒。這種基因型加的C型肝炎病毒(顆粒)可以為嵌合病毒(顆粒)。 優選該基因型加的C型肝炎病毒顆粒為通過表達包含下述核苷酸序列的嵌合HCV基因組而產生的病毒顆粒，所述核苷酸序列包含來自C型肝炎病毒的任一毒株的5 『非翻譯區； 分別編碼來自J6CF株的結構蛋白(核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白)、來自J6CF株和JFHl株的嵌合蛋白即NS2蛋白(NS2蛋白的N末端的胺基酸殘基至第16位胺基酸殘基來自J6CF株，且上述NS2蛋白的始自N末端的第17位胺基酸殘基至C末端的胺基酸殘基來自JFHl株)、以及來自JFHl株的NS2以外的非結構蛋白(NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白)的核苷酸序列；以及來自C型肝炎病毒的任一毒株的3』非翻譯區。(2)病毒顆粒的純化將含有上述(1)中獲得的HCV顆粒的病毒液用離心和/或過濾器等除去細胞和細胞殘渣。除去了殘渣的溶液也可以使用截留分子量100，000至500，000的超濾膜濃縮至 10 100倍左右。除去了殘渣的含HCV顆粒的溶液可以將下述色譜法和密度梯度離心按任意順序組合、或者單獨進行純化。下面描述了代表性的色譜法、密度梯度離心的方法，但並不限於這些方法。凝膠過濾色譜法可以優選通過使用以烯丙基葡聚糖和N，N』 -亞甲基雙丙烯醯胺的交聯聚合物作為凝膠基質的色譜載體，且優選由S^hacryl (註冊商標)S-300、S-400或 S-500構成的色譜，進行HCV顆粒的純化。離子交換色譜法可以優選用Q-kpharose (註冊商標)等作為陰離子交換樹脂來進行HCV顆粒的純化。還可以優選使用SP kpharose (註冊商標)等作為陽離子交換樹脂來進行HCV顆粒的純化。親和色譜法中作為配體，可以優選將選自肝素、硫酸化Cellulofine、凝集素及各種色素的基質結合而成的樹脂用作載體，進行HCV顆粒的純化。更優選可以利用HiTrap Heparin HP (註冊商標)、HiiTrap Blue HP (註冊商標)、HiiTrap Benzamidine FF (註冊商標)、硫酸化Cellulofine以及LCA、ConA、RCA-120和WGA結合而成的載體來純化HCV顆粒。最優選的手法為將硫酸化Cellulofine用作載體來純化HCV顆粒，作為純化前和純化後溶液中的總蛋白量與HCV的RNA拷貝數的比率，可以純化至30倍以上。用密度梯度離心進行的純化中，作為形成密度梯度的溶質，優選可以使用氯化銫、 蔗糖、Nycodenz (註冊商標)以及稱為Ficoll (註冊商標)和Percoll (註冊商標)的糖聚合體。更優選可以使用蔗糖。作為使用的溶劑，優選可以使用水或者磷酸緩衝液、Tris緩衝液、乙酸緩衝液或甘氨酸緩衝液等緩衝液。通過密度梯度離心進行純化時的離心力優選為1 X IO4 1 X IO9g,更優選為5 X IO4 1 X IO7g,最優選為5 X IO4 5 X IO5go進行純化時的溫度優選為O 40°C，更優選為O 25°C，最優選為O 10°C。也可以用超濾膜濃縮HCV顆粒，之後通過密度梯度離心純化HCV顆粒。而且，在將密度梯度離心和柱色譜法組合進行純化的情況下，無論按何種順序何種組合均可，但優選通過多個柱色譜法純化後使用密度梯度離心的組合，更優選將使用陰離子交換柱、之後再用親和色譜法獲得的含HCV顆粒的組分用密度梯度離心進行純化的組合，最優選將使用 Q-Sepharose (註冊商標)的柱獲得的含HCV顆粒的組分用使用硫酸Cellulofine的柱進一步純化，將所得含HCV顆粒的組分用密度梯度離心純化的組合。需要說明的是，柱色譜法和密度梯度離心的步驟之間可以通過使用透析、超濾，進行含HCV顆粒的溶液的溶質置換和/ 或HCV顆粒的濃縮。(3)病毒顆粒的滅活本發明的疫苗以滅活HCV顆粒作為抗原。關於本發明的疫苗，由於HCV對嚙齒類不顯示感染性，因此該HCV顆粒有無感染性，在使用嚙齒類進行評價時不成問題，但向人接種時需要使用滅活的HCV顆粒。作為將HCV顆粒滅活的方法，可以將福馬林、β-丙內酯、 戊二醛等滅活劑添加混合到例如病毒懸液中，通過與病毒反應來實現(Appaiahgari等人， Vaccine, 22 =3669-3675,2004)。還有通過用紫外線照射HCV顆粒，使病毒失去感染性，迅速滅活的方法。紫外線照射對構成病毒的蛋白等的影響小，可以進行病毒的滅活，因此優選。 作為用於滅活的紫外線的線源，可以使用一般市售的殺菌燈，特別是使用15W殺菌燈進行， 但並不限於此。另外，在本發明中，HCV顆粒使用通過上面所述方法純化的顆粒，但本滅活方法不受純化、未純化等狀態限制。優選可以通過將含感染性HCV顆粒的溶液用20mW/cm2 的紫外線在室溫下照射5分鐘以上來滅活感染性HCV顆粒。(4)佐劑佐劑可以使用已經作為疫苗用佐劑得到認可的氫氧化鋁(Alum)、正在進行臨床試驗的雙股RNA(dsRNA)、含非甲基化CpG的寡核苷酸(CpG-ODN)。dsRNA 可舉例如 polyI:C，polyICLC 或 polylpolyC 12U。本發明疫苗中所含的免疫刺激寡核苷酸含有非甲基化CpG即可，優選為國際公開專利07/139190號中記載的寡核苷酸。更優選為GGGGGGGCGACGATCGTCAGG(SEQ ID NO 4 稱為 Mod87)。具有磷酸二酯骨架的寡核苷酸的分解通過核酸外切酶和核酸內切酶介導。已知通過對核苷酸之間的鍵進行硫代磷酸修飾，獲得對這些核酸酶的抵抗性。作為一部分核苷酸殘基間被修飾的寡核苷酸，例如有5』和3』末端的核苷酸之間具有硫代磷酸修飾鍵的寡核苷酸、PolyG序列的核苷酸之間具有硫代磷酸修飾鍵的寡核苷酸，對核酸外切酶具有耐性。因此，作為更優選的寡核苷酸，可舉例如SEQ ID NO :4的寡核苷酸的5』 -末端的Poly G序列和3』 -末端一側最末端的磷酸二酯鍵被硫代磷酸修飾的EEEEEEECGACGATCGTCAEG (SEQ ID NO :5 ；將硫代磷酸化的鳥嘌呤(G)記作E，稱為 「Mod87s」)。(5)疫苗組合物及其效果本發明的疫苗組合物可以如下製造通過用常規方法將上述方法等製造的滅活C型肝炎病毒顆粒和佐劑，特別是將序列表的SEQ ID NO :5記載的含非甲基化CpG的寡核苷酸和氫氧化鋁混合，製造C型肝炎病毒疫苗組合物。本發明的疫苗組合物中含有0.001 99. 999重量％作為抗原的滅活HCV顆粒即可。給予量是根據對象者的年齡、患者的症狀、治療目的、給予途徑等適當選擇的，只要是能激活可防止HCV感染或發病的免疫的量即可，通常，成人每次的給予量優選0. Img lOOOOmg，更優選Img lOOmg。另外，初次給予後，通過在2周、4周、6周、8周、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或1年以上之後追加給予1次以上本發明的疫苗組合物，可維持免疫應答誘導能力。因此，給予次數優選2次以上，更優選2 6次，更加優選3 5次，最優選4次。本發明疫苗組合物的效果可通過將本疫苗給予動物，檢測免疫反應誘導的抗HCV 抗體來評價。作為免疫中使用的動物，為黑猩猩、猴、小鼠、大鼠、倉鼠，兔子等非人動物(例如非人哺乳動物)的任一種均可，但本發明中優選小鼠，使用小鼠的例子如下所示。通常，通過將上述(1) (3)的步驟獲得的HCV顆粒作為抗原，將抗原和佐劑一起數次給予4 10周齡的小鼠來進行免疫。作為佐劑，可以單獨或組合使用(4)中所示的 Alum、CpG-0DN、dsRNA。疫苗組合物給予後，由給予小鼠的尾靜脈採血，如下面(6)所述，測定血清中抗 HCV蛋白的抗體效價，由此可以測定疫苗組合物的免疫應答誘導的程度。已知HCV經由包膜蛋白感染細胞，因此優選測定抗包膜蛋白(例如E1、E2蛋白)的抗體效價。更優選，如下面 (7)所述，通過測定HCV感染抑制活性來查證疫苗組合物的效果。(6)抗體效價測定為了評價本發明疫苗組合物的效果，將HCV的蛋白固定(固相化)於載體，接著添加血清，在血清中的抗體和固相化的抗原足以形成複合體的時間和條件下使其反應即可。 接下來，使生成的複合體與識別血清中抗體的抗體(二次抗體)接觸，生成第2混合物，所述血清中抗體結合有作為信號的酶、色素或放射性同位素。使第2混合物在足以形成抗體 /抗原複合體的時間和條件下反應。通過用酶、色素或放射性同位素的信號檢測，來檢測識別HCV蛋白的抗體的存在。作為固相化於載體上的HCV蛋白，可以使用HCV顆粒本身，也可以使用由HCV基因組中的核心蛋白編碼區域、El蛋白編碼區域、E2蛋白編碼區域、p7蛋白編碼區域、NS2蛋白編碼區域、NS3蛋白編碼區域、NS4A蛋白編碼區域、NS4B蛋白編碼區域、NS5A蛋白編碼區域和/或NS5B蛋白編碼區域的核苷酸序列構成的cDNA，也可以使用在大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等中表達的、編碼這些區域的蛋白，還可以化學合成該蛋白使用。使J6CF株的包膜蛋白在哺乳動物細胞中表達的方法記載於日本專利申請 2007-193413號和日本專利申請2008-2M338號中。具體來說，在以J6CF株全長蛋白的胺基酸序列(NCBI蛋白質登錄號AAF01178. 1)的起始甲硫氨酸作為第1位的情況下，J6CF株的El蛋白始自上述的192位的胺基酸殘基，止於383位的胺基酸殘基。J6CF株的E2蛋白始自上述胺基酸序列的384位的胺基酸殘基，止於750位的胺基酸殘基。該El蛋白的353 位的胺基酸殘基至383位的胺基酸殘基、E2蛋白的722位的胺基酸殘基至750位的胺基酸殘基被認為是跨膜域(Cocquerel，L.等人，J. Virol. 74 :3623-3633,2000)。利用哺乳動物細胞使蛋白在培養上清液中分泌表達的情況下，該蛋白需要攜帶信號肽，不具有跨膜域。因此，在J6CF株中，El蛋白的情況下，如果為192位的胺基酸殘基至352位的胺基酸殘基內的序列，E2蛋白的情況下，如果為384位的胺基酸殘基至720位的胺基酸殘基內的序列，則可用作不含跨膜域的蛋白。使El或E2蛋白的不含跨膜域的蛋白在哺乳動物細胞中分泌表達時，在密碼子的框架(讀框)符合的狀態(in-frame，符合讀框)下將該蛋白編碼的核酸連接到編碼信號肽的核酸的下遊，再在其3』末端附加終止密碼子插入表達載體中。信號肽由分泌蛋白的N末端存在的15 30胺基酸殘基、主要為疏水性胺基酸構成，參與蛋白的細胞膜通透機制。可用於在哺乳動物細胞中分泌表達蛋白的信號肽是分泌蛋白的信號肽即可。作為攜帶信號肽的載體，可舉例如攜帶小鼠GM-CSF的信號肽序列的載體(日本特開昭 63-276490)、攜帶 IgG κ 鏈的信號肽序列的載體 pSecTag/FRT/V5-His (Invitrogen 公司)、攜帶前胰蛋白酶原的信號肽序列的載體p3XFLAG-CMV13(Sigma公司)、攜帶IL-2 的信號肽序列的載體pFUSE-Fdanvivogen公司)以及攜帶IgM的信號肽序列的載體 pTriEx-7 (Novagen 公司)等。表達蛋白時，以目標蛋白與標記蛋白的融合蛋白形式表達，可以用抗標記蛋白的抗體或特異性結合分子來進行融合蛋白的檢測或純化。這種標記蛋白也稱為標籤(Tag)。對標記蛋白沒有限定，例如有FLAG肽(flag肽，也稱為Flag肽)、3 X FLAG肽(也稱為3 X FLAG 肽、3 XFlag 肽、3 X flag 肽)、HA 肽、3 XHA 肽、myc 肽、6 XHis 肽、GST 多肽、MBP 多肽、PDZ 域多肽、鹼性磷酸酶、免疫球蛋白、抗生物素蛋白等。這些肽或多肽通常融合到目標蛋白的 N末端或C末端，但根據情況也可以插入目標蛋白內。另外，攜帶前胰蛋白酶原信號肽和 3 X FLAG肽的融合多肽的載體可以作為p3 X FLAG-CMV-9購自Sigma公司。(7)感染抑制測定為了測定疫苗組合物給予後的動物血清樣品是否具有HCV的感染抑制活性，可以使用感染性HCV樣顆粒(HCVpp)或感染性HCV顆粒(HCVcc)。通過在逆轉錄病毒顆粒上提呈功能性HCV包膜蛋白，可以製作感染性HCV樣顆粒。 通過在這些感染性HCV樣顆粒中包裝綠色螢光蛋白標記基因、螢光素酶基因，能夠以高可靠性迅速地測定HCV包膜蛋白介導的感染(Bartosch, B.等人· J. Exp. Med. 197 =633-642, 2003)。具體來說，例如，通過使用FUGENE6，將編碼基因型加的HCV株即J6CF的蛋白 (NCBI蛋白質登錄號AAF01178. 1)的132位的胺基酸殘基至750位的胺基酸殘基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3. 1的載體pcDNA J6dC_E2、克隆了編碼小鼠白血病病毒的gag和pol的基因的表達載體feig-Pol 5349、以及克隆了螢光素酶基因的逆轉錄病毒載體LucU6轉染到人胚腎細胞(ATCCCRL-157;3)中，可以生產HCVpp。轉染後，回收含假顆粒的培養液，用0. 45 μ m的薄膜濾器過濾，可以作為HCVpp樣品。
製作攜帶基因型Ia的包膜蛋白的HCVpp時，可以使用將編碼基因型Ia的HCV即 H77的蛋白(NCBI蛋白質登錄號AAB67036. 1)的132位胺基酸殘基至746位胺基酸殘基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3. 1的載體pcDNA H77dC_E2。製作攜帶基因型Ib的包膜蛋白的HCVpp時，可以使用將編碼基因型Ib的HCV即TH的蛋白(Wakita， Τ.等人，J. Biol. Chem.，269，14205-14210，1994)的132位胺基酸殘基至747位胺基酸殘基 (核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3. 1的載體pcDNA THdC_E2。例如，將HCVpp和稀釋的血清樣品混合，在室溫下反應30分鐘。血清的稀釋用DMEM 培養基(含10% FCSdnvitrogen公司),1 % MEM非必需胺基酸溶液(Invitrogen公司)、 IOmM HEPES-Tris (pH7. 3)、ImM丙酮酸鈉的DMEM)進行。向前一天在96孔板上按1 X IO4細胞 /孔培養的Huh7. 5. 1細胞中添加上述HCVpp和血清樣品的混合液，在37°C培養3小時。培養後除去樣品，用PBS洗滌細胞1次，然後加入新鮮培養基繼續培養。72小時後，除去培養上清液，用PBS洗滌4次，然後加入25 μ L/孔的DMEM培養基和25 μ L/孔的Meady-Glo (Promega 公司目錄號E2520)，按所附的說明書溶解細胞，將細胞的溶解液按40 μ L/孔移至白色的 96孔板(住友Bakelite公司目錄號MS-8496W)上，用ARVO X4 (PerkinElmer公司)測定發光強度。以和DMEM混合時的值作為100%感染，用％表示和血清樣品混合時螢光素酶的活性後，可以求出感染抑制活性(％ )。例如，將HCVcc和稀釋的血清樣品混合，在室溫下反應30分鐘。血清的稀釋用DMEM 培養基(含10% FCSdnvitrogen公司)U % MEM非必需胺基酸溶液(Invitrogen公司)、 IOmM HEPES-Tris (pH7. 3)、ImM丙酮酸鈉的DMEM)進行。向前一天在96孔板上按1 X IO4細胞/孔培養的Huh7. 5. 1細胞中添加J6/JFH1-HCV顆粒等的HCVcc和血清樣品的混合液， 在37°C培養3小時。培養後除去樣品，用PBS洗滌細胞1次，然後加入新鮮培養基繼續培養。72小時後，除去培養上清液，將板浸在冰冷卻的甲醇中，固定細胞。之後，風乾除去甲醇，用含0. 3% Triton (註冊商標)-XlOO (GE Healthcare公司)的BlockAce (註冊商標) (大日本製藥公司)進行細胞的可溶化處置。與HRP標記抗HCV-核心抗體(Ortho公司) 反應後，用QuantaBlu (註冊商標)(PIERCE公司)反應液檢測C型肝炎病毒感染細胞。加入QuantaBlu終止液後，按20 μ L/孔移至黑色的384孔板(Corning公司目錄號3676)， 用ARVO X4(PerkinElmer公司)測定螢光強度。以和DMEM混合時的值作為100%感染，用％表示和血清樣品混合時QuantaBlu的螢光強度後，可以求出感染抑制活性(％ )。按以上的操作可以確認，本發明的疫苗組合物具有顯著優異的感染抑制活性。而且，該疫苗組合物不僅對用作抗原的基因型加的！！⑶，對其他各種基因型(例如la、lb、2b 等)的HCV也可發揮優異的感染抑制活性，是有利的。實施例下面，基於實施例更具體地說明本發明。(實施例1)J6/JFH1-HCV 顆粒的製作將分離自暴發性肝炎患者的C型肝炎病毒(HCV)JFHl株(基因型加)的基因組 RNA全部區域逆轉錄獲得的cDNA(基因組cDNA)克隆至pUC19質粒的T7RNA啟動子序列的下遊，將獲得的質粒DNA即ρJFHl (ffakita, T.等人，Nat. Med.，11(2005)791-796頁及國際公開WO 2004/104198)用EcoR I消化後，進一步用Bcl I部分消化，製備切除了 EcoR I部位至最初的BclI部位的片段(約^40bp)的質粒DNA片段，將其純化。另一方面，將來自HCV J6CF 株的基因組 cDNA(GenBank 登錄號 AF177036，Yanagi， M.，等人，Virology 262:250-263(1999))克隆至pUC19質粒的T7 RNA啟動子序列的下遊， 將獲得的質粒DNA即pJ6CF(國際公開WO 2006/022422)用EcoR I和Bcl I部分消化，將獲得的約^40bp的片段純化，將該片段連接至切除了上述EcoRI-Bcl I片段的pJFHl質粒片段，製作質粒DNA PJ6/JFH1。克隆至該ρJ6/JFHl中的DNA (SEQ ID NO 2)為嵌合病毒基因組cDNA，其是使JFHl株基因組cDNA的編碼NS2蛋白的17位胺基酸殘基至C末端的區域的序列，順序編碼NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白的序列以及3， 非翻譯區與J6CF株基因組cDNA的5』非翻譯區，編碼核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白的序列以及編碼NS2蛋白的N末端至16位胺基酸殘基的區域的序列連接而成的。用)(bal切割上述PJ6/JFH1後，加入綠豆核酸酶20U (總反應液量50μυ在30°C培育30分鐘，由此使^CbaI切割末端平滑。接下來，進行苯酚-氯仿提取、乙醇沉澱，獲得除去了 CTAG的4鹼基的^CbaI切割片段。以該DNA作為模板，用MEGAscript T7試劑盒(Ambion 公司)合成RNA。將如此合成的HCV RNA用於以下的細胞導入。將3X IO6 個的 Huh-7 細胞和 5 μ g 的 HCV RNA 懸浮於 Cytomix 溶液(120mM KCl、 0. 15mM CaCl2UOmM K2HP04/KH2P04、25mM H印es、2mM EGTA、5mM MgCl2,20mM ATP、50mM 穀胱甘肽400yL)中，移至4mm小玻璃管中，然後使用Gene Pulser (BioRad公司)在^OV、 950 μ F下使HCV RNA電穿孔至Huh_7細胞中。之後，將HCV RNA導入細胞接種在IOcm2培養皿中，進行繼代培養。繼代時，使用HCV抗原ELISA檢測試劑盒(Ortho公司)對培養上清液中所含的HCV核心蛋白進行定量，確認HCV顆粒的產生。選擇核心蛋白的量多、HCV顆粒產生的活性高的培養上清液，作為病毒原液(virus stocks)保存。向用10% FCS-DMEM培養基(1 % MEM非必需胺基酸溶液Qnvitrogen公司)、IOmM HEPES-Tris (pH7. ；3)、ImM丙酮酸鈉)培養的IOcm培養皿中的Huh_7細胞中加入上述獲得的 J6/JFH1病毒原液GX 104ffu/mL)各100 μ L左右，使HCV病毒感染Huh_7細胞。細胞適宜在不融合的情況下進行繼代，由1個225cm2培養瓶(flask)擴大培養至 6個。接下來由其中的5個225cm2培養瓶剝離細胞，接種在3個5層CellSTACK(註冊商標)(Corning公司)中，培養基添加至650mL/個。將得自餘下1個培養瓶的細胞接種在6 個培養瓶中，由此繼續以良好的效率產生病毒。繼代次日棄去培養基，加入650mL 2 % FCS-DMEM培養基(1 % MEM非必需胺基酸溶液(Invitrogen公司)、10mM HEPES(pH7. 3)、ImM丙酮酸鈉)。培養基更換3天後回收培養基，通過0. 45 μ m過濾器，然後保存在超低溫冰櫃中。另外，向回收培養上清液後的CellSTACK中加入650mL 2 % FCS-DMEM培養基(1 % MEM非必需胺基酸溶液、IOmM HEPES (pH7. 3) UmM丙酮酸鈉)，繼續培養。培養基更換2天後進行同樣的操作，回收培養上清液。再重複1次同樣的操作。這裡，將回收的培養上清液用作後述實施例中含有J6/ JFHl-HCV顆粒的培養上清液。(實施例2)J6/JFH1-HCV 顆粒的純化
將實施例1中產生的J6/JFH1-HCV顆粒用以下3個步驟純化。1)濃縮和透析過濾利用中空纖維濾芯(HollowFiber Cartridge) (GE Healthcare 公司500kDa 截留，型號UFP-500-C-8A，下稱「中空纖維」)，將上述實施例1獲得的含HCV顆粒的培養上清液濃縮至60倍。2)密度梯度超離心向 Ultra-clear 25X89mm 離心管(Beckman Coulter 公司目錄號 344058)中加入 3mL 冷卻的含 60%蔗糖的 TNE 緩衝液(IOmM Tris-HCl (pH7. 4)、150mM NaClUmM EDTA)， 覆蓋7mL含20%蔗糖的TNE緩衝液。再在含20%蔗糖的TNE緩衝液上覆蓋25mL樣品。使用SW-沘(Beckman Coulter公司)，以沘，000轉在4°C下超速離心4小時。使用25G注射針(Terumo公司)在管的底面穿孔，由該孔獲得12支ImL的組分。 測定各組分溶液的比重，確認形成了蔗糖的密度梯度。由比重大的組分開始，回收第3、4、5 號的各個組分，用於濃縮和緩衝液置換。3)濃縮和緩衝液置換使用Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (排除分子量 lOOkDa， Millipore公司)和TNE緩衝液，將洗脫組分進行緩衝液置換的同時進行濃縮。將如此獲得的濃縮液在後述免疫步驟中用作含感染性HCV顆粒的病毒液。(實施例3)HCV顆粒的滅活將實施例2的步驟1) 3)獲得的濃縮C型肝炎病毒通過紫外線照射滅活。使用東芝公司制GL-15作為紫外線的線源。具體來說，將純化的感染效價IX 106ffu/mL的含C型肝炎病毒顆粒(JFH1株)的溶液裝入塗布了矽的聚乙烯制微量離心管(Assist公司制) 中，放置在使紫外線的照射強度為20mW/cm2的距離，照射5分鐘UV-C。處置後，將C型肝炎病毒顆粒在Dulbecco，s改良培養基(Dulbecco，s modified Eagle medium, DMEM)中以 50 倍、250 倍、1250 倍、6250 倍、31250 倍、156250 倍、781250 倍系列稀釋。前一天，按1 X IO4細胞/孔在96孔聚-L-賴氨酸包被板(Corning公司制； Corning 96孔透明平底聚-L-賴氨酸包被微孔板(Corning 96 Well Clear Flat Bottom Poly-L-Lysine Coated Microplate))中接種Huh_7細胞，向其中接種系列稀釋的上述病毒顆粒，在37°C培養72小時。除去培養上清液後，將板浸在冰冷卻的甲醇中，固定細胞。之後，風乾除去甲醇，用含 0. 3% iTriton (註冊商標)-X100 (GE Healthcare 公司)的 BlockAce (註冊商標)(大日本製藥公司)進行細胞的可溶化處置。使用克隆2H9抗HCV-核心抗體(Wakita，Τ.等人， Nat. Med. 11 :791-796,2005)和山羊抗-小鼠 IgG_Alexa488 (Molecular Probe 公司)，檢測C型肝炎病毒感染細胞，在螢光顯微鏡(Olympus公司制IX-70)下計數。確認紫外線處置後的C型肝炎病毒的感染效價在檢測限以下。在後述實施例中，給予小鼠時使用這種感染性完全消失的HCV顆粒。(實施例4)J6E1FC蛋白及J6E2Fc蛋白的製作
J6E1FC蛋白及J6E2Fc蛋白按下示方法製作。(1)構建用於表達在來自HCVh的J6CF株的El蛋白中附加了人IgG的Fc蛋白的融合蛋白的載體以HCVh的J6CF株的基因組RNA的cDNA (GenBank登錄號AF177036)作為模板，利用 Advantage GC2PCR 試劑盒(Takara Bio 公司)，將 J6ElF_s(SEQ ID NO 9 CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)和 J6ElF_as(SEQ ID NO :10 :TCGGGATCCCAATGAGCCCCG CTAATGATGTC)用作引物，通過PCR法擴增編碼El蛋白的基因，所述El蛋白為以J6CF株的前體蛋白的N末端的起始甲硫氨酸作為第1位時由第192位 第353位構成的蛋白。將PCR法擴增的片段克隆至pCR-TOPOanvitrogen公司)中。分析3個克隆的核苷酸序列，將核苷酸序列正確的克隆命名為「PT0P0-J6E1F」。接著，用Hind III和BamH I消化p3XFLAG_CMV_13 (Sigma公司)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離後進行純化。將該DNA片段、以及用Hind III和BamH I消化pT0P0_J6ElF獲得的含編碼J6CF的El蛋白的cDNA的DNA片段用T4 DNA連接酶環化。將該載體命名為 「CMV-13-J6E1F」。將 CMV-13-J6E1F 用 Sac I 和 BamH I 消化，將編碼 JFHl 的 El 蛋白的 DNA 片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，用GeneElute (Sigma公司)純化。將表達由小鼠IL-7受體-人免疫球蛋白Fc區域構成的嵌合蛋白的載體 CDM-mIL7R-Ig(Sudo 等，Proc Natl. Acad Sci USA，1993年，90卷，9125 91 頁)用 Sac I 和BamH I消化，將含編碼人免疫球蛋白Fc區域的序列的DNA片段通過瓊脂糖電泳分離、純化。將該DNA片段和上述編碼J6E1蛋白的DNA片段用T4DNA連接酶連接，獲得表達由J6E1 蛋白和免疫球蛋白的Fc區域構成的嵌合蛋白(下稱「J6E1FC蛋白」)的載體「CDM-J6E1FC」。 (2)構建用於表達在來自HCVh的J6CF株的E2蛋白中附加了人IgG的Fc蛋白的融合蛋白的載體首先，以HCVh 的 J6CF 株的基因組 RNA 的 cDNA (GenBank 登錄號AF177036) 作為模板，利用 Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio 公司)，將 J6E2Fc_s (SEQ ID NO 6 :CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)禾口 J6E2Fc_as (SEQ ID NO :7: ACAGGATCCCATCGGACGATGTATTTTGTG)用作引物，通過PCR法擴增編碼下述蛋白的基因，所述蛋白為以J6CF株的前體蛋白的N末端的起始甲硫氨酸作為第1位時由相當於第384位 第720位的胺基酸殘基的區域構成的蛋白。接著，將擴增的DNA片段克隆至pCR-TOPOanVitrogen公司)中，分析3個克隆的核苷酸序列。從具有正確的核苷酸序列的插入片段的克隆中，用Hind III和BamH I消化編碼抗原E2蛋白的基因片段並切出，插入p3XFLAG-CMV-13(Sigma公司)的信號肽序列下遊的Hind III部位和BamH I部位之間，使符合讀框，將該載體命名為「CMV-13-J6E2」。接下來，將CMV-13-J6E2用Mc I和BamH I消化，將生成的編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，用GeneElute (Sigma公司)純化。之後，在表達由小鼠IL-7受體-人免疫球蛋白Fc區域構成的嵌合蛋白的載體 CDM-IiiIL7R-Ig (Sudo 等，Proc Natl. Acad Sci USA，I993 年，9O 卷，9I25 9U9 頁)的 Sac I部位和BamH I部位之間，插入上述編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的各個DNA片段，使符合讀框，獲得表達附加了人免疫球蛋白的Fc區域的抗原E2蛋白(下稱「J6E2FC蛋白」)的載體 「CDM-J6E2Fc，，。
(3)表達HCVEl蛋白或HCVE2蛋白與IgGFc蛋白的融合蛋白如下所述，將CDM-J6E1FC或CDM_J6E2Fc導入來自猴腎臟的COSl細胞中，表達各
融合蛋白。首先，用含有10%胎牛血清(Invitrogen公司)、100U/mL青黴素、100 μ g/mL鏈黴素的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)繼代培養COSl細胞，在基因導入的前一天，以2 倍的稀釋倍率接種到150cm2培養瓶(Corning Coaster公司)中，在37°C、5% CO2培養箱
中培養一夜。之後，在RPMI1640培養基中加入DEAE葡聚糖(GE Healthcare公司)和氯喹 (Sigma公司)，使其終濃度分別為400 μ g/mL和100 μ Μ,按每13mL為0. 1 μ g/ μ L的濃度加入50 μ g上述表達載體CDM-J6ElFc或CDM_J6E2Fc，培養3 4天。培養後，吸除COSl細胞的上清液，添加IOmL的PBS(-)(日水製藥公司)，再次通過吸除PBS (-)洗滌細胞，接下來，按13mL/150cm2培養瓶添加DEAE葡聚糖-DNA混合液，在 37°C>5% CO2存在下靜置。4小時後，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合液，用IOmL的PBS洗滌1次，按50mL/培養瓶加入Hybridoma-SFM培養基Qnvitrogen公司)，在37°C、5 % CO2存在下培養4天。之後，將培養上清液回收到50mL的離心管(Corning Coaster公司)中，在2500rpm、30分鐘、 4°C下離心分離，將其上清液用0. 2 μ m的過濾器(Whatman公司)過濾。(3)純化HCVEl蛋白或HCVE2蛋白與IgGFc蛋白的融合蛋白使用結合有蛋白-A的載體印_A(MiIlipore公司)，如下所述將導入了 CDM-J6EIFc或CDM-J6E2Fc的COSl細胞的培養上清液純化。首先，將ImL的ftOs印-A填充在Econo-Column中，使500mL的培養上清液以1 1. 5mL/分鐘的流速通過，之後用20mL的PBS(-)洗滌。接著，用0. IM甘氨酸_HCl(pH3.0)按ImL/組分洗脫出5個組分。洗脫後，立即添加IM Tris-HCl (pH9.幻，返回中性。將各組分的其中20 μ L在還原下通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分級分離，用考馬斯亮藍染色。結果顯示，HCVEl蛋白與人免疫球蛋白Fc區域的融合蛋白(J6E1FC蛋白)或HCVE2蛋白與人免疫球蛋白Fc區域的融合蛋白(J6E2Fc蛋白)得到純化，還原下的分子量分別為約60kDa和約97kDa。(實施例5)含抗原和佐劑的疫苗組合物的製備如下所示，以乳劑的形式製備疫苗組合物。佐劑使用Alum、非甲基化 CpG-ODN、polyI:C。Alum 使用 PIERCE 公司的 Imject Alum (註冊商標)，目錄號 77161。非甲基化 CpG-ODN 使用 Mod87s (SEQ ID NO :5)。polyI:C 購自Yamasa Shoyu公司。這些佐劑單獨或組合使用。單獨使用佐劑時，按Alum 為 200 μ g/100 μ L、Mod87s 為 25 μ g/100 μ L、polyI: C 為 100 μ g/100 μ L 製備。另外，組合使用佐劑時(Alum+Mod87s、Alum+poly I C 或Mod87s+poly I C)，按 Alum 為 200 μ g/50 μ L、Mod87s 為 25 μ g/50 μ L、polyI: C 為 100 μ g/50 μ L 製備，分別組合使用3種之中的2種佐劑。用實施例4所示的J6E2Fc蛋白作為抗原時，向IOOyL 0. 2 μ g/μ L的J6E2Fc蛋白溶液(含20yg的J6E2Fc蛋白)中加入50 μ L的Alum和Mod87s，形成乳劑。需要說明的是，將5 μ g的J6E2FC蛋白作為抗原時，向25 μ L 0. 2 μ g/ μ L的J6E2FC蛋白溶液中加入 75 μ L的PBS達到100 μ L，同樣地與佐劑混合。單獨使用佐劑時，相對於實施例3所示的、用作抗原的含滅活J6/JFH1-HCV顆粒 (相當於2pmol HCV核心的量)的溶液100 μ L，加入等量的Alum、Mod87s或poly I: C，形成乳劑。另夕卜，組合使用佐劑時，相對於含滅活J6/JFH1-HCV顆粒的溶液IOOyL,加入分別組合選自 50 μ L ^ Alum,50 μ L 的 Mod87s、50y L 的 poly I:C 中的 2 種佐劑(合計 100 μ L)， 形成乳劑。(實施例6)疫苗組合物的免疫應答誘導能力的評價1.疫苗組合物的給予1) J6E2FC嵌合蛋白的給予向Balb/c小鼠(5周齡，雌)腹腔內給予實施例5製備的含J6E2Fc蛋白(5 μ g或 20 μ g)的乳劑進行免疫。2周後，同樣地腹腔內給予同樣製備的含J6E2FC蛋白的乳劑進一步免疫。血清樣品由最終免疫10天後採集的血液製備。需要說明的是，作為對照，給予生理鹽水。2)滅活J6/JFH1-HCV顆粒的給予向Balb/c小鼠(5周齡，雌)腹腔內給予實施例5製備的含滅活J6/JFH1-HCV顆粒(相當於2pmol HCV核心的量)的乳劑進行免疫。2周後，同樣地腹腔內給予同樣製備的含滅活J6/JFH1-HCV顆粒的乳劑進一步免疫。再在4周後及6周後，同樣地腹腔內給予進行免疫。血清樣品由最終免疫1周後(初次免疫7周後)採集的血液製備。需要說明的是，作為對照，給予生理鹽水。2.測定抗El蛋白和E2蛋白的抗體效價測定上述「1.疫苗組合物的給予」中給予各疫苗組合物小鼠的血清中抗El蛋白和 E2蛋白的抗體效價。抗體效價的測定如下進行將El蛋白或E2蛋白固定在板上，用EIA評價疫苗接種小鼠血清中的抗體是否與固定在該板上的E1蛋白或E2蛋白結合。1)來自J6CF株的E2蛋白的製作如下所示製備J6CF株的E2蛋白。以來自基因型加的J6CF株的基因組 cDNA (GenBank 登錄號 AF177036)作為模板，使用 Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio 公司)、以及 J6E2Fc-s (SEQ ID NO 6 CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)和 J6E2dTM_as (SEQ ID NO 8 :GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT)，通過 PCR 法擴增編碼 E2 蛋白的基因，所述E2蛋白為以J6CF全長蛋白序列(J6CF株基因組序列所編碼的一個連續的蛋白序列； GenBank登錄號AF177036中也有記載的胺基酸序列)的N末端的起始甲硫氨酸作為第1 位時相當於384位至720位胺基酸殘基的、不含跨膜域的蛋白。將擴增的DNA片段克隆至 pCR-TOPO(Invitrogen)中，分析3個克隆的核苷酸序列。將具有正確的核苷酸序列的插入片段的克隆命名為pT0P0-J6E2dTM。接著，將用Hind III 和 XbaI 消化 p3XFLAG_CMV_9 (SIGMA)獲得的 DNA 和用 Hind III和XbaI自pT0P0-J6E2dTM切出的約1，OOObp的DNA片段用T4DNA連接酶連接而環化。 將該載體命名為「CMV-3XFLAGJ6E2dTM」。如下所述，將CMV-3XFLAGJ6E2dTM導入來自猴腎臟的COSl細胞(根據理研細胞銀行的保藏號RCB0143獲得)表達蛋白。用含有10%胎牛血清anvitrogen公司)、100U/mL青黴素、100 μ g/mL硫酸鏈黴素的Dulbecco』 s MEM(D_MEM =Invitrogen公司)培養COSl細胞。在基因導入前一天，以 2倍的稀釋倍率將COSl細胞接種到150cm2培養瓶(Corning Coaster)中，在37°C、5% CO2
培養箱中培養一夜。另一方面，向D-MEM培養基Qnvitorogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯喹(SIGMA)，使其終濃度分別為400 μ g/mL和100 μ Μ,再按照每13mL該溶液為0. 1 μ g/ μ L 的濃度加入50 μ g上述表達載體CMV-3XFLAGJ6E2dTM進行培養。接著，吸除培養的COSl細胞的上清液後，添加IOmL的PBS (-)(日水)洗滌細胞1次。吸除PBS (-)後，按照13mL/150cm2 培養瓶加入DEAE葡聚糖-DNA混合液，在37°C、5% CO2存在下培育4小時。4小時後，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合液，用IOmL的PBS洗滌1次，按50mL/培養瓶加入CHO-SFM培養基anvitorogen)，在37°C、5% (X)2存在下培養。4天後，將培養上清液回收至50mL的離心管(Corning Coaster)中。回收的上清液在以6，OOOrpm(使用HITACHI RPR9-2轉子)、30分鐘、4°C離心後，用0. 2 μ m的過濾器(Whatman公司)過濾。使用抗FLAG M2瓊脂糖(SIGMA)，如下所述純化過濾的培養上清液。向500mL的培養上清液中添加ImL的抗FLAG M2瓊脂糖，用轉瓶邊攪拌邊在4°C (低溫室)下反應2 小時。2小時後，將上清液和抗FLAG M2瓊脂糖的混合液移至Econo-Column (BIO-RAD)中， 回收流出的組分(flow-through fractions)。接著，用 IOmL 的 TBS (50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7. 4)洗滌2次。用0. IM甘氨酸-HCl (pH3. 5)按ImL/組分洗脫出6個組分。洗脫後，立即添加IM Tris-HCl (pH9. 5)，返回中性。將各組分的20 μ L在還原下供給SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，用考馬斯亮藍染色。結果，確認來自J6CF株的Ε2蛋白得到純化。將該蛋白稱為「J6E2dTM蛋白」。2)測定血清樣品中的抗包膜蛋白的抗體效價關於由上述「1.疫苗組合物的給予」中給予了各疫苗組合物的小鼠採血得到的血清，通過下示方法測定抗J6CF株的El蛋白和E2蛋白的抗體效價。關於抗來自J6CF株的 El蛋白的抗體效價，用J6E1FC蛋白作為抗原，關於抗來自J6CF株的E2蛋白的抗體效價，用 J6E2Fc蛋白或J6E2dTM蛋白作為抗原。用PBS將抗原稀釋至1 μ g/mL後，按每50 μ L/孔添加至酶標板(Immunoplate) (Nunc公司目錄號4394M)，通過在室溫下培育2小時或在 4°C下培育一夜使其固相化。棄去抗原溶液，按每200 μ L/孔添加用MilliQ水稀釋5倍的 Blocking One (Nacalai Tesque公司目錄號03953-95)，在室溫下培育1小時或在4°C下培育一夜，進行封閉。封閉結束後，用0. 05%吐溫20/PBS按150 μ L/孔洗滌2次，按每50 μ L/ 孔添加用0. 05%吐溫20/PBS稀釋至1000 10000倍的血清，在室溫下反應1. 5小時。反應結束後，用0. 05 %吐溫20/PBS按150 μ L/孔洗滌3次，按每50 μ L/孔添加用0. 05 %吐溫20/PBS稀釋至5000倍的辣根過氧化物酶複合體化抗小鼠IgG (GE Healthcare公司)，在室溫下反應1小時。反應結束後，用0. 05%吐溫20/PBS洗滌4次，按每50 μ L/孔添加過氧化物酶顯色試劑盒(住友Bakelite公司目錄號ML-1120T)的顯色液(含1/100量的基質液)，在室溫下培育5分 15分鐘。通過按每50 μ L/孔添加停止液終止反應，用Benchmark Plus (Bio-Rad公司)測定450nm的吸光度。3.測定中和效價
通過評價由上述1.中給予各疫苗組合物的小鼠採血得到的血清樣品中的抗體是否可抑制HCVpp感染或HCVcc感染來檢驗疫苗效果。1)感染性HCV樣顆粒(HCVpp)的製作HCVpp的製作按照Bartosch等的方法進行(文獻=Bartosch, B.等人，(2003) J. Exp. Med.，197,633-642)。該方法如下通過使3種載體(表達逆轉錄病毒的Gag-pol的載體、表達HCV的包膜蛋白的載體、表達報導基因的逆轉錄病毒包裝載體)在動物細胞中表達，報導基因被包裝，製作在其病毒表面表達HCV包膜蛋白的假病毒。為了製作攜帶基因型加的包膜蛋白的HCVpp，使用將編碼基因型加的HCV株即 J6CF的蛋白(NCBI蛋白質登錄號AAF01178. 1)的132位的胺基酸殘基至750位的胺基酸殘基(核心蛋白的一部分、E1、E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3. 1而獲得的表達載體pcDNA J6dC-E2。為了製作攜帶基因型Ia的包膜蛋白的HCVpp，使用將編碼基因型Ia的HCV即 H77的蛋白(NCBI蛋白質登錄號AAB67036. 1)的132位的胺基酸殘基至746位的胺基酸殘基(核心蛋白的一部分、EU E2蛋白)的核酸克隆至pcDNA3. 1而獲得的表達載體pcDNA H77dC-E2。為了製作攜帶基因型Ib的包膜蛋白的HCVpp，使用將編碼基因型Ib的HCV即 TH 的蛋白(ffakita, T.等人，J. Biol. Chem.，269 14205-14210，1994 ;Moradpour，D.等人， Biochem. Biophys. Res. Commun.，246 :920-924,1998 ；以及國際公開 W02006/022422)的 132 位的胺基酸殘基至747位的胺基酸殘基(核心蛋白的一部分、EU E2蛋白)的核酸克隆至 pcDNA3. 1而獲得的表達載體pcDNA THdC_E2。作為將編碼小鼠白血病病毒的gag和pol的基因克隆化的表達載體，使用feg-Pol 5349。作為將螢光素酶基因克隆化的逆轉錄病毒包裝載體，使用LucU6。293T細胞在10% FCS-DMEM培養基(1% MEM非必需胺基酸溶液Qnvitrogen公司)、10mM HEPES (pH7. 3)、lmM 丙酮酸鈉、100 單位/mL 青黴素、100 μ g/mL 鏈黴素(Gibco 公司目錄號15140-122))(下稱「DMEM-10F」)中繼代培養。培養使用膠原包被的培養瓶 (IWAKI公司目錄號4100-010和4160-010)。將細胞接種在膠原包被的IOcm培養皿中(IWAKI公司目錄號4020-010)，達到2. 5X IO6細胞/培養皿，培養一夜。將下示量的 Opti-MEM (Gibco 公司目錄號 11058)、FuGENE6 (Roche 公司目錄號 11814443001)以及 3 種構建物(construct) (HCV 包膜蛋白表達載體、Gag-Pol 5349 及 Luc 126)按 Opti-MEM 為 500 μ L、FuGENE6 為 21. 6 μ L、HCV 包膜蛋白表達載體為 1 μ g、Gag-Pol 5349 為 3. 1 μ g、 Lucl26為3. 1 μ g(或與它們相同的構成比)進行混合，在室溫下培育15分鐘。將細胞的培養基更換為Opti-MEM 7. 5mL,向其中添加DNA複合體，在37°C、5% CO2下培育6小時。反應結束後，用PBS洗滌1次，添加8mL DMEM-10F，在37°C、5% CO2下培育48小時。培養結束後，回收上清液，將用0. 45 μ m過濾器過濾所得的溶液作為HCVpp溶液。HCVpp按每 ImL分注，在-80°C下保存。將如此獲得的攜帶基因型加的J6CF株的結構蛋白的假HCV顆粒稱為「 J6CF HCVpp",攜帶基因型Ia的H77株的結構蛋白的假HCV顆粒稱為「H77 HCVpp",攜帶基因型 Ib的TH株的結構蛋白的假HCV顆粒稱為「TH HCVpp」。2)感染抑制活性的測定對於由上述「1.疫苗組合物的給予」中給予各疫苗組合物進行免疫的小鼠採集的血清，通過下示方法測定HCV感染抑制活性。
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(A)使用HCVpp病毒的HCV感染抑制活性將Huh7. 5. 1細胞按IX IO4細胞/孔接種在96孔板(包被poly-D-lysin)上，培養一夜。向上述1)的步驟獲得的J6CF HCVpp病毒液(培養上清液)中等量混合小鼠血清， 在室溫下培育30分鐘。小鼠血清用DMEM培養基(含10% FCSdnvitrogen公司)、1% MEM 非必需胺基酸溶液Gnvitrogen公司)、10mM HEPES-Tris (pH7. 3) UmM丙酮酸鈉的DMEM) 稀釋50倍使用(小鼠血清的最終稀釋倍率100倍)。棄去細胞的培養基後，加入小鼠血清按50 μ L/孔加入培育的病毒液，在37°C下培育3小時。棄去病毒液後，用PBS按100 μ L/ 孔洗滌1次，加入200 μ L/孔的DMEM培養基，在37°C下培育72小時。棄去培養基後，加入 25 μ L/孔的DMEM培養基和25 μ L/孔的Steady-Glo (Promega公司目錄號E2520)，按所附的說明書溶解細胞。將細胞的溶解液按40 μ L/孔移至白色的96孔板(住友Bakelite公司目錄號MS-8496W)，使用ARVO Χ4 (PerkinElmer公司)測定發光強度。此外，為了確認來自用攜帶基因型加的結構蛋白的J6/JFH1-HCV顆粒免疫的小鼠的血清對攜帶基因型Ia和Ib的結構蛋白的HCV是否具有感染抑制活性，使用H77HCVpp(攜帶基因型Ia的結構蛋白的假HCV顆粒)和TH HCVpp (攜帶基因型Ib的結構蛋白的假HCV 顆粒)，通過與上述同樣的方法測定小鼠血清的感染抑制活性。(B)使用HCVcc病毒的HCV 感染抑制活性將Huh7. 5. 1細胞按IX IO4細胞/孔接種在96孔板(包被poly-D-lysin)上，培養一夜。作為HCVcc病毒液，使用上述實施例2中的步驟1)獲得的J6/JFH1-HCV顆粒液(含 HCV顆粒的培養上清液的濃縮液)(下稱「J6/JH11 HCVcc」)，向其中等量混合小鼠血清，在室溫下培育30分鐘。小鼠血清用DMEM培養基(含10% FCSdnvitrogen公司)、1% MEM非必需胺基酸溶液Qnvitrogen公司)、10mM HEPES-Tris (pH7. 3) UmM丙酮酸鈉的DMEM)稀釋50倍使用(小鼠血清的最終稀釋倍率100倍)。棄去細胞的培養基後，加入小鼠血清按 50 μ L/孔加入培育的病毒液，在37°C下培育3小時。棄去病毒液後，用PBS按100 μ L/孔洗滌1次，加入200 μ L/孔的DMEM培養基，在37°C下培育72小時。除去培養上清液後，將板浸在冰冷卻的甲醇中，固定細胞。之後，風乾除去甲醇，按100 μ L/孔加入含0. 3% Triton (註冊商標)-X100 (GEHealthcare公司)的BlockAce (註冊商標)(大日本製藥公司)，在4°C 封閉處置一夜。用PBS按150 μ L/孔洗滌2次，按50 μ L/孔加入稀釋100倍的HRP標記抗 HCV-核心抗體(Ortho公司)，反應1小時，然後用PBS按150 μ L/孔洗滌4次，按50 μ L/ 孔加入QuantaBlu (註冊商標)(PIERCE公司)反應液，在室溫下靜置30分鐘，按50 μ L/孔加入QuantaBlu停止液停止反應。按20 μ L/孔移至黑色的384孔板(Corning公司目錄號3676)，使用ARVO X4 (PerkinElmer公司)測定螢光強度。此外，為了確認來自用攜帶基因型加的結構蛋白的J6/JFH1-HCV顆粒免疫的小鼠的血清對攜帶基因型Ib的結構蛋白的HCVcc是否具有感染抑制活性，使用TH/JFHl-HCV顆粒液(攜帶基因型Ib的結構蛋白的HCVcc顆粒)(下稱「TH/JHll HCVcc」)，通過與上述同樣的方法測定血清的感染抑制活性。需要說明的是，TH/JFHl HCVcc利用W02009/131203中記載的方法製備。4.以J6E2FC蛋白為抗原的疫苗組合物的免疫應答誘導能力的評價1)含J6E2FC蛋白作為抗原的疫苗組合物的免疫應答誘導能力關於上述「1.疫苗組合物的給予」的1)中給予含J6E2FC蛋白的疫苗組合物的小鼠，抗E2蛋白的抗體效價測定(上述「2.抗El蛋白和E2蛋白的抗體效價測定」)的結果示於圖1中。圖中的對照表示未給予的正常小鼠血清、5 μ g和20 μ g表示給予的J6E2Fc蛋白的量，X 1000、X 3000、X 10000表示小鼠血清稀釋倍率。如圖1所示，確認與單獨的Alum、 Mod87s相比，Alum+Mod87s誘導抗E2蛋白抗體的活性強。關於在上述「1.疫苗組合物的給予」的1)中給予含J6E2FC蛋白的疫苗組合物的小鼠，中和效價(感染抑制率)測定(上述「3.中和效價測定」)的結果中，給予含對E2蛋白顯示最高值抗體效價的20 μ g的J6E2Fc蛋白和作為佐劑的Alum+Mod87s的疫苗組合物的小鼠的結果示於圖2。如圖2所示，免疫小鼠的血清停留在對J6CF HCVpp顯示12%的感染抑制活性。因此，以J6E2Fc蛋白作為抗原的疫苗組合物，即使在用Alum+Mod87s作為佐劑的情況下，抗E2蛋白的抗體效價也升高，但沒有HCV的感染抑制活性。2)含滅活J6/JFH1-HCV顆粒作為抗原的疫苗組合物的免疫應答誘導能力關於上述「1.疫苗組合物的給予」的2、中給予含滅活J6/JFH1-HCV的疫苗組合物的小鼠，抗El蛋白或E2蛋白的抗體效價測定(上述「2.抗El蛋白和E2蛋白的抗體效價測定」)的結果分別示於圖3和圖4中。如圖3所示，與單獨的Alum和單獨的Mod87s相比，含單獨的 polyI:C、Alum+Mod87s、Alum+poly I:C 以及 Mod87s+poly I :C 的疫苗組合物顯示出抗El蛋白的抗體效價有所增加。另外，如圖4所示，與單獨的Alum和單獨的Mod87s 相比,含單獨的 polyI:C、Alum+Mod87s、Alum+poly I :C、Mod87s+poly I:C 的疫苗組合物顯示出抗E2蛋白的抗體效價有所增加。關於上述「 1.疫苗組合物的給予」的2、中給予含滅活J6/JFH1-HCV的疫苗組合物的小鼠，中和效價(感染抑制率)測定(上述「3.中和效價測定」)的結果示於圖5中。如圖5所示，使用Alum和Mod87s的組合佐劑的疫苗組合物對J6CF HCVpp顯示60%的感染抑制活性，而使用其他佐劑的疫苗組合物，給予使用感染抑制活性最強的、單獨的Alum佐劑的疫苗組合物的小鼠仍停留在顯示47%的感染抑制活性。關於上述「3.中和效價測定」的2)中用滅活J6/JFH1-HCV免疫的小鼠的血清，研究免疫使用的基因型加以外的基因型的HCV的感染抑制能力的結果示於圖6(H77HCVpp(攜帶基因型Ia的結構蛋白的假HCV顆粒))和圖7 (TH HCVpp (攜帶基因型Ib的結構蛋白的假 HCV顆粒))中。使用基因型Ia的H77HCVpp測定感染抑制活性的結果為以Alum+Mod87s 作為佐劑的疫苗組合物顯示84%的感染抑制活性，以Alum單獨作為佐劑的疫苗組合物顯示70%的感染抑制活性(圖6)。另一方面，使用基因型Ib的TH HCVpp測定感染抑制活性的結果為以Alum+Mod87S作為佐劑的疫苗組合物顯示72%的感染抑制活性，以Alum單獨作為佐劑的疫苗組合物顯示55%的感染抑制活性(圖7)。關於上述「1.疫苗組合物的給予」的2、中給予含滅活J6/JFH1-HCV的疫苗組合物的小鼠的血清，使用基因型h&J6/JFHlHCVCC的中和效價測定(上述「3.中和效價測定」)的結果示於圖8中。如圖8所示，以Alum+Mod87S作為佐劑的疫苗組合物顯示56% 的感染抑制活性，而使用其他佐劑的疫苗組合物中，給予使用感染抑制活性最強的、單獨的 Mod87s和單獨的poly I C佐劑的疫苗組合物的小鼠各自仍停留在顯示的阻害活性。關於在上述「3.中和效價測定」的2)中給予含滅活J6/JFH1-HCV的疫苗組合物的小鼠的血清，研究免疫使用的基因型加以外的基因型的HCVcc的感染抑制能力的結果示於圖9中。如圖9所示，使用基因型Ib的TH/JHll HCVcc測定感染抑制活性的結果為以 Alum+Mod87s作為佐劑的疫苗組合物顯示42%的感染抑制活性，而使用其他佐劑的疫苗組合物，以感染抑制活性最強的Mod87S+poly I C作為佐劑的疫苗組合物為27%。由這些結果可知，Alum+Mod87s的佐劑有利地誘導顯示HCV的感染抑制活性的抗體。而且，這些結果顯示在用基因型加WHCV免疫誘導的抗體中，不僅存在抑制基因型加的HCV感染的抗體，也存在抑制基因型Ia和Ib的HCV感染的抗體。[序列表自由文本]SEQ ID NO 1 JFHlSEQ ID NO 2 合成 DNA J6/JFH1SEQ ID NO 3 合成 DNA TH/JFHlSEQ ID NO 4 合成寡核苷酸 Mod87SEQ ID NO 5 合成寡核苷酸Mod87s。1 7及20位的鹼基為硫代磷酸酯化的鳥嘌呤。SEQ ID NO :6 引物 J6E2Fc_sSEQ ID NO :7 引物 J6E2Fc_asSEQ ID NO :8 引物 J6E2dTM_as
權利要求
1.C型肝炎病毒疫苗組合物，其包含將由含編碼來自C型肝炎病毒的JFHl株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白的序列的C型肝炎病毒基因組製作的感染性C型肝炎病毒顆粒滅活獲得的滅活病毒顆粒；序列表的SEQ ID NO :5記載的含非甲基化CpG的寡核苷酸；以及氫氧化鋁。
2 權利要求1記載的C型肝炎病毒疫苗組合物，其中所述C型肝炎病毒基因組含有編碼來自C型肝炎病毒的J6CF株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白的序列。
3.權利要求1或2記載的C型肝炎病毒疫苗組合物，其中所述C型肝炎病毒基因組包含編碼來自C型肝炎病毒的J6CF株的NS2蛋白的N末端的胺基酸殘基至第16位胺基酸殘基的序列；和編碼來自C型肝炎病毒的JFHl株的NS2蛋白的始自N末端的第17位胺基酸殘基至C 末端的胺基酸殘基的序列。
4.C型肝炎病毒疫苗組合物，其包含將含有來自C型肝炎病毒的Ji7Hl株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及 NS5B蛋白的感染性C型肝炎病毒顆粒滅活獲得的滅活病毒顆粒； 序列表的SEQ ID NO :5記載的含非甲基化CpG的寡核苷酸；以及氫氧化鋁。
5.權利要求3記載的C型肝炎病毒疫苗組合物，其中所述感染性C型肝炎病毒含有來自C型肝炎病毒的J6CF株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白及p7蛋白。
6.權利要求4或5記載的C型肝炎病毒疫苗組合物，其中所述感染性C型肝炎病毒的 NS2蛋白為嵌合蛋白，所述NS2蛋白的N末端的胺基酸殘基至第16位胺基酸殘基來自J6CF 株，所述NS2蛋白的始自N末端的第17位胺基酸殘基至C末端的胺基酸殘基來自JFHl株。
全文摘要
找出誘導具有HCV感染抑制活性的抗體的HCV抗原和最適合的佐劑的組合，提供有效的HCV疫苗組合物。C型肝炎病毒疫苗組合物，其包含將由含編碼來自C型肝炎病毒的JFH1株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白及NS5B蛋白的序列的C型肝炎病毒基因組製作的感染性C型肝炎病毒顆粒滅活獲得的滅活病毒顆粒；序列表的SEQ ID NO5記載的含非甲基化CpG的寡核苷酸；以及氫氧化鋁。
文檔編號C07K14/18GK102596244SQ20108004513
公開日2012年7月18日 申請日期2010年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者中村紀子, 森山正樹, 脅田隆字, 赤澤大輔 申請人:東麗株式會社, 日本國立感染症研究所, 財團法人東京都醫學綜合研究所