植物無選擇轉化的製作方法

2023-07-21 02:17:16 1

專利名稱：：植物無選擇轉化的製作方法植物無選擇轉化
背景技術：
：本申請要求於2006年8月31日申請的美國臨時申請順序號60/841,519的優先權，該臨時申請所公開的全部內容都通過引用結合到本文中。1.發明領域本發明涉及植物生物
技術領域：
。具體地講，本發明涉及產生轉基因植物的方法，該方法在得到再生植物或植物部分之前無需使用選擇標記基因。2,相關技術的描述植物細胞的穩定轉化和轉基因植物的產生通常需要選擇步驟，其中在接觸一個或多個外源核酸序列(包括含有一個或多個編碼目標基因和標記基因的序列的外源核酸序列)後，在選擇劑存在下選擇植物組織。經過這樣的選擇後，可使含有目標基因(GOI)的穩定轉化植物再生並進行鑑定。然而，一旦產生含有GOI的轉化植物後，通常就不再需要本身並非GOI的可選擇或可篩選的標記基因，而且其存在可能使後續分析和產品開發工作變得複雜化。此外，需要強啟動子以驅動選擇標記，已經顯示出會偏倚所需基因的表達(Yoo等，2005)。已經報導了產生無標記基因的轉基因植物的各種方法，例如共轉化、可轉座元件、位點特異性重組和染色體內重組(例如Darbani等,2007)。然而，這些系統大部分既肆毛時又〗氐效。Goldsbrough(2001)綜DeVetten等(2003;和美國專利申請公布說明書2005/0097641)5描述了營養體繁殖作物(例如馬鈴薯)的無標記轉化方法，然而會產生嵌合植物。Palys等(PCT公布說明書WO2004/081184)介紹了番茄、萵苣和甘藍的無選擇轉化。Francis和Spiker(2005)介紹了用基於PCR的篩選來鑑定轉基因擬南芥C4ra&V/opw》系，以免轉基因整合中的選擇偏倚。相比之下，本發明提供通過在獲得再生玉米植物之前不需要存在選擇劑或可篩選標記基因(例如目測標記基因)的方法而快速有效產生種系轉化玉米植物的方法。發明概述一方面，本發明提供轉基因玉米植物的鑑定方法，所述方法包括(a)獲得用含有目標核酸序列的DNA區段轉化的玉米植物細胞；(b)不經過測定所述DNA區段存在的初次篩選，就從所述細胞再生出多個玉米植林或分化的玉米植物部分；和(c)從多個玉米植林或分化的玉米植物部分中鑑定出至少第一轉基因玉米植物或轉基因分化植物部分。在一些實施方案中，DNA區段不包含選擇標記基因或目測標記基因。在其它實施方案中，植物在固體培養基、液體培養基或者固體與液體培養基組合上生長而得以再生。在具體的實施方案中，植物通過僅在液體培養基上生長並隨後接觸含GOI的細胞、而在鑑定轉基因玉米植物或轉基因分化植物部分之前就得以再生。在某些實施方案中，將僅生長在液體培養基中並隨後接觸含GOI的細胞、而在鑑定轉基因植物或轉基因植物部分之前的細胞轉化頻率，與在固體培養基或土壤上生長並隨後接觸含GOI的細胞、而在鑑定轉基因植物或轉基因植物部分之前的細胞轉化頻率進行比較，前者相對更高。在某些實施方案中，植物細胞是未成熟的玉米胚細胞。在具體的實施方案中，未成熟玉米胚的長度約1.5mm至約3.5mm,或長度約1.9mm至約2.3mm。在某些實施方案中，所述方法在步驟(b)與(c)之間還包括(l)將多個玉米植物或分化的植物部分放入裝有生長培養基或水的培養管或生長穴盆(growthplug)中並保留玉米植物各自的識別標記；和(2)讓植物或植物部分經歷至少第一測定，看DNA區段是否存在，從而根據測定結果來鑑定一個或多個植物或植物部分是轉基因的。測定還可選自DNA印跡雜交、PCR、DNA測序、RNA印跡、蛋白質印跡、免疫測定和DNA區段所編碼的酶活性測定。在具體的實施方案中，在將再生植抹植入土壤之前進行測定。在其它實施方案中，鑑定推定缺乏目標核酸序列的轉化玉米植物或分化的植物部分，其中在包含匯集所述多個玉米植物或分化的植物部分的合併核酸亞類的植物組織上進行測定。在一些實施方案中，在DNA區段轉化到玉米植物細胞後不遲於6周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它實施方案中，在DNA區段轉化到玉米植物細胞後不遲於4周使玉米植物或玉米植物部分再生。在又一些實施方案中，在DNA區段轉化到玉米植物細胞後不遲於3周使玉米植物或玉米植物部分再生。在再一些實施方案中，在DNA區段轉化到玉米植物細胞後不遲於2周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它實施方案中，在DNA區段轉化到玉米植物細胞後不遲於1周使玉米植物或玉米植物部分再生。在某些實施方案中，通過細菌介導的轉化、電穿孔、PEG介導的轉化或粒子轟擊法，將DNA區段引入玉米植物細胞中。在具體的實施方案中，細菌介導的轉化是由選自土壤桿菌(^gra^cfen'wm)細胞、根瘤菌(A/^oZ^w)細胞、中華根瘤菌0S/wor/2izo6/ww)細胞和中間根瘤菌(AfesoWz&c^MW)糹田胞的細菌細胞介導的。該方法還可包括在植物或植物部分再生後、使從第一玉米植物細胞獲取的玉米植物或植物部分經歷培養條件的步驟，所述條件選擇或允許篩選目標核酸序列的存在與否。在某些實施方案中，生長培養基是固體培養基。在又一些實施方案中，生長培養基是液體。在再一些實施方案中，生長培養基是土壤。在其它實施方案中，再生植物或分化的植物部分就DNA區段的存在而言是一致的。附圖簡述下列附圖構成本說明書的組成部分，用於進一步證明本發明的某些方面。參考這些附圖中的一幅或多幅並結合本文所給出的具體實施方案的詳細描述，可以更好地理解本發明。圖1.無選擇("nosel")轉化方案和ZT轉化方案的示意性比較。(有關2T策略的細節請參見Huang等，2004)。圖2.用代表性再生品系的GUS進行的組織化學分析。圖3.通過用草甘膦溶液噴灑各才直林後"無選擇"方法的草甘膦耐受性事件的恢復。圖4.來自如實施例4所述的所選Ro植物的代表性DNA印跡分析數據。圖5.用Ro花粉和與親本系回交-驗證GUS基因的繼代種系傳遞和分離。圖6.所選獨立轉化事件後代的DNA印跡分析數據，證明轉化序列(CP4基因)的穩定傳遞。圖7.安排生長穴盆以允許在轉基因序列存在的測定後容易鑑定各個植林。圖8.利用半固體培養基-比較有選擇方法和無選擇方法的再生方案的示意圖。圖9.用獲取再生植林之前的無選擇液體培養的再生方案-增殖培養基的比較。發明詳述許多現代遺傳轉化植物的產品開發都包括將多個轉基因性狀集中在一起，從而給農民們提供多個增值性狀。該方法的一個主要瓶頸就是存在著選擇標記基因，在轉化期間這些基因與目標基因(GOI)—起攜帶，因為該過程通常依賴於使用選擇標記基因以確保植物細胞的轉化。儘管在轉化後去除選擇標記基因有多種方法可行，但這些方法通常都耗時且效率也不高。本發明通過開發無需使用選擇標記基因的有效轉化方法，以及用於推進無選擇產生的轉基因事件的有效的植物處理和篩選方法，從而消除了上述瓶頸。具體地講，本發明涉及不用選擇而提高植物轉化效率和隨後再生的方法，導致產生無標記轉基因事件。這是產生轉基因作物的一項重大突破，因為少標記的轉化(以及隨後在選擇劑不存在時進行植物再生)避免了去除標記所帶來的麻煩，避免了因需要啟動選擇標記基因表達而使所得轉化事件遺傳結構發生偏倚，同時也避免了後代生長期間的潛在困難(例如因為相應GOI與選擇標記編碼基因的轉基因分離)。該方法也消除了對用於可選擇或可篩選標記基因的額外表達盒的需要，因而降低了轉化載體的大小並帶來相關益處(例如降低了因重複性盒序列所致沉默機會，降低了啟動子幹擾並簡化了轉化載體的構建)。無選擇標記轉基因植物的高通量產生，需要轉化體的有效產生。優選的是無選擇轉化、尤其是在獲得再生苗或完整小植抹(包含苗和根)之前的無選擇轉化，可以在選擇劑不存在時進行。在某些實施方案中，轉化到靶植物細胞的核酸序列可不包含選擇標記基因。在其它實施方案中，可存在選擇標記基因或目測標記基因，但轉化細胞和再生組織仍然不經歷選擇劑，所述選擇劑是選擇標記基因所能耐受、抵抗或對其具有指定的其它可測定表型。此外，優選這些轉化體對於GOI的存在而言是非嵌合的(即均勻的)，因為對於GOI的存在而言是非均勻的嵌合植物組織的存在，使得對含GOI的後代植物的進一步分析、產生和鑑定變得複雜化。因此，已經發現，對常規產生非嵌合轉基因植物而言的無選擇轉化(包括隨後的再生步驟)需要有效產生大的轉基因部分並快速產生苗原基(shootprimordia)。此外，在選擇壓力不存在時，大量植物都可再生，它們許多或大多數都缺乏GOI。因此，提供了用於再生、培育和鑑定潛在包含GOI的植物的有效方法。在某些實施方案中，植物的再生是在半固體培養基中進行，然後才將推定的轉化體移栽到土壤中。在其它實施方案中，培養基可以是液體的。在又一些實施方案中，在再生期間，可釆用半固體和液體培養基的組合，以便在篩選和移至組織培養期間所用的不同生長條件時進行植物的處理並能節省時間、金錢和費用。在再一些實施方案中，再生期間只使用液體培養基。在具體的實施方案中，在液體培養基上再生可提高目標基因所接觸細胞的轉化頻率。在再生出轉化植林的整個組織培養步驟中，選擇劑的存在可使所選組織特性發生偏倚，所述偏倚基本上需要某水平的選擇標記的表達，以使組織在選擇壓力下存活。舉例來說，這可導致傾向得到異源核酸序列的多重或複合插入的轉基因事件的偏倚。因此，本發明提供得到推定轉化植物群體或系列的方法，所述方法不需要讓植物在組織培養(例如愈傷組織增殖、預再生(pre-regeneration)和再生)階段期間經歷這樣的選擇壓力，而且所述植物可表現出有利的GOI表達特性、和/或在指定事件中發現的轉基因插入位點分子結構和遺傳分離相關的有利特性。具體地講，這樣的有利特性可包括例如表現出GOI的有利表達水平的有效比例的轉化事件，或表現出低拷貝數(即1-2拷貝)插入的有效比例的轉化事件。在具體的實施方案中，低拷貝數轉化事件缺乏on7或其它載體骨架(backbone)序列，如果這些序列在轉化過程開始最初接觸植物細胞的原始轉化構建體中存在的話。根據本發明方法，無這類選擇的轉化和再生是可重現且有效的。在某些實施方案中，轉化頻率(transformationfrequency,TF)定義為所得到的穩定轉化的均勻(即非嵌合)植物的數量除以包含與異源核酸構建體接觸的細胞的未成熟胚或其它外植體；轉化頻率為至少3%,根據胚的大小和培養條件(包括再生方法種類)的不同，轉化頻率的範圍為約3%至約60%。在具體的實施方案中，TF的範圍為約10%至約15%。或者，可用其它方式計算TF，例如根據所得轉化植林數量除以所述未成熟胚或其它外植體中再生並生長的植夂朱數量而求出TF。在某些實施方案中，無選擇轉化的作物選自單子葉作物，包括禾本科(Poaceae),例如玉米、水稻、高粱、小麥、黑麥、黍、甘蔗、燕麥、小黑麥、草坪草(turfgrass)和柳枝稷(switchgrass)植物。在一個具體的實施方案中，作物是玉米植物。在某些實施方案中，接觸異源核酸序列的轉化靶組織(例如外植體)包括分生組織，例如胚或苗分生組織(shootmeristem)。在某些實施方案中，外植體是胚。在具體的實施方案中，胚是未成熟胚。在再一些實施方案中，未成熟胚是未成熟玉米胚，大小介於約1.9-3.5mm之間，或大小介於約1.6-1.8mm之間。在具體的實施方案中，未成熟玉米胚的大小介於約1.9-2.5mm之間，優選約2.3mm。在其它實施方案中，未成熟玉米胚的大小為約2.5-3.2mm，或約2.8-4.0mm。根據其發育階段或分離時間、授粉後的天數(DAP)(例如約9-14天DAP或約10-12DAP),也可選擇未成熟胚作為轉化靶。為了啟動本發明的轉化過程，首先需要選擇準備插入到植物細胞或組織中的遺傳組件。遺傳組件可包括用本發明方法引入到植物細胞或組織中的任何核酸。遺傳組件可包括非植物DNA、植物DNA或合成DNA。在一個優選的實施方案中，將遺傳組件摻入到DNA組成中，例如包含至少一個或更多以下類型的遺傳組件的重組雙鏈質粒或載體分子(a)在植物細胞中起作用並導致產生RNA序列的啟動子，(b)導致產生農藝學有用產物的編碼RNA序列的結構DNA序列，和(c)在植物細胞中起作用並使聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA序列3'端的3'非翻譯DNA序列。載體可含有大量遺傳組件以便轉化植物細胞或組織並調節所需基因的表達。在一個優選的實施方案中，遺傳組件是定向的，以便能表達mRNA，而在一個實施方案中可翻譯為蛋白質。以雙鏈形式存在的植物結構編碼序列(基因，cDNA、合成DNA或其它DNA)的表達包括通過RNA聚合酶從一條DNA鏈轉錄出信使RNA(mRNA)，然後在核內加工mRNA初級轉錄物。該加工涉及將聚腺苷酸化核苷酸添加到mRNA的3'端的3'非翻譯區。含所需遺傳組件的質粒或載體的製備方法是本領域眾所周知的。載體通常由大量遺傳組件組成，包括但不限於調節元件，例如啟動子、前導序列、內含子和終止序列。根據元件與它們所控制的序列或基因的接近度，調節元件也稱為順式或反式調節元件。將DNA轉錄為mRNA是由通常稱為"啟動子"的DNA區調節的。啟動子區含有這樣的鹼基序列所述序列發信號給RNA聚合酶而使其與DNA締合併啟動轉錄為mRNA，用DNA鏈之一為模板製備相應的RNA互補鏈。文獻中已經介紹了在植物細胞中具有活性的大量啟動子。這些啟動子可包括但不限於根癌土壤桿菌C4gro6acfe/7'ww/wwe々c/e"j)根瘤誘導質粒攜帶的胭脂鹼合酶(NOS)和章魚鹼合酶(OCS)的啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子(例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子和35S啟動子)以及玄參花葉病毒(FMV)MS啟動子、增強型CaMVMS啟動子(e35S)、核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO,—種非常豐富的植物多肽)的光誘導型啟動子。所有這些啟動子都已用於產生各類DNA構建體，其已在植物中表達。也可構建啟動子雜合體以增強轉錄活性(美國專利號5,106,739)，或與所需轉錄活性、誘導性和組織特異性或發育特異性結合。在植物中起作用的啟動子包括但不限於所述誘導型啟動子、病毒啟動子、合成啟動子、組成型啟動子以及用於時間調節、空間調節和時空調節的啟動子。本領域也已知組織增強型啟動子、組織特異性啟動子或發育調節型啟動子等其它啟動子，它們都可用於本發明的實踐中。啟動子可得自不同來源，例如來自植物和植物DNA病毒，包括4旦不限於CaMV35S和FMV35S啟動子和從植物基因(例如ssRUBISCO基因)中分離的啟動子。如下所述，優選的是所選具體啟動子應當能引起足夠表達，導致產生有效量的目標基因產物。如有必要，可修飾本發明DNA構建體(例如嵌合/重組植物基因)中所用的啟動子，以影響其控制特性。可通過與操縱子區連接、隨機或控制誘變等方式來衍生啟動子。此外，可改變啟動子，使其含有多個"增強子序列"以便提高基因表達。本發明DNA構建體所產生的mRNA也可含有5'非翻譯前導序列。該序列可衍生自選擇用於表達基因的啟動子，並可經過特異性修飾以增加mRNA的翻譯。5'非翻譯區也可得自病毒RNA、合適的真核基因或合成基因序列。這樣的"增強子"序列有望提高或改變所得mRNA的翻譯效率。本發明不限於這樣的構建體其中非翻譯區得自啟動子序列所伴隨的5'非翻譯序列。相反，非翻譯前導序列可得自無關啟動子或基因(參見例如美國專利5,362,865)。用於增強表達或影響基因轉錄或翻譯的其它遺傳組件也視為遺傳組件。嵌合構建體3'非翻譯區應含有轉錄終止子、或具有等同功能的元件以及在植物中起作用的聚腺芬酸化信號，以使聚腺普酸化核苷酸添加到RNA的3'端。合適3'區的實例是(l)含有土壤桿菌根瘤誘導(Ti)質粒基因(例如胭脂鹼合酶(NOS)基因)聚腺苷酸化信號的3'轉錄、非翻譯區，和(2)植物基因例如大豆貯存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)基因。優選的3'區的實例來自豌豆的ssRUBISCOE9基因(歐洲專利申請0385962)。通常，位於聚腺普酸化位點下遊幾百個鹼基對的DNA序列的作用是終止轉錄。該DNA序列在本文中稱為轉錄終止區。該區是轉錄信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化所必需的，稱為3'非翻譯區。RNA聚合酶通過聚腺香酸化發生位點轉錄編碼DNA序列。在一個實施方案中，T-DNA不包括可選擇、可篩選或可記錄的標記基因。或者，待轉移的DNA可含有可選擇、可篩選或可記錄的標記基因，儘管在本發明的某些實施方案中，僅僅為了在再生發生後標記的存在而選擇或篩選植物組織。這些遺傳組件在本文中也稱為功能性遺傳組件，因為它們產生在轉化植物鑑定中起作用的產物或具有農藝學用途的產物。利用選擇組分的DNA在可再生植物組織(尤其是已再生組織)中起作用，以產生賦予植物組織抵抗別的毒性化合物的化合物。用作可選擇、可篩選或可記錄標記的目標基因包括但不限於編碼GUS的wW丄編碼綠色螢光蛋白(GFP)的她、花色素苷生物合成相關基因(C1，B-peru)、螢光素酶(LUX)基因和賦予例如卡那黴素等抗生素抗性的基因(Dekeyser等，1989)和賦予例如草甘膦等除草劑抗性的基因(Della-Cioppa等，1987)。其它選擇方法也可採用，包括但不限於草胺膦(phosphinothricin)耐受性、雙丙氨膦耐受性和陽性選擇機制，它們也都落入本發明的範圍之內。本發明可以與任何合適的植物轉化質粒或載體一起使用，所述質粒或載體含有可選擇或可篩選標記和所述相關調節元件，以及一個或多個核酸，其表達方式足以賦予特定性狀。本發明所包括的合適的具有農藝學價值的結構基因的實例包括但不限於昆蟲或病蟲害耐受性基因、除草劑耐受性基因、品質改良基因(例如產量、營養增強、環境或脅迫的耐受性)、或者在植物生理、生長、發育、形態或植物產物方面的任何所需改變的基因。型，其可導致對內源基因表達的定向抑制，例如通過反義或共抑制介導的機制(參見例如Bird等，l"l)。RNA也可以是催化性RNA分子(例如核酶)，所述分子經改造可切割所需內源mRNA產物(參見例如Gibson和Shillitoe,1997)。更具體地講，有關基因表達在植物細胞中的反義調節的描述，可參見美國專利5,107,065;有關植物中通過dsRNA轉錄所致的基因抑制的描述，可參見美國專利6,506,559、美國專利申請公布說明書號2002/0168707Al和美國專利申請順序號09/423,143(參見WO98/53083)、09/127,735(參見WO99/53050)和09/084,942(參見WO99/61631)，所有這些文獻都通過引用結合到本文中。因此，能產生表達目標表型或形態變化的蛋白質或mRNA的任何基因都可用於本發明的實踐。可通過本發明方法引入的示例性核酸包括例如來自另一物種的DNA序列或基因，或者甚至是原來存在於相同物種、但通過遺傳工程方法(而非傳統繁殖或育種技術)摻入到受體細胞的基因或序列。然而，術語外源也指在所轉化的細胞中通常不存在的基因，或者僅在轉化DNA區段或基因的某種形式、結構等中不存在的基因，或者是當人們需要時(例如過量表達)正常存在的基因。因此，術語"外源"基因或DNA是指引入受體細胞的任何基因或DNA區段，無論類似基因在所述細胞中是否已經存在。外源DNA所包括的DNA類型可包括植物細胞中已經存在的DNA、來自另一植物的DNA、來自不同生物體的DNA或外部產生的DNA(例如含基因的反義信息的DNA序列)或編碼基因的合成或修飾形式的DNA序列。將DNA引入細胞的技術是本領域技術人員眾所周知的，可分為包括但不限於下列類型(l)化學方法；(2)物理方法，例如顯微注射、電穿孔和微彈轟擊；(3)病毒載體；(4)受體介導機制；和(5)根瘤菌介導(例如土壤桿菌介導)的植物轉化方法(例如Broothaerts等，200》。對於土壤桿菌介導的轉化，在構建植物轉化載體或構建體之後，將體外製備成DNA組分的所述核酸分子卩1入合適的宿主(例如大腸桿菌(五.co/0)中並與另一合適宿主(例如土壤桿菌)交配，或直接轉化到感受態土壤桿菌。這些技術是本領域技術人員眾所周知的，已經描述了用於包括以下許多植物系統在內的所述技術大豆、棉花和小麥(參見例如美國專利號5,569,834和5,159,135和WO97/48814,通過引用全部結合到本文中)。本發明包括用細菌菌林將一個或多個遺傳組件^I入植物中。本領域技術人員將會知道土壤桿菌介導的轉化方法在這類過程中的應用。攜帶Ti質粒或Ri質粒的根癌土壤桿菌和髮根土壤桿菌0^rokz"eWwmr/z&ogewe力的許多野生型菌抹和解武裝菌抹(disarmedstrain)可用於將基因傳遞給植物。優選的土壤桿菌宿主分別含有解武裝Ti質粒和Ri質粒(其不含引起根瘤或髮根的癌基因)，所述質粒用作載體並含有隨後引入植物的目標基因。優選的菌抹可包括但不限於來自C58菌林的根癌土壤桿菌，胭脂鹼型菌抹(可用於介導將DNA傳遞給植物細胞)、章魚鹼型菌抹(例如LBA4404)或琥珀鹼型菌抹(例如EHA101或EHA105)。可以修飾與植物具有天然相互作用的其它細菌(例如中華根瘤菌、根瘤菌和中間根瘤菌)以介導將基因傳遞給各種不同植物。可以使這些植物相關的共生菌成為感受態，用於通過同時得到解武裝Ti質粒和合適雙元載體而進行基因傳遞(Broothaerts等，2005)。這些菌抹在植物轉化中的應用已有報導，這些方法是本領域技術人員熟知的。外植體可來自單一基因型或來自基因型組合。任何可發芽的玉米種子都是有活力的原料。在一個優選的實施方案中，來自植物雜種的優良外植體可用作外植體。例如，可用含有幾種基因型的雜種胚產生具有高培養響應(更高頻率的胚性愈傷組織形成、生長率、植物再生率等)的快速生長的細胞系。在一個實施方案中，雜交育種的F!雜種或第一代後代可用作供體植物並與另一基因型雜交。本領域技術人員知道，當兩個近交系雜交時會產生雜種優勢(在本文中也稱為"雜種活力")。因此，本發明包括使用來自三系雜交的外植體，其中至少一個或更多近交系是高度可再生和可轉化的，而且三系雜交外植體的轉化和再生頻率超過近交系各自的頻率。其它組織也可用於本發明的實踐。外植體可包括成熟胚、未成熟胚、分生組織、愈傷組織或可轉化和可再生的任何其它組織。在轉化過程中任何合適的植物培養基都可能使用。這些培養基的實例可包括但不限於Murashige和Skoog(1962)，N6(Chu等，1975);Linsmaier和Skoog(1965);Uchimiya和Murashige(1962);Gamborg氏培養基(1968),D培養基(Duncan等，1985)，McCown氏Woody植物培養基(McCown和Lloyd,1981),Nitsch和Nitsch(1969),以及Schenk和Hildebrandt(1972)或這些補充培養基的衍生物，以及以下描述的多種培養基。本領域技術人員知道，可以針對具體的目標變種來優化培養基和培養基補充物(例如用於轉化和再生的營養物和生長調節劑)和其它培養條件(例如培養時的光強度、pH和培養溫度)。在包含苗、或者包含苗和根的小植抹再生出來之後，可對小植抹或小植抹部分施用選擇劑，例如如果選擇標記基因與GOI—起轉化到原始靶植物細胞中的話，或者如果GOI本身就編碼選擇標記的話。因此，當通過本發明方法產生植物後，可根據本發明將選擇劑施用於所述植物，以便測定或鑑定顯示有用特性的轉化植物。本發明也包括有效處理再生植抹的方法，所述方法允許鑑定含有GOI的轉化植物。這些方法簡化並理順了再生和培育推定轉化植物群體的過程，節省了過程所需的時間、空間和費用，並使該方法成為商業上可行的方法。在一個實施方案中，將植物靶組織(例如未成熟玉米胚(正))與包含GOI的土壤桿菌菌抹在23。C共培養例如1-3天，然後在相同的共培養培養基或愈傷組織增殖培養基上，在3(TC繼續再培養7-10天。觀察胚，以便鑑定哪些胚"有反應"，即產生可再生而形成小植抹的胚性愈傷組織。然後，將具有愈傷組織的有反應的胚(通常是盾片愈傷組織)從共培養物中移入第一預再生培養基或第一再生培養基中，用合適的溫度、光照和營養的培養條件，讓愈傷組織進一步生長、分化和再生。可將愈傷組織放入半固體再生培養基中或放在其上。或者，可將它們放在接觸液體再生培養基的支持物(例如培養板中的墊子(felt)和/或濾紙)上，4吏愈傷組織可以生長和分化。如有需要，可以培養接種的胚，例如在30。C暗培養l-2周，包括移至新鮮營養培養基。在暗培養後，培養物可在再生培養基中在光照黑暗交替周期中生長，例如在16/8光照/黑暗周期下生長1-3周，在約27°C，光強度為約100|LiE,或根據所研究的植物種或變種的合適條件和植物組織培養領域技術人員的知識。通常，在開始共培養的l-3周內植物開始再生，尤其是當存在生長的愈傷組織階段(callusphaseofgrowth)時。該方法也可包括預再生步驟，其包括使用含有比愈傷組織增殖培養基中的植物生長素水平更低的基礎植物組織培養基。在半固體或液體培養基上培養和再生約2-3周後，可將從單個外植體(例如未成熟胚(IE))再生出的植林移入單個生長培養基容器中。一個這樣的實例是PHYTATRAY(Sigma-Aldrich,St.Louis，MO)，其包含半固體或液體植物組織培養再生培養基並讓其生長約4周，然後將所得植抹移入生長培養基(例如土壤中的生長穴盆)中以便進行壯苗。因為移栽到土壤中是時間和勞動密集型過程，所以最好在移栽之前篩選各植株，或者甚至在將它們放入PHYTATRAY之前就篩選出存在GOI或其它目標性狀的植抹。在選擇壓力不存在時，再生小植抹的數量可以比在愈傷組織生長和植物再生期間使用了選擇劑的類似實驗高出20-50倍。因此，提供了處理大量植物的方法，例如將其從組織培養期移至非無菌條件下生長時。本發明的再一個實施方案是在非無菌條件下使用園藝穴盆或分離的培養管或盤，以允許小植林生長並進行分析。這些小植抹還可以這樣培養無需標記所有單個植林、而是對生長的植林進行適當分組，以便容易找出給定植林及其組織之間的相關性，所述組織經歷一種或多種測定或篩選以鑑定含GOI的轉化植物。在一個實施方案中，可採用基於PCR的篩選，以便在移入生長培養基(包括液體生長培養基，例如在PHYTATRAY中)之前就能排除非轉化植物。因此，例如在用細菌菌林轉化時如果使用約5000個未成熟玉米胚，則可產生約25,000抹植物，需要約5,000個PHYTATRAY。如果達到約10%的轉化頻率，處於PHYTATRAY生長期的再生植林的初次篩選將得到約2500株推定的轉化植物，相當於500個有反應的胚或需要約500個PHYTATRAY,它們可移入土壤中的生長穴盆。篩選方法可包括將來自各個Phytatray或任何其它生長容器(例如穴盆)的再生植林的組織合併起來。設計合併的組織可用於通過分析多個合併組織來鑑定群體的單個成員，而無需單獨分析群體的每個成員。一個合併的方法是將來自PHYTATRAY或類似生長容器中的外植體(優選IE)的所有植物分組，並棄去陰性容器，因而極大地減少了植物處理和檢測相關工作量。合併在一起的植抹數量還可進一步增加到PCR測定的檢出限。可處理生長穴盆或將其分組，以提高進一步篩選步驟的效率，而且不需要給每個再生植林做標籤。例如可將穴盆分組排列，以對應於測定模式使用的微量滴定板，例如植物生長在96個穴盆組中，對應於96孔板。這可快速準確地建立測定結果與植物(測定組織正是自這些植物分離的)之間的關係。在某些實施方案中，在推定轉化再生的無標記植物中檢測GOI存在與否的測定可選自基於PCR的測定、DNA印跡雜交、DNA測序、RNA印跡、蛋白質印跡、免疫測定和在與土壤桿菌共培養期間接觸靶組織的轉基因DNA區段所編碼的酶活性測定。在一個具體的實施方案中，測定是基於PCR的測定。在某些實施方案中，基於PCR的測定或其它測定是在自再生植林分離的植物組織上進行的，其中再生植林生長在PHYTATRAY或等同物上，隨後才移栽到基於土壤的生長培養基上。對於得到無標記轉基因植物而言，本發明的方法比其它典型方法更有效，所述其它方法例如土壤桿菌介導的方法，使用一個或多個含GOI的T-DNA和可選擇或可篩選標記(圖1)。本發明的各實施方案提供的優勢包括1.轉化構建體較小，簡化了克隆過程。2.標記基因表達盒的消除釋放了標記盒所需的表達元件，減少了因重複元件存在所致的重組穩定性的有關問題。標記盒中重複調節元件的消除也可降J氐基因沉默的可能性。3.Ro植物的篩選方法更筒化。在現有方法中，必須篩選至少兩個元件(GOI和選擇標記基因)。在本發明方法中，無需篩選標記。另夕卜，需要篩選GOI陽性植物以判定標記基因插入序列是否與GOI插入序列連鎖，並且通常發現連鎖，這會干擾對下一代缺乏選擇標記的植物的鑑別能力。相反，連鎖卻並非本發明方法的問題。4.也發現在後代中效率提高。對於現有方法(例如2-T轉化方法)，必須篩選一大群Fi植物或R,植物才能鑑定GOI陽性的無標記植物。對於通過本發明方法產生的植物，不需要標記基因的分離。5.允許更快速選出最好的含GOI事件、而不存在選擇標記基因，因而有助於多個GOI的有效堆積，例如當選擇標記基因編碼目標農藝學性狀時。本發明提供有效產生無標記轉基因植物的方法，通常當原始靶外植體接觸外源核酸後7-10周內，能夠在基於土壤的培養基上生長。本發明的高通量方法允許開發有效的無選擇轉化系統。具體地講，處理再生組織和再生植抹的簡化允許許多步驟的機械化並能節省時間、金錢和人機工程總費用。在每次轉化實驗中，本系統使用約100個胚，就可產生約4-6個可用的無標記轉化事件(即單拷貝事件和無載體骨架事件)，因此加快了轉化植物產物的流程。實施例下列實施例用於說明本發明的實施方案。本領域技術人員應當知行之有效的技術。然而，根據本說明書，本領域技術人員應當知道，在不偏離本發明的構思、精神和範圍的前提下，可以對所公開的具體實施方案進行許多改動，而仍能得到同樣或類似的結果。更具體地講，應當清楚，某些化學和生理相關的試劑可以替代本文所述的試劑，而仍可達到相同或類似的結果。本領域技術人員顯而易見的所有這些類似的替代和修改都視為在本發明的精神、範圍和構思之內，如同所附權利要求書所限定的那樣。實施例1無標記轉化可通過根瘤菌介導的方案進行可再生的未成熟玉米胚的轉化，所述方案的一般性描述例如參見Cai等(美國專利申請公布說明書20040244075)。具體地講，使用改進的土壤桿菌介導的方法。從玉米穗中選出大小範圍為1.9-2.5mm(例如約2.3mm)的未成熟胚並與ABI土壤桿菌菌抹C58共培養，以介導DNA向含有目標重組構建體(例如同時含有處於肌動蛋白啟動子表達控制之下的GUS和CP4EPSPS的pMON93040)的植物細胞轉移，從而允許對轉化細胞和部分(sector)兩者進行目測分析，並允許使用WeathermaxTM草甘膦噴灑作為替代品，用於隨後的再生後篩選，再進行轉化植物的基於PCR的篩選的證實試驗。也可使用較大的胚(例如大小為約2.5mm或最多至約3.2mm)，而且最好是通過在組織培養的預再生和再生期之前減少愈傷組織增殖而使每個胚產生很少植抹。以下所用培養基組成見下表1。用土壤桿菌接種後，將胚移至Lynx1947或Lynx1898，在23。C共培養1-3天，然後在30。C在相同平板或愈傷組織增殖培養基(例如Lynx1316)上培養7-14天，最後在預再生培養基(Lynx1844;2232;2197)或再生培養基(Lynx1344、2282、2379等)上培養。用下列兩種方法進行植物的最後培育l)將來自每個胚源性愈傷組織的植林移至含Lynx1607的Phytatray上或2)將來自每個胚源性愈傷組織的植抹移至含液體Lynx2168的Phytatray上。讓植抹在Phytatray中生長約4周，然後移至穴盆(QPlugs,產自InternationalHorticulturalTechnologies,Hollister，CA)。在將植抹移栽到穴盆前1周，當植抹仍在Phytatray中時，自植抹上採樣並進行測定，以去除掉無GOI的植抹。塞植後(post-plugging)大約10天，自各植林採樣，進行DNA印跡分析，鑑定GOI陽性植林並保留它們，使其進一步生長發育。表1.本發明不同方面所用的培養基組成.鑑定了代表性培養基的功能。tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23實施例2在愈傷組織增殖期間無選擇壓力下轉基因部分(sector)的有效開發開發了用於在選擇劑不存在時轉基因植物有效再生的系統。外植體與土壤桿菌共培養(4天，在Lynx1898培養基(表l)上)後，愈傷組織增殖在Lynx1316(表l)進行10-14天，無選擇。然後，愈傷組織在Lynx1844培養基(表l)預再生10天，接著在LynxI344(表l)上再生10天，最後在Lynxl471上再生3周(表1)。除了在Lynxl471上培養之外，所有步驟都未使用選擇劑；因此在共培養後4周在無選擇劑下，發生愈傷組織的生長並再生出植抹。最後一步在Lynx1471上再生植抹的生長是在低水平草甘膦(0.02mM,體積比)存在下進行至估計最大可能的轉化頻率。將組織移至Lynx1471培養基之前，在轉化後4周，將24個獨立的來自胚的愈傷組織和相關組織染色以測定GUS活性。鑑定出4個GUS陽性苗，由此證明~16%轉化效率。將組織移至Phytatray中的Lynx1471,讓植抹進一步生長，共再生出43個轉基因事件，它們全都存活至移栽土Jt裡。轉化和拷貝數分析見下表2。共有約14°/。的存活植抹逃逸，但約45%的植抹轉化了1-2個插入序列。轉化後5周，代表性再生愈傷組織系的組織化學分析見圖2。表2.僅在植物再生最後步驟期間用有選擇的有效轉化表明形成了無選擇的有效轉化部分。tableseeoriginaldocumentpage24實施例3額外的玉米轉化和再生實驗，對推定轉化植物的篩選又進行了3項研究以證實在任何時期都不用選擇時轉基因部分的有效再生是常規可行的。所用質粒是如上所述的pMON93040。在Lynx1898上共培養1天後，在Lynx1316上進行愈傷組織增殖達10天，在Lynx1844上預再生10天，然後在Lynx1344上再生3天，接著在Lynx1607上生長。用單個玉米穗分離胚，用於每次實驗，所述胚的大小範圍為2.8-3.2mm。在兩項研究中，進行胚的接種，直接將分離胚接種到土壤桿菌懸液(在0".66=1.0時)中，而在其它研究中，胚初次分離到下列成分的1ml液體Lynx1013培養基(l升)中，接著用O.D.66Q=1.0的土壤桿菌懸液進行接種MS基礎鹽(Phytotech):2.165g;MS維生素(100X;Phytotech):10ml;蔗糖(Phytotech):68.5g;脯氨酸(Fisher):0.115g.;葡萄糖(Phytotech)36g，用KOH將培養基調節至pH5.4,然後過濾除菌。研究結果見下表3。表3.額外的玉米無選擇轉化。tableseeoriginaldocumentpage25*括號中的數據表示有反應的胚的數量；~50%胚在培養中有反應"IES數量"=接種的未成熟胚的數量在再生周期結束時，將每次實驗的植林移栽到穴盆中，超過95%的植抹移栽成活，證明繁殖穴盆提供了處理大量植抹的改良方式。移栽後約10天，用組織化學染色，對每棵植林葉片打孔測定GUS活性，再移栽GUS陽性植抹，用於進一步生長和組織化學分析。為了進一步證明轉化頻率並提高方案的總效率，開發出一種基於PCR篩選的替代方法，其中將1%WeatherMaxTM(草甘膦)施用於GUS陰性植林。鑑定出另外5抹耐草甘膦植林(從實驗6700-2鑑定出3林，從實驗6698-2和實驗6688-2中分別鑑定出1林(參見圖3的代表性植林)。共37抹植物得自穴盆中的723抹植物，每林植物的收率估計為5%的成功率(表3)。用未成熟胚的無選擇轉化的結果表明，該方法是有效的，基於所篩選的植林數量計算具有平均為5%的轉化頻率。為了進一步證明無選擇轉化方案的重現性並提高方案的總效率，開發出一種基於PCR篩選的替代方法，其中在PHYTATRAY中的無選擇再生周期結束以後施用1%WeatherMax(草甘膦)。結果見下表4和表5。表4.有效並可重現的玉米無選擇轉化tableseeoriginaldocumentpage26表5.具有較低拷貝插入序列的事件從無選擇轉化中有效恢復。tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27結果表明，在總共900個胚中，產生了141抹耐草甘膦植抹，包括具有較低目標基因拷貝數(l-2個拷貝)的IOO林，即基於所接種的未成熟胚的數量計算具有平均為約15%TF。進一步篩選(表6)表明，在通過表5所示的100個低拷貝數事件的DNA印跡分析篩選出的90個事件中，存在79個獨立整合事件。姊妹事件是具有相同條帶模式並來自同一外植體的事件。更高轉化頻率導致具有姊妹事件的轉基因事件的更高百分率。然而，其頻率非常低，而且DNA印跡分析揭示5。/。表現出克隆性(clonality)，尤其是當TF>30%時(表5和6)。表6.無選擇轉化效率-所產生的獨立整合事件的數量。tableseeoriginaldocumentpage27實施例4證實在無選擇壓力下轉化和再生後，轉移DNA的染色體整合使用例如Dellaporta(1983)所述方法，從Ro植物葉片中分離基因組DNA。基因組DNA(20-30嗎)用///"dill消化，在0.7%(重量/體積)瓊脂糖凝膠上進行分離，再轉移到帶正電荷的尼龍膜(RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)上。用非放射性的基於DIG的系統(RocheMolecularBiochemicals),按照製造商的方案，進行膜的預雜交、雜交、洗滌和檢測。CP4基因的DNA序列經PCR標記，以產生探針。///"dill酶在載體中切割一次(靠近CP4表達盒的5，端)，因此，DNA印跡條帶數對應於CP4基因拷貝數。在所選植林上進行DNA印跡分析，見表3(即選擇22個較低拷貝事件)。Rq植物的代表性DNA印跡分析數據見圖4。分析表明，從320個胚產生的共37個事件中產生了8個(單拷貝，ony陰性)事件(表3)。為了進一步證實種系繼代傳遞，將Ro植物與親本非轉化近交玉米系雜交。在該項研究中，使用來自3種獨立品系的R,植物；ZMJ87694(4拷貝-cp4);ZM—189983(0拷貝,cp-4-可能的cp4截短事件)；ZM一187738(3拷貝-cp4)。對發育中的穗的gw表達進行組織化學分析表明，陽性玉米粒與未表達玉米粒的比例為1:1,表明轉基因和連鎖的種系傳遞(圖5)。該結果證實用無選擇產生的轉基因事件的轉基因種系傳遞。用CP4基因作為探針，也通過DNA印跡分析對3個額外獨立事件ZM_187692、ZM—18997和ZMJ8998的後代進行了分析(圖6),表明從這3種不同Ro植物獲得的所有後代都表現出預期模式，即轉基因事件向下一代穩定傳遞。實施例5有效的植物處理有效處理多個植株的方法是在獲得再生植抹前不用選擇劑的有效植物轉化系統的一個重要組成部分。這是因為需要篩選大量植物，以鑑定具有合適的插入序列拷貝數和複雜性、以及GOI表達的轉化植物。該"處理"(例如轉移或移栽到培養基或土壤中以便進一步生長；和在篩選步驟期間保留識別標記)允許在一個放有獨立穴盆或培養管的容器內處理多個小植林，同時保留植抹各自的識別標記，而且還有利於在無單個植物標籤時進行數據採集。在"園藝穴盆，，中培育植物、省略對每林植物分別做標籤並開發用於採集測定數據的方案以鑑定和向前推動所需事件，這一系列工作加快了基於在基因轉移和再生期間無選擇的轉化流程。總之，本發明涉及有效的植物無選擇轉化系統、植物處理和數據採集的開發。將從與含有目標基因的土壤桿菌菌抹共培養的愈傷組織再生出的推定轉化植抹，從例如PhytatrayTM移栽到生長穴盆的土壤中。使用這些穴盆使植物的採樣和分析更流暢並能節省生長空間。例如，將穴盆安排的模式對應於例如96孔微量滴定板的各孔(例如圖7),如果植物樣品的測定在這樣的微量滴定板中進行時。這允許方便地鑑定出具有目標測定表型的植物，而無需給每個植抹單獨做標籤。通過基於PCR或其它分子篩選，完成不含GOI植抹的早期排除，當植株在PHYTATRAY的半固體或液體培養基中再生時，然後再將植林移栽到生長穴盆或土壤。實施例6在轉化植物再生期間用於培養的半固體培養基用於在轉化和組織培養過程中愈傷組織生長、預再生和再生期間的培養用半固體培養基允許有效的組織操作。圖8歸納了無選擇劑時進行的轉化研究(下圖)，與在選擇劑存在下培養植物組織的平行研究(上圖)進行比較。參見表1和表7的培養基成分。愈傷組織增殖、預再生和再生期均在所示的半固體培養基中進行。在第二再生期後，將植抹移栽到生長穴盆中，測定GOI的存在。表7.在現有方法中使用的含有半固體含草甘膦選擇培養基的培養基組成(Cai等；美國專利申請公布說明書2004/00244075)。tableseeoriginaldocumentpage30*含有1250mg/L煙酸(Sigma),250mg/L鹽酸吡哆醇(Sigma),250mg/L鹽酸碌u胺素(Sigma)和250mg/L泛酸鉤(Sigma)。實施例7轉化植物再生期間的液體培養。在轉化和組織培養過程中愈傷組織生長、預再生和再生期間的液體培養允許有效的組織操作。圖9表明在再生前無選擇劑時進行的轉化和再生研究。愈傷組織增殖、預再生和再生期在所示的液體無草甘膦培養基中進行。在第二再生期(其也可在半固體培養基上發生)後，將植抹移栽到生長穴盆中。GUS組織化學測定可以與基於PCR或其它篩選方法(例如用草甘膦的替代篩選)聯用，以檢測在再生植抹組織中例如草甘膦耐受性的表達。用無標記基因的載體(即pMON97372)或有標記基因的載體(pMON93040)進行了這些實驗。圖9所示的用於研究的質粒是含cp4和gws基因的pMON93040。將來自各穗的胚分離到裝有1ml液體Lynx1013培養基的培養皿中，並在Lynx1947上共培養。如下表8所示，將胚分為不同處理組，包括有選擇8周(處理1);無選擇8周，液體培養，在PHYTATRAY中的固體培養基上生長(處理2);和無選擇8周，液體培養，在PHYTATRAY中的液體培養基上生長(處理3)。與用有選擇獲得的轉化相比，用無選擇的轉化非常有效(1/3X)。"液體穴盆，，方法的結果歸納於下表8。當小的外植體樣品僅用液體培養(即處理#3，，用Lynx2168作為最終生長培養基)培養時，效率更高，幾乎與有選擇所得到的一樣高。如下表9所示，液體培養看來能促進轉基因事件更有效再生。可能是不用繼代培養，就可降低脅迫並加快植物再生。表8.用"液體穴盆方案"和無需使用選擇的有效轉化。tableseeoriginaldocumentpage32表9.轉化效率與再生效率的關係。tableseeoriginaldocumentpage32實施例8轉化效率與愈傷組織增殖期間持續時間的關係愈傷組織增殖期間持續時間對轉化頻率的作用見下表10。縮短愈傷組織期間的時間可提高TF，更快產生植物。表IO.更長的愈傷組織增殖期對無選擇轉化的不利影響。tableseeoriginaldocumentpage33實施例9用無選擇快速液體培養進行轉化和再生為了進一步使過程更流暢，開發了長達6周的快速液體循環(RLC)方案，其中省略愈傷組織增殖步驟(Lynx2133)。轉化方案的步驟包括預再生(Lynx2197)和再生期(Lynx2168和Lynx1607，例如圖9和表11)。含有Cp4和gws基因的pMON93040用於該項研究。將來自各穗的胚分離到裝有液體培養基(Lynx1013)的培養皿中，在Lynx1947培養基上共培養，然後如下表11所示分為處理組。處理包括比較有選擇或無選擇的胚的TF,並比較在Lynx2197增殖培養基上1周或2周的效果。如表ll所示，縮短在Lynx2197增殖培養基上的持續時間確實會影響TF。然而，當採用在預再生培養基上生長的最佳持續時間時，無選擇轉化所得到的TF與有選擇所得到的TF類似。表11.用無選擇的快速液體培養方案進行有效轉化。tableseeoriginaldocumentpage34在這些實驗中，進一步縮短愈傷組織增殖、預再生和再生期的持續時間，並將使用選擇與在非選擇性培養基上生長進行比較。減少所需組織處理步驟進一步使該方法適合於自動化(另見下表15)。對如上所述獲得的所選植物的表達水平進行比較，表明按照針對pinll3'轉錄終止信號的基於PCR的測定得到類似表達水平(表12)。表12.對按照轉基因拷貝數分類的植物進行表達分析。tableseeoriginaldocumentpage34*來自"無選擇"的植物在採樣時為2周齡無選擇的快速液體培養方案的總時間安排見下表13。表13.無選擇的快速液體培養方案。tableseeoriginaldocumentpage35為了證實以上基於表13所述方案所得結果，用pMON93040轉化，進行了3項實驗。如下表14所示將胚分為不同處理組。在這些實驗中，GUS測定在小植抹上進行；不噴灑草甘膦。來自各穗的胚分離到裝有1ml液體Lynx1013培養基的培養皿中，並在Lynx1947上共培養。如結果所示，與用有選擇所得到的轉化相比，用無選擇的轉化非常有效(〉60%)。表14.快速轉化方案對有選擇和無選擇都有效。tableseeoriginaldocumentpage35為了更好地理解細胞增殖的特性及其對無選擇轉化的影響，用兩種不同的共培養培養基(含0.5mg/l2，4-D的Lynx1947和含0.2mg/l2,4-D的Lynx2232)進行額外實驗。將來自每種共培養培養基的胚平分為2組，移入預再生培養基(含0.2mg/l2，4-D-Lynx2197)或再生培養基(不含任何生長調節劑-Lynx2282)中。用僅含w'c^基因的少標記的轉化載體(pMON97372)進行5次實驗(8415-8419)。實驗方法的概述見圖9。植林在穴盆中定植後，將來自每個胚衍生品系的植物匯集在一起，染色測定GUS，以鑑定陽性品系。然後，對陽性克隆的每個品系進行進一步GUS染色，以鑑定GUS陽性事件。將每個穗的約1/5的胚分別與對照w!V^+cp4載體(pMON97367)—起接種，然後按照RLC方案(例如表13)來比較有選擇和無選擇的轉化結果(實驗8420)。這些實驗結果歸納於下表15和16。表15.用gws載體(pMON97372)的有效的無選擇轉化。tableseeoriginaldocumentpage36tableseeoriginaldocumentpage37如表15所示，發現含2,4-D濃度比Lynx2232更高的共培養培養基Lynx1947更好。這些結果表明再生前細胞增殖有利於得到有效的無選擇轉化。此外，外植體在無生長調節劑的培養基(例如Lynx2282)上再生、然後共培養並不會明顯減少植物/胚數量。將採用RLC方案、用pMON97367轉化的胚的轉化頻率進行比較，表明無選擇轉化是有效的。此外，拷貝數分析表明更高百分率的植物具有更低拷貝的插入序列(表17)。表17:無選擇轉化產生更高％的單拷貝or/K陰性事件。tableseeoriginaldocumentpage38認為缺乏選擇和/或更短的T-DNA可能是產生更高％可用事件的原因。對於無選擇處理，優選胚的大小範圍比RLC所用的胚大小範圍(1.9-2.1mm)稍微大一些(2.0-2.3mm)。通過DNA印跡雜交而驗證的120個事件(表17)表明，所有事件都是獨立的。這進一步強調在更早的發現在低TF(15%)下得到的大多數事件都是獨立事件，表明在移栽生長穴盆前釆用匯集策略，可進一步提高方案的效率。實施例10在移栽穴盆之前篩選植物，以排除非轉基因植物，提高效率來自含最終生長培養基(Lynx1607)的單個容器的植物匯集在一起，用組織化學GUS測定來檢測gus並用PCR檢測轉基因的存在。GUS與PCR測定間有100%相關性。該研究允許排除無陽性事件的生長容器，因此極大降低了植物處理的負擔並提高通量。按照本說明書，無需過度實驗就可製備和實施本文所公開和要求保護的所有組合物和/或方法。儘管在優選的實施方案中已經描述了本發明的組合物和方法，但是本領域技術人員顯而易見的是，在不偏離本發明的構思、精神和範圍的前提下，可以對本文所述的組合物和/或方法以及所述方法的步驟或步驟順序進行改動。更具體地講，顯而易見的是某些化學和生理相關的試劑可以替代本文所述的試劑，而仍可達到相同或類似的結果。本領域技術人員顯而易見的所有這些類似的替代和修改都視為在本發明的精神、範圍和構思之內，如同所附權利要求書所限定的那樣。參考文獻下列參考文獻通過引用結合到本文中，其程度是它們補充、解釋、提供背景、或教導本文所用的方法、技術和/或組合物。美國專利5,362,865美國專利5,106,739美國專利5,107,065美國專利5,159,135美國專利5,569,834美國專利6,506,559美國專利申請順序號09/423,143美國專利公布說明書2002/0168707Al美國專利/>布說明書20040244075美國專利公布說明書2005/0097641Bird等，所ofec/z7ev"9:207-227，1991.Broothaerts等，Atowre,433(7026):583腸584，2005.Chu等，5We倫57w'ca，18:659,1975.Darbani等，/，2:83-90，2007.DeVetten等，艦5/ofec/mo/"21:439-442,2003.Dekeyser等，屍/a"f戶/^w.o/"90:217-223，1989.Della-Cioppa等，祝o/Tec/z"o/ogy，5:579-584,1987.DellaportaP/a"fAfo/.5/o/.1:19-21，1983.Duncan等，屍/a"to，165:322-332，1985.歐洲專利申請0385962Francis和Spiker,屍/a"f41:464-471,2005.Gamborg等，五jcp.CW/ie&,50:151，1968.Gibson和Shillitoe,Mo/.5/oto^.，7:125-137,1997.Goldsbrough,Methodsforavoidanceandremovalofselectablemarkergenesincroptransformationsystems(避免和去除作物轉4匕系統中的選擇標記基因的方法),2001.Huang等，rnmsge"/c/仏13:451-61，2004.Linsmaier和Skoog，屍/z戸'o/.18:100，1965.McCown和Lloyd,T7ow5W認e,16:453，1981.Murashige和Skoog,屍/^w'o/.iVaW,15:473-497,1962.Nitsch和Nitsch,Scz'e"ce,163:85-87，1969.PCT申請WO09/084,942PCT申請WO09/127,735PCT申請WO2004/081184PCT申請WO97/48814PCT申請WO98/53083PCT申請WO99/53050PCT申請WO99/61631Schenk和Hildebrandt,Oz"./50:199-204，1972.Uchimiya和Murashige,Haw/屍/z拜'o/.15:473,1962.Yoo等，221:523-530,2005.權利要求1.一種鑑定轉基因玉米植物的方法，所述方法包括(a)獲得用含有目標核酸序列的DNA區段轉化的玉米植物細胞；(b)不經過測定所述DNA區段存在的初次篩選，就從所述細胞再生出多個玉米植株或分化的玉米植物部分；(c)從所述多個玉米植株或分化的玉米植物部分中鑑定出至少第一轉基因玉米植物或轉基因分化植物部分。2.權利要求1的方法，其中所述DNA區段不包含選擇標記或目測標記基因。3.權利要求1的方法，其中所述植物在固體培養基、液體培養基或者固體與液體培養基組合上生長而得以再生。4.權利要求3的方法，其中所述植物通過僅在液體培養基上生長而得以再生，然後鑑定所述轉基因植物或轉基因分化植物部分。5.權利要求4的方法，其中將僅生長在液體培養基中並隨後接觸含GOI的細胞、而在鑑定轉基因植物或轉基因植物部分之前的細胞轉化頻率，與在固體培養基、半固體培養基、土壤或者固體培養基、半固體培養基、液體培養基和/或土壤的組合上生長並隨後接觸含GOI的細胞、而在鑑定轉基因植物或轉基因植物部分之前的細胞轉化頻率進行比較，前者相對更高。6.權利要求l的方法，其中所述植物細胞是未成熟玉米胚細胞。7.權利要求6的方法，其中所述未成熟玉米胚的長度為約1,5mm至約3.5mm。8.權利要求7的方法，其中所述未成熟玉米胚的長度為約1.9mm至約2.3mm。9.權利要求1的方法，所述方法在步驟(b)與(c)之間還包括(1)將所述多個玉米植物或分化的植物部分放入裝有生長培養基或水的培養管或生長穴盆中並保留玉米植物各自的識別標記；和(2)讓所述^:物或^:物部分經歷至少第一測定，看所述dna區段是否存在，從而根據所述測定結果來鑑定一個或多個植物或植物部分是轉基因的。10.權利要求9的方法，其中所述測定選自dna印跡雜交、pcr、dna測序、rna印跡、蛋白質印跡、免疫測定和所述dna區^殳所編碼的酶活性測定。11.權利要求9的方法，其中所述測定是在將所述再生植林移入土壤前進行的。12.權利要求10的方法，其中鑑定缺乏目標核酸序列的推定轉化的玉米植物或分化的植物部分，其中在包含匯集所述多個玉米植物或分化的植物部分的合併核酸亞類的植物組織上進行所述測定。13.權利要求1的方法，其中在所述dna區段轉化到玉米植物細胞後不遲於6周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。14.權利要求1的方法，其中在所述dna區段轉化到玉米植物細胞後不遲於4周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。15.權利要求1的方法，其中在所述dna區段轉化到玉米植物細胞後不遲於3周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。16.權利要求1的方法，其中在所述dna區段轉化到玉米植物細胞後不遲於2周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。17.權利要求1的方法，其中在所述dna區段轉化到玉米植物細胞後不遲於1周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。18.權利要求1的方法，其中通過細菌介導的轉化、電穿孔、peg介導的轉化或粒子轟擊法，將所述dna區段引入所述玉米植物細胞中。19.權利要求18的方法，其中所述細菌介導的轉化是由選自土壤桿菌細胞、根瘤菌細胞、中華根瘤菌細胞和中間根瘤菌細胞的細菌細胞介導的。20.權利要求1的方法，所述方法還包括在植物或植物部分再生後、使來自第一玉米植物細胞的玉米植物或植物部分經歷培養條件的步驟，所述條件選擇或允許篩選目標核酸序列的存在與否。21.權利要求l的方法，其中所述生長培養基是固體培養基。22.權利要求21的方法，其中所述生長培養基是土:t。23.權利要求1的方法，其中所述再生植物或分化的植物部分就所述DNA區段的存在而言是一致的。全文摘要本發明提供用於鑑定再生轉化植物和分化的轉化植物部分的方法，所述方法在使植物細胞再生以得到分化組織之前，無需讓植物細胞經歷選擇條件。在具體的實施方案中，所述植物細胞是玉米植物細胞。也提供了植物的培育和處理方法，包括對表現出特定目標性狀的植物的鑑定方法。文檔編號C12N15/82GK101528932SQ200780039999公開日2009年9月9日申請日期2007年8月31日優先權日2006年8月31日發明者J·R·勞特申請人:孟山都技術有限公司