一種番茄抗冷害基因及應用的製作方法

2023-07-20 23:11:21

本發明屬於植物生物
技術領域：
，具體地說，涉及一種番茄抗冷害基因及應用。
背景技術：
：神經鞘脂質(Sphingolipids)是一類含有脂肪酸和長鏈鞘氨醇骨架的複雜脂類總稱。它是在內質網上由絲氨酸軟脂醯輔酶A轉移酶(Serinepalmitoyltransferase,SPT)催化絲氨酸和棕櫚醯輔酶A而從頭合成的。該類脂質是植物細胞質膜，液泡膜和內膜系統的重要組成部分，約佔膜上脂類的40％，主要存在於細胞膜的外葉。細胞膜的外葉會影響膜的完整性和離子的通透性，而細胞膜在低溫條件下的生理狀態是植物抗冷害能力的重要指標。此外，神經鞘脂質可以被還原生成一種含有不飽和烴基鏈的十八碳氨基醇，即鞘氨醇(Sphinganine)。它是一類長鏈基(Longchainbase,LCB)，可以被鞘磷脂脫氫酶(Sphingolipiddesaturase,SLD)催化生成不飽和的鞘磷脂。大量的研究表明，不飽和鞘磷脂在耐寒型植物中大量存在，因為該物質含量的多少影響著植物耐寒能力的高低。在擬南芥中，葡糖苷醯鞘氨醇(d18:1c24:0)含量的上升可以增強植株的抗凍能力。也有實驗進一步表明，AtSLD基因突變的擬南芥植株在低溫環境下會出現萎黃病，植株不能正常生長。另外，研究發現，葡萄苷醯鞘氨醇在細胞膜和液泡膜上有相當高的含量，而高度羥基化的葡萄苷醯鞘氨醇對維持細胞膜和液泡膜的完整性非常重要。△8-鞘磷脂脫氫酶是催化鞘脂長鏈基C8位脫氫生成△8-不飽和鞘磷脂的關鍵酶。冷害處理可以促使大豆葉片中含葡萄苷醯鞘氨醇的△8-不飽和鞘磷脂含量增加，因此，可以認為△8-不飽和鞘磷脂及△8-鞘磷脂脫氫酶與大豆的抗寒性密切相關。從前人的研究中可以發現，神經鞘脂質及其不飽和鞘磷脂脫氫酶可能影響著植物的抗冷害能力。然而，關於該脫氫酶與抗寒關係的研究仍較少，特別是在經濟作物方面，二者的聯繫還有待進一步的闡明。番茄(LycopersiconesculentumMill)系茄科番茄屬植物，是一種重要的經濟作物，與國民的「菜籃子工程」息息相關。它是冷敏感型植物，低溫冷害會給番茄的生產造成較大損失，是影響番茄周年生產量和市場供應的主要因素之一。多數番茄品種在溫度低於10℃時生長發育容易受阻，當溫度低於6℃時表現出明顯的冷害症狀，所以關於番茄對低溫環境的適應性受到了學者們的廣泛關注。為了改良番茄品種，提高番茄對低溫的抵抗力，減少番茄受冷害的經濟損失，目前研究者們已經在細胞膜結構、抗氧化性酶、細胞壁物質代謝等多方面對番茄抗冷害機制進行了探索。但是，還未有研究者探索過△8-鞘磷脂脫氫酶在番茄低溫適應性中的作用。因此，本發明不僅從神經鞘脂質代謝這個全新的角度去挖掘番茄抗冷害的機制，同時也為培育耐低溫番茄品種提供一定的理論依據，對提高番茄種植的適應性、擴大栽種面積、增加產量等方面具有重要的意義。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種番茄抗冷害基因SlSLD，該基因的沉默可以導致番茄耐低溫能力降低。該基因可以應用於番茄抗凍育種，可以有效的提高番茄品種的抗凍性。本發明的另一個目的在於提供一種番茄抗冷害基因在番茄耐寒育種中的應用。通過提高植物體內SlSLD基因表達量來進行植物耐低溫育種，以此來使植物的適宜種植範圍擴大。一種番茄△8-鞘磷脂脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。編碼上述番茄△8-鞘磷脂脫氫酶基因的番茄△8-鞘磷脂脫氫酶，其胺基酸序列如SEQIDNO.2所示。通過調節本發明所描述的SlSLD基因的表達，可以改變植物對冷的敏感性。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明通過病毒誘導的基因沉默(Virusinducedgenesilencing,VIGS)技術發現了一種新的番茄抗冷害相關基因SlSLD，該基因的沉默可以導致番茄植株的耐低溫能力明顯降低。對該基因編碼的胺基酸序列分析證明該基因所編碼的蛋白是一種△8-鞘磷脂脫氫酶，與神經鞘脂質代謝相關，該酶在植物抵抗低溫脅迫的反應中起重要的作用。本研究提供了這個基因的核酸序列，及其胺基酸序列，同時還涉及該基因在番茄耐寒育種中的用途。SlSLD基因可以應用於番茄的抗凍育種，提高番茄優良品種的適應性，擴大其種植範圍，促進其穩產和高產。附圖說明圖1為低溫脅迫處理番茄植株後的表型圖。具體實施方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1：番茄的VIGS處理以下使用的LB固體培養基的配方為：10g/L胰蛋白腖(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeastextract)，10g/L氯化鈉(NaCl)，15～20g/L瓊脂粉，用10MNaOH調整pH值到7.4，餘量為水；121℃，滅菌20min，溫度降至55℃左右(不燙手)時，加入終濃度為30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)，或者加入終濃度為30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L慶大黴素(Gentamicin,Gen)，倒平板，保存備用；LB液體培養基的配方為：10g/L胰蛋白腖(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeastextract)，10g/L氯化鈉(NaCl)，用10MNaOH調整pH值到7.4，餘量為水；121℃，滅菌20min，溫度降至55℃左右(不燙手)或冷卻後，加入終濃度為30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)，或者加入終濃度為30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L慶大黴素(Gentamicin,Gen)。以下對實施例的具體步驟進行說明：1)番茄RNA的提取及cDNA的獲得番茄RNA提取方法參考華越洋生物公司超快型植物RNA提取試劑盒使用說明。具體步驟如下：取0.1g用液氮磨碎的番茄葉片置於1.5mL離心管中，加入1mL細胞裂解液，充分混勻；加入300μL去蛋白液和200μL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩混勻30s；室溫12,000×g，離心10min，將上清(不多於700μL)轉移至1.5mLRNase-free離心管中；加入等體積漂洗液，充分顛倒混勻，將混合物(不多於700μL)轉移至離心吸附柱中，室溫12,000×g，離心1min，棄穿透液；加入500μL洗柱液，室溫12,000×g，離心1min，棄穿透液，重複一次。室溫12,000×g，離心1min，以便去除殘留的液體；將離心吸附柱轉移到RNase-free離心管中，加入50μLRNA洗脫液，室溫放置5min；室溫12,000×g，離心1min，將含有番茄RNA的穿透液存於-80℃冰箱。將番茄RNA逆轉錄成cDNA，採用Takara公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)試劑盒。取出-80℃凍存番茄RNA，待融化後，根據說明書加入DNA酶後，42℃消化DNA2min，再加入反轉錄試劑，37℃15min，85℃5sec；得到逆轉錄的cDNA。2)△8-鞘磷脂脫氫酶基因(SlSLD)的克隆利用生物信息學分析方法，在番茄基因組資料庫中搜索番茄△8-鞘磷脂脫氫酶基因(SlSLD)，得到1條候選序列。根據該序列信息，設計用於擴增SlSLD基因全長序列的引物序列，上遊引物SlSLDF：5』-GGATCCCAGGGTAAGGTGTATGATGT-3』和下遊引物SlSLDR：5』-TCTAGAGCAATTCCCAGTAAGGAC-3』。反應體系參照說明書，PCR擴增用Takara的PrimeSTARMaxPremix(2×)10μL，10μM上遊引物SlSLDF和10μM下遊引物SlSLDR各0.5μL，逆轉錄的cDNA模板0.1μL，加雙蒸水補足20μL。PCR擴增程序為98℃30sec，1個循環；98℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，35個循環；72℃10min，1個循環。由此擴增得到△8-鞘磷脂脫氫酶基因(SlSLD1)的全長序列，全長序列經限制性內切酶BamHI和XhoI酶切後(37℃酶切反應2h)，連接到表達載體pTRV2載體(37℃限制性內切酶BamHI和XhoI酶切2h)中，得到重組質粒pTRV2-SlSLD，送公司測序。△8-鞘磷脂脫氫酶基因(SlSLD)的核酸序列如SEQIDNO.1所示，其編碼的△8-鞘磷脂脫氫酶基因的胺基酸序列如SEQIDNO.2所示。確認序列正確後，利用熱激法(42℃熱激90sec)將該重組質粒pTRV2-SlSLD轉入大腸桿菌DH5α中，於37℃在含30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)LB固體培養基上培養1天，挑取陽性單克隆於1mL的含30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)LB液體培養基中，在37℃條件下，以200轉/分鐘培養1天，至OD600值為1.0左右，保存於15％的甘油，放於-80℃冰箱備用。3)農桿菌介導的△8-鞘磷脂脫氫酶基因(SlSLD)的VIGS挑取2)中所存的菌種，置於含5mLLB液體培養基(含30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan))中，在37℃條件下，以200轉/分鐘培養1天，至OD600值為1.2左右，然後用小提質粒試劑盒提取重組的質粒pTRV2-SlSLD。取1μLpTRV1質粒和pTRV2-SlSLD質粒，分別加入置已經在冰上解凍的30μLGV3101感受態細胞。將感受態細胞轉移到2mm型的電機杯，通過電機方式進行轉化，具體參數如：選擇Pre-SetProtocols下的Bacterial下的A.tumefaciens，電壓2400V，電容25μF，電阻200Ω，電擊杯Cuvette為2mm。電擊後，加入無抗性的LB液體培養基，顛倒混勻，轉移到1.5mL離心管，於28℃條件下，以200轉/分鐘培養2h，再將該菌於30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L慶大黴素(Gentamicin,Gen)的LB固體培養基上培養2-3天。挑取陽性單克隆於1mL的含30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L慶大黴素(Gentamicin,Gen)LB液體培養基中，在28℃條件下，以200轉/分鐘培養1天，至OD600值為1.0左右。在4000×g下，離心15min，收集沉澱，加入含30mg/L卡那黴素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L慶大黴素(Gentamicin,Gen)LB液體培養基，使得pTRV1/GV3101菌液的OD600值為0.4，pTRV2-SlSLD/GV3101菌液的OD600值為0.4。再將二者菌液以1：1的比例混合，並於室溫靜置3～6h。通過真空注射的方法侵染剛長出第一片真葉的番茄幼苗，以pTRV2/GV3101為對照，同時進行侵染。侵染後的幼苗置於21℃，16：8(白天：黑夜)條件下，培養30d。用螢光定量PCR分析的方法來鑑定基因被抑制的程度，具體結果如表1所示。表1VIGS後番茄植株中SlSLD基因的表達量植株SlSLD基因的表達量*植株10.0064植株20.0036植株30.0048植株40.0032植株50.0031註：*以對照組基因的表達量為1.實施例2：SlSLD基因沉默的植株(處理組)與對照組的低溫脅迫試驗將SlSLD基因沉默的(處理組)和對照組的植株於4℃條件下脅迫處理，並拍照記錄植株在低溫環境中的表型變化。從圖1可以看出，SlSLD基因沉默的和對照組的植株在低溫處理6h時，葉片邊緣都出現了捲曲，其中處理組的變化更為明顯；在24h時，對照組仍保持6h時的狀態，葉片出現輕微的捲曲，而處理組的植株整體都出現萎蔫，已經不能正常生長。實施例3：低溫脅迫試驗後植株的生理指標測定測定經低溫處理6h番茄葉片的生理指標，主要包括電導率、丙二醛含量可溶性多糖含量、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性和葉綠素含量。具體操作如下所示：製備上清液製備，稱取0.1g番茄葉片，加入2.5mL預冷的50mM磷酸緩衝鹽溶液(pH7.0)，於冰上研磨，勻漿液在4℃、4,000×g條件下離心10min，收集上清液，置於4℃冰箱，用於下面第2-5項指標的測定。1)電導率(Relativeelectrolyticleakage,REL)的測定取0.05g經低溫處理後對照組和處理組番茄的葉片，用雙蒸水清洗葉片表面的電解質。將葉片置於含10mL雙蒸水的離心管中，在室溫浸泡22h，然後用導電率計(JingkeDDS-307A)測定，所得值為R1。將含番茄葉片的離心管於沸水中處理30min，然後等其降到室溫後，用導電率計重新測定，所得值為R2。計算公式：電導率(REL)＝R/R2×100％。2)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的測定採用硫代巴比妥法測定葉片中MDA的含量。取200μL的上清液置於1.5mL離心管，加入等體積的0.6％硫代巴比妥酸溶液，將混合物進行沸水浴30min。冷卻後，于波長532nm、600nm和450nm下測吸光值。計算公式：MDA濃度(μmol/L)＝6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。3)可溶性多糖含量的測定採用蒽酮比色法測定葉片中可溶性多糖的含量。取100μL的上清液置於1.5mL離心管，加入400μL含0.2％蒽酮的硫酸溶液。將混合物進行沸水浴5min。冷卻後，于波長630nm下測吸光值，以葡萄糖繪製標準曲線。4)超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活性的測定採用碧雲天WST-8試劑盒測定SOD的活性，具體操作步驟參照試劑盒所提供的說明書。5)過氧化物酶(POD)活性的測定採用愈創木酚比色法測定POD的活性。取10μL上清液，加入190μL含0.12％H2O2和0.56％愈創木酚的混合液，于波長470nm下測吸光值，每隔1min讀數一次，直至反應終止，以每分鐘吸光值變化1為1個酶活性單位(U)。POD活性的單位是U/mg蛋白。6)葉綠素含量的測定稱取0.02g番茄葉片，用2mL80％的丙酮於黑暗處過夜浸泡，在8,000×g條件下離心10min，收集上清液。于波長647nm和665nm下測吸光值。計算公式：葉綠素濃度(mg/g)＝(17.90×OD647+8.08×OD665)×浸泡液體積(ml)/1000/鮮重(g)。從表2可以看出，相比於對照組的植株，SlSLD基因沉默的植株抗冷能力明顯減弱。處理組的電導率高於對照組，說明該基因表達量的抑制會導致番茄植株在低溫條件下受脅迫的程度加重。丙二醛的含量也是處理組高於對照組，而超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性確是對照組更高。另外，番茄葉片的葉綠素含量是SlSLD基因沉默的植株低於對照組。因此，通過冷脅迫實驗表明，SlSLD基因的沉默會減弱番茄的抗冷害能力。表2低溫脅迫後番茄葉片的生理指標生理指標對照組處理組電導率(％)45.64±5.55*71.47±4.09丙二醛濃度(μmol/g鮮重)6.23±0.31*7.41±0.33可溶性多糖含量(mg/0.1g鮮重)3.24±0.28*2.28±0.26超氧化物歧化酶活性(U/mg蛋白)0.30±0.06*0.20±0.06過氧化物酶活性(U/mg蛋白)2.51±0.41*1.12±0.28葉綠素(mg/g鮮重)3.18±0.20*2.24±0.31註：*表示對照組與處理組有顯著性的差異，p≤0.05。SEQUENCELISTING中國科學院華南植物園一種番茄抗冷害基因及應用2PatentInversion3.511344DNA番茄（Solanumlycopersicumcv.Micro-Tom）1atggcagattcaagaaagtacatttctagtgaggaactgaagaatcacaacaaaccaggg60gatctgtggatatccattcagggtaaggtgtatgatgtatcagattgggtgaaggaacat120cctggtggtgatttcccactgttaaatcttgctggacaggatgttactgatgcatttgtt180gcatttcatcctgctactgcttggaagtatcttgacaagttctttaaggggttttacctc240aaggattattctgtttctgaggtatctacggattatagaaggcttgtgtctgagttcact300aaaatggggttgtttgaaaagaaaggccatgtttgtttattcaccatgttcttaatgaca360atgttgttttccttaagtgtttatggaatcttgtattgtcatggtgtgttggcacatttg420ataagtggtgccttgatggggtgtctttggattcagagtgggtggattggtcatgattca480gggcattatcaggtgatgagcactcgcggattcaacagatttgctcaagtccttactggg540aattgccttgctggaatcagcattgcttggtggaagtggaaccacaatgctcaccacatt600gcctgcaacagtcttgaatatgaccctgatcttcaacacatgccattctttgtggtatct660tccaagtttttcgactcactcacttcttatttttacgataggaagatgaattttgattct720tttactagattcttggttagtcatcaacattggacattttatcctgttatgtgttttgct780agaatcaatttgtttgctcagtcattcatattgttgttatccaacaaaaatgtgccccat840cgagttcaggagcttttgggggtggtttctttctggatttggtatccgttgcttgtttct900ttcttgccaaactggggcgaaagaattatatttgttcttgctagtttcacagtgactgga960attcagcatgttcaattctgtttaaaccatttctcatctgaaatttatgttgcaccacct1020aaaggaaatgattggtttgagaagcaaactaatggctctctcgacatatcatgccctagt1080tggatggattggtttcatggtggattgcagtttcagattgagcatcatttgtttcctaga1140ttaccaagatgccaactgaggaaagtctctccctttgtgaaagacctctgtaaaaagcat1200ggtttgccttacagttgtgtctccttctggaagtctaatgttttgaccatcagcaccctc1260agagctgcagctttgcaggctcgggatttaactaagcctgttccaaaaaatctagtttgg1320gaagccgtcaacactcacggttga13442447PRT番茄（Solanumlycopersicumcv.Micro-Tom）2MetAlaAspSerArgLysTyrIleSerSerGluGluLeuLysAsnHis151015AsnLysProGlyAspLeuTrpIleSerIleGlnGlyLysValTyrAsp202530ValSerAspTrpValLysGluHisProGlyGlyAspPheProLeuLeu354045AsnLeuAlaGlyGlnAspValThrAspAlaPheValAlaPheHisPro505560AlaThrAlaTrpLysTyrLeuAspLysPhePheLysGlyPheTyrLeu65707580LysAspTyrSerValSerGluValSerThrAspTyrArgArgLeuVal859095SerGluPheThrLysMetGlyLeuPheGluLysLysGlyHisValCys100105110LeuPheThrMetPheLeuMetThrMetLeuPheSerLeuSerValTyr115120125GlyIleLeuTyrCysHisGlyValLeuAlaHisLeuIleSerGlyAla130135140LeuMetGlyCysLeuTrpIleGlnSerGlyTrpIleGlyHisAspSer145150155160GlyHisTyrGlnValMetSerThrArgGlyPheAsnArgPheAlaGln165170175ValLeuThrGlyAsnCysLeuAlaGlyIleSerIleAlaTrpTrpLys180185190TrpAsnHisAsnAlaHisHisIleAlaCysAsnSerLeuGluTyrAsp195200205ProAspLeuGlnHisMetProPhePheValValSerSerLysPhePhe210215220AspSerLeuThrSerTyrPheTyrAspArgLysMetAsnPheAspSer225230235240PheThrArgPheLeuValSerHisGlnHisTrpThrPheTyrProVal245250255MetCysPheAlaArgIleAsnLeuPheAlaGlnSerPheIleLeuLeu260265270LeuSerAsnLysAsnValProHisArgValGlnGluLeuLeuGlyVal275280285ValSerPheTrpIleTrpTyrProLeuLeuValSerPheLeuProAsn290295300TrpGlyGluArgIleIlePheValLeuAlaSerPheThrValThrGly305310315320IleGlnHisValGlnPheCysLeuAsnHisPheSerSerGluIleTyr325330335ValAlaProProLysGlyAsnAspTrpPheGluLysGlnThrAsnGly340345350SerLeuAspIleSerCysProSerTrpMetAspTrpPheHisGlyGly355360365LeuGlnPheGlnIleGluHisHisLeuPheProArgLeuProArgCys370375380GlnLeuArgLysValSerProPheValLysAspLeuCysLysLysHis385390395400GlyLeuProTyrSerCysValSerPheTrpLysSerAsnValLeuThr405410415IleSerThrLeuArgAlaAlaAlaLeuGlnAlaArgAspLeuThrLys420425430ProValProLysAsnLeuValTrpGluAlaValAsnThrHisGly435440445當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp