硼酸化合物的脂質體製劑的製作方法

2023-07-21 04:19:31 3

專利名稱：：硼酸化合物的脂質體製劑的製作方法
技術領域：
：本發明提供包含硼酸化合物特別是肽硼酸化合物的脂質體組合物。更具體而言，本發明提供包含肽硼酸化合物和如下面定義的式I和/或式II化合物的脂質體組合物。
背景技術：
：脂質體(或脂質雙層小泡)是由可包封水相的同心有序脂質雙層構成的圓形小泡。脂質體可作為包含於水相或脂質雙層中的治療和診斷劑的遞送載體。以脂質體包封形式遞送藥物可提供許多優勢，視藥物而定，包括例如降低藥物毒性、改變藥代動力學或提高藥物溶解度。脂質體在被配製成包括親水聚合物鏈的表面包衣，即所謂的STEALTH⑧或長循環脂質體時，可提供另一優勢即長的血液循環壽命，這部分歸因於單核吞噬細胞系統對脂質體的清除減少。通常，延長的壽命是必要的，以使脂質體從注射部位到達它們的理想靶區域或細胞。理想的是，可製備這類脂質體以包括被包封的治療或診斷化合物，其(i)具有高的載藥效率，(ii)被包封化合物的濃度高，和(iii)處於穩定的形式，即在儲存期間幾乎沒有化合物滲漏。一類尤其令人感興趣的治療化合物為肽硼酸化合物，其為在肽序列的酸性末端或C-端含有a-氨基硼酸的肽蛋白酶體抑制劑化合物。一種該類肽硼酸化合物為硼替佐米，以前稱作PS-341(VELCADE,MillenniumPharmaceuticals,Inc，Cambridge,MA)。硼替佐米為二肽硼酸衍生物並被合成為&為0.6nmol/L的高選擇性、強效、可逆蛋白酶體抑制劑(Ad塞，Semin.0nco1.28(6):613-619(2001))。使用國家癌症中心(NationalCancerInstitute)的體外篩選，硼替佐米顯示出對一系列腫瘤系的細胞毒性(Adams，同上)並對人前列腺癌異種移植物模型(Frankel等人，Clin.CancerRes.6(9):3719-3728(2000);DiPaola等人，Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.15(3):509-524(2001))和肺癌異種移植物模型(0yaizu等人，0ncol.R印.8(4):825-829(2001))具有抗腫瘤活性。由具有包封於脂質體中的肽硼酸蛋白酶體抑制劑化合物的脂質體構成的脂質體組合物在國際申請案WO2006/052734中有所描述，該申請案於2006年5月18日在專利合作條約(PatentCooperationTreaty)下出版。肽硼酸化合物以硼酸酯的形式包封於脂質體中，該硼酸酯是在與脂質體包封的多元醇反應後形成的。在一個實施例中，脂質體包封的多元醇為含有醇羥基基團的單體或多聚體化合物，其中所述多元醇可為脂族化合物、環狀化合物二醇、多酚等。在另一個實施例中，單體多元醇包括糖類、甘油、二醇類、碳水化合物、氨基糖類(尤其是氨基_山梨醇)、糖_醇類、脫氧山梨醇、葡糖酸、酒石酸、沒食子酸等。期望將該肽硼酸化合物包封於脂質體載體中。然而，如何有效裝載這些相對非極性的二肽並使它們以穩定的被包封形式滯留在脂質體存在困難。更具體而言，本主題涉及用可改善肽硼酸化合物在脂質體內的裝載和滯留的組分製備的脂質體。
發明內容因此，本發明的一個目標在於提供包含穩定包封於脂質體中的肽硼酸化合物的脂質體組合物。另一目標為提供具有以肽硼酸酯的穩定形式包封於脂質體中的肽硼酸化合物的脂質體混懸液。在一個實施例中，提供一種脂質體組合物，其包含穩定包封於脂質體中的肽硼酸化合物，其中所述肽硼酸化合物為二肽基硼酸化合物。一種示例性的二肽基硼酸化合物為硼替佐米。在一方面，本發明提供一種組合物，其包含由小泡形成脂質形成的脂質體和包封於所述脂質體中的硼酸酯化合物，該硼酸酯化合物由肽硼酸化合物和式I化合物及其任何對映異構體或非對映異構體構成。式Iformulaseeoriginaldocumentpage4R=(H，A)R2=(H，A)R3=(H，A)R4=(H，A)R5=(H，A)R6=(H，A)R7=(H，A)formulaseeoriginaldocumentpage4X=(R20(n=1，2，3，4)formulaseeoriginaldocumentpage5其中X、Y、A、B、E、RpR2、R3、R4、Rs、R6和R7如上文所述，然而前提條件是Y、&、R2、Rs、R4和R5不各自為H。在另一個實施例中，式I化合物為其中Y為H的化合物。一種示例性化合物中Y為H並且&為H。另一示例性化合物中Y為H並且R2為H。另一示例性化合物中Y為H並且R3為H。另一示例性化合物中Y為H並且R4為H。另一示例性化合物中Y為H並且R5為H。另一示例性化合物中Y為H並且R3為A。特別是，化合物中Y、&、R2、R4、R5為H且R3為A。在另一個實施例中，式I化合物為其中Y為B的化合物。一種示例性化合物中Y為B並且&為H。另一示例性化合物中Y為B並且R2為H。另一示例性化合物中Y為B並且R3為H。另一示例性化合物中Y為B並且R4為H。另一示例性化合物中Y為B並且R5為H。特別是，Y為B並且1、R2、R3、R4且R5為H。另一示例性化合物中Y為B並且R3為A。特別是，化合物中Y為B並且R2、R4、R5為H且R3為A。在另一個實施例中，式I化合物為其中Y為E的化合物。一種示例性化合物中Y為E並且&為H。另一示例性化合物中Y是E並且R2為H。另一示例性化合物中Y是E並且R3為H。另一示例性化合物中Y是E並且R4為H。另一示例性化合物中Y是E並且R5為H。另一示例性化合物中Y是E並且Re為H。另一示例性化合物中Y是E並且I^為H。特別是，化合物中Y是E且HmRe且R7為H。另一示例性化合物中Y是E且R3為A。特別是，化合物中Y是E並且R2、R4、R5、R6、R7為H且R3為A。在一方面，本發明提供一種組合物，其包含由小泡形成脂質形成的脂質體和包封於所述脂質體中的硼酸酯化合物，該硼酸酯化合物由肽硼酸化合物和為共軛樹枝狀聚合物的式II化合物構成。式IIformulaseeoriginaldocumentpage5n=3-30formulaseeoriginaldocumentpage6其中D、X、A、R2、R3、R4和R5是如上文所述。在一個實施例中，式II化合物為其中樹枝狀聚合物為^或G2樹枝狀聚合物的化合物。一種示例性化合物中樹枝狀聚合物為Gp另一示例性化合物中樹枝狀聚合物為G2。在另一個實施例中，式II化合物為其中n為3至30之間整數的化合物。一種示例性化合物中&為H。另一示例性化合物中R2為H。另一示例性化合物中&為H。另一示例性化合物中R4為H。另一示例性化合物中R5為H。特別是，化合中R2、R3、R4和R5為H。特別是，該化合物為共軛62樹枝狀聚合物。在一個實施例中，^樹枝狀聚合物每分子具有16個氨基基團。在另一個實施例中，脂質體還包括內部較高/外部較低的離子梯度。該離子梯度可為例如氫離子(PH)梯度。當離子梯度為pH梯度時，脂質體的內部pH可為約7.5-8.5，並且脂質體外部環境的PH可為約6-7。在另一個實施例中，脂質體還包括約1-20摩爾百分比的用親水聚合物衍生的疏水部分。在脂質體包括與親水聚合物共價連接的疏水部分的實施例中，優選的聚合物為聚乙二醇。優選的疏水部分為脂質，並且優選為小泡形成脂質。在另一方面，本發明提供遞送肽硼酸化合物的方法，其包括製備脂質體在水溶液中的混懸液，所述脂質體具有被包封的與式I或II化合物共價結合以形成肽基硼酸酯化合物的肽硼酸化合物，並將該脂質體混懸液施用給受試者。在一個實施例中，通過注射施用脂質體。在另一方面，本發明提供在接受放射治療的荷瘤受試者中選擇性破壞腫瘤組織的方法，該方法包括給荷瘤受試者施用脂質體，該脂質體具有被包封的與式I或II化合物共價結合以形成肽基硼酸酯化合物的肽硼酸和硼同位素；並讓所述受試者接受中子放射療法。在一個實施例中，硼同位素是在肽硼酸中，例如1QB。除了上述的示例性方面和實施例，通過參照附圖和下文描述的試驗，本發明其他方面和實施例將變得顯而易見。圖1A-1C示出了示例性的硼酸化合物的結構。圖2示出了在內部較高/外部較低的pH梯度下裝載硼酸化合物至脂質體中以在脂質體內形成硼酸酯化合物。具體實施方式I.定義"肽硼酸化合物"意指下式化合物其中R1、R2和R3為彼此相同或不同的獨立選擇部分，並且n為1_8，優選1_4。"親水聚合物"意指在室溫下在水中具有一定量溶解度的聚合物。示例性的親水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯酸羥丙基酯、聚丙烯酸羥乙基酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬醯胺和親水性肽序列。這些聚合物可作為均聚物或作為嵌段共聚物或無規共聚物使用。優選的親水聚合物鏈為聚乙二醇(PEG)，優選分子量為500-10，000道爾頓的PEG鏈，更優選為750-10，000道爾頓，還更優選為750-5，000道爾頓。"內部較高/外部較低的pH梯度"指脂質體內部(較高pH)和脂質體懸浮於其中的外部介質(較低PH)之間的跨膜pH梯度。通常，脂質體內部pH至少比外部介質pH大l個PH單位，並優選大2-4個單位。"脂質體包封的"意指隱蔽在脂質體中心的水性隔室中、脂質體脂質雙層之間的水性空間，或雙層本身內的化合物。II.脂質體製劑在一個方面，本發明提供具有被包封的肽硼酸化合物的脂質體組合物。在這部分，將描述脂質體組合物和製備方法。A.月旨制糊,分如上文所述，脂質體製劑由包含被包封的肽硼酸化合物的脂質體構成。肽硼酸化合物是在肽序列的酸性末端或C末端包含a-氨基硼酸的肽。一般而言，肽硼酸化合物的形式如下formulaseeoriginaldocumentpage8其中&、1^和R3為彼此相同或不同的獨立選擇部分，並且n為l-8，優選1_4。還可以考慮具有以硼酸作為側鏈的天冬氨酸殘基或穀氨酸殘基的化合物。優選的是，1^、12和13獨立地選自氫、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、芳烷氧基、環烷基或雜環；或1^、12和13中任意一者可與肽骨架中的相鄰氮原子形成雜環。烷基包括烷氧基、芳烷基和芳烷氧基中的烷基組分，優選為1至IO個碳原子，更優選1至6個碳原子，並且可為直鏈或支鏈。芳基包括芳氧基、芳烷基和芳烷氧基中的芳基組分，優選為單核或雙核(即兩個稠環)，更優選為單核，例如苄基、苯甲氧基或苯基。芳基還包括雜芳基，即在環中具有一個或多個氮、氧或硫原子的芳香環，例如呋喃基、吡咯、吡啶、吡嗪或吲哚。環烷基優選為3-6個碳原子。雜環指在環中具有一個或多個氮、氧或硫原子的非芳香環，優選具有3-6個碳原子的5元至7元環。這類雜環包括(例如)吡咯烷、哌啶、哌嗪和嗎啉。環烷基或雜環可與烷基組合；例如環己基甲基。上述任何基團(不包括氫)可被一個或多個選自以下的取代基取代滷素，優選氟或氯；羥基；低級烷基；低級烷氧基，例如甲氧基或乙氧基；酮；醛；羧酸、酯、醯胺、碳酸酯或氨基甲酸酯；磺酸或酯；氰基；伯、仲或叔胺；硝基；脒基；和硫基或烷硫基。優選的是，該基團包括最多兩個這類取代基。示例性的肽硼酸化合物顯示於圖1A-1C中。&、&和R3的具體例子在圖1A-1C中示出，包括正丁基、異丁基和新戊基(烷基)；苯基或吡唑基(芳基)；4-((叔-丁氧基羰基)氨基)丁基、3-(硝基脒基)丙基和(l-環戊基-9-氰基)壬基(經取代的烷基)；萘基甲基和苄基(芳烷基)；苯甲氧基(芳烷氧基)；和吡咯烷(R2與相鄰的氮原子形成雜環)。—般而言，肽硼酸化合物可為單肽、二肽、三肽或更高級的肽化合物。其他示例性的肽硼酸化合物在美國專利No.6，083，903、No.6，297，217和No.6，617，317中有所描述，將所述專利以引用的方式併入本文。肽硼酸化合物例如硼替佐米為在序列的酸性末端、C-末端包含氨基硼酸的通常2-4個胺基酸短肽的衍生物(Zembower等人，Int.J.P印t.ProteinRes.虹(5):405-413(1996))。由於可在硼酸基團和活性位點絲氨酸或蘇氨酸部分之間形成穩定的四面體硼酸酯複合物，肽硼酸為強效的絲氨酸蛋白酶抑制劑。通過改變肽硼酸的序列並引入非天然胺基酸殘基和其他取代基通常可增強該活性並使其對特定蛋白酶體有高度特異性。這使得可選擇具有強效抗病毒活性(Priestley,E.S.和Decicco，CP.，Org.Lett.2(20):3095-3097(2000);Bukhtiyarova，M.等人，Antivir.Chem.Chemother.H(6):367-73(2001);Archer，S.J.等人，Chem.Biol.9(1):79-92(2002);Pristley，E.S.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12(21):3199-202和細胞毒性活性(Teicher，B.A.等人，Clin.CancerRes.，互(9):2638—45(1999);Frankel等人，Clin.CancerRes.g(9):3719-28(2000);Lightcap，E.S.等人，Clin.Chem.巡(5):673-83(2000);Adams，J.，Semin.Oncol.，^(6):613-19(2001);Cusack，J.C.，Jr.等人，CancerRes.虹(9):83535-40(2001);Shah，S.A.等人，J.Cell.Biochem.§2(1):110-22，(2001);Adams，J.，Curr.Opin.Chem.Biol.g(4):493-500(2002);0rlowski，R.Z.禾口Dees，E.C.，BreastCancerRes.5(1):1-7(2002);0rlowski，R.Z.等人，J.Clin.Oncol.^(22):4420—27，(2002);Schenkein，D.，Clin.Lymphoma^(1):49-55(2002);Ling，Y.H.等人，ClinCancerRes2(3):1145-54(2003))的肽硼酸。這些衍生物受累於和其他短肽相同的問題，最值得注意到是清除非常快速和不能到達體內靶部位。許多肽硼酸化合物缺乏易於離子化的氨基基團，或極性較大，並因此使用上文討論的常規遠距離裝載操作難以裝載至脂質體中。因此，已經設計了適用於肽硼酸化合物的裝載方法，以提供其中肽硼酸化合物以肽硼酸酯的形式包封於脂質體中的脂質體製劑，如現在將會參照圖2所描述的。圖2示出了具有脂質雙層膜(由單實線12表示)的脂質體10。應當理解，在多室脂質體中脂質雙層膜由具有居間的水性空間的多個脂質雙層構成。脂質體10懸浮於外部介質14中，其中外部介質的pH約7.O，通常在5.5-7.0之間，更通常在6.0-7.0之間。脂質體10具有由脂質雙層膜限定的內部水性隔室16。包封在內部水相室中的是化合物18，優選式I化合物。式I化合物優選為具有多個羥基官能團的部分，下面提供了示例性的化合物。內部水相室的pH優選大於約7.0，更優選7.1-9.0，還更優選在7.5和8.5之間。也包封在脂質體中的有肽硼酸化合物，在圖2中由硼替佐米代表。在通過脂質雙層膜之前，硼替佐米也顯示在外部水性介質中。在外部水相介質中，該化合物絕大部分不帶電荷，這歸因於該略微酸性的介質。在其不帶電狀態下，該化合物可自由滲透穿過脂質雙層。硼酸酯的形成將使該平衡改變而引起更多化合物從外部介質滲透通過脂質雙層，導致該化合物在脂質體中的積聚。在另一個實施例中，外部混懸介質中較低PH和脂質體內部較高pH，結合脂質體內部的絡合劑，誘導藥物積聚在脂質體的水性內部隔室中。一旦進入脂質體，該化合物與絡合劑反應而形成硼酸酯。硼酸酯基本不能跨過脂質體雙層，從而硼酸酯形式的藥物化合物積聚在脂質體內部。脂質體內部絡合劑的濃度優選為使得帶電的基團(例如羥基基團)的濃度高於硼酸化合物的濃度。例如，在藥物終濃度為lOOmM的組合物中，聚合物帶電基團的內部化合物濃度將通常至少為這麼大。絡合劑以高-內部/低_外部的濃度存在；即，存在跨越脂質體脂質雙層膜的絡合劑濃度梯度。如果在外部體相中存在大量的絡合劑，則該絡合劑與外部介質中的肽硼酸化合物反應，減慢化合物在脂質體內部的積聚。因此，優選的是，如下文所述製備脂質體，以使得該組合物在體相(水相之外)中基本不含該絡合劑。適合用做絡合劑的各種分子為上面示出的式I或式II化合物。式I或II化合物可形成硼酸酯。可考慮可利用式I或II化合物之間的反應性差異來製備具有包封強度梯度的脂質體製劑，由此可微調藥物釋放特性。一般而言，絡合劑的滯留強度與絡合劑的分子量和疏水性質相關。絡合劑的分子量越大以及疏水性越低，硼酸化合物的滯留時間則越長。在一個實施例中，式I化合物為其中Y為H的化合物。一種示例性化合物中Y為H且&為H。另一示例性化合物中Y為H且R2為H。另一示例性化合物中Y為H且R3為H。另一示例性化合物中Y為H且R4為H。另一示例性化合物中Y為H且R5為H。另一示例性化合物中Y為H且R3為A。特別是，化合物中Y、R2、R4、R5為H且R3為A。其中Y為H的式I化合物可商購獲得或根據實例1列出的操作製備。在另一個實施例中，式I化合物為其中Y為B的化合物。一種示例性化合物中Y為B且&為H。另一示例性化合物中Y為B且R2為H。另一示例性化合物中Y為B且R3為H。另一示例性化合物中Y為B且R4為H。另一示例性化合物中Y為B且R5為H。特別是，化合物中Y為B且&、12、13、14和R5為H。另一示例性化合物中Y為B且R3為A。特別是，化合物中Y為B且R2、R4、R5為H且R3為A。其中Y為B的式I化合物可商購獲得或根據實例2-3列出的操作製備。在另一個實施例中，式I化合物為其中Y為E的化合物。一種示例性化合物中Y是E且&為H。另一示例性化合物中Y是E且R2為H。另一示例性化合物中Y是E且R3為H。另一示例性化合物中Y是E且&為H。另一示例性化合物中Y是E且Rs為H。一種示例性化合物中Y是E且&、R2、R3、R4和R5為H。另一示例性化合物中Y是E且R3為A。特別是，化合物中Y是E且R2、R4、R5為H且R3為A。其中Y為E的式I化合物可商購獲得或根據實例5列出的操作製備。在一個實施例中，式II化合物為其中樹枝狀聚合物為^或G2樹枝狀聚合物的化合物。一種示例性化合物中樹枝狀聚合物為Gp另一示例性化合物中樹枝狀聚合物為G2。在另一個實施例中，式II化合物為共軛樹枝狀聚合物。一種示例性化合物為化合物D，其中n為3至30之間整數。一種示例性化合物中&為H。另一示例性化合物中R2為H。另一示例性化合物中R3為H。另一示例性化合物中R4為H。另一示例性化合物中R5為H。特別是，化合中Rp&、R3、R4和R5為H。特別是，化合物為共軛^樹枝狀聚合物。在一個實施例中，G2樹枝狀聚合物每分子具有16個氨基基團。式II化合物可商購獲得或根據實例4列出的操作製備。組合物中的脂質體主要由小泡形成脂質構成。該類小泡形成脂質為可在水中自發形成雙層小泡的脂質，例如磷脂類，其疏水部分與內部(雙層膜的疏水區)接觸，其頭部基團部分朝外部(該膜的極性表面)取向。能夠穩定摻入脂質雙層的脂質(例如膽固醇及其多種類似物)也可用於脂質體中。小泡形成脂質優選為具有兩個烴鏈(通常為醯基鏈)和一個極性或非極性頭部基團的脂質。有許多合成的小泡形成脂質和天然的小泡形成脂質，包括磷脂類，例如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸、磷脂醯肌醇和鞘磷脂，其中兩條烴鏈的長度通常為約14-22個碳原子，並且具有不同程度的不飽和度。其醯基鏈具有不同飽和度的上述脂質和磷脂可商購獲得或根據公開的方法製備。其他合適的脂質包括糖脂類、腦苷脂類和甾醇類例如膽固醇。可選擇小泡形成脂質以實現特定程度的流動性或剛度，以控制脂質體在血清中的穩定性和/或控制脂質體中被包封物質的釋放速率。具有剛性更大的脂質雙層或液晶雙層的脂質體可通過摻入相對剛性的脂質(例如具有相對較高的相變溫度，如高達6(TC)的脂質來獲得。剛性的、即飽和的脂質有助於使脂質雙層具有更大的膜剛性。其他脂質組分例如膽固醇也已知可有助於脂質雙層結構的膜剛性。另一方面，脂質流動性可通過摻入相對流動的脂質來實現，通常為具有相對低的液相至液晶相轉變溫度(例如室溫或低於室溫)的脂相的脂質。脂質體可任選包括與親水聚合物共價連接的小泡形成脂質。如美國專利No.5，013，556已描述的，在脂質體組合物中包括這樣一種聚合物衍生的脂質可在脂質體周圍形成親水聚合物鏈的表面包衣。與缺少這種包衣的脂質體相比，親水化合物鍊表麵包衣可有效增加該脂質體的體內血液循環壽命。由甲氧基(聚乙二醇)(mPEG)和磷脂醯乙醇胺(例如二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)或二油醯磷脂醯乙醇胺)構成的具有各種mPEG分子量(350、550、750、1，000、2，000、3，000和5，000道爾頓)的聚合物衍生的脂質可購自AvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,AL)。mPEG-神經醯胺的脂質聚合物也可購自AvantiPolarLipids,Inc。脂質-聚合物綴合物的製備也在文獻中有所描述，參見美國專利No.5，631，018、No.6，586，001和No.5，013，556;Zalipsky，S.等人，BioconjugateChem.g:111(1997);Zalipsky，S.等人，Meth.Enzymol.，50(2004)。這些脂質聚合物可製備成具有高純度和最小分子量分散度的明確定義的均相材料(Zalipsky，S.等人，BioconjugateChem.§:111(1997);Wong，J.等人，Science^:820(1997))。脂質聚合物也可為"中性"脂質聚合物，例如聚合物_二硬脂醯綴合物，如美國專利No.6，586，001中所述，將該專利以引用的方式併入本文。當脂質體中包含脂質_聚合物綴合物時，通常將1-20摩爾百分比的脂質_聚合物綴合物摻入總體脂質混合物中(參見，例如，美國專利No.5，013，556)。脂質體可另外包含經改性而包括配基的脂質聚合物，形成脂質_聚合物_配基綴合物，本文中也稱作"脂質聚合物-配基綴合物"。該配基可為治療分子，例如藥物或具有體內活性的生物分子，可為診斷分子，例如造影劑或生物分子，或對結合配偶體(優選細胞表面的結合配偶體)具有結合親和力的靶向分子。優選的配基對細胞表面具有結合親和力並輔助脂質體通過細胞內化作用進入胞質。存在於包括該脂質聚合物-配基的脂質體中的配基從脂質體表面朝外取向，並因此可與其同源受體相互作用。將配基連接至脂質聚合物的方法是已知的，其中該聚合物可經官能化以用於和所選配基的後續反應。(美國專利No.6，180，134;Zalipsky，S.等人，FEBSLett.353:71(1994);Zalipsky，S.等人，BioconjugateChem.4:296(1993);Zalipsky，S.等人，J.Control.Rel.巡153(1996);Zalipsky，S.等人，BioconjugateChem.,:111(1997);Zalipsky，S.等人，Meth.Enzymol.裡:50(2004))。官能化的聚合物_脂質綴合物，例如末端官能化的PEG-脂質綴合物也可以商購獲得(AvantiPolarLipids,Inc.)。配基和聚合物之間的鍵合可以是穩定的共價鍵合或可響應剌激(例如pH變化或還原劑存在)而裂解的可釋放鍵合。配基可以是對細胞受體或對循環於血液中的病原體具有結合親和力的分子。配基也可為治療或診斷分子，特別是當以游離形式施用時具有較短血液循環壽命的分子。在一個實施例中，配基為生物配基，並優選為對細胞受體具有結合親和力的配基。示例性生物配基為對以下分子的受體具有結合親和力的分子CD4、葉酸、胰島素、LDL、維生素、轉鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白、選擇蛋白(例如E、L和P選擇蛋白)、Flk-1，2、FGF、EGF、整聯蛋白特別是av|33、civl^、av|35、av|36整聯蛋白、HER2，以及其他。優選的配基包括蛋白質和肽，包括抗體和抗體片段，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv(由重鏈和輕鏈可變區組成的片段)和scFv(其中的輕鏈和重鏈可變區通過肽接頭連接的重組單鏈多肽分子)等。配基也可為小分子模擬肽。應當理解，細胞表面受體或其片段可作為配基。其他示例性靶向配基包括但不限於維生素分子(例如生物素、葉酸、氰鈷胺素)、寡肽、寡糖。其他示例性的配基在美國專利No.6，214，388、No.6，316，024、No.6，056，973和No.6，043，094中示出，將這些專利以引用的方式併入本文。B.月旨制本先U誦燃肽硼酸化合物通過在脂質體包封的式I化合物的羥基官能團和硼酸化合物之間形成硼酸酯的形式積累和包封於脂質體中(Eggert，H.等人，J.Org.Chem.M:3846-52(1999))。簡而言之，將含有多個羥基官能團的式I化合物置於脂質體內，肽硼酸化合物擴散穿過脂質體脂質雙層膜，並形成硼酸酯，將肽硼酸化合物包封於脂質體中。在一個實施例中，該過程由pH驅動，其中脂質體外部pH較低(如pH6-7)而脂質體內部pH稍高(pH7.5-8.5)，加上式I或II化合物的存在，誘導了該化合物的積聚和裝載。在該實施例中，通過配製具有內部較高/外部較低的式I或II化合物梯度的脂質體來製備組合物。製備所需濃度(如上文所述測定)的式I或II化合物(如上文所述選擇)的水溶液。優選式I或II化合物在溶液中時具有適於脂質水合的粘度，如下文所述。式I或II化合物水溶液的pH優選大於7.0。含水的式I或II化合物化合物被用於使乾燥的脂質膜水合，該脂質膜是用小泡形成脂質、非小泡形成脂質(例如膽固醇、DOPE等)、脂質聚合物例如mPEG-DSPE和任何其他需要的脂質雙層組分製備。乾燥的脂質膜可這樣製備將所選的脂質溶解於適當的溶劑中，通常為揮發性有機溶液，並使溶劑揮發以留下乾燥膜。用含有式I或II化合物的溶液水合該脂質膜，調節至大於約7.0的pH，以形成脂質體。實例1-5描述了製備由脂質磷脂醯膽鹼醯膽鹼(PC)、膽固醇和聚乙二醇衍生的二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE)構成的脂質體。將PC:CHOL:PEG-DSPE摩爾比為10:5:l的脂質溶解於氯仿中並蒸發溶劑以形成脂質膜。用聚乙烯醇水溶液pH7.5水合脂質膜，以形成式I或II化合物包封在內的脂質體。脂質體形成後，可對脂質體進行整粒以得到具有基本均一大小範圍的脂質體群體，通常在約0.01至0.5微米之間，更優選在0.03-0.40微米之間。一種用於REV和MLV的有效整粒方法涉及將脂質體的含水混懸液擠壓透過具有所選擇的均一孔徑(在0.03至0.2微米的範圍內，通常為0.05、0.08、0.l或0.2微米)的一系列聚碳酸酯膜。該膜的孔徑大致對應於由擠壓透過該膜，尤其是兩次或更多次擠壓透過相同膜進行製備時而產生的脂質體的最大尺寸。勻化方法也可用於減小脂質體至大小為100nm或更小(Martin，F.J.，SpecializedDrugDeliverySystems—MMiufacturingMidProductionTechnology,P.Tyle(編輯)，MarcelDekker，NewYork,第267-316頁(1990))。整粒後，通過適當的技術例如透析、離心、尺寸排阻色譜法或離子交換移除未包封的體相式I或II化合物，以獲得具有內部高濃度的式I或II化合物並優選外部幾乎沒有式I或II化合物的脂質體混懸液。同樣在脂質體形成後，通過滴定、透析等調節脂質體的外部相至低於pH7.0。接著將硼酸化合物加入脂質體混懸液中以主動裝載至脂質體中。加入的肽硼酸化合物的量可根據待包封藥物的總量，假設100%的包封率，即加入的化合物最終全部以硼酸酯的形式裝載進脂質體中來確定。將化合物和脂質體分散體的混合物在這樣的條件下孵育使得脂質體攝取化合物達到的化合物濃度為主體介質中化合物濃度的數倍，這可通過在脂質體中形成沉澱來表明。後者可通過(例如)標準的電子顯微鏡或x-射線衍射技術來確認。通常在高溫下，並優選在高於脂質體脂質的相變溫度Tp下進行孵育。例如，對於T為5(TC的高相變脂質，可在55-6(TC下進行孵育。孵育時間可在一小時至小於12小時或更長時間內變化，視孵育溫度而定。在該孵育步驟結束時，可進一步處理混懸液以移除游離的(未包封的)化合物，例如使用上文提及的用於從含有被包封的式I或II化合物的起始脂質體分散體中移除游離聚合物的任何方法。實例1-5描述了製備包含硼酸酯形式的硼酸化合物和式I或II化合物的脂質體的方法，其中式I或II化合物為絡合劑。在這些實例中，製備卵PC和膽固醇的薄脂質膜。用式I或II化合物的溶液水合脂質膜，以形成具有包封於內部水性隔室內的式I或II化合物的脂質體。通過適當的技術例如透析、離心、尺寸排阻色譜法或離子交換移除未包封的式I或II化合物，以獲得具有內部高濃度的式I或II化合物並優選外部幾乎沒有式I或II化合物的脂質體混懸液。然後，將所需肽硼酸化合物加入外部介質。非離子狀態的化合物可自由滲透穿過脂質體脂質雙層。一旦進入脂質體，該化合物則與被包封的式I或II化合物反應而形成硼酸酯，將平衡移向更多的藥物穿過脂質雙層。通過這一方式，肽硼酸化合物積累在脂質體中並且穩定地包封於其中。包括脂質-聚合物-配基靶向綴合物的脂質體製劑可通過多種方法製備。一種方法涉及製備包括末端官能化的脂質-聚合物衍生物的脂質小泡；即，其中游離聚合物末端為反應性的或"活化的"的脂質_聚合物綴合物(參見例如美國專利No.6，326，353和No.6，132，763)。這種活化綴合物包括在脂質體組合物中並且在脂質體形成後活化的聚合物末端可與靶向配基反應。在另一方法中，脂質_聚合物_配基綴合物在脂質體形成時包括於脂質組合物中(參見，美國專利No.6，224，903和No.5，620，689)。在又一方法中，將脂質_聚合物_配基綴合物的膠束溶液與脂質體混懸液孵育並將脂質_聚合物_配基綴合物插入預形成的脂質體中(參見，例如，美國專利No.6，056，973和No.6，316，024)。III.使用方法具有以硼酸酯形式包封的肽硼酸化合物的脂質體製劑可用於治療荷瘤患者。在肽硼酸化合物包括硼同位素的實施例中，該脂質體製劑可用於硼中子捕獲療法。現描述這些用途A.腫瘤治療硼酸化合物屬於被稱作蛋白酶體抑制劑的一類藥物。蛋白酶體抑制劑可通過它們抑制細胞蛋白酶體活性的能力誘導細胞凋亡。更具體而言，在真核細胞中，泛素-蛋白酶體途徑是胞內蛋白質的蛋白降解的中心途徑。通過連接多聚泛素鏈蛋白質首先被靶向以進行蛋白水解，接著通過蛋白酶體快速降解成小肽並釋放和回收泛素。這一協調的蛋白水解途徑依賴於泛素-綴合系統和26S蛋白酶體的協同活性。26S蛋白酶體為存在於真核細胞的細胞核和胞質中的大分子量(1，500-2，000kDa)多亞基複合物。該複合物的催化核心，稱作20S蛋白酶體，是由四個包含_和_亞基的七聚體環組成的圓柱結構。該蛋白酶體是蘇氨酸蛋白酶，-亞基的N-端蘇氨酸提供攻擊靶蛋白質中的肽鍵羰基基團的親核體。至少有三種不同的蛋白水解活性與該蛋白酶體相關糜蛋白酶、胰蛋白酶和肽基穀氨醯胺酶活性。識別和結合多泛素化底物的能力來自19S(PA700)亞基，其結合至20S蛋白酶體的各個末端。這些附屬亞基使底物去摺疊並將它們提供至20S催化複合物中，同時移除連接的泛素分子。26S蛋白酶體的組裝和蛋白質底物的降解均為ATP-依賴性的(Almond,Leukemia顯433(2002))。泛素-蛋白酶體系統通過蛋白質的協同和暫時性降解調節許多細胞過程。通過控制許多關鍵細胞蛋白質的水平，蛋白酶體可作為細胞生長和凋亡的調節劑並且對其活性的破壞對細胞周期具有深遠影響。例如，缺陷凋亡與數種疾病包括一些癌症例如B細胞慢性淋巴細胞性白血病(存在靜止期腫瘤細胞的積聚)的發病機理相關。作為一類化合物，蛋白酶體抑制劑通常通過抑制蛋白酶體對蛋白質的降解來發揮作用。這類化合物包括肽醛、肽乙烯基碸，其通過結合併直接抑制蛋白酶體20S核心內的活性位點來發揮作用。然而你，肽醛和肽乙烯基碸以不可逆方式結合20S核心顆粒，從而在將它們去除時蛋白水解活性不可恢復。相反，肽硼酸化合物可穩定抑制蛋白酶體，但可從蛋白酶體緩慢解離。肽硼酸化合物比它們的肽醛類似物作用更強，並更特異性地發揮作用，因為硼和硫之間的弱相互作用意味著肽硼酸酯不抑制巰基蛋白酶(Richardson,P.G.，等人，CancerControl.邊(5):361，(2003))。將各種腫瘤衍生細胞系與蛋白酶體抑制劑接觸可引發凋亡，很可能是對數個途徑作用的結果，包括細胞周期調節蛋白p53和核因子B(NF-kB)(Grimm，L.M.和0sborne，B.A.，ResultsProbl.Cell.Differ.益209-28(1999);0rlowski，R.Z.，CellDeathDiffer.&(4):303-13(1999))。許多證明蛋白酶體抑制劑介導的凋亡的初步研究使用造血源細胞，包括成單核細胞(I腿joh-0hmi，S.等人，Biochem.Biophys.Res.Co匪n.217(3):1070-77(1995))、T-細胞和淋巴細胞性白血病細胞(Shinohara，K.等人，Biochem.J.317(Pt2):385-88，(1996))、淋巴瘤細胞(Tanimoto，Y.等人，J.Biochem.(Tokyo)121(3):542-49(1997))和前髓細胞性白血病細胞(Drexler，H.C.，Proc.Natl，Acad，Aci.U.S.A.M(3):855-60(1997))。對蛋白酶體抑制劑的體內抗腫瘤活性的第一次闡述使用了人淋巴瘤異種移植物模型(0rlowski，R.Z.等人，CancerRes顯(19):4342-48(1998))。而且，據報導，蛋白酶體抑制劑可誘導患者衍生的淋巴瘤(Or1owski，R.Z.等人，CancerRes顯(19):4342-48(1998))和白血病細胞(Masdehors，P.等人，Br.J.Haematol.，(3):752-57(1999))的優先凋亡並優先抑制多發性骨髓瘤細胞的增殖(Hideshima，T.等人，CencerRes.，虹(7):3071-76(2001))，而對對照、非轉化細胞則相對不足。因此，蛋白酶體抑制劑尤其可用作患有難以治癒的血液惡性腫瘤的患者的治療藥物。在一個實施例中，包含肽硼酸化合物的脂質體製劑被用於治療癌症，更具體而言用於在癌症患者中治療腫瘤。多發性骨髓瘤是一種不可治癒的惡性腫瘤，在美國每年有大約15，000人被診斷出該疾病(Richardson,P.G.等人，CancerControl.蓋(5):361(2003))。它是一種血液惡性腫瘤，其特徵通常在於同源漿細胞在骨髓的多個位點積聚。大部分患者可響應化療和放射的初步治療，然而由於抗性腫瘤細胞的增殖絕大多數最終會復發。在一個實施例中，本發明提供了治療多發性骨髓瘤的方法，該方法通過施用包含硼酸酯形式的包封的肽硼酸化合物的脂質體製劑。該脂質體製劑還可通過幫助克服癌細胞抵抗化療作用的一些主要途徑，而有效用於乳腺癌治療。例如，通過NF-kB(凋亡調節劑)的信號轉導和p44/42分裂素活化蛋白激酶途徑可以抗凋亡。因為蛋白酶體抑制劑可阻斷這些途徑，所以這些化合物可激活凋亡。因此，本發明提供了用於治療患乳腺癌的受試者的方法，該方法是通過施用包含肽硼酸化合物的脂質體。此外，因為化療藥物例如紫杉烷類和蒽環類已顯示可激活這些途徑之一或二者，蛋白酶體抑制劑與常規化療藥物結合使用可增強藥物例如紫杉醇和多柔比星的抗腫瘤活性。因此，在另一個實施例中，本發明提供一種治療方法，其中游離形式或脂質體包封形式的化療藥物與脂質體包封的肽硼酸化合物聯合使用。脂質體製劑的劑量和給藥方案取決於所治療的癌、癌階段、患者的體型大小和健康狀況以及對醫護人員而言顯而易見的其他因素。此外，用蛋白酶體抑制劑硼替佐米、Pyz-Phe-boroLeu(PS-341)進行的臨床研究提供了適當劑量和給藥方案的充分指導。例如，每周一次或兩次靜脈內給藥，實體瘤患者的最大耐受劑量為1.3mg/m2(0rlOWski，R.Z.等人，BreastCancerRes.互1-7(2003))。在另一試驗中，在為期3周的周期的第1、4、8和11天靜脈內推注硼替佐米表明最大耐受劑量為1.56mg/m2(Vorhees，P.M.等人，ClinicalCancerRes.2:6316(2003))。通常腸胃外施用脂質體製劑，優選靜脈內施用。應當理解，製劑可包括輔助遞送的任何必要的或需要的藥用輔料。在上述治療方法中，優選的蛋白酶體抑制劑為硼替佐米(Pyz-Phe-boroLeu;Pyz:2，5-吡嗪酸；PS-341)，其具有以下結構硼替佐米已顯示對各種癌組織包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌以及對各種腫瘤例如胰腺瘤、淋巴瘤和黑素瘤具有活性。(Teicher，B.A.等人，Clin.CancerRes.5(9):2638-45(1999);Adams，J.，Semin.Oncol.，^(6):613-19(2001);0rlowski，R.ZS.和Dees.E.C.，BreastCancerRes.互(l):1-7(2002);F屋kel等人，Clin.CancerRes.&(9):3719-28(2000);Shah，S.A.等人，J.Cell.Biochem.§^(1):110-22(2001))。b.辨補雙m去在另一方面，本發明提供施用硼-10同位素至腫瘤，用於硼-中子捕獲療法(1QB-NCT)的方法。根據以下等式，用於癌症治療的中子-捕獲療法是基於、同位素與熱中子(各自均相對無害)的相互作用"B+'n—7Li+4He+2.4MeV該反應導致限定至單個癌細胞或鄰近的癌細胞的強烈電離輻射。因此，對於成功的治療，需要遞送足夠量的硼-10同位素至腫瘤。本文描述的脂質體製劑提供了將帶有、同位素的肽硼酸化合物包封在脂質體內的手段。由於這種脂質體長的血液循環壽命，包括表面包覆有親水聚合物鏈的該脂質體優先積聚在腫瘤中(參見例如美國專利No.5，013，556和No.5，213，804)。裝載了帶有1QB同位素的肽硼酸化合物的脂質體通過兩種獨立的機制根除腫瘤脂質體在腫瘤中作為藥物貯庫起作用並在該腫瘤中逐漸釋放抗癌化合物；以及脂質體用於在腫瘤中積聚大量的硼10同位素，促進硼中子捕獲療法的效率。根據上述內容，本發明的各個方面和特徵將顯而易見。本文描述了包含水溶性的不可滲透脂質雙層的式I或II化合物和肽硼酸化合物的脂質體。該脂質體通過如下方式製備將式I或II化合物包封在脂質體的內部水性隔室內，從外部介質移除任何未包封的式I或II化合物，加入可滲透脂質雙層的硼酸化合物，其穿過脂質雙層膜與式I或II化合物的鄰位羥基部分形成不可逆的酯鍵。通過該方式，正常情況下可自由滲透通過脂質雙層的硼酸化合物被穩定地包封於脂質體中。肽硼酸化合物向脂質體內積聚發生在無離子梯度存在的情況下，然而，需要時可存在離子梯度。以下實例進一步說明了本文描述的發明並且絕不旨在限制本發明的範圍。實例1化合物1絡合劑的合成將乳糖(4.lg，12mmol)、鹽酸甲胺(1.35g，20翻l)和氰基硼氫化鈉(5M，1.2mL，6mmo1)加入壓力管，充氬氣，調pH至7.0(pH試紙)。密封反應管，在室溫下攪拌反應混合物24小時，然後於40-5(TC加熱16小時。通過TLC(Si02，乙醇/乙酸/水5:1:2)監測反應。在乙醇(400mL)中沉澱反應混合物。過濾分離沉澱，在離子交換樹脂柱(Bio-Rex70，水為洗脫劑)上純化。通過離子交換純化產物兩次。合併產物級分，凍幹得到1.373g白色固體產物。'HNMR(400MHz，D20)S4.53(d，J=8Hz，1H)，4.23-4.19(m，1H)，3.97-3.53(m，10H)，3.55(dd，J=10and8Hz，1H)，3.361(dd，J=13and3Hz，lH)，3.14(dd，J=13and10Hz，1H)，2.77(s，3H)。裝載硼替佐米的fl旨質體將化合物l溶解於水中並調pH至7.4。將摩爾比為IO:5:l的卵磷脂醯膽鹼、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2，OOODa，AvantiPolarLipids,Birmingham,AL)混合物溶解於氯仿中，真空蒸乾溶劑，將脂質膜在化合物l溶液中振搖孵育，在壓力下將脂質分散體擠壓透過2層重疊的孔徑為0.2ym的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用S印haroseCL-4B(Pharmacia,Piscataway，NJ)上的凝膠色譜將外緩衝液交換為P朋.5包含5mM羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(HEPES)的0.14MNaCl;與此同時，移除未包封的化合物1。向如此獲得的脂質體中加入硼替佐米。將混合物於37t:振搖孵育過夜，用Dowex50WX4(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)處理，並用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通過濾過0.2m濾器將所得脂質體除菌。實例2化合物2絡合劑的合成將乳糖(4.79g，14mmo1)、L-賴氨酸(0.985g，6mmo1)、氰基硼氫化鈉(5M，3mL，15rnmo1)和MilliQ水(8mL)加入裝有磁性攪拌棒的壓力管中。向管中充入氬氣，密封，並在50-6(TC下攪拌2天。在乙醇中沉澱反應混合物。分離沉澱，然後溶於MilliQ水，加入透析管(MWC0=500)中，在水中透析。在乙醇中再次沉澱產物，過濾，並將固體真空乾燥2天，獲得3.081g白色固體產物。力NMR(400MHz，D20)S4.52(d，J=6Hz，1H)，4.50(d，J=6Hz，161H)，4.25-4.12(m，2H)，3.97—3.50(m，28H)，3.07(m，2H)，1.70(broad,m，4H)，1.40(broadm，2H)。織石朋靴細薩本將化合物2溶解於水中並調pH至7.4。將摩爾比為IO:5:1的卵磷脂醯膽鹼、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2，000Da，AvantiPolarLipids,Birmingham,AL)混合物溶解於氯仿中，真空蒸乾溶劑，將脂質膜在化合物.2溶液中振搖孵育，並在壓力下將脂質分散體擠壓透過兩層重疊的孔徑為0.2m的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用S印haroseCL-4B(Pharmacia,Piscataway，NJ)上的凝膠色譜將外緩衝液交換為P朋.5包含5mM羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(HEPES)的0.14MNaCl;與此同時，移除未包封的化合物2。向如此獲得的脂質體中加入硼替佐米。將混合物於37t:振搖孵育過夜，用Dowex50WX4(SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)處理，並用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通過濾過0.2m濾器將所得脂質體除菌。實例3化合物3絡合劑的合成將右旋糖(4.5g，25mmo1)、L-賴氨酸(0.985g，6mmo1)、氰基硼氫化鈉(5M，5mL，25mmol)和MilliQ水(8mL)加入裝有磁性攪拌棒的壓力管中。向管中充入氬氣，密封，在50-6(TC下攪拌2天。在乙醇中沉澱反應混合物。分離沉澱，然後溶解於MilliQ水中，加入透析管(麗C0=500)，在水中透析。在乙醇中再次沉澱產物，過濾，並將固體真空乾燥16小時，獲得3.22g白色固體產物。力NMR(400MHz，D20)S3.84-3.60(m，15H)，3.09(broadm，4H)，1.70(broad,m，4H)，1.40(broadm，2H)。裝載硼替佐米的fl旨質體將化合物3溶解於水中並調pH至7。將摩爾比為10:5:l的卵磷脂醯膽鹼、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2，000Da，AvantiPolarLipids,Birmingham,AL)混合物溶解於氯仿中，真空蒸乾溶劑，將脂質膜在化合物3溶液中振搖孵育，在壓力下將脂質分散體擠壓透過2層重疊的孔徑為0.2ym的Nucleopore(Pleasanton,CA)膜。用S印haroseCL-4B(Pharmacia,Piscataway,NJ)上的凝膠色譜將外緩衝液交換為P朋.5包含5mM羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(HEPES)的0.14MNaCl;與此同時，移除未包封的化合物3。向如此獲得的脂質體中加入硼替佐米。將混合物於37t:振搖孵育過夜，用Dowex50WX4(SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)處理，並用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通過濾過0.2m濾器將所得脂質體除菌。實例4化合物4絡合劑的合成將樹枝狀聚合物(PAMAM，第二代，分子量為3284，在Me0H中為20重量X，2g)減壓蒸乾。將殘餘物溶解於水(5mL)中，轉移至壓力管，並用鹽酸調pH至7.0。將右旋糖(0.51g，2.83mmo1)和氰基硼氫化鈉(5M，3mL，15mmo1)加入裝有磁性攪拌棒的壓力管中。向管中充入氬氣，密封，在4(TC下攪拌16小時。在乙醇中沉澱反應混合物。分離沉澱，然後溶於MilliQ水，加入透析管(MWC0=l，OOO)中，在水中透析。然後在乙醇中沉澱產物，過濾，並將固體真空乾燥16小時，獲得0.48g白色固體產物。所用的樹枝狀體每分子具有16個氨基。分子量為3284。化合物4是數種不同綴合物數目的混合物。織石朋靴細薩本將化合物4溶解於水中並調pH至7.4。將摩爾比為IO:5:1的卵磷脂醯膽鹼、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2，000Da，AvantiPolarLipids,Birmingham,AL)混合物溶解於氯仿中，真空蒸乾溶劑，將脂質膜在化合物4溶液中振搖孵育，在壓力下將脂質分散體擠壓透過2層重疊的孔徑為0.2m的Nucleopore(Pleasanton，CA)膜。用S印haroseCL-4B(Pharmacia,Piscataway，NJ)上的凝膠色譜將外緩衝液交換為P朋.5包含5mM羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(HEPES)的0.14MNaCl;與此同時，移除未包封的化合物4。向如此獲得的脂質體中加入硼替佐米。將混合物於37t:振搖孵育過夜，用Dowex50WX4(SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)處理，並用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通過濾過0.2m濾器將所得脂質體除菌。實例5化合物5絡合劑的合成將乳糖(5.13g，25mmol)、3-氨基-l，2-丙二醇(1.64g，18mmol)、氰基硼氫化鈉(5M，3.6mL，18mmo1)和MilliQ水(6mL)加入裝有磁性攪拌棒的壓力管中。向管中充入氬氣，密封，並在40-5(TC下攪拌2天。在乙醇中沉澱反應混合物。分離沉澱，然後溶解於MilliQ水中，加入透析管(MWC0=100)中，在水中透析。然後在乙醇中沉澱產物，過濾，將固體真空乾燥16小時，獲得1.07g白色固體產物？HNMR(400MHz，D20)S3.84-3.60(m，15H)，3.09(寬峰，m，4H)，1.70(寬峰，m，4H)，1.40(寬峰，m，2H)。織石朋靴細薩本將化合物5溶解於水中並調pH至7.4。將摩爾比為10:5:1的卵磷脂醯膽鹼、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE，PEG分子量2，000Da，AvantiPolarLipids,Birmingham,AL)混合物溶解於氯仿中，真空蒸乾溶劑，將脂質膜在化合物5溶液中振搖孵育，在壓力下將脂質分散體擠壓透過2層重疊的孔徑為0.2m的Nucleopore(Pleasanton,CA)膜。用S印haroseCL-4B(Pharmacia,Piscataway,NJ)上的凝膠色譜將外緩衝液交換為P朋.5包含5mM羥乙基哌嗪乙磺酸鈉(HEPES)的0.14MNaCl;與此同時，移除未包封的化合物5。向如此獲得的脂質體中加入硼替佐米。將混合物於37t:振搖孵育過夜，用Dowex50WX4(SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)處理，並用NaCl-HEPES溶液平衡以移除未包封的硼替佐米。通過濾過0.2m濾器將所得脂質體除菌。實例6脂質體包封的硼替佐米的體外活件讓多發性骨髓瘤細胞在微量滴定板上生長至匯合。將這些細胞與如實例1-5所述以不同濃度的肽硼酸化合物製備的脂質體一起孵育。在24小時孵育期後，檢測細胞的凋亡。發現，經脂質體製劑處理的細胞比對照細胞具有更高的凋亡發生率。實例7脂質體包封硼替佐米的體外活件對如實例1-5所述製備的脂質體進行數個體外試驗，用以葡甲胺作為絡合劑的脂質體包封的硼替佐米作為對照。數據來自(1)硼替佐米與脂質體中所用的絡合劑的ITC結合試驗，(2)脂質體的藥物釋放試驗；和(3)載藥穩定性試驗。ITC藥物結合試驗通過可控參數下的溫滴定微量熱儀(VP-ITC，MicroCal，Northampton,MA)來研究多種絡合劑與硼替佐米的結合。在相同的甘氨酸儲液(Sigma-Aldrich，100mM，pH9.5)中溶解所需量的材料來單獨製備實例1-5的絡合劑、葡甲胺(ImM)和硼替佐米(18.2mM)溶液，以保證與甘氨酸濃度和pH匹配。檢查pH水平兩次，必要時調整至O.2個單位以內。將溶液脫氣10-15分鐘。將硼替佐米溶液上樣至自動注射器中並滴定(每次注射5-10iiL)至已載入ITC樣品細胞的絡合劑(CR)溶液。該試驗在3(TC下進行。使用與活性操作相同的參數將相同的藥物溶液滴定至100mM甘氨酸溶液進行基準操作。用ITC生產商提供的軟體程序(Microcaloriginv5.0)進行數據處理以產生結合參數。tableseeoriginaldocumentpage19全血中的體外藥物釋放測l定法將體積比為l:4的試驗製劑和大鼠全血的混合物以500rpm在37t:下振搖24小時。在時間點0、1、2、6和24小時取樣，並於以低的RPM旋轉數分鐘。取出上清血漿並用MS/MS分析游離藥物。在藥物釋放上，根據實例1製備的脂質體和以葡甲胺為絡合劑的脂質體包封的硼替佐米之間無顯著性差異。載藥穩定件i式驗於25t:孵育脂質體包封的硼替佐米製劑，檢測其粒徑、pH和藥物包封率。用尺寸排阻色譜法測定藥物包封率。將樣品(100uL)上樣至Bio-Gel，P-6柱(0.5X30cm)中，用pH7.0，100mMHEPES-NaCl(150mM)溶液洗脫，並收集級分(lmL/管)。檢測脂質體和游離藥物級分在270nm處的紫外吸收，並分別合併，然後用HPLC分析。25"C下的脂質體載藥穩定性試-險tableseeoriginaldocumentpage19E.E.=包封率儘管已就具體的實施例描述了本發明，但是對本領域技術人員顯而易見的是，可進行各種變化和修改而不偏離本發明。權利要求一種組合物，包含由小泡形成脂質形成的脂質體和包封於所述脂質體中由肽硼酸化合物和式I或II化合物構成的硼酸酯化合物。2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述肽硼酸化合物為二肽基硼酸化合物。3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述肽硼酸化合物為硼替佐米。4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述化合物為式II化合物，並且其中RpR^RpR4和R5為H。5.根據權利要求4所述的組合物，其中D為每分子具有16個氨基基團的共軛G2樹枝狀聚合物。6.根據權利要求1所述的組合物，其中所述化合物為式I化合物，並且其中Y為H、B或E。7.根據權利要求6所述的組合物，其中&為H，或R2為H，或R3為H或A，或R4為H，或Rs為H。8.根據權利要求6所述的組合物，其中Y、&、R2、R4、R5各自為H並且R3為A。9.根據權利要求1所述的組合物，其中所述脂質體進一步包括內部較高/外部較低的離子梯度。10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述離子梯度為氫離子梯度。11.根據權利要求IO所述的組合物，其中所述氫離子梯度提供約7.5-8.5的內部pH和約6-7的外部pH。12.根據權利要求1所述的組合物，其中所述脂質體進一步包含約1-20摩爾百分比的用親水聚合物衍生的疏水部分。13.根據權利要求12所述的組合物，其中所述用親水聚合物衍生的疏水部分為用聚乙二醇衍生的疏水部分。14.根據權利要求13所述的組合物，其中所述疏水部分為脂質。15.—種用於使用肽硼酸化合物的療法的組合物，包含根據權利要求1所述的組合物，其中將所述組合物施用給受試者。16.根據權利要求15所述的組合物，其中所述組合物經注射施用。17.根據權利要求15所述的組合物，用於治療多發性骨髓瘤。18.—種用於治療多發性骨髓瘤的組合物，包含根據權利要求1所述的脂質體組合物。19.一種用於在接受放射療法的荷瘤受試者中選擇性破壞腫瘤組織的組合物，所述組合物包含根據權利要求1所述的脂質體混懸液，其中所述混懸液與硼的同位素聯合施用給所述受試者；並且其中所述受試者接受放射療法。20.根據權利要求19所述的組合物，其中所述硼的同位素是在肽硼酸中。21.根據權利要求19所述的組合物，其中所述硼的同位素為"B。全文摘要本發明描述一種由脂質體構成的脂質體組合物，所述脂質體具有包封於其中的肽硼酸蛋白酶體抑制劑化合物。更具體而言，將具有包封於內部水性隔室內的式I或II化合物的脂質體裝載肽硼酸化合物，以在所述脂質體水性隔室內形成硼酸酯化合物。在一個實施例中，所述脂質體具有親水聚合物鏈的外包衣並用於在受試者治療實體腫瘤。文檔編號A61K9/127GK101795672SQ200880105678公開日2010年8月4日申請日期2008年8月21日優先權日2007年8月21日發明者A·黃,B·羅,J·王,Y·張申請人:阿爾扎公司