一種含有從桑黃中提取的活性物質的藥物組合物、製備方法及其在製備藥物中的應用的製作方法

2023-07-21 15:15:21 1

專利名稱：一種含有從桑黃中提取的活性物質的藥物組合物、製備方法及其在製備藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物、製備方法及其在製備藥物中的應用，具體講涉及一種含有從桑黃中提取的活性物質的藥物組合物、製備方法及其在製備抗癌藥物、免疫調節藥物、降血壓藥物及降血糖藥物中的應用。
背景技術：
桑黃作為中藥材在中國早有記載，其子實體入藥，味微苦，能利五臟，軟堅，排毒，止血，活血；多用於和胃止瀉，淋病，崩漏帶下，脾虛洩瀉等症。在韓國、日本和東南亞國家也作為汗方治療腸胃病、淋巴疾病及各種癌症。日本最早對桑黃的抗腫瘤作用進行了研究，Ikekawa T，Nakanishi等人(Chem.Pharm.Bull.1995.43(12)2105-2108)在1968年進行的真菌抗腫瘤的研究中，對包括雲芝Coriolus versicolor和桑黃等在內的擔子綱真菌用肉瘤180對ICR小鼠進行了抗腫瘤實驗，發現在11種擔子綱真菌中，桑黃提取物對腫瘤的抑制率最強，達到96.7％，而且這種水萃取物對肉瘤180細胞不表現細胞毒性。韓國在80年代開始對桑黃進行正式研究並在菌種培養、分離純化、成分分析、藥效、藥理作用及作用機制等方面取得了豐碩的成果，1984年，韓國製藥公司成功取得桑黃菌絲體的培養許可；1993年韓國政府正式許可桑黃成為菌類抗癌藥品。
國際專利申請WO0151070公開了通過分子篩法處理木層孔菌屬菌類的熱水或低級醇萃取物，收集分子量6,000-60,000部分的活性物質，該活性物質顯示抗癌作用、免疫激活作用、抗氧化作用、降低血壓和血糖作用等生理作用。但並未給出這種活性物質的物理化學性質，也未給出其藥效學實驗數據。
國際專利申請WO0160385公開了從裂蹄木層孔菌屬(Phellinus linteus)提取的多糖PL用於治療糖尿病的新用途。PL是對桑黃菌絲體培養物的熱水萃取物進行了醇沉、二乙氨基乙基-纖維素柱層析和凝膠滲透柱層析的提純(Chem.Pharm.Bull.，43(12)，2105-2108，1995)。用凝膠滲透HPLC法分析，發現其為含13.2％肽和82.5％糖的基本純物質，其中6.8％的多糖為糖醛酸。凝膠色譜顯示PL的分子量為153KD。PL含有7.0％阿拉伯糖，3.7％木糖，21.1％葡萄糖，24.1％半乳糖，44.2％甘露糖，同時含有以穀氨酸和天冬氨酸為主的十種胺基酸。此雜多糖對B淋巴細胞的激活濃度為3μg/ml，此化合物保持完整結構和其多糖部分對活性是至關重要的。PL具有增強免疫，抗腫瘤、抗病毒及抗氧化的作用是已知的(Journal of biochemistry and molecular biology34(2001)2144-149；Carcinogenesis 23(2002)71163-1169；Internationalimmunopharmacology 3(2003)91281-1292；Biotechnology Letters25(2003)242093-2096；Biotechnology Letters25(2003)2167-172；Biologicalpharmaceuticalbulletin26(2003)101418-1423；Biologicalpharmaceuticalbulletin26(2003)6823-831；)。但從桑黃菌絲體中提取的雜多糖藥效活性有待提高。

發明內容
本發明提供一種藥物組合物，含有從桑黃子實體中提取的活性物質及藥學上可接受的載體，此活性物質具有抗腫瘤、抗病毒及增強免疫的活性。
本發明的另一目的是提供所述藥物組合物的製備方法。
本發明的第三個目的是提供所述組合物在製備抗癌藥物、免疫調節藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應用。
本發明的藥用組合物，所述組合物包含從桑黃中提取的活性物質以及藥學上可接受的載體；所述活性物質是由分子量11～15千道爾頓的多糖PT1與分子量17～23千道爾頓的蛋白多糖PT2以1∶1～1∶4的重量比相混合，所述桑黃是指針層孔菌Phellinus igniarius以及其同屬的Phellinus vaninii；Pheliinusbaumii；Phellinus linteus；Phellinus hartigii；Phellinus pini真菌的子實體。
本發明通過將從桑黃中提取的分子量11～15千道爾頓的多糖PT1和分子量17～23千道爾頓的蛋白多糖PT2按比例混合，配以藥學上可接受的載體，成功的發明了一種抗腫瘤、抗病毒及增強免疫的藥物組合物。
本發明的藥用組合物，所述多糖PT1中按重量百分比計總多糖為94～98％，其中還原糖為5～10％，酸性多糖為20～25％；多糖PT1的主要組分為葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖∶甘露糖重量比為60-64∶1；痕量的胺基酸組成為天門冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和賴氨酸。
本發明的藥用組合物，所述多糖PT1紅外吸收的最大波數為3410.2cm-1±50cm-1、2895.0cm-1±50cm-1、1635.3cm-1±50cm-1、1418.8cm-1±50cm-1、1374.7cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、894.4cm-1±50cm-1和579.8cm-1±50cm-1。
本發明的藥用組合物，所述蛋白多糖PT2中按重量百分比計總多糖為67～90％，其中酸性多糖為30～40％，還原糖含量為10～14％；蛋白多糖PT2中構成多糖的主要組分為葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，其中葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖重量比為70-73∶1∶0.5-0.8；蛋白多糖PT2中蛋白含量是10～33％，其中胺基酸的組成為纈氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸。
本發明的藥用組合物，所述蛋白多糖PT2紅外吸收的最大波數為3388.4cm-1±50cm-1、2895.7cm-1±50cm-1、1612.1cm-1±50cm-1、1413.5cm-1±50cm-1、1298.3cm-1±50cm-1、1155.4cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、896.8cm-1±50cm-1、627.7cm-1±50cm-1和585.2cm-1±50cm-1。
本發明的藥用組合物，所述活性物質與藥學上可接受載體按製劑領域中的技術製成的口服製劑或非腸道給藥製劑。
例如，本發明的藥物組合物可以按常規製劑方法製備成膠囊劑，其中所述藥學上可接受載體包括微晶纖維素、澱粉、乳糖、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基澱粉鈉、微粉矽膠或40CP-100CP乙基纖維素、硬醋酸鈉等中的一種或幾種。本發明膠囊劑的製備方法是取桑黃活性物質和所述藥學上可接受載體分別研細過篩，混合均勻，裝膠囊，或用粘合劑製成軟材，篩濾制粒，置50-60℃條件下乾燥，再篩濾整粒後加入潤滑劑，混合均勻，裝膠囊。
例如，本發明的藥物組合物可以按常規製劑方法製備成顆粒劑，其中所述藥學上可接受載體包括成型劑，可選用如β-環糊精、乳糖和糊精等中的至少一種，矯味劑可選用，如蔗糖、碳酸鈉、椰子香精等中的至少一種，崩解劑可選用，如可溶性澱粉、羧甲基澱粉鈉等中的一種；粘合劑可選用，如聚維酮K30或其它臨床上可接受的結構類似物。本發明顆粒劑的製備方法為按配方量取主藥與上述輔料混合後，噴霧乾燥，乾式制粒，整粒即得產品；或將原輔料混合按配方量加入粘合劑，製成軟材，將上述軟材經12目篩制粒，再於30-75℃乾燥，12目篩整粒，將整粒好的顆粒加入已過80目篩的椰子香精混合均勻，分裝即得顆粒劑。
例如，本發明的藥物組合物可以按常規製劑方法製備成片劑，其中所述藥學上可接受載體包括藥用片劑的稀釋劑、粘合劑、崩解劑和潤滑劑；其中稀釋劑可選擇微晶纖維素、澱粉、乳糖、糊精、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇等中的一種或多種。粘合劑可選擇澱粉漿、PVP膠漿、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素和明膠漿等中的一種。崩解劑可選擇澱粉、羧甲基澱粉鈉、微粉矽膠等中的一種。潤滑劑可選擇滑石粉、硬脂酸鎂等中的一種。本發明片劑的製備方法是取桑黃活性物質和稀釋劑、崩解劑分別研細過篩，混合均勻，用粘合劑製成軟材，篩濾制粒，置50-60℃條件下乾燥，再篩濾整拉後加入潤滑劑，混合均勻，壓片。
例如，本發明的藥物組合物可以按常規製劑方法製備成注射液，賦形劑為甘露醇、山梨醇、或低分子右旋糖酐等中的一種。抗氧劑為氮氣、二氧化碳氣、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等。本發明注射劑是通過下述方法實現的在潔淨條件下，將活性物質與藥學允許的賦性劑和抗氧劑按配方量充分混合均勻，加入適量的注射用水，加熱攪拌使之完全溶解，粗濾，超濾得到無熱源的澄清液，置於安瓿瓶或西林瓶中，按水針工藝或凍幹工藝製作即得產品。
本發明藥物組合物的製備方法，所述多糖PT1和蛋白多糖PT2是通過下述方法得到將桑黃子實體的水萃取物溶於pH為7.1-7.8的磷酸鈉緩衝液中，上載所述磷酸鈉緩衝液平衡的乙二氨基乙基纖維素柱，用所述磷酸鹽緩衝液洗脫後，再用pH為7.1-7.8的0.1～1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩衝液進行梯度洗脫，最後用pH為7.1-7.8的0.9-1.1M的氯化鈉磷酸鹽緩衝液洗脫，其中將對糖含量和蛋白含量的檢測方法均呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對糖含量檢測方法呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述多糖PT1。
本發明的藥物組合物的製備方法，所述得到的多糖PT1、蛋白多糖PT2再分別通過seveg法和/或凝膠滲透方法純化，得到精提的多糖PT1、蛋白多糖PT2。
本發明所述的活性物質更具體的製備方法是所述桑黃子實體的水萃取物以1∶1.5～8重量比溶於pH為7.7的磷酸鈉緩衝液中，上載所述磷酸鈉緩衝液平衡的4×60釐米的乙二氨基乙基纖維素柱，以流速5毫升/分鐘先後用以下洗脫液洗脫(1)pH為7.7的磷酸鈉緩衝液500毫升洗脫；(2)再用0.1-1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩衝液溶液(pH為7.7)1000毫升進行梯度洗脫；(3)最後用1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩衝液溶液(pH為7.7)500毫升洗脫；其中將對糖含量的檢測方法和蛋白含量的檢測方法均呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對測糖含量的檢測方法呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述多糖PT1。進一步通過seveg法除游離蛋白，也可再用凝膠柱G200去游離蛋白和其他雜質得到所述多糖PT1和蛋白多糖PT2；上述糖含量的檢測方法是指苯酚-硫酸檢測法，蛋白含量的檢測方法為Folin酚試劑法或考馬斯亮藍法。
本發明的藥物組合物的製備方法，所述桑黃子實體的水萃取物通過下述方法得到將桑黃子實體粉碎，過20～60目篩後用4～30倍體積的水在70～100℃的溫度下回流萃取2～10小時，萃取液過濾後減壓濃縮，加入乙醇沉澱，過濾得沉澱，沉澱用丙酮和乙醇先後洗滌，冷凍乾燥。
本發明組合物在製備抗癌藥物、免疫調節藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應用。
桑黃子實體的水萃取物、多糖PT1和蛋白多糖PT2的分子量的測定和純度研究採用凝膠滲透色譜，多糖分子量的測定都是以分子量已知的標準多糖在高效凝膠滲透色譜(HPGPC)系統中研究LgM與保留時間之間的線性關係從而確定所研究多糖的分子量，通過該色譜條件可獲得多糖純度的信息；活性多糖組合物、多糖PT1和蛋白多糖PT2中總糖含量採用硫酸苯酚法測定；酸性多糖含量採用硫酸咔唑法測定；還原糖含量採用DNS法測定；多糖PT1和蛋白多糖PT2中蛋白含量可採用Folin-酚試劑法、BCA法或Bradford法測定。
本發明的有意效果在於1.本發明從桑黃提取的活性物質中多糖PT1與蛋白多糖PT2按比例組合表現很好的協同作用，使本發明從桑黃提取的活性物質具有顯著的抗腫瘤活性和增強免疫活性。
2.本發明從桑黃提取的活性物質工藝簡單，產量高。


圖1桑黃多糖PT1紅外線吸收圖譜圖2桑黃多糖PT1H-NMR圖譜圖3桑黃多糖PT1C-NMR圖譜圖4桑黃蛋白多糖PT2紅外線吸收圖譜圖5桑黃蛋白多糖PT2H-NMR圖譜圖6桑黃蛋白多糖PT2C-NMR圖譜下面實施例對本發明進行更具體說明，並不是對本發明的具體限制。
實施例1一種製備桑黃中提取的活性物質的方法包括以下步驟i.桑黃子實體的水萃取物的製備方法將桑黃子實體400g粉碎，過60目篩後用3000ml水在90℃的溫度下回流萃取8小時，過濾，固體殘渣再重複上述提取過程3次後，合併濾液，減壓濃縮至50ml體積，加入乙醇200ml，置4℃環境下放置24小時，過濾，固體用丙酮和乙醇先各30ml洗滌後，冷凍乾燥，得28g；硫酸苯酚法測得多糖含量為65％。
ii.多糖PT1和蛋白多糖PT2的製備方法取桑黃子實體的水萃取物經醇沉後所得樣品5g加15ml pH為7.7的磷酸鈉(5m mol)緩衝液，溶液用DEAE-cellulose柱(4×60cm)層析進行初步分離。首先以緩衝液500ml作為洗脫液，再用0.1-1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩衝液溶液(pH為7.7)1000ml作梯度洗脫液進行梯度洗脫，最後用1.0M的氯化鈉-磷酸鹽緩衝液溶液(pH為7.7)500毫升洗脫，其中將對測糖含量的苯酚-硫酸檢測法和測蛋白含量的考馬斯亮蘭檢測方法均呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對苯酚硫酸法檢測呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述多糖PT1。進一步通過seveg法除游離蛋白，冷凍乾燥，得到粗品PT10.6g和PT21.7g。再通過凝膠滲透方法純化PT1，選用Sephadex-G200(1.6×40cm)，上樣粗品PT160mg，250mlNaCl溶液(20mmol)衝洗，流速0.2ml/min，去游離蛋白和其他雜質，自動收集儀分別收取各流分，冷凍乾燥後得到所述多糖PT130mg；PT2無需通過此步純化步驟；PT1和PT2總收率2.8％，佔水萃取物的40％。
多糖PT1的物理化學性質(1)分子量11～15千道爾頓(2)糖含量總糖為95％，還原糖為7％，酸性多糖為22％(3)主要糖構成比葡萄糖∶甘露糖＝62∶1；(4)胺基酸組成天門冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸；(5)紅外光譜見圖1(6)1H-NMR圖譜見圖2(7)13C-NMR圖譜見圖3蛋白多糖PT2的物理化學性質(1)分子量17～23千道爾頓(2)糖含量總糖為69％，還原糖為12％，酸性多糖為37％(3)蛋白含量10％；(4)主要糖構成比葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖＝72∶1∶0.7；(5)胺基酸組成纈氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸；(6)紅外光譜見圖4
(7)1H-NMR圖譜見圖5(8)13C-NMR圖譜見圖6iii.PT1和PT2以1∶3重量比相混合。
實施例2製備桑黃中提取的活性物質的方法基本同實施例1，所不同之處在於所用測蛋白含量的檢測方法為Folin酚試劑法。
實施例3一種含有從桑黃提取的活性物質的混合物製成的片劑，活性物質是PT1和PT2按重量比1∶3的混合物(PT1和PT2製備方法如實施例1)，處方如下桑黃活性物質200g乳糖200g澱粉漿 適量羧甲基澱粉納10g硬脂酸鎂6g共制的1000片製備方法桑黃活性物質，乳糖，羧甲基澱粉鈉，分別研細過60目篩，按上述處方稱重、配料並混合均勻，在攪拌下，用澱粉漿製成軟材，過18目篩製成溼顆粒並在60℃的溫度下乾燥4小時，再篩濾整粒後加入硬脂酸鎂，混合均勻，壓片。
本發明的用法與用量口服，飯間服用；每日兩次，每次兩片。
實施例4一種藥物組合物製成的抗癌的顆粒劑，活性物質是PT1和PT2按重量比1∶3的混合物(PT1和PT2製備方法如實施例1)，處方如下桑黃活性物質200g乳糖400g蔗糖1000g椰子香精30g
聚維酮K3030g共制的1000袋製備方法取桑黃活性提取物、乳糖、蔗糖、椰子香精、聚維酮K30，分別研細過60目篩，按處方量取主藥與上述輔料混合後，噴霧乾燥，乾式制粒，整粒即得產品；或將原輔料混合按處方量加入粘合劑，製成軟材，將上述軟材經12目篩制粒，再於60℃乾燥，12目篩整粒，將整粒好的顆粒加入已過80目篩的椰子香精混合均勻，分裝即得顆粒劑。
本發明的用法與用量口服，飯間服用；每日兩次，每次一袋。
實施例5一種藥物組合物製成提高免疫的膠囊劑，活性物質是PT1、PT2重量比為1∶2.5的混合物(PT1和PT2製備方法如實施例1)，處方如下桑黃活性物質200g微晶纖維素 150g乳糖150g羧甲基澱粉鈉30g2％羥丙基纖維素 適量硬脂酸鎂6g共制的1000袋製備方法取桑黃活性物質、微晶纖維素、乳糖、羧甲基澱粉鈉，別研細過60目篩，按處方量取主藥與上述輔料，混合均勻，用黏合劑2％羥丙基纖維素製成軟材，18目篩篩濾制粒，置60℃條件下乾燥，整粒後加入硬脂酸鎂，混合均勻，裝膠囊。
本發明的用法與用量口服，飯間服用；每日兩次，每次一粒。
實施例6一種藥物組合物製成的治療癌症的注射劑，活性物質是PT1、PT2重量比為1∶3的混合物(PT1和PT2製備方法如實施例1)，處方如下
桑黃活性物質200g甘油50g亞硫酸鈉2g氯化鈉 4g共制的1000支製備方法在潔淨條件下，將活性物質與甘油、亞硫酸鈉、氯化鈉溶於注射用水，用0.2μm的微孔濾膜過濾，分裝於2ml安剖瓶中，封口、滅菌，製成0.2g的產品。
本發明的用法與用量注射，每次一支。
實施例7小鼠體內抗腫瘤作用實驗1實驗材料及方法1.1動物瑞士種昆明遠交系小鼠，雌性，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，二級動物，合格證SCXK-(軍)2002-001。選擇健康狀況良好、發育正常的3-4周齡、體重為17□22g的小鼠。每個劑量組小鼠混養在一個大的飼養缸中，自由攝食、飲水，飼料由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。動物房溫度控制在25℃，相對溼度50-60％。
1.2藥物桑黃多糖PT1桑黃蛋白多糖PT2桑黃中提取的活性物質(桑黃多糖PT1∶桑黃蛋白多糖PT2＝1∶3，w/w)注射用環磷醯胺(CTX)，購於解放軍307醫院，江蘇恆瑞醫藥股份有限公司，批准文號蘇衛藥準字(1996)第403501號，生產日期2003年11月，臨用前，準確稱100mg，加入10ml生理鹽水溶解混勻，按0.1ml/10g.bw腹腔注射給藥，給藥劑量100mg/kg.bw。
1.3小鼠腫瘤肝癌(H22)；肉瘤(S180)；肺癌(Lewis)
1.4實驗方法1.4.1 H22和S180小鼠實體瘤模型選擇接種傳代後第7天健康狀況較好的H22和S180腹水型瘤源動物，頸椎脫臼，固定於蠟板上，腹部皮膚用碘酊、酒精消毒後，剪開並剝去腹部皮膚，無菌抽取乳白色腹水，置於放置在冰塊上的無菌小燒杯內，加適量生理鹽水稀釋成1∶3的瘤組織懸液，使濃度為2×106個/ml活的癌細胞。立即接種於小鼠右前肢腋窩處皮下，每隻接種細胞懸液0.2ml，製成局灶性實體瘤試驗模型。
1.4.2 Lewis肺癌小鼠實體瘤模型選擇接種後10天，腫瘤生長旺盛而動物健康狀況較好的瘤源動物，頸椎脫臼，用碘酊、酒精消毒操作部位皮膚。切開皮膚、選擇生長良好的重量大約1克左右的Lewis肺癌腫瘤，剔除包膜和壞死部分，選取數個完好的瘤塊混合，放入含少許無菌生理鹽水的無菌平皿內保存瘤塊，將瘤塊剪成2-3cm3的小塊，置於玻璃勻漿器內，加入適量的生理鹽水，按1∶5的比例配製成瘤細胞懸液。每隻小鼠右前肢腋窩處皮下注射細胞懸液0.2ml，製成局灶性腫瘤模型。
1.4.3動物分組及給藥方法小鼠接種24小時後，隨機分組，每組10-15隻動物，所述藥物給藥劑量定為500mg/kg.bw，按0.2ml/10g.bw灌胃給藥；環磷醯胺組(陽性對照)100mg/kg.bw一次性腹腔注射給藥；腫瘤模型對照組(陰性對照)，每天灌胃蒸餾水0.4ml。每天給藥一次，連續10-13天。腫瘤對照組小鼠平均瘤重達1-2g時，停止給藥。
1.4.4樣本處理和觀察方法於末次給藥後24小時，各組小鼠稱體重後，脫頸處死，剖取腫瘤稱重。按照公式(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)×100％/對照組平均瘤重，求出抑瘤率，進行組間比較。所用小鼠均為雌性。
2結果列於表1表1.本發明從桑黃中提取的活性物質對小鼠腫瘤的抑制作用不同提取成分對腫瘤的抑制率(％)

表中數字為3次實驗的平均數±標準差由表1可知，本發明從桑黃中提取的活性物質對小鼠肝癌H22、小鼠肉瘤S180以及小鼠肺癌Lewis具有一定的生長抑制作用。
實施例8本發明從桑黃中提取的活性物質對小鼠免疫功能的影響1實驗材料1.1藥物桑黃中提取的活性物質(桑黃多糖PT1∶桑黃蛋白多糖PT2＝1∶3，w/w)用培養液(RMPI1640)配成25mg/ml的母液，0.2μm濾器過濾除菌後，4℃保存。臨用時用培養液配成所需濃度。
1.2陽性藥脂多糖(LPS)，購自Sigma公司，具有多方面的免疫刺激作用。用培養液配成1mg/ml保存液，-20℃保存。臨用取出，用培養液配成所需濃度。
1.3動物瑞士種昆明遠交系小鼠，6-8周齡，♀，購自本院實驗動物中心。
1.4細胞小鼠黑色素瘤B16細胞，引自醫科院藥物所。
2方法和結果
2.1巨噬細胞(MФ)對腫瘤細胞的細胞毒反應取小鼠腹腔巨噬細胞，2×105個/孔接種於U型底96孔組織培養板。分別加LPS1μg/ml，所述藥物各組加入50μg、100μg、200μg、300μg、500μg、1000μg/ml，作用24h後，加小鼠黑色素瘤B16細胞5000個/孔共同孵育6h。以LDH釋放法測巨噬細胞介導的細胞毒作用。細胞毒％＝(實驗孔-MФ自然釋放孔-B16自然釋放孔)/(B16最大釋放孔-B16自然釋放孔)100，結果見表2。
表2桑黃粗提物誘導巨噬細胞對小鼠腫瘤細胞的細胞毒反應

從表2對細胞毒性的結果可以看到本發明從桑黃中提取的活性物質對腫瘤細胞有一定的抑制作用，最小有效劑量為100μg/ml。
2.2腫瘤壞死因子(TNF-α)的測定藥物對MФ分泌腫瘤壞死因子-α的測定。小鼠MФ經粘附培養純化後，以2×105個/孔接種於96孔板。藥物處理24h後，吸取培養液上清，ELISA法測TNF-α，每個樣品測兩個孔。以吸光值對應於標準曲線的點計算其濃度，結果見表3。
表3.從桑黃中提取的活性物質對MФ分泌腫瘤壞死因子-α的測定

從表3的結果可以看到本發明從桑黃中提取的活性物質能促進小鼠巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子，並有一定的劑量效應關係，實驗中本發明從桑黃中提取的活性物質100μg/ml產生TNF是陰性對照組的4倍。
3小結初步的試驗結果表明本發明從桑黃中提取的活性物質對小鼠有免疫調節作用，可促進巨噬細胞殺傷腫瘤細胞，並促進巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子。
權利要求
1.一種藥用組合物，其特徵在於所述組合物包含從桑黃中提取的活性物質以及藥學上可接受的載體；所述活性物質是由分子量11～15千道爾頓的多糖PT1與分子量17～23千道爾頓的蛋白多糖PT2以1∶1～1∶4的重量比相混合，所述桑黃是指針層孔菌Phellinus igniarius以及其同屬的Phellinus vaninii；Phellinusbaumii；Phellinus linteus；Phellinus hartigii；Phellinus pini真菌的子實體。
2.按照權利要求1所述的藥用組合物，其特徵在於所述多糖PT1中按重量百分比計總多糖為94～98％，其中還原糖為5～10％，酸性多糖為20～25％；多糖PT1的主要組分為葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖∶甘露糖重量比為60-64∶1；痕量的胺基酸組成為天門冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和賴氨酸。
3.按照權利要求1所述的藥用組合物，其特徵在於所述多糖PT1紅外吸收的最大波數為3410.2cm-1±50cm-1、2895.0cm-1±50cm-1、1635.3cm-1±50cm-1、1418.8cm-1±50cm-1、1374.7cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、894.4cm-1±50cm-1和579.8cm-1±50cm-1。
4.按照權利要求1所述的藥用組合物，其特徵在於所述蛋白多糖PT2中按重量百分比計總多糖為67～90％，其中酸性多糖為30～40％，還原糖含量為10～14％；蛋白多糖PT2中構成多糖的主要組分為葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，其中葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖重量比為70-73∶1∶0.5-0.8；蛋白多糖PT2中蛋白含量是10～33％，其中胺基酸的組成為纈氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸。
5.按照權利要求1所述的藥用組合物，其特徵在於所述蛋白多糖PT2紅外吸收的最大波數為3388.4cm-1±50cm-1、2895.7cm-1±50cm-1、1612.1cm-1±50cm-1、1413.5cm-1±50cm-1、1298.3cm-1±50cm-1、1155.4cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、896.8cm-1±50cm-1、627.7cm-1±50cm-1和585.2cm-1±50cm-1。
6.按照權利要求1、2、3、4或5所述的藥用組合物，其特徵在於所述活性物質與藥學上可接受載體按製劑領域中的技術製成的口服製劑或非腸道給藥製劑。
7.按照權利要求1所述的藥物組合物的製備方法，其特徵在於所述多糖PT1和蛋白多糖PT2是通過下述方法得到將桑黃子實體的水萃取物溶於pH為7.1-7.8的磷酸鈉緩衝液中，上載所述磷酸鈉緩衝液平衡的乙二氨基乙基纖維素柱，用所述磷酸鹽緩衝液洗脫後，再用pH為7.1-7.8的0.1～1.0M的氯化鈉磷酸鹽緩衝液進行梯度洗脫，最後用pH為7.1-7.8的0.9-1.1M的氯化鈉磷酸鹽緩衝液洗脫，其中將對糖含量和蛋白含量的檢測方法均呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只對糖含量檢測方法呈陽性的洗脫液合併，冷凍乾燥，得到所述多糖PT1。
8.按照權利要求7所述的藥物組合物的製備方法，其特徵在於本發明的藥物組合物的製備方法，所述得到多糖PT1、蛋白多糖PT2再分別通過seveg法和/或凝膠滲透方法純化，得到精提的多糖PT1、蛋白多糖PT2。
9.按照權利要求1所述組合物在製備抗癌藥物、免疫調節藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應用。
全文摘要
一種含有從桑黃中提取的活性物質的藥物組合物、製備方法及其在製備抗癌藥物、免疫調節藥物、降血壓藥物或降血糖藥物中的應用。所述組合物包含從桑黃中提取的活性物質以及藥學上可接受的載體；所述活性物質是由分子量11～15千道爾頓的多糖PT
文檔編號A61P37/00GK101032532SQ20071009759
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月28日 優先權日2007年4月28日
發明者王洪權, 王毅民, 竇媛媛, 丁建新, 竇茜茜, 王京燕, 王海燕, 張敏, 鄭成貴, 紀曉光, 何偉庭, 鄭文俊 申請人:北京鴻華新康生物技術有限公司