用質譜法高靈敏度定量肽的製作方法

2023-08-10 01:42:46

專利名稱：用質譜法高靈敏度定量肽的製作方法
用質譜法高靈敏度定量肽 本申請是申請日為2003年10月2日，發明名稱為"用質譜法高靈敏度定量肽"以 及申請號為200380103688. 6的分案申請。
發明技術領域及背景 本發明涉及用於對如人血漿等的複雜樣品中的蛋白進行評價的定量分析。本發明 可用於分析來自單一個體來源的樣品，也可用於評價群體中特定蛋白質的水平，並可用於 分析來自目標人群的集合樣品。 需要對各種複雜蛋白質樣品中(例如人血漿中)的蛋白質進行定量分析。通常， 這些分析以免疫試驗的方式進行，利用了相對於靶蛋白的特定抗體作為特異性試劑和檢測 試劑。新的方法，特別是涉及用同位素標記的肽進行內部標準化的方法，使得質譜法(MS) 提供了這樣的定量肽和蛋白質的分析(如現在MS用於測定低分子量藥物代謝產物)。然 而，當應用於非常複雜的混合物時，如那些自全血漿蛋白消化到肽的的複雜混合物時，存在 著MS動態範圍和試驗敏感性的問題。本發明通過以下方式處理了這一問題提供對敏感性 的改進，及有效平衡了含有高量及低量蛋白質樣品的消化液中監控肽的豐度，從而使得可 同時測定複雜樣品中的低量和高量蛋白。 能幫助擴增診斷學上有用的蛋白質組的一個重要的進展是同時將許多蛋白測 定一起用作一個組，以便於將模式的改變與疾病或治療關聯，而不是依賴於單獨解釋的 單個蛋白標記物。幾種科研工作對該方法提供了數據支持。(參見Jellum、Bjornson、 Nesbakken、Johansson和Wold，J Chromatogr 217:231-7,1981。)人們努力使用後一種方 法在後標準化20種分析物的血清化學組中檢測疾病標誌物，但可能是由於該分析物的間 接特性及其較少的數量，該努力收效甚微。 —段時間以來已建立了多變的蛋白質標記物的概念和使用方法。需要說明的是為 什麼該方法未曾有效進入到臨床實踐中去。 雖然蛋白質組學可顯示並有時測定許多種蛋白質，現有技術(例如2D凝膠)已難 於應用於大量足夠大的樣品來在研究水平上證明臨床相關性。使用現有測驗的另一方法對 於確定檢測組的疾病相關性通常太昂貴。在血漿的單個樣品中全部可測得七十種蛋白，但 使用單個試驗的商業成本是$10896. 30。這樣最終，多分析物診斷的成功與科學工作的成本 相同。 質譜法(MS)已解決了通過2D凝膠和其他方法溶解析的蛋白的鑑別問題，並也為 複雜蛋白混合物的分析提供了顯得穩定的通用方法。在以後的分類中，可區別兩種通常的 方法第一，對樣品中的蛋白質和肽經其檢測或識別而獲得"無偏見的"發現，及第二，對蛋 白質或肽進行定量測定，通常需要某種額外的標準化物。 質譜技術發現複雜樣品中蛋白質的能力依賴於存在通常源於DNA測序工作的大 的蛋白質序列資料庫，除了下述一種值得注意的例外。由於這些資料庫越來越全面，至少 在理論上該方法為蛋白質發現提供了一種通常的解決方案。到目前為止，MS工作已為蛋白 質組問題審查了三種基本的窗口 (window):全蛋白質、通過體外消化蛋白(例如，用胰蛋白 酶)獲得的肽片段、及天然存在的肽(低分子量蛋白組或肽組)。
可用稱為SELDI-T0F(為表面強化的雷射解吸電離飛行時間)質譜的方法分析全 蛋白質，該質譜法是MALDI-T0F(基質強化的雷射解吸電離飛行時間質譜)的變體，在該方 法中用基於對派生的MS靶的蛋白質親和力的化學分級來將樣品的複雜性降低至全蛋白MS 可解析一系列單個峰的水平。該方法的嚴重缺點在於全蛋白MS分析不直接提供基於序列 的識別(有許多蛋白質接近給定的質量)，因此沒有其他有效的工作，嚴格意義上說未識別 作為標誌發現的蛋白質峰。尤其是，沒有離散的識別，一般不可能說明一種峰是一個蛋白質 分析物或將測定值轉換為典型的免疫分析形式。然而，由於這已通過基於某些單克隆抗體 的成功分析(其中靶蛋白質未識別)清楚顯示，如果該技術允許該分析在任何目標實驗室 中重複(現在顯示正在進行的工作)，此點不對臨床使用造成重大限制。
更通用的方法包括將蛋白質消化(例如用胰蛋白酶)為可進一步在質譜儀中斷 裂(MS/MS)的肽，從而產生基於序列的識別。該方法可與電噴霧(ESI)或MALDI電離一同 使用，並通常在一維或多維色譜分級後應用該方法從而在任意給定的瞬間降低導入MS中 的肽的複雜性。多維色譜、離子化、質譜及數據分析的優化系統(例如，多維蛋白質識別技 術，或Yates的"MudPIT"方法也稱為獵槍蛋白質組學)已顯示在一次分析中可檢測並識 別 1500個酵母蛋白(Washb證、Wolters和Yates，Nat Biotechnol 19 :242-7， 2001)，而 結合傅立葉變換離子回旋加速器共振(FTICR)MS極高解析度的一維LC分離可識別細菌中 多於1900種的不同開放閱讀框(即，預測的蛋白)的蛋白質產物。在人的尿液中，一種比 上述微生物樣品更像血漿的樣品，Patterson在ESI-MS/MS之前使用一維LC分離來檢測源 於124種不同基因產物的751種序列。最近，Adkins等人已使用結合MS的兩種色譜分離 法來識別人血清中的總共490種不同的蛋白質(Adkins等人，Molec CellProteomics 1: 947-955(22002))，因而實質擴增了該蛋白質組。這樣的方法應具有能力來處理血漿中的許 多蛋白的大量轉譯後修飾特性，如能顯示錶徵在老化的人晶狀體中發生的非常複雜的轉譯 後修飾所說明的。 通常在腎過濾截點之下並因而通常收集於尿液或血透析液的天然肽，提供了在 血漿蛋白質組低質量端的許多情況的補充寫照。可從患有晚期腎病並進行透析治療的 患者中收集上千升人血透析液(Sch印ky、 Bensch、 Schulz-K卿pe禾口 Forssma皿，Biomed Chro腿togr 8 :90-4， 1994)，儘管它只含有50 y g/ml蛋白質/肽材料，它提供了低於45kd 的蛋白質和肽的大量來源。通過將色譜和MS方法結合已分析了這樣的材料，從而分辨了大 約5000種不同的肽，包括75種不同蛋白質的片段。55%的片段源自血漿蛋白和整體的7% 代表肽激素、生長因子和細胞生長因子。 上述蛋白質發現方法集中於識別複雜樣品中的肽和蛋白質，但它們一般都顯示了 低質量的精確度和再現性。肽離子化的這種公知特異性質很大一部分是由於一種肽的存 在可影響離子化並由此影響其他的信號強度的強度。這已成為用質譜法進行精確定量的 主要障礙。然而，通過使用穩定的同位素標記的內標物可克服該問題。以適當高濃縮的形 式(> 98原子％ )在商業上至少可獲得四種適合的同位素(2H、13C、15N、180)。通常，最終應 獲得如同用內標物在藥物代謝物MS測定中所獲得的豐度同樣精確的豐度數據(變異係數 < 1%)。在二十世紀八十年代，製備"0標記的腦啡肽並用於ppb水平上測定組織中的這 些肽。在二十世紀九十年代，開發了 GC/MS方法來準確定量穩定的同位素標記的胺基酸，以 及由此的體內標記的人肌肉及血漿的蛋白質的蛋白質代謝。如果有適當的蛋白質或肽標記方案，這些方法的極度敏感和準確性表明穩定的同位素方法可用於定量的蛋白組學研究。
在過去的三年，已研究了許多這樣的標記策略。最直接的方法(在生物合 成過程中，標記的結合達到了高取代水平)已成功應用於微生物(Lahm和Langen， Electrophoresis 21 :2105-14，2000 ;0da，Huang，Cross,Cowburn禾口Chait，Proc Natl Acad Sci USA 96:6591-6,1999)和培養的哺乳動物細胞，但由於成本和倫理道德的原因不可能 直接用於人類。 一種相關的方法(可應用於人蛋白質)是現在通用的化學合成在特定位置 含有重同位素的監測肽。也已研製了合成後的方法來標記肽，從而用後來混合併通過MS — 起分析的標記/未標記對來區分源於"內部對照"樣品的肽與那些源於試驗樣品的肽。這 些方法包括Aebersold的同位素親和標籤(ICAT)方法及用氖化丙烯醯胺和N標記肽硫氫 化物、用氖化乙酸標記伯氨基、n端特異性試劑、肽羧基的全甲基化酯化及斷裂過程中在胰 蛋白酶處理的肽c端加入一對180標記物。 因為通過測定釋放進入血漿中的高豐度組織蛋白可在少量組織中檢測嚴重病理， 所以少量蛋白質，如組織洩漏蛋白，是重要的。正常個體血漿中存在的心臟肌球素(Mb)為 l-85ng/ml，而心肌梗塞卻使之提高到200-1100ng/ml，而用溶血纖維蛋白治療梗塞卻使之 上升至3000ng/ml。 一般局部作用(在感染或發炎部位)的細胞因子可能在它們正常的血 漿濃度(或甚至相關於大量局部釋放後達到較高的水平)無活性，因為它們從Pi或ml組 織體積稀釋為17L組織間隙液。因此，雖然它們在血漿中存在並不顯示細胞破裂，但它們也 在感測洩漏的標誌物之列。用於進行這種測定的商業上有用的方法是本發明的目的。
將穩定的同位素標記的肽內標物結合抗肽抗體富集步驟從而進行基於MS定量 肽分析的這種原始思想於1989年由Jardine等人發表(Lisek、 Bailey、 Benson、 Yaksh和 Jardine，R即id Commun MassSpectrom 3 :43-6， 1989)。該參考文件披露了使用單一合成的 穩定的同位素標記的肽(物質P序列)插入神經組織，然後(在從組織中提取後)結合到 固定化抗物質P特異性抗體上，從而富集神經肽物質P並最終用MS定量。通過天然肽離子 流與同樣序列的內部標記標準肽之比計算底物P的量B卩，顯示單一分析物肽標準/抗體富 集過程的全部元素。Jardine等人使用了 10倍分子過量的標記形式的物質P作為內標和載 體，並用快原子轟擊(FAB)選擇的離子監測(SM)MS測定質量。如所報導的，Jardine的方 法僅用於內源肽而不用於體外所製備的蛋白質片段(例如，一種或多種較大蛋白質的胰蛋 白酶消化產物)。離線進行抗體捕獲，濃縮洗脫液，然後加到C18毛細管柱上，從該毛細管柱 將其洗脫到ESI源。 Nelson等人(Intrinsic Bioprobe s公司)雖然沒有提到應用於來自耙蛋白 消化的肽，但他們已開發了相似的方法，通過使用抗體來富集特定蛋白，然後用MS進行檢 測(用或不用外加的同位素標記標準)。他們用抗體從血漿中富集蛋白，並用馬b2M(來 自加入的馬血清)作為內標物從而分析了人P-2小球蛋白(Kiernan、 Tubbs、 Nedelkov、 Niederkofler禾口 Nelson, Biochem Biophys Res.Comm皿 297 :401,2002 ;Niederkofler、 Tubbs、 Gruber、 Nedelkov、 Kier薩、Williams和Nelson, Anal. Chem. 73 :3294—9， 2001a)。 Nelson(美國專利5955729)已用內標肽加入到親和純化的天然肽樣品中，但在這種情況 下，標準肽具有與分析物不同的序列並且不結合在同一抗體上。穩定的同位素標記肽和抗 肽抗體現在都是常用的試劑，可從多種商業來源獲得。 自1995年以來，單一肽已用作複雜蛋白質混合物中母體蛋白(通過蛋白水解消化作用該肽來自該蛋白)存在的代表，基於例如MALDI-PSD(Griffin、MacCoss、Eng、Blevins、 Aaronson及Yates， Rapid Co匪nMass Spectrom 9:1546-51,1995)或離子陷阱(Yates、 Eng、McCormack和Schieltz， Anal Chem. 67 :1426-36， 1995) ， MS/MS譜。
Regn i er等人已從事"鮮明特徵肽"定量方法(Chakraborty和Regnier， J.Chromatogr A949 :173-84，2002a ;Chakraborty禾口 Regnier， J.Chromatogr A.949 : 173-84， 2002a ;Zhang、Sioma、Wang和Regnier， Anal. Chem. 73 :5142-9， 2001a)，及已公開的 專利申請的主題(Regnier， F. E. 、X. Zhang等人，US2002/0037532)，其中蛋白質樣品由酶消 化為肽，用蛋白質活性試劑的不同同位素形式進行差異標記，通過選擇性富集柱進行純化， 並使用MALDI或ESI-MS結合進行MS分析。該方法包括了本發明的一些特徵，但特別選擇使 用了消化物中肽的合成後標記來產生內標(使得未知肽可進行分析)，並且描述了應用抗 體作為富集特異性特徵組肽而不是單一肽的一種方式"限定為抗原的蛋白質或肽胺基酸 序列部分也可作為內牛親和配體，如果i亥內牛M某酸序列為原始混合物中的多於一種蛋白 質所共有，i泰配體特別有用。在那種情況下，為含有內生抗原序列的多肽的家族選擇的多克 隆抗體或單克隆抗體可用作為捕獲物質"(Regnier、F. E. 、X. Zhang等人，US2002/0037532)。
Scrivener、 Barry等人(Scrivener、 Barry、 Platt、 Calvert、 Masih、 Hextall、 Soloviev和Terrett， Proteomics 3 :122-128， 2003 ;Barry等人，美國專利申請 2002/0055186)已用固定於陣列的抗體從消化物中富集肽來通過MALDI MS進行檢測。該方 法需要將抗體以特定的空間形式固定以便於進行MALDI MS分析(通常是在平面基質表面 上的陣列)，並且該方法不包括靶肽的標記型式作為定量分析內標。 Gygi使用穩定同位素標記的合成的肽來定量在1-D凝膠上分離的蛋白質消化物 中的磷酸化與非磷酸化肽的水平(Stemmann、 Zou、 Gerber、 Gygi和Kirschner， Cell 107 : 715-26， 2001)，並且已描述了用於肽定量的方法(W003016861)，該方法使用Jardine途徑 並外加更高的質譜解析度(選擇的反應監測方法[SRM]，其中通過第一質量分析儀分離所 需的肽，肽在飛行中斷裂並且用第二質量分析儀檢測特定的片段)。在MS之前，用通常的分 離法(例如，反向LC)而不是特異性的捕獲試劑(如抗體)來分離肽。
通過化學合成可製成標準品。Crowther在1994年公開了一種類似的方法(Anal. Chem. 66 :2356-61， 1994)使用氖化的合成內標來檢測血槳中的肽藥物。Rose使用合成的穩 定同位素標記的胰島素來標準化MS法而用於定量胰島素(小蛋白或大肽)，在該過程中通 過反相色譜來分離受阻的樣品從而使樣品分級。現在通過完全化學合成法可製成甚至較大 的蛋白。 用抗體來親和捕獲蛋白質和肽的幾種方式是本領域技術人員已知的。已將抗體結 合蛋白消化從而消除非抗原決定簇肽，然後用MS法洗脫並識別抗原決定簇肽(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9848-52,1990)。已使用DNA(而不是Ab)結合嬰兒尿中的乳鐵蛋白用於 進行MS分析(Pediatr. Res. 29 :243-50， 1991)。 以前用捕獲在抗體上的抗原決定簇肽及隨後的MS法已對蛋白質間的相互作用繪 制了圖譜(Methods Mol. Biol. 146 :439-52,2000)。已開發了方法通過在進行MS前使固 定化Ab從消化液中除去結合(抗原決定簇)肽用於識別肽抗原決定簇(J. Am. Soc. Mass Spectrom 11 :746-50,2000)。 已使用在磁珠上的抗體來結合所選擇的蛋白質，然後消化該蛋白質並用MS分析肽(J. Am. Soc. Mass Spectrom 9 :208-15， 1998) 。 Hurst研製了一種用固相抗體親和捕獲蛋 白質配體(a TNF)然後用MS進行分析的方法(Anal. Chem. 71 :4727-33， 1999) 。 Wehland通 過結合抗體和其他蛋白質來濃縮肽，從而識別線性結合的抗原決定簇(Anal. Biochem. 275 : 162-70，1999)。 Naylor研究了一種類似的方法用於在MS前分離轉鐵蛋白從而測定糖基化變體 (Anal. Biochem. 296 :122-9,2001) 。 Clarke和Naylor公開了 (Clarke、 Crow、 Younkin和 Naylor， Anal. Biochem. 298 :32-9,2001) —種方法，其中通過抗體將40個胺基酸的P澱粉 樣肽捕獲到16個胺基酸上，吸脫並用MS進行定量分析。該方法不包括使用穩定同位素標 記的內標物。 Thibault在進行MS前使用微液流裝置來將ciyc肽捕捉在抗體上，檢測受阻肽達 到20ng/ml(Mol. Cell Proteomics 1:157-68,2002)。 自1975年起使用固定化多克隆抗體柱的再循環免疫親和就已知。使用固定在 CNBr活化的瓊脂糖或商業可獲得的P0R0S支持物(A卯liedBiosystems公司)上的抗體、多 克隆抗體已顯示可再循環幾百次而不會喪失底物特異性結合能力。 本發明將幾種現有技術所引的方法用於一個完全不同的組合中。在後面的說明 中，本發明針對通常意義上的蛋白質、肽或其他生物分子的定量，因此所披露的本發明決不 限於血清和其他體液的分析。
發明概述 本發明提供了一種經濟的流通型方法來檢測靶蛋白在樣品中的量。用抗體製劑 (不論是多克隆或是單克隆，或其他等價的特定結合劑)來進行捕獲從而富集特定的監測 肽(在複雜蛋白質樣品的水解蛋白消化物中要進行定量的蛋白質的一種特定肽片段)和內 標肽(同樣的化學結構但包括穩定的同位素標記物)。當吸脫入適宜的質譜儀中時，對天然 (來源於樣品)和內標(同位素標記)肽進行定量，並且對它們所測得的豐度比例用於計算 監控肽和其母體蛋白在起始樣品中的量。這不同於使用較小特異性的親和方法來捕獲共有 某特性(如糖基化、含有半胱氨酸或賴氨酸殘基、磷酸化)的一類監測肽；也不同於使用選 擇存在於特定細胞部分中的、具有相似的天然分子量(例如大小排阻層析)、電荷等等的分 析物的另一種分級形式。這種特異性種類分級方法已由包括Regnier的其他人開發，其目 的和實踐將稍減小提供給MS的混合物的複雜度，因而使得不超出其解析度和敏感度，而不 是對於每種親和結合劑(通常是抗體)的單一肽。在本發明中，目的是用給定的抗體或其 他結合劑選擇源自複雜蛋白樣品消化物的單個靶蛋白(或其他分析物)的單一肽。本發明 提供了進行多路肽測定的方法，用於有效選擇監測肽的序列，並進而增加測定的有效性。
本發明的公開也教導了具有結合劑的支持物，該結合劑可自樣品收集各種濃度的 靶肽和蛋白質。通過選擇性使用結合劑和一定數量的這樣的試劑，可能獲得樣品中很少量 的靶肽/蛋白質的大部分，而僅僅結合了一小部分以高濃度存在於樣品中的靶肽/蛋白質。 這種改進的方法通過限制導入分光計的洗脫液中的靶蛋白或肽的濃度範圍促進了 MS讀數 的有效性和準確性。
附圖簡述

圖1.每個抗體結合表面包括盤(此處為圓盤)中孔的內腔，通過刻凹槽使內腔表 面積增大。圖1說明了在含抗體的孔或管中作出凹槽以增加表面積。
圖2顯示了盤8中孔內結合表面的設置，該盤含有齒緣9使其受控旋轉。顯示了 16個含抗體的孔10，4個空孔11，繞軸12排列。 圖3顯示了一組盤8如何排列為堆疊17，其具有空的對齊的端帽16和18。所結 合的抗體示為19。 圖4.圖4顯示了排列並加載盤的設置，其中用在經31計算機控制下驅動的裝置 30交替擠壓並擴張球管28中的抗體溶液29，從而將該液體往復擠過管32、33、34，向上通 過管35進入球管36中。由於存在孔38，擠過37的溶液未在球管36中建立起壓力。因而 可將抗體施加到一系列盤中的每一個上的單孔中，重複該過程將抗體(通常是不同特異性 的)施加到其他孔中。對刻了凹槽的內腔表面進行化學修飾以便於結合抗體。 一旦將抗體 加入了孔中，可洗滌這些孔並且抗體在適當的位置乾燥。然後拆開堆疊的盤產生一系列相 同的載有抗體的肽捕獲盤。 圖5.在使用中，如圖5所示，盤39在空盤41和42之間持為40，含有對齊的孔。 該設置使盤41和42固定而盤40可通過使用具有齒緣9的外部裝置轉動。
圖6.圖6顯示了該系統在一個分析循環中的操作，其中具有齒緣64的盤63包括 16個含抗體的孔65和4個空孔70-73。 圖7顯示了整合的整個系統，具有結合到盤分析儀75上的質譜儀74，然後通過76 製成並控制供給的盤，全部過程在計算機77的控制下。 圖8描述了在樣品消化液(A)中具有寬範圍濃度的一系列肽分析物的豐度，加入 內標肽，該內標肽濃度類似於所期望的分析物濃度(B)，在從抗體結合介質捕獲並洗脫後平 均這些濃度。 圖9描述了以相似濃度存在的肽分析物的組如何一起進行處理以便於節約使用 內標物。 圖IO顯示了如何從組中選擇監測肽組(天然肽為實條，標記的標準物為陰影線的 條)，這些組在質量上不重疊，因而可以分別定量。 圖n描述了以不同濃度使用不同質量的多個內標肽來提供用於定量樣品肽分析
物的工作曲線。
發明詳述 本發明提供了一種流通型方法用於識別並定量樣品中的肽和/或蛋白質。雖然 將上述披露的許多方法結合到本發明的方法中去，但以前未披露過這樣有商業化用途的方 法。 本發明通過使用監控蛋白和抗肽抗體來檢測蛋白分析物的方法來進行說明，雖然 其他試劑組可類似地用於檢測其他種分析物分子。本公開自始至終，術語"分析物"和"配 體"可以是任何各種的不同的分子，或人們需要在樣品中測定或定量的組分、部分、片段或 不同分子的區域。術語"監測片段"可以指分析物的任何部分，上至並包括全部分析物，該 片段可通過可重複的斷裂過程產生(或者如果監控片段是整個分析物則不需要片段化)， 該片段的量或濃度可用作分析物量或濃度的代表。術語"監測肽"是指選作蛋白質或肽的 監測片段的肽。 術語"結合劑"和"受體"可以是大量不同分子、生物細胞或聚合體中的任何種，這 些詞可以互換使用。關於這一點，結合劑結合要檢測的分析物以便於在檢測前將其富集，且以特定性的方式進行使得只結合併富集一種分析物。蛋白質、多肽、肽、核酸(寡聚核苷酸 和多核苷酸)、抗體、配體、多糖、微生物、受體、抗生素、試驗化合物(特別是那些通過組合 化學產生的)，每一種都可以是結合劑。 術語"抗體"可以是任何物種的任何類免疫球蛋白分子、或任何其衍生的分子、或 任何其他由保守分子構架的變異構成以便特異性結合分析物或監測片段的特異性結合劑。 術語"抗肽抗體"可以是任何種抗體(在前述一般意義上)，該抗體結合特定的肽、監測肽、 或用於從樣品或已處理的樣品進行富集的其他監測片段。通常，此處對抗體的任何利用理 解為也可通過上述限定的結合劑而實現的目的。 術語"結合"包括任何物理連接或密切關聯，其可以是永久的或暫時的。通常，可 逆結合包括以下方面電荷相互作用、氫鍵、疏水力、範德華力等等，其促進目標分子和待測 分析物之間進行物理連接。在結合引起化學反應發生的狀況下，"結合"反應是短暫的。如 果反應可以隨後返向釋放監測片段，則由結合劑和分析物之間的接觸引起的反應也在用於 本發明目的結合的定義中。 術語"內標物"、"同位素標記的監測片段"、或"同位素標記的監測肽"可以是任何 相應監測片段或監測肽的下述變化形式1)作為監控片段或監測肽的等價物被適當的結 合劑進行識別和2)通過直接分子量檢測或通過片段質量檢測(例如，通過MS/MS分析)，或 是通過其他同等的方式，以某種可通過質譜法區分的方式與之進行區分。
術語"特異性監測肽"指在抗體(或其他結合劑)接觸區具有獨特序列的肽，它源 自單基因的蛋白質產物。具有該序列非實質性改變的肽，如單一胺基酸取代(可發生在自 然產生的多態性中)、接觸區域外的取代或不會實質性影響結合的肽的化學修飾(包括糖 基化、磷酸化和其他已知的翻譯後修飾)，都包括在該術語中。每一種抗體製劑(或其他結 合劑)用於富集單一的監測肽作為單一蛋白質分析物的代表物。為了檢測並定量測定蛋白 質分析物，本發明使用抗肽抗體(或任何其他可逆結合大約5-20個殘基的特異性肽序列的 結合性實體)來從肽混合物中捕獲特異性肽，例如從通過水解蛋白酶(如胰蛋白酶)或化 學試劑(如溴化氫)由蛋白質混合物(如人血清)的特異性斷裂產生的肽混合物中。通過 將特異性肽結合到抗體上(抗體通常連接到固相支持物上)，然後洗滌抗體肽複合物，最 後將結合的肽洗脫成為小體積(通常通過酸性溶液，如10%醋酸獲得)，本發明有可能富集 在整個消化物中以小濃度存在的且因此相對於存在於混合物中更大量的肽背景而不可用 簡單質譜法(MS)或液相色譜-MS(LC-MS)系統檢測的特異性肽。這種富集步驟用於捕獲高、 中或低豐度的肽，並將它們提供給MS進行分析因而它捨棄了關於起始混合物中肽的相對 豐度的信息以便於增加檢測的敏感性。然而這種在蛋白質組學領域具有很大價值的豐度信 息可以通過使用同位素稀釋方法而得到再現本發明用這樣的方法(優選使用穩定的同位 素)結合特異性肽的富集，從而提供了一種用於定量分析肽的方法，包括分析低豐度肽。
本方法將產生將進行測定的肽的結合了一或多種質量不同於主要的自然同位素 的同位素的一種形式，從而形成標記的肽變體，該標記肽變體與存在於混合物中的天然肽 化學性質相同(或近似相同)，但卻由於它變化的肽質量(同位素的標記)仍可通過質譜 儀進行區分。產生標記肽的優選方法是化學合成，其中通過結合含有氫、碳、氧或氮的重同 位素的胺基酸前體引入同位素標記物而製成與天然肽相同的肽。該同位素肽變體用作內標 物，在用抗體捕獲進行富集之前以一種已知濃度加到樣品肽混合物中。從而抗體根據它們在樣品中的相對量一起捕獲並富集天然和標記的肽(由於它們的化學性質相同而具有彼 此之間無差異的親和性)。由於標記的肽以已知濃度加入，通過最終MS分析測得的天然形 式和標記形式的量之間的比率使得可以計算在樣品混合物中的天然肽濃度。這樣，本發明 可以測定複雜混合物中低豐度肽的量，並且由於肽通常通過蛋白質混合物的定量(完全) 斷裂而產生，可以推導出蛋白質混合物中的母體蛋白質的豐度。本發明可延伸為包括平行 測定多個肽，並且通過計算機控制而自動化從而為蛋白質測定提供通用系統。因此產生新 的特異性蛋白分析僅需要生成肽特異性抗體和標記的肽類似物。本發明的關鍵特徵是本 發明旨在建立對於先以選擇的特定蛋白的定量分析，而不是解決兩或多種樣品的所有未知 成分之間的比較問題。這種對特異性分析的關注使產生相對於每個監測肽的特異性抗體 (原則上一個抗體對每個分析結合一種肽)具有了吸引力現在產生成千上萬的可能抗肽 抗體是不具有吸引力的，例如，這些抗體需要包括可能的人蛋白質的所有範圍。由於此原 因，前面所述方法還未集中於抗肽抗體，而卻替代地使用了通常的親和概念，其通過識別配 體、標記物或該類物質所共有的特徵而結合併富集所有的這類肽，例如，用固定化的金屬親 和層析(IMAC)選擇磷酸肽作為一組、用抗磷酸酪氨酸抗體選擇含抗磷酸酪氨酸肽作為一 組、或者用凝集素選擇糖肽作為一組。本發明的目的是提供特意使用不同抗體(或其他等 價的選擇性結合劑)富集每一種肽序列的方法。 另一目的是以非常接近的相同豐度並不含其他無關肽的方式傳送一系列不同的 監測肽(通過相應系列的特異性抗體來選擇的)到質譜儀上。通過對一系列肽的豐度進行 平衡，該方法確保所有的肽都在質譜儀動態範圍內並且可將該動態範圍在跨越肽分析物的 真實動態範圍內優化使用。如果MS系統的動態範圍為1000 (根據MS的類型100到10000 的範圍是典型的)，該方法確保所有提供給MS的肽在該範圍的中間水平，從而使得最優化 其檢測天然和同位素標記的形態相對豐度增加或減小的能力。如果提供給MS的肽是不同 的豐度(例如相對濃度為l，O. 001和1000)，那麼MS將很難檢測這三種肽的天然及同位素 標記形式之間的等價的數量差異。通過"拉平"肽的豐度分布，充分加強了質譜儀定量分析 的解析度。 雖然在選擇最優肽來監控每種蛋白質的過程中 一些技術是有用的，但是相對於產 生高親合抗體和進行通常夾心型定量免疫分析所需的其他要素所需的大量成本，本方法通 用並且不昂貴。它可與低容量免疫分析技術競爭，作為一種測定混合物(如人血清或血漿) 中十到上百種特異性蛋白質的手段。 優選的實施例結合1)已有的用於產生及親和純化抗體的方法，該抗體緊密但可 逆地結合短肽序列；2)用於將複雜蛋白質混合物消化產生短肽的已有方法；3)用於合成含 同位素標記的限定肽的已有方法；4)用於有效循環親和色譜而重複捕獲及傳遞肽的已有 方法；和5)用於MS測定標記和未標記(源自樣品的)肽的比率的已有方法，來產生定量測 定。此處，用血漿蛋白質作為示例來描述該結合的方法。除了以新的方式結合單獨的步驟， 我們還描述了多路傳輸並自動化這種試驗的新方法，及優化選擇監測肽序列的方式。對其 它蛋白質或肽混合物的應用對本領域技術人員將是顯而易見的。使用除了抗體以外的肽結 合劑(例如，RNA適體、肽體等等)對本領域技術人員也是顯而易見的。同樣將顯而易見的 是該概念推廣到其他生物分子的定量檢測，如核苷酸和低聚糖，或推廣到到任何分子實體， 該分子實體可以是l)以同位素標記形式產生，並且2)可產生與之可逆結合的結合劑。
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單一分析物實施例(1 :) 在最簡單的實施方案中，對每個人們希望在血漿中測定的蛋白質進行下面的步 驟以便於產生特定的定量分析系統。出發點是蛋白質鑑定，通常表示為序列資料庫(如 SwissProt或Genbank)中的登錄號。該步驟是
詵擇監控蛋白(歩驟a) 使用蛋白質的已知序列，人們在其中選擇一種或多種肽片段作為"監測肽"。雖然 用所需的酶通過切割產生的任何肽都是一種可能的選擇，但通過一組設計為選擇肽的標準 來定義良好的監測肽，該肽可以高產量化學合成，可在適宜的質譜儀中進行定量檢測，並且 當用作抗原時可引發抗體。 一組有用的標準如下所示 1 :該肽具有由所需蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)切割蛋白質而產生的序列。應
用通常可獲得的軟體可以容易地從蛋白質序列計算所有可能的胰蛋白酶肽。
2 :該肽應是完全親水性的，在通常用於酶消化和親和層析的溶劑中是可溶的。基
於從通常可獲得的軟體程序對每種肽所得到的計算結果選擇親水性肽。
一般，親水性肽是
那些含有較多極性胺基酸(組氨酸、賴氨酸、精氨酸、穀氨酸、天冬氨酸)和較少疏水性氨基
酸(色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)的肽。 3 :由於可加入C-末端半胱氨酸以方便綴合免疫原並且在肽中存在兩個半胱氨酸 可能導致不利的二聚作用和交聯，因此該肽應優選不含半胱氨酸。 4 :肽應通過電噴霧(ESI)或矩陣輔助的雷射解吸(MALDI)離子化作用很好地進行 離子化。該特性可用軟體程序估計或通過目的蛋白消化物的MS分析而試驗確定以了解哪 種肽以最高相對量被檢測。 5 :該肽在抗體產生的物種中是具有免疫原性的。對下面的肽具有通常更好的免疫 原性，即那些親水性的肽(與上述第(2)點一致)；該肽包括由第二結構預測軟體預測的 彎曲；該肽不包括糖化位點；並且該肽在長度上為10-20個胺基酸。 6 :在該肽中不應包括任何在靶蛋白質中普遍存在的序列多態性(也就是遺傳變 異體)位點(由於如果變異體肽未以期望的質量出現，這可能影響對各蛋白質量的估計)。
7 :該肽不應與靶生物體的任何其他肽具有顯著的同源性(例如通過BLAST序列比 較程序確定的)。該特性應可減小抗體捕獲步驟中的任何來自非靶蛋白質的肽的幹擾。
根據這些標準可容易地評估來自靶蛋白質的所有可能的肽並且選擇最優平衡本 方法的需要的一種或多種肽。尤其是，對有限組分析物(如在血漿中的抑制蛋白質)直接 產生所有肽及其衍生特性的資料庫，並使用該資料庫作為選擇監測肽的基礎。以蛋白質分 析物的已知胺基酸序列開始，有效的算法可構建所有可能的胰蛋白肽，這些肽通過蛋白質 的胰蛋白酶消化作用產生。這些胰蛋白酶肽序列作為記錄存儲於資料庫中，並對其他可能 的切割酶和試劑產生的相似記錄進行存儲。可用另外的算法計算每種肽的各種不同的物理 及生物特性，包括長度、質量、在中性pH下的靜電荷、採取二級結構的趨勢、親水性等等。對
每種肽可將這些衍生數據製成表格，並且額外進行集合計算以產生與作為監控蛋白成功可 能性有關的優先分值。將這些優先分值分類來為每種蛋白質選擇優選的待選監測肽。
也可能將實驗數據加到優先化中。例如，可能通過合成所有來自蛋白質的各胰蛋 白酶肽序列產生並將這些肽固定在膜上的陣列中。然後用全蛋白質的抗體或用抗蛋白質 混合物(包括靶蛋白)的抗體混合物探測這樣的陣列，通過用第二標記抗體二次染色對抗
11體與各種肽的結合進行顯示與定量，從而可用發光、螢光或比色染色法檢測(PEPSCAN方法 {Carter Methods Mol. Biol. 36 :207-223 (1994)。然後那些定位於檢測到抗體結合的地方 的肽因此顯示可以引發抗體應答。這樣使用PEPSCAn的主要限制是需要存在對於所選蛋白 質的抗體，或對於含所選蛋白質的混合物的抗體。當蛋白質是一種以前研究過的蛋白質時， 這樣的抗體可以獲得或者它可在選擇最優監控蛋白時產生。
產牛同位素監測肽(歩驟b) 然後製作所選擇肽的同位素標記的形式，其中保留了化學結構，但用同位素代替 一個或多個原子，以使得MS可將標記的肽與普通肽(含有各元素同位素的天然豐度)相區 分。例如，氮-15可替代天然的氮-14導入合成肽的一個或多個位點。該合成肽超出的重 量等於替代的氮數量的原子量單位。應仔細製備該肽，以使得加入的質量單位數是已知的 並已確定(即，以一種標準產生的所有材料具有儘可能相同範圍的質量-例如，通過使用 高富集的胺基酸同位素變異體)。在優選實施方案中，由氮-15標記的胺基酸前體(取代 > 98% )用於肽合成過程的一個或多個位置從而與天然肽相比導入4-10個額外的質量單 位。這樣的氮-15標記的胺基酸前體(或其碳-13標記的等價物)作為FM0C衍生物可商 業獲得，適於直接用於通常的商業肽合成工具。用通常的LC法純化最終產生的標記的監測 肽(通常達到> 90%純度)，並用MS對其進行表徵以確保正確的序列和質量。
f械fl雄本(制聚c) 免疫動物以生產抗肽抗體，將同樣的肽(標記或未標記，如果這是所盼望的，更加 經濟)偶聯到載體蛋白(例如鑰孔血藍蛋白(KLH);不與人蛋白質同源)上，並用於通過 已知方案免疫動物(如兔、雞、山羊或綿羊)，該免疫方案有效產生抗肽抗體。為了方便， 用於免疫及抗體純化的肽優選含有加到監控蛋白序列上的額外的c-端殘基(此處簡化為 MONITOR)，例如n端-MONITOR-lys-gly-ser-gly-cys-c端。所產生的延伸的監測肽可方 便地偶聯載體KLH，該載體KLH在先已與異雙功能試劑反應，以使得多個SH-活性基團結合 到載體上。在用肽進行典型的免疫時(該肽現作為載體蛋白上的半抗原)，產生的多克隆 抗血清含有針對該肽、針對載體及針對其他非特異性抗原決定簇的抗體。或者，在本領域中 有許多已知方法來偶聯肽，用於抗體產生的載體有或無任何擴充或修飾，且可使用任何這 樣的方法。同樣，存在已知的方法通過用載體上的肽免疫動物以外的方式來產生抗肽抗體。 只要對於監測肽產生適宜的特異性可逆結合劑，可使用任何變化的方法。
然後，通過在含緊密結合的肽的柱上進行親和純化而從該抗血清中製備特異性的 抗肽抗體。通過將一等分量的延伸的監測肽與硫醇活化固相支持物(例如，商業可獲得的 丙基硫氧嘧啶瓊脂糖)反應可容易地製備這樣的柱。將粗提抗血清加到該柱上，然後洗滌 該柱並最終暴露於10%醋酸(或其他低pH、高pH、或高促溶劑濃度的洗脫緩衝液)來特異 性洗脫抗肽抗體。中和或從洗脫緩衝液分離這些抗體(為防止變性)，並且再生該柱達到生 理條件以便於需要時對更多抗血清進行應用。 將肽特異性抗體最終固定在柱、珠或其他表面上用作肽特異性親和捕獲劑。在優 選實施方案中，根據製造者的說明，抗肽抗體固定於商業可獲得的蛋白質A-衍生的POROS 層析介質(應用生物系統)上並且通過與二甲基庚二亞胺(pimelimidate)共價交聯共價 固定在該支持物上。所產生的固相介質可特異性從肽混合物(例如，血清或血漿的胰蛋白 酶水解液)中結合監測肽，並且洗滌步驟後，在和緩的洗脫條件(例如，10%醋酸)下釋放
12監測肽。然後將該柱恢復至中性PH從而再生該柱用於另一樣品的再次使用，本領域公知的 方法可使之重複上百次。 抗肽抗體優選的親和性在100-100， 000， 000範圍內。需要較高的親和性來富集更
低量的肽，也就是說，捕獲低濃度肽。
鵬口口口齢,髓(制聚d) 將人們希望測定的血漿樣品中的所選蛋白由適宜的蛋白酶(在此為胰蛋白酶) 消化完全從而產生肽(包括在步驟l中所選擇的監測肽)。對於其序列於靶蛋白序列中只 顯示一次的監測肽，該消化應產生同指定樣品中所存在的靶蛋白分子相同數量的監測肽。 通過以下步驟進行消化首次先使蛋白質樣品變性(例如，用尿素或鹽酸胍)，減少蛋白質 中的二硫鍵(例如，用二硫蘇糖醇或巰基乙醇)，烷基化半胱氨酸(例如，通過加入碘乙醯 胺)，通過加入更多二硫蘇糖醇或巰基乙醇淬滅過剩的碘乙醯胺，最後(在除去或稀釋變性 物後)加入所選擇的蛋白質水解酶(例如，胰蛋白酶)，然後進行孵育使得消化進行。在孵 育後，通過加入化學抑制劑(例如，DFP或PMSF)，或通過使胰蛋白酶變性(加熱或加入變性 劑，或使用兩者)或除去(如果胰蛋白酶在固體支持物上)胰蛋白酶而終止胰蛋白酶的反 應。破壞胰蛋白酶的活性是重要的以避免後來由於殘留在樣品中的蛋白質水解酶活性產生 對抗體的破壞。力口A瞎飾iP扁測陽fe淨勿(制聚e) 然後將量取的等分的同位素標記的合成監測肽以接近或大於(如果標準物作為 低豐度肽的載體)等分樣品中所期望的相同"天然"肽的量加入到量取的等分消化樣品肽 混合物中。在加入後，監測肽在樣品中以兩種形式存在(天然的及同位素標記的)。基於加 入的數量和已知的等分體積將準確知道同位素標記形式的濃度。 [國]通過抗體捕獲及洗脫,富集監測l肽(歩驟f) 使肽混合物(帶有所加入的同位素標記監測肽的消化物)與肽特異性親和捕獲劑 接觸，該捕獲劑優選與監測肽結合但不會區分標記與未標記形式(由於同位素取代物不會 影響抗體的結合親和性)。在洗滌步驟後(例如，磷酸鹽緩衝液)，然後洗脫結合的肽(例 如，用10%醋酸，或用水和乙腈的混合液)以進行MS分析。如果需要，親合性支持物可以制 備再生以用於另一樣品。假設在高通量分析應用中，循環使用固定的抗體結合數百次，如果 不是數千次，將是有利的。現在的證據顯示，當用5%或10%醋酸洗脫抗原並且對酸的總接 觸量較短(例如，在用中性PH緩衝液在生前少於一分鐘)時，兔多克隆抗體可循環至少200 次。在固定抗體床在尺寸上低於微升的毛細管柱的形式中，接觸酸的持續時間可更進一步 減少，可能會進一步延長固定的抗體吸收劑的壽命。 通過抗體對於肽的親合常數及通過肽和抗體兩者的濃度來控制對肽的捕獲效應。
我們特別關注結合抗體的肽片段。相關通用方程為formula see original document page 13
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[Ab] 、 [P印]和[AbP印]分別是Ab、P印、AbP印的濃度；&是在給定的溶液條件下控 制結合反應的親合常數。在本實施方案中，我們特別關注低豐度肽(由於高量肽相對容易 捕獲)，這樣我們令抗體以最大可獲得濃度存在於固相支持物上([Ab]=對於結合到蛋白八衍生P0R0S樹脂的IgG接近10—5M)。由於在該濃度下lOOfmol的Ab僅佔據InL POROS，並 且雖然以通常的標準看所使用的柱非常小，實際上其比這大得多，該抗體的存在相當過量 於肽，且我們可以假設任何可獲得的[AbP印]水平不會有效減小[Ab]，該[Ab]可假設為常 數(10—5M)。通常抗肽抗體具有106-108範圍的親合常數。因此抗體結合的肽與游離肽的量 的比例([AbP印]/[P印])為KaX[Ab] = 106-108X 10—5 = 10-103)。這樣甚至在相當低的親 合性(Ka = 106)的情況下，肽的主要部分(90% )應結合到抗體上，而高親合性抗體則給出 99. 9%抗體結合。該比例不依賴於抗體濃度，因為抗體捕獲任何可獲得的肽，並且主要通過 檢測器的敏感性確定該敏感性。 上述計算應用於平衡結合。親合常數Ka是"結合速率"K。n和"解離速率"K。ff的商 (Ka = K。n/K。ff)。由於主要由擴散(分子撞到另一分子上)確定，對所有的肽-抗體結合反 應，K。n是相似的。通常K。n值為105-106M—Sec—、此處我們假設更守恆的值(106)。從該值 和上述所使用的通常Ka值(106-108)，我們可計算1(。 值的範圍l-0.01/秒或換句話說為 1-100秒。如果在肽離開後，該肽可再連接到另一結合位點上，那麼它可在另一相似的時間 段保持結合。因此，如果裝載和洗滌相對較快並且假設有過量的結合位點(抗體)用於再 次結合，在裝載和洗滌期間肽可能留在柱上。因為洗脫條件(例如，低pH)改變肽與抗體之 間的相互作用並急劇增加解離速度，所以洗脫非常快速。由於這個原因，甚至在快速循環的 親和層析過程中觀察到結合到固定化抗體柱上的抗原以尖銳峰帶洗脫。這樣鋒面表現使得 捕獲肽的洗脫體積很小，特別是如果柱長與柱直徑的比例大的情況下。通過例如直徑為100 微米長度為3mm(長度/直徑=30，體積= 25nL)的毛細管固定化抗體柱滿足後者的需 要。在這樣的柱中，肽區在lmm區域中洗脫，其具有8nl體積。如果10yL血槳樣品的消化 液可裝載於柱上，那麼以上述高效率捕獲的監測肽洗脫為8nL，則本發明方法獲得1000倍 的濃度增加，並同時除去了大量潛在的幹擾性肽材料。 由於該步驟使得源於樣品中低豐度蛋白質的低豐度肽富集和濃縮，因此富集步驟 是本方法的重要步驟。理論上，該富集方法僅將監測肽供給MS，並使它的檢測成為純粹MS 敏感性的問題，而不是相對於許多其他潛在的更大豐度存在於整個消化物中的肽背景的檢 測監測肽問題。該方法有效地擴展了在樣品及其消化液中存在其它高豐度蛋白和肽的情況 下MS檢測器的檢測敏感性並有效擴展了動態範圍。
通過MS分析所捕獲的監測l肽(歩驟g) 將在上述步驟富集的監測肽(包括天然和同位素標記的形式)優選通過電噴霧離
子化供給到質譜儀的入口中去。在優選實施方案中，肽在洗脫緩衝液(例如，10%醋酸)中
直接導入質譜儀。或者，將監測肽加到反相(例如，C18)柱上，並梯度(例如，在水中的乙腈
/三氟乙酸)洗脫到質譜儀(也就是LC/MS)的電噴霧源。質譜可以是離子阱、三重四極、
ESI-TOF、Q-TOF型設備、或適宜質量分辨(> 1000)和靈敏度的任何其他設備。 對於兩種形式的監測肽(天然和標記的)MS測定離子電流(離子數量)作為時間
的函數。對每種質量類型，離子電流在時間上積分(理論上只要監測肽出現在質譜上)，計
算天然和同位素標記形式的積分數。 i十算樣品內毎種監測l肽的豐度(歩驟h) 計算標記和未標記(天然的)監測肽之間的數量比例。由於加入的標記肽的量是 已知的，那麼用該測定比例乘標記的監測肽的已知濃度可計算源自樣品消化物的天然監測肽的量。通過假設消化液中監測肽的量與該肽源於的母體蛋白的量相同(或近似相關)，可 獲得樣品中該蛋白量的計算。 為檢測並補償樣品消化過程完成性的變化，可選擇一系列消化監測肽，該監測肽 顯示消化過程的進展。由於樣品消化液在水解蛋白酶對血漿蛋白比率之間的差異、消化時 間和溫度的差異、樣品的內源蛋白酶抑制劑含量的差異、或內源蛋白酶水平或活性的差異， 消化的完成性可以有所不同。尤其是，人們可以進行時程實驗，在該實驗中用胰蛋白酶消化 血漿樣品(在血漿蛋白還原並烷基化作用後)， 一系列釋放肽中的每種的數量作為時間的 函數測定。 一些肽在消化過程初期釋放，可能是由於它們位於靶蛋白的表面並由於該肽末
端的切割位點與蛋白酶接觸並於消化早期達到了它們的最大終濃度。其他肽在消化過程晚 一些時候釋放，可能是由於它們形成了靶蛋白的核心部分或由於形成該肽末端的切割位點
不在完整靶蛋白的表面暴露，因此這些肽在消化過程晚些時候顯示並在晚些時候達到它們 的最大終濃度。也發生了以下情況一些水解蛋白肽從後來在溶液中切割的靶蛋白上釋放， 並由於該肽進一步被切割為其他更短的肽而引起消化液中該肽濃度先增加後減小。通過在 這樣的時間過程中測定一系列特定肽的時間比濃度性質，人們可選擇一起定出血漿消化過 程狀態精確測定的消化液監測肽。如果這種的肽是一種或一些蛋白質的產物，那麼這樣肽 群體的應用就增加，從而肽之間的豐度比例反映了消化過程而不是親代蛋白質間的濃度差 異。通過在接下來的單一樣品消化液中測定所選擇的消化監測肽，人們可計算消化過程中 在何處捕獲各樣品，對所涉及的樣品種類有效產生消化過程的標準化標度。該信息結合對 於每種將用於樣品分析的監測肽的釋放的時間過程知識(相對於參考消化液中消化監測 肽的釋放)，當特定的樣品不完全消化為同樣程度時，這使得可以校正監測肽的豐度。
通過使用多級肽捕獲法進一步增強了該方法的特異性和敏感性。在多級方法的一 個實施方案中，基於下面的原理可使用兩個不同的連續捕獲步驟首先在針對該肽N端部 分的抗體上捕獲，從該第一抗體洗脫並中和後，在針對該肽C端部分的第二抗體(A2)上捕 獲。由於用於製造抗肽抗體的免疫原通常由通過附於所需監測肽序列上(通常由一些間 隔殘基與監測肽序列相隔)的半胱氨酸殘基連接在大載體蛋白(例如，鑰孔血藍蛋白或清 蛋白)上的肽構成，因此可製成這樣的N-端或C-端抗體。如果半胱氨酸包含在免疫肽的 N-端，導致N-端連接到載體的表面，那麼將使監測肽序列的C-端暴露用於識別和抗體產 生。相反的，如果半胱氨酸包含在免疫肽的c-端，導致C-端與載體表面連接，那麼將使監測 肽序列的N-端暴露用於識別和抗體產生。由於抗體常識別3-6個胺基酸的長度，並由於監 測肽常常為8-15個胺基酸長度，出現以下情況是高度可能的由N-端及C-端抗體識別的 抗原決定簇實質上不同，這將對監測肽提供分離的但特異性的識別。任何通過與監測肽序 列N-端部分的某些相似性結合到第一 (例如N端)抗體上的雜質(其他肽)極不可能也 與C-端抗體結合。使用兩個不同的富集過程通常會產生與兩個分離的富集步驟的積相等 的純化作用如果N-端抗體結合1/104消化肽(作為雜質，即除了所需的監測肽以外的)， 並且C-端抗體也結合1/104消化肽(作為雜質，即除了所需的監測肽以外的)，那麼作為兩 個分離的富集步驟的這些抗體的相繼結合可能結合1/108非監測肽。如果N-端和C-端抗 體都結合大部分的監測肽(例如，每一步驟為90% )，那麼兩步捕獲的最終結果是81 %的監 測肽回收，僅0.000001% (1/108)的其他結合肽。 其他多級富集方法也是有利的。第一抗體可以針對表面肽或整個肽，可用於捕獲來自血漿的天然蛋白，之後可將蛋白質消化為肽和通過第二抗肽抗體捕獲監測肽。
或者，相繼的消化方法可用於與兩個抗肽抗體相結合。此處，用第一蛋白酶消化血 漿樣品，產生由第一抗肽抗體結合的監測肽序列的第一種形式。洗脫該肽後，用第二蛋白酶 將之切割，產生兩個(或可能更多的)新肽，其中每一種具有至少一個新的末端(第一監測 肽先前的C-端片段具有新的N-末端，先前的N-端片段具有新的C-末端)。第二抗肽抗體 用於捕獲一個這樣新暴露的末端序列(一個在第二消化步驟之前並未暴露的末端)用於MS 檢測。作為示例，該方法的一種操作涉及選擇通過賴氨酸和/或N-或C-端結合的監測肽序 列，在該序列中存在一個精氨酸殘基。使用lys-C(其優先在賴氨酸殘基處而非精氨酸處切 割)作為第一蛋白酶，製成第一抗肽抗體來識別該序列C端賴氨酸部分(例如，經N-端半 胱氨酸連接載體而成免疫肽)。用胰蛋白酶(該蛋白在賴氨酸和精氨酸之處都切割)進行 的第二消化作用在該肽的內部精氨酸處斷裂，產生兩個片段，其中一個片段具有新的c-端 序列(以精氨酸結束)並且該片段由第二抗肽抗體識別。該方法實際上使用了三個特異性 步驟(第一抗體、第二蛋白酶、第二抗體)從而進一步加強了最終檢測過程的整體特異性。 在使用兩個蛋白酶的多級系統時，存在捕獲並檢測兩種(或更多的，如果第二蛋白酶進行 多於一次的切斷)"子代"肽分別作為相互證實的試驗的機會。可使用具有不同特異性的 蛋白酶的任何組合。 兩種蛋白酶的多級系統的一個特定的有趣事實是其中第一蛋白酶作用發生在體 內，在樣品中的部分天然蛋白分子中產生斷裂的系統。例如，這樣的蛋白酶的作用可以顯示 一種疾病過程或對於治療的有益響應。 一種所需的測定可能是被斷裂分子的一部分。通過 用不在體內蛋白酶的位點切割的蛋白酶(體外蛋白酶)消化血漿樣品可獲得該結果，產生 天然蛋白質的片段(肽)，其中一個片段含有該體內切割位點。針對監測肽N端(或者是 c-端)的抗肽抗體捕獲整個監測肽和來自體內斷裂的較短的形式。監測肽在長形式和短形 式之間的豐度比例(優選通過相對於同樣的穩定同位素標記內標物肽定量每一種)給定親 代蛋白質的未斷裂形式與體內斷裂形式之比。 上述所有多級方法使用同位素標級肽作為內標物，通過與第一單一分析物實施方
案同樣的方式應用於定量肽。 某本操作的自動化(2:) 優選結合基本操作步驟d、 e、 f和g為自動化過程，將計算機控制的液體作業系統 應用於步驟d、 e和f，並將計算機控制的質譜儀應用於步驟g。在該方法中，計算機化的液 體作業系統進行樣品的還原和烷基化、加入胰蛋白酶、孵育、淬滅胰蛋白酶活性並加入標記 的肽標準物。 在一種形式中，計算機化的液體作業系統然後將準備好的消化樣品加到對監測肽 特異性的抗體上(優選在固體支持物上)，移走消化物，在它的支持物上洗滌抗體，最後將 所捕獲的肽直接洗脫入質譜儀進行步驟g。可以非常小的體積(例如10 Pi)進行該洗脫， 且因此將全部洗脫樣品逐漸灌輸到MS以獲得最大的敏感度。 或者可以離線進行步驟f，產生可隨後導入質譜儀進行測量的一系列富集的肽樣 品。由於載有數百樣品的MALDI靶盤可離線製備並在此後導入MS中，當MALDI MS用於檢 測和定量這些肽時，該方法特別適用。 步驟a-h的整個過程可作為統一的分析過程而用於定量樣品中蛋白質。formula see original document page 17
在第一個平行的實施方案中，在一種裝置中用各種抗體一次一個地詵擇各種監測l 肽而測定多種蛋白質，該裝置使得連續的抗體間斷地洗脫入MS(當其抗體在適當的位置進 行洗脫時，連續測定每種監測肽)。在該方案中，不是用層析分離法來分離含有一系列監測 肽的混合物(在所有情況下連同它們所加入的同位素標記的形式)，人們使用液流或機械 方式來將每種抗體放置在其固體支持物上進入洗脫路徑(通常10%醋酸的洗脫液流導入 到MS中)。可用圖1-7所示的設置為旋轉腔室的多個小抗體柱來實現這種基本的實施方 案。 在該實施例中，最耗費時間並且昂貴的兩個過程是製備被消化的微樣品以及製備 和使用結合要分析的肽的固定化的抗體表面。因而，人們希望僅製備一份或很少的要分析 樣品的消化液，並將其加到許多免疫吸收支持物或表面上，該數量對測定所需數量監測肽 (靶蛋白質)是有效並必須的。由於結合與擴散相關，一個目的是使肽消化樣品在相對大 的表面擴散，以及有效地進行施加和去除。最初有兩個限制是明顯的。首先是吸收表面的 容量和多特異性，其次是當將進行檢測的數量增加導致它們的更大稀釋時，質譜對同時定 量大量不同分析物的限制。這樣，如果使用最大多價吸收性表面，那麼它對任意一種分析物 的容量就非常小，且每種結合劑只有很少數量存在。並且，由於分析物的數量上升至極大 的數量，MS不可能分辨所有存在的物質。在結合自動操作的本實施方案中，目的是讓消化 樣品通過一系列不同的免疫吸收性支持物，每一種支持物含有一個或多個不同的特異性抗 體，在封閉系統中以如下方式設置所有支持物都與樣品接觸，然後洗脫過量的樣品。在該 步驟後，分離分立的支持物，每一支持物分別有效洗脫到電噴霧MS系統中。免疫吸收性支 持物必須以如下方式設計將抗體連接到它們的大組上(也就是它們製造的關鍵步驟)的 操作可平行進行並具有高度再生性。 在開始的設計中，使用十六個包含不同表面的不同免疫吸收支持物，且期望十種 不同抗體混合物會連接到每一個上，對每種分析組給出總共160種不同的要分析的蛋白 質。每一種抗體結合表面包括盤(此處為圓盤)中小孔的內腔，且通過開槽而使內腔表面 積增加。圖l表明對含抗體的孔或管開槽以增加表面積。 圖2顯示含有齒緣9的盤8中的孔內的結合表面設置為使它進行受控制的旋轉。 所顯示的是16個含抗體的孔10，4個空孔ll，它們繞軸12對齊。 圖3顯示一組盤8對齊為堆疊17，有空的對齊的端帽16和18。結合的抗體示為 19。 圖4顯示對齊並裝載盤的設置，其中通過由31計算機控制驅動的裝置30對在球 管28中的抗體溶液29進行交替擠壓和擴散，從而將液體往復推過管32、33和34，且向上通 過管35進入球管36。由於存在孔38，壓過37的溶液不會在球管36中建立壓力。這樣將 抗體加到一系列盤中的每一個上的單孔中，並重複該過程將抗體(通常是不同種類的)加 到其他孔上。對開槽的內腔表面進行化學修飾以便於結合抗體。 一旦將抗體加入，可洗滌 該孔並在原位使抗體乾燥。然後拆開堆疊的盤產生一系列同樣的載有抗體的肽捕獲盤。
在使用中，如圖5所示，盤39在空盤41和42之間持為40，其含有對齊的孔。該設 置保持盤41和42穩定，而盤40可通過具有齒緣9的外部裝置的設置而進行旋轉。
圖6顯示了在一個分析循環中操作該系統，其中具有齒緣64的盤63含有十六個含抗體的孔65和四個空孔70-73。含抗體的孔通過上下空盤中的縫隙交替相連，用虛線66 表示下面的縫隙而用非虛線67表示上面的連接，連接入口 68，通過經上(67)和下(66)連 接縫隙的蛇形連接穿過所有含抗體的孔65，通過69流出製成了連續路徑。這使得樣品消化 液往復泵過所有的孔，然後排出，並將孔組進行洗滌。這些部件在圖6b中顯示為通過盤的 圓形截面。在下一操作中，移動可旋轉的盤63使得裝載抗體的管69與盤41和42的管70 對齊，並且將洗液流過。向前指引一步將管69移到位置71，在位置71洗脫液(如10%醋 酸)用於分離所結合的肽並將它們傳輸到質譜儀上或中間的捕獲點，如反相柱。下一個指 引將試管69帶進有位置72的寄存器，其中緩衝液流過以再生抗體並在暴露於洗脫液後使 它穩定。如此將每種不同的含抗體管(或孔)引導通過該狀態，產生16個順序的連續洗脫 至lj MS中。 圖7顯示了整個系統如何整合，質譜儀74與盤分析器75連接，然後通過自動取樣 器76供給樣品，全部處於計算機77的控制下。 可形成含抗體的孔以使得將抗體(或其他結合劑)裝載於它們的內表面上(如所 示)或它們可以用結合有抗體的多孔單片材料填充，產生較大的表面積從而有較高的抗體 分子局部濃度。可通過以下方式形成這樣的單片支持物原位聚合、燒結預製的顆粒、將預 形成的多孔杆通過摩擦配合插入每一孔、或通過其他方法。在抗體結合到內表面的情況下， 這些表面可以是圓柱形的(如通常的管)或它們可以通過各種方式形成網狀以增加內表面 積。 在必須使用多種不同分析部件(如盤)的臨床化學中，最重要的問題是確定在位 置上的部件是正確的部件。成為該系統一部分的注意是能質量控制和陽性識別結合位點的 能力。由於標準物的混合物加到每一個肽的消化樣品中，其中只有一些結合到每一載有抗 體的結合表面上，因此這就實現為該系統的自動化特徵。因而通過質譜對從每個表面(孔) 洗脫的肽進行分析提供了對表面的抗體及它們的操作條件的陽性識別。該方面確定了該盤 含有正確的抗體特異性。外加的任選特徵是在製造過程中在每個帶有抗體的相應肽的孔裝 載抗體在此情況下，在任何樣品加載前，盤中的每個孔可洗脫到MS，通過MS識別這些洗脫 肽而證實抗體的特異性。 或者，以其他方式執行該多抗體分離洗脫方法，例如使用電磁裝置使包被抗體的 反磁性顆粒移過所需的位置(取樣、洗滌、洗脫到MS中)。可使用如下設置的固定化抗肽抗 體陣列設置在平面上以使得從覆蓋的液體體積捕獲肽；設置在針狀物上以使得從浸漬它 們的容器中捕獲肽；或設置在微液流裝置的分離的微容器中以使得可連通多個液流通道。 多個機械及電磁溶液顯然存在以下問題使多個分別固定的抗體與樣品接解，洗滌它們，然 後通過暴露於其後移入MS的液流單獨洗脫它們。 在m^fi實施方案中，該方法應用於一系列不同質量的監測肽(A-L)，用於同時 測定一系列蛋白質(a-l)(圖8A)。在該情況下，將預定量的標記肽的混合物(基於樣品中 各蛋白質期望的相對豐度)加到樣品消化液中(圖8B :實條代表天然肽，虛線條代表加入 的穩定同位素標記監測肽)。用一系列捕獲抗體來恰好地捕獲這些監測肽(天然的及標記 的形式)。這些抗體(在適當的固相介質上)優選以相對量組合以使得捕獲近似相等量的 每種監測肽，而與這些肽在消化液中的量無關，因此在洗脫到MS中時產生了近似等摩爾的 監測肽混合物(圖8C)。如果抗體親和性高，那麼通過製備柱或近似等量的每種抗體固定在
18其上的其他親和性支持物，並使足夠量的樣品消化液通過該支持物使得所有抗體可結合達 到飽和，而實現該目的。如果一種或多種抗體具有較低的親和性，那麼需要更多該抗體以便 於獲得捕獲及釋放肽的近似相等的化學計量。高豐度監測肽的大部分將不結合(超過了在 支持物上的捕獲抗體的量)，而低豐度的肽僅飽和各自的捕獲抗體而未有顯現於流通(未 結合)的部分。通過使監測肽在豐度上更接近相等(相比於與它們在樣品中可能具有的非 常不相同的豐度)，LC和MS的動態範圍限制不再成為主要問題。如果監測肽(天然和標記 形式)的質量足夠不同以使得MS可解析分辨並定量全部監測肽(以兩種形式)，可以通過 導入MS直接分析監測肽的該組合。使一系列監測肽更接近相等摩爾是允許多路(多分析 物)質譜法檢測中主要的進步。 或者，結合的監測肽可施加於LC/MS以使得僅有一種或一些監測肽同時導入到 MS，且可對MS進行預編程以接連尋找每一監測肽。這樣，為測定一系列監測肽(代表一系 列蛋白質分析物)，將全部相應的同位素標記肽標準物加入消化液中(如上所述通過計算 機化的液體作業系統製備)，並然後將洗脫的肽(現在由一系列帶有它們相應標記的標準 物的監測肽)導入層析柱(如C18反相柱，也在計算機控制下形成部分層析系統)並從該 反相柱上由梯度(通常含有O. 05%三氟乙酸的0-70%乙腈水溶液)洗脫(通常經過5-30 分鐘)。將輸出(柱的洗脫液)導入質譜儀，結果是任意一次只出現一種或一些監測肽，這 樣使MS可單獨測定每一種而不存在其他監測肽的潛在幹擾。進行起始操作，在起始操作的 過程中，通過掃描所有洗脫肽的質量確定每一監測肽的洗脫時間。在接下來的操作中，可將 LC/MS系統編程為查看已知質量的標記和未標記形式的監測肽的正確洗脫時間，因而將更 多的測定時間給予目的監測肽而不是掃描所有的肽質量。 以此方式，使用捕獲抗體進行富集的該披露方法可平行對許多蛋白質進行測定， 在樣品中具有非常不同的相對豐度的一系列蛋白質可在單次MS或LC/MS操作中進行定量。 監測肽豐度的均衡化("化學計量平衡")是關鍵的思想，且它克服了用MS定量的關鍵性問 題，即現有系統可獲得的有限的動態範圍。 在m^ifi實施例中，測定在樣品中具有不同豐度的一系列蛋白質，但我們希望 對大量蛋白質節省使用標記監測肽。(圖9)。例如，血清白蛋白、補體C2和甲狀腺球蛋白在
人血清中的豐度不同，相差的級數接近iooo倍(在濃度上相對為io6 : io3 : i)。如果用
酶(如胰蛋白酶)將血漿樣品消化為肽，那麼來源於這三種蛋白質的監測肽在數量上也以
同樣的係數而不同(假設全部消化)。現在建議的定量方法的基礎是l)選擇適宜化學性 質的至少一種肽來代表每一種將進行測定的蛋白質(監測肽)；2)以相同於天然肽(來源 於樣品)的濃度加入同位素標記形式的每種監測肽，因而提供了一種內部定量標記物，其 在質譜儀中可通過質量進行區分但與天然肽化學性質相同；3)通過捕獲將每一監測肽(天 然和同位素標記的標準物)富集在特異性抗肽抗體上，並在洗滌後洗脫；及4)在質譜儀中 分析所富集的監測肽，從而確定測定的天然對同位素標記的肽的比例。該比例給出了原始 分析蛋白質相對與加入的同位素標記標準物的數量。 在該實施方案中，注意由於優選以與等價天然肽(實條，圖9中的系列1)相同濃 度加入標記肽標準物(虛線條，圖9中的系列2);也就是，內標物以相同於所定量的監測肽 的濃度而存在，那麼白蛋白監測肽必須以1000倍C2監測肽的量及1000000倍甲狀腺球蛋 白的量加入(由於這三種蛋白質通常以該相對濃度存在)。當甲狀腺球蛋白肽可檢測時，1000000倍高濃度的白蛋白監測肽無疑是太過量了 ，並且加入對於甲狀腺球蛋白監測肽所 需量的1000000倍浪費了標記的白蛋白監測肽(該肽通常通過合成製成)。因此在該實施 方案中(圖9C)，製備了血漿肽消化液的三種子樣品一種未稀釋的(加入其中的是所需量 的甲狀腺球蛋白標記監測肽，及組3豐度類型中的其他蛋白的監測肽圖9)，第二種稀釋了 大約1000倍(組2，在其中我們加入了大約同樣數量的標記的補體C2監測肽)，第三種稀釋 了大約1000000倍(組l，在其中加入了白蛋白監測肽)。這樣產生了稀釋樣品，其中檢測 較高量、中量及低量組蛋白質，從而需要較少的相應標記監測肽。在用抗體捕獲和洗脫後， 使肽恢復到近似相同的相對豐度回收(圖9C)。 在實踐中，組的數量(稀釋組)依賴於標記肽需要保存的程度，可以大於三。在優 選的實施例中，通過將監測肽根據樣品中蛋白質的各種豐度的種類分組而實現該原則，將 監測肽分為5個豐度組，每一組只含蓋100倍範圍的蛋白質豐度(其加起來在數量上跨越 10， 000， 000， 000倍)。使組中每一蛋白質的標記監測肽混合成其成分在彼此的100倍範圍 內的混合物(根據樣品中蛋白質所期望的相對豐度設定相對豐度)。製備未稀釋的等分和 樣品肽消化液的4個稀釋液(每一個相對於後一個100倍)，在富集和分析步驟(上述4和 5)之前將5種標記的監測肽混合物加到各稀釋液中。這樣該方法以操作5個分析物而不是 一個分析物的成本而對於高豐度蛋白質只需要更少的監測肽。由於下述給出的原因，其與 其他優化因素一致，無論用什麼方法那都限制一個步驟中分析的肽的數量。
該實施方案的主要因素是根據樣品中各靶蛋白的預期豐度將肽分成幾組。使用所 披露的發明從探索性研究(掃描一系列這樣的稀釋液以觀察在那一組中可檢測給定的監 測肽)中，或從包括公開數據的其他定量測定獲得所需的豐度信息。將所需的數據組織成 資料庫，與其他標準一起使用來選擇最佳的監測肽組，通過複雜標準使用資料庫系統的能 力用來篩選、排列並分類矽肽中的成千上萬種待測物。 在第四平行實施例中(圖10)，基於肽的質量以如下方式將監測肽分成幾組一組 中的肽不重疊。這樣的一組標準示例如下所示假設選作蛋白旦監測肽的肽具有質量A(以 原子質量單位(amu)或道爾頓)並為此示例單獨帶電(也就是以A的M/Z值檢測)，並且相 應的同位素標記監測肽A具有A+6的質量，並且可以假設兩種肽在它們的譜上具有一系列 質量類似物，比親代質量上升擴展了 5個質量單位(由於公知的各種穩定同位素的天然頻 率的結合)。因此，這些肽的肽峰值相對於天然肽(圖10中的實條)在範圍{A，A+l，A+2， A+3，A+4，A+5}上擴展，且相對於穩定同位素標準物(圖10中的虛線條)在範圍{A+6，A+7， A+8，A+9，A+10，A+11}上擴展，或者換句話說在A到A+llamu範圍上。那麼假設人們從具有 質量A+12的另一蛋白質h選擇監測肽B :該肽B的質量變化峰值將沒有一個與肽A的質量 變化峰值重疊。同樣，人們選擇理想間隔至少12amu的一系列監測肽。這樣，50個肽的系列 可設置在1000-1600的質量範圍內。在實踐中，可用於選擇的肽將不會理想設置，並因此可 能會結合不超過10個來跨越該理論測定範圍而不發生重疊。這樣，通過MS可一次對這10 個蛋白質進行定量，該類是可同時測定的一組蛋白質。由於肽組將一次導入MS，需要MS可 有效地以高運行循環掃描所需的質量範圍。在所披露的檢測方案中，這IO個監測肽加到天 然樣品肽消化液中，且可一起用相應的10個抗體來富集這10個肽以進行分析。
該實施例的關鍵元素是基於不重疊質量選擇相互協調的監測肽的組。在miifi實施例中，結合上述第三和第四實施方案。此處，我們選擇同時滿足下
20列情況的監測肽組l)在樣品中的親代蛋白質豐度類中具有相似性，及2)不重疊的質量。
這些標準可與披露於基礎單一分析物實施方案中的其他標準結合(親水性、適宜的大小、
缺少某些胺基酸，等等)。將如此產生的這些類最優化以用於所披露的測定方法中。它們將
可在一個MS操作中定量的蛋白質數量最大化，並使通常昂貴的穩定同位素標記的監測肽
的耗費最小化。這些允許多個監測肽一次檢測的策略可與自動化方法結合，以允許大量分
析物常規檢測。 雄輔錄 另外的一系列實施方案在可選擇的方法中使用抗肽抗體。 其他實施例利用通過MS/MS技術獲得的作為"從頭"序列的試驗觀察的部分肽序 列數據代替來源於現存資料庫的序列用於監測肽的設計。 另一實施例(圖11)對給定的監測肽分析物使用多個同位素標記肽，以一系列水 平加入從而生成標準曲線。在該實施方案中，合成每種監測肽的兩種或更多形式，其具有不 同同位素質量。如果該肽序列含有例如3個組氨酸，該肽(IV1)的一種形式含有單一的同 位素標記的HIS殘基(6X碳-13 ;比天然的淨重6道爾頓)，而第二種形式(IV2)含有兩 個，而第三種形式(IV3)含有全部三種重同位素形式的組氨酸。因此這三種修飾的肽比天 然形式重6、12、18道爾頓。那麼，人們可以在樣品中加入的IV1的量等於1/5的天然形式 的期望的量，IV2的量等於所期望的天然水平，IV3的量等於2倍的天然水平。這樣監測肽 的MS譜顯示四個分離的解析形式，三個同位素標記形式給出了覆蓋所期望值周圍10倍範 圍的內標物曲線。以此方式，在每一樣品中可相對於內標物曲線測定監測肽。顯然，標記的 胺基酸與適宜同位素標記的任何組合可結合以設計標記的在任何質量增加的範圍上不同 於天然肽並彼此不同的監測肽。 其他實施方案利用了監測肽中改造產生的特異性的特性，其設計為便於用氧-18 標記監測肽。在此情況下(假設用胰蛋白酶作為分裂酶)，不用同位素標記的胺基酸合成 監測肽的擴展形式，但在此形式中所加入的c-端殘基開始於賴氨酸或精氨酸殘基(例如，n 端-MONITOR-lys-gly-ser-gly-cys-c端，如在第一優選實施方案中)。通過在存在氧_18 的水溶液中用胰蛋白酶切割該肽，氧-18的兩個原子(比天然的重4道爾頓)將被導入最 終的監測肽。該方法的優點是只需要製造單一形式的監測肽同樣的擴展形式可用於免疫、 抗體親和純化並作為MS內標物(在斷裂及氧18導入後)，因而潛在地減少了成本。可構建 其他類似的適於其他酶切割的構建體，如果它們斷裂的機理適於同位素標記的導入。
另一實施方案利用了由標記天然肽(來源於參考樣品的消化液)而不是化學合 成(如上述第一優選實施方案所述)而製備的同位素標記監測肽。在該方法中，接下來進 行分析的該種參考樣品用同樣的酶或試劑進行消化，其中該酶或試劑用於隨後的樣品(例 如，胰蛋白酶)而產生肽。然後使這些肽與含同位素標記的化學衍生試劑反應。例如，該肽 可與氖化碘乙醯胺反應，從而將一種標記導入所有含半胱氨酸的肽。或者，在用胰蛋白酶斷 裂前用氖化碘乙醯胺還原並烷基化樣品蛋白。用未標記的碘乙醯胺還原並烷基化要分析的 樣品，以使得樣品和標記的監測肽在化學上相同。將標記的監測肽混合物(基本上是參考 樣品的標記的消化液)通常以相同的比例加到試驗樣品的消化液中，並使產生的混合物用 於對所選擇監測肽的抗體富集。在該情況下，從靶蛋白質中的含半胱氨酸的肽中選擇監測 肽。產生的MS讀數顯示了監測肽(及從而的靶蛋白)在參考樣品和試驗樣品之間的豐度
21比例。由於在該實施例中，通過監測肽的化學修飾導入標記物，優選通過用類似修飾的肽進 行免疫接種而產生富集抗體肽免疫原可以是含半胱氨酸的肽，其中用碘乙醯胺烷基化半 胱氨酸。可用其他化學方式在各種胺基酸上導入其他標記，或特異性地導入n-端或c-端 組。在每一種情況下，對試驗樣品肽進行同樣的修飾(只要適宜，或者在消化前或者在消化 後，但不具有同位素標記)並針相對適宜修飾的合成肽產生抗體。
或者，用噬菌體展示或其他體外技術選擇針對監測肽的抗體。 進一步的實施方案利用多克隆抗體、噬菌體展示抗體(單鏈或Fab)，單功能區抗 體、親和體或其他化學一致性的蛋白質作為肽結合劑。 在另一可選擇實施方案中，從母體蛋白質消化液而不通過化學合成製備免疫肽。
在另一可選擇的實施方案中，免疫肽可在表達體系(如大腸桿菌、杆狀病毒、酵母 菌)或體外轉譯體系(如兔網織紅細胞、麥芽或大腸桿菌溶菌產物)中作為融合蛋白合成， 而不通過化學合成。如果需要，可在融合蛋白中產生所需的肽多個樣板，可通過結合的親和 標記物(例如，FLAG肽或多組氨酸標記物)進行分離，並可在後來從融合蛋白上切割(例 如，經胰蛋白酶)並通過液體層析或其他方法進行純化。用類似的方法通過將標記的氨基 酸整合到合成系統中而產生同位素標記的監測肽。 在另一可選擇的實施方案中，富集監測肽(天然和同位素標記的)加到靶上用於 在MALDI質譜儀中進行MS分析。 另一實施方案利用螢光檢測代替了MS檢測，並使用了共價螢光標記(例如與半胱 氨酸反應的Cy3和Cy5染色標記)來標記樣品肽和所加入的監測肽。在此情況下，針對連 接染料的抗原產生抗肽抗體，並如下述方式選擇該抗肽抗體它們相對相等地結合該兩種 形式(例如，Cy3和Cy5)。直接對來自抗體的肽的洗脫液進行最終的螢光比例檢測(如果 該抗體具有足夠的特異性來排斥所有的其他肽)，或者緊隨另一分離步驟(例如，反相LC或 毛細管電泳)，在該分離步驟中，Cy3和Cy5肽表現如果不相同，至少表現為可再生的及可解 釋的方式(以使得可以可靠預測兩種形式的監測肽的洗脫位置用於測定)。
另一實施方案利用螢光檢測，其中用標記物(例如，Cy5)標記合成的監測肽標準 物，並且使樣品消化液保持未標記。在該實施方案中，源於樣品的監測肽與螢光標記的標 準肽競爭結合相應的抗肽抗體。如此使用標準工作曲線，從結合到抗肽並隨後從抗體洗脫 的標記的標準肽的數量可推斷源於樣品的肽的濃度。在親代蛋白的高樣品濃度(在消化 液中監測肽的濃度高)下較少的標記標準肽發生結合，並反之亦然。然後分離該螢光標記 標準肽，並用毛細管電泳及特別是用於DNA測序的多通道裝置(例如，ABI3700， Amersham MegaBACE)非常靈敏地進行檢測。
實施例 通過結合來自教科書、診斷分析目錄及收集的科學文獻的信息構建了在人血漿中 通過各種方式檢測的289種蛋白質的資料庫。將這些蛋白質的胺基酸序列下載並以文本 欄位存儲於微軟Access資料庫中。通過產生蛋白質水解酶片段列表的宏程序在Excel電 子表格中處理每一個蛋白質序列。對每一肽序列計算一系列參數，包括長度、質量、在中性 pH時的預期淨電荷、總帶電基團、Ho卯-Woods親水性(HWH)和標準化的HWH(HWH/胺基酸數 量)，以及Cys、 Trp、 Pro和Met殘基的數量。基於下面由Excel宏估計的要求進行可用的 肽的第一次選擇長度> 7並 -0. 5並 800。將結果(肽序列及所計算的參數)存儲在資料庫中。這樣派生出總 共10204種肽，其中751種符合起始的需要。 為證明原理試驗，為四種蛋白質分析物中的每一種選擇一種監測肽TNF、 IL-6、血
紅素蛋白和a-l-抗胰凝乳蛋白酶。當來自蛋白質的多種肽都適合起始要求時，對含有脯
氨酸(由於期望該胺基酸增加免疫原性)的肽給出優先選擇。對每一序列所產生的合成肽
具有四個殘基的伸長(GSGC或CGSG)，這使得經末端Cys殘基與鑰孔血藍蛋白(KLH)載體結
合。在TNFa肽的情況下，合成兩種形式的監測肽一種具有N-端延伸，另一種具有C-端
延伸(所有其他的肽攜帶c-端延伸)。該肽序列(下劃線為延伸)是 IL-6 具有C端延伸的殘基83-94 血紅素蛋白 具有C端延伸,的殘基92-102 a -1-抗胰凝乳蛋白酶 具有C端延伸,的殘基307-314 TNF- a C_端 具有C端延伸GSGC的殘基66-78 每一種肽連接到白蛋白載體上，並根據短期免疫方案注射兩隻兔。通過ELISA試
驗使用固定在微孔盤上的肽監控抗體的產生。對每種肽，將來自兩隻兔抗血清中較好的那
種的多克隆抗體(基於更高的ELISA信號顯示更多或更高親和性的抗體)在含硫醇的瓊脂
糖上以適當方向固定肽的柱上進行免疫親和純化。 將免疫純化抗體以定向方式固定在POROS蛋白G樹脂上(A卯liedBiosystems)。 一旦抗體通過蛋白A與抗體分子Fc部分的特異性相互作用而連接，則根據生產者的說明通 過與鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)接觸實現共價交聯。洗滌該抗肽抗體P0R0S(APA-P0R0S)支
持物並將其保存在4t:。 用壓有1000psig氦的高壓瓶將含有該支持物的毛細管微柱(1釐米X 100微米) 包在預製的裝有玻璃料的毛細管(New Objectives)中。攜帶著針對上述試驗的前四個肽 的兔多克隆AB的支持物分別與四種各自標記的監測肽的混合物接觸。洗滌該支持物並用 10微升10X醋酸將結合肽洗脫到毛細管C18反相柱，其後通過在0. 05甲酸中的0% -70% CAN梯度洗脫到Qtrap (Applied Biosystem)MS系統的ESI源。平均起來，抗體支持物顯示 對"正確"監測肽的100倍的富集。
示例性地，本發明涉及如下項目的技術方案 項目1. 一種用於定量樣品中至少一種靶蛋白數量的方法，包括以下步驟
1)將樣品消化以提供肽， 2)製備至少一種經標記的含所述靶蛋白亞序列的監測肽從而提供內標物，
3)將含已知量的標記的合成肽的步驟2)產物的一等份加到步驟1)產物中去，
4)將步驟3)產物裝載在至少一種支持物上，該支持物上連接有至少一種結合至 少一種監測肽的結合劑， 5)洗滌步驟4)的支持物以除去未結合的肽，
6)從結合到支持物上的結合劑上洗脫監測肽， 7)將存在於步驟6)所得洗脫液中的至少一種監測肽進行質譜檢測從而通過與標 記的合成標準物比較而確定消化液中監測肽的數量。 項目2.如項目1的方法，其中標記物是穩定的同位素或其混合物。
項目3.如項目2的方法，其中同位素是"N。
項目4.如項目2的方法，其中同位素是"C。 項目5.如項目2的方法，其中同位素是180。 項目6.如項目1的方法，其中在步驟4)中，結合劑是抗體。 項目7.如項目6的方法，其中該抗體是單克隆抗體。 項目8.如項目6的方法，其中該抗體是多克隆抗體。 項目9.如項目1的方法，其中在步驟4)中，結合劑是RNA適體。 項目10.如項目1的方法，其中結合劑是可再循環的結合劑。 項目11.如項目1的方法，其中固體支持物由珠子構成。 項目12.如項目1的方法，其中固體支持物是填充柱。 項目13.如項目1的方法，其中固體支持物是單片多孔支持物。 項目14.如項目1的方法，其中支持物具有至少一個開口，所述開口具有將結合劑
結合在其上的表面。 項目15.如項目1的方法，其中結合劑結合在其上的支持物具有親水可塑性。
項目16.如項目1的方法，其中支持物是網孔。
項目17.如項目1的方法，其中支持物是凝膠。 項目18.如項目1的方法，其中結合劑結合在其上的支持物具有疏水可塑性表面。
項目19.如項目1的方法，其中流路是可重構的流路。 項目20.如項目1的方法，其中可在步驟4)的裝載和步驟6)的洗脫之間對流路 進行調整，以使得每個支持物單獨洗脫。 項目21.如項目1的方法，其中在步驟7)中，在導入質譜儀後使肽斷裂。 項目22.如項目1的方法，其中在步驟7)中，肽不斷裂，而該肽以它們導入質譜儀
中的形式檢測。 項目23.如項目1的方法，其中用不同的標記原子標記特定的合成的監測肽，以使 得具有相同胺基酸序列的標記的監測肽在質量上有所不同。 項目24.如項目1的方法，其中在步驟2)製備至少兩種不同的標記的監測肽，將 標記的監測肽混合物加到步驟l)產物中，且其後在步驟4)將步驟3)產物裝載於帶有多種 結合劑的支持物系統上，至少一種這樣的結合劑優先結合特定的監測肽。
項目25.如項目24的方法，其中選擇不同的監測肽以優化質譜儀的差示檢測。
項目26.如項目1的方法，其中在步驟2)中製備至少兩種不同的標記的監測肽， 將標記的監測肽混合物加到步驟l)產物中，且其後在步驟4)將步驟3)產物順序裝載於支 持物上，每一支持物具有優選與一種特定序列結合的結合劑，其後將每一支持物進行洗脫， 且其後將每一洗脫樣品分別導入質譜儀中。 項目27. —種用於從樣品中捕獲相似量的兩種或更多種不同監測肽的方法，該樣 品含有寬泛變化濃度的不同監測肽，該方法包括以下步驟
1)使樣品蛋白質片段化，
2)產生標記的監測肽， 3)將步驟1)產物加到含有已知量的標記監測肽的步驟2)產物中， 4)製備至少一種支持物，該支持物具有至少一種結合樣品中較豐富的肽的小部分
的結合劑及至少一種結合樣品中較少量肽的更高比例部分的結合劑，
5)將步驟3)產物裝載於步驟4)所製備的支持物上，
6)洗滌步驟5)的支持物，然後
7)從該支持物上洗脫該肽從而獲得監測肽，及
8)使步驟7)的洗脫物進行質譜檢測。 項目28. —種用於從肽樣品中收集一種以上監測肽的支持物系統，其中樣品中的 至少一種監測肽以比至少另一種監測肽大許多的濃度存在，所述支持物具有連接在其上的 第一結合劑和第二結合劑，該第一結合劑施加到所述支持物上以只結合高濃度監測肽的小 部分，而第二結合劑施加到所述支持物上以結合樣品中低濃度的監測肽的較高比例部分。
項目29.如項目28的支持物，其中每種結合的監測肽比例量依賴於每種結合劑的 項目30.如項目28的支持物，其中每種結合的監測肽比例量依賴於每種結合劑的 親和性。 項目31. —種含有至少一種標記監測肽的試劑盒，其中該試劑盒進一步含有至少 一種結合劑用於捕獲至少一種監測肽。 項目32. —種測定樣品蛋白水解消化過程的方法，包括以下步驟 1)選擇來源於樣品中一種已知蛋白序列的至少兩種監測肽，其中已知至少一種所
述的監測肽相對於至少一種其他的監測肽在參考消化的時間過程中較早釋放。 2)在消化過程中的一個或多個時間點測定所述監測肽的數量，及 3)用數學方法比較所述監測肽的相對量從而計算反映消化相對於所述參考消化
的時間過程已進行程度的指數。 項目33.如項目32的方法，進一步包括使用所述指數來確定為推斷樣品中至少一 種蛋白質的量的目的的樣品消化的可接受性，其中所述推斷基於對源自所述蛋白質序列的 至少一種監測肽的測定。 項目34.如項目32的方法，進一步包括使用所述指數來校正所述消化液中至少一 種監測肽的測定，從而估計如果該消化已進行至與在所述參考消化時間過程中的特定的點 參考消化液的相同程度時所獲得的測定。 項目35. —種確定樣品中至少一種靶蛋白數量的方法，包括以下步驟
1)將樣品消化以提供肽， 2)製備至少一種經標記的含所述靶蛋白序列的合成監測肽從而提供內標物，
3)將含已知量的標記的監測肽的步驟2)產物的一等份加到步驟1)產物中，
4)將步驟3)產物裝載在至少一種支持物上，該支持物在其上連接有至少一種結 合至少一種監測肽的結合劑， 5)洗滌步驟4)的支持物以除去未結合的肽， 6)從結合於步驟4)的支持物上的結合劑上洗脫監測肽， 7)將步驟6)洗脫的監測肽裝載於其上連接有至少一種結合劑的第二支持物上，
該結合劑不同於步驟4)的結合劑並與至少一種監測肽結合， 8)洗滌步驟7)的支持物從而除去未結合的肽， 9)從結合於步驟7)中的支持物上的結合劑上洗脫監測肽，及 10)使步驟9)獲得的洗脫液進行質譜檢測從而通過與標記的合成標準物比較而確定在洗脫液中監測肽的數量。 項目36. —種表徵樣品中靶蛋白結構的方法，所述方法包括如下步驟 1)使所述樣品的一等份進行變性操作， 2)消化步驟1)產物， 3)消化所述樣品的未經變性的第二等份， 4)製備至少一種經標記的含所述靶蛋白序列的合成監測肽從而提供內標物， 5)對步驟2)產物加入已知量的步驟4)產物， 6)對步驟3)產物加入相同的已知量的步驟4)產物， 7)將步驟5)和6)的每一種產物裝載到分離的支持物上，所述支持物在其上連接
有至少一種結合所述監測肽的結合劑， 8)洗滌步驟7)中製備的各種支持物， 9)從每種支持物上洗脫所述肽， 10)使步驟9)獲得的每種洗脫液進行質譜檢測，及 11)比較每種洗脫液中監測肽的數量。 項目37.如項目1的方法，其中在步驟2)中，監測肽是合成肽。 項目38.如項目1的方法，其中通過天然肽的化學修飾導入該標記物。 項目39.如項目38的方法，其中化學修飾將額外的原子結合到監測肽上。 項目40.如項目39的方法，其中選擇結合劑來結合監測肽經化學修飾的結構。 項目41.如項目40的方法，其中將樣品肽進行同樣的化學修飾但不導入標記物。 項目42.如項目31的試劑盒，其另外含有支持物。 項目43.如項目42的試劑盒，其中結合劑連接於支持物上。
權利要求
一種用於定量樣品中至少一種靶蛋白數量的方法，包括以下步驟1)將樣品消化以提供肽，2)製備至少一種經標記的含所述靶蛋白亞序列的監測肽從而提供內標物，3)將含已知量的標記的合成肽的步驟2)產物的一等份加到步驟1)產物中去，4)將步驟3)產物裝載在至少一種支持物上，該支持物上連接有至少一種結合至少一種監測肽的結合劑，5)洗滌步驟4)的支持物以除去未結合的肽，6)從結合到支持物上的結合劑上洗脫監測肽，7)將存在於步驟6)所得洗脫液中的至少一種監測肽進行質譜檢測從而通過與標記的合成標準物比較而確定消化液中監測肽的數量。
2. 如權利要求1的方法，其中標記物是穩定的同位素或其混合物。
3. 如權利要求2的方法，其中同位素是"N。
4. 如權利要求2的方法，其中同位素是"C。
5. 如權利要求2的方法，其中同位素是180。
6. 如權利要求l的方法，其中在步驟4)中，結合劑是抗體。
7. 如權利要求6的方法，其中該抗體是單克隆抗體。
8. 如權利要求6的方法，其中該抗體是多克隆抗體。
9. 如權利要求l的方法，其中在步驟4)中，結合劑是RNA適體。
10. 如權利要求l的方法，其中結合劑是可再循環的結合劑。
全文摘要
本發明提供了一種用於測定樣品中靶蛋白數量的經濟的流通型方法。用一種抗體製劑(不論是多克隆、單克隆或任何等價的特定結合劑)來捕獲並從而富集特定的監測肽(在複雜蛋白樣品的蛋白水解液中要定量的蛋白質的特定肽片段)及內標肽(具有同樣的化學結構但包括穩定的同位素標記)。當洗脫到適宜的質譜儀中時，對天然的(源於樣品的)和內標(同位素標記)肽進行定量，其所測定的豐度比較用計算起始樣品中監控肽及其母體蛋白的數量。
文檔編號G01NGK101782581SQ20091017476
公開日2010年7月21日 申請日期2003年10月2日 優先權日2002年10月3日
發明者諾曼·利·安德森 申請人:諾曼·利·安德森