東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法
2023-08-07 22:06:26 4
專利名稱：東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法
技術領域：
本發明涉及一種在培養瓶內生產東方百合脫毒小籽球的方法，屬於百合種球繁育技術領域。
背景技術：
百合(Lilium)是百合科百合屬的多年生草本鱗莖植物，由於其花大色美，氣質高雅，是世界著名的觀賞花卉，多年來，其切花銷售量一直佔居了全球鮮切花銷售量的前四位。而東方百合雜種系(Oriental hybrids)是百合雜種類中花朵最大而又最美麗的一大類，花型為碗型或星狀碗型，能散發出怡人的香味，故又稱之為香水百合，深受人們的喜愛，是世界上廣泛栽培的一大類百合雜種系。在百合種球的培育過程中，東方百合種球的生產周期較長，由鱗片扦插繁殖到開花商品球的培育需要2.5～3年。同時常規無性繁殖中的病毒積累是制約種球繁殖、栽培及切花生產的一大因素，所以脫毒種苗(球)的生產與使用是控制百合病毒病的最基本的關鍵措施之一。在脫毒種苗(球)的生產過程中，已有的報導均是以脫毒苗進行繁殖和生產的，未見在瓶內直接生成脫毒小籽球的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能有效縮短培育周期，減少病毒交叉感染的機會，提高百合種球質量的東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法。
本發明通過下列技術方案完成一種東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法，其特徵在於經過下列步驟1)、外植體的選擇與滅菌選擇無病蟲害、生長健壯、未檢測到CMV(黃瓜花葉病毒)和LSV(百合隱症病毒)的百合種球，在3～6℃的低溫、黑暗條件下貯藏6～8周後取出，邊剝鱗片邊用自來水衝洗，去除外部2～3層包裹不緊實的鱗片後，用濃度為0.1％的洗衣粉水浸泡2～5分鐘後，用自來水清洗乾淨，在0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中滅菌15～25分鐘，然後在1～3％的次氯酸鈉溶液中消毒10～15分鐘，用無菌水洗3～5次；2)、誘導培養在無菌條件下，將滅菌後的鱗片切塊接種到下列誘導培養基中培養，在溫度為25±2℃，光照時間10～12h/d，光照強度2000～3000Lx的環境條件下，培養20～25d後，在切口處生成不定芽MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L蔗糖 30000～40000mg/L瓊脂 5000～5500mg/LpH 5.5～6.03)、獲得脫毒莖尖將上述誘導產生的不定芽在36～40℃條件下氣熱培養10～30天後，在解剖鏡下剝取獲得0.2～0.5mm的莖尖；4)、增殖培養在無菌條件下，將步驟3)獲得的脫毒莖尖轉入下列增殖培養基中MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.2～0.5mg/L蔗糖 30000～40000mg/L瓊脂 5000～6000mg/LpH 5.5～6.0在溫度為26±2℃，光照時間10～12小時/天，光照強度1500～2000Lx的條件下，培養20～25d，使1個莖尖生長成多個不定芽；5)、繼代培養將上述增殖的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3個一叢，接入同樣的增殖培養基中，在相同的培養環境下進行培養，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內直接生成脫毒小籽球將繼代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列生球培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA)0.05～0.1mg/L蔗糖 80000～120000mg/L瓊脂 4500～6000mg/L活性炭 500～600mg/LpH 5.5～6.0在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養60～70d，不定芽切塊及周圍直接生成直徑0.8～1.2cm，圍徑3.0～3.5cm的小籽球，每個切塊可生成小籽球2～4個。
本發明解決了下列技術難點1、針對東方百合成球周期長，病毒容易累積的難點，本發明通過上述方法，在瓶內直接生成小籽球，其色白，鱗片緊實，無葉片，出瓶後可直接下地種植，直徑、圍徑已達到常規組培苗在田間生長3個月以上的小籽球，大大縮短了脫毒種球的培育周期，降低了生產成本。同時出瓶後的小籽球無葉片，易於種植前的冷藏處理，定植後成活率較高。
2、在植物組織培養中，培養瓶內的植株均以異養生長為主，糖是植株進行碳物質積累的主要來源。本發明解決的第二個難點是通過在固體或液體培養基中添加高濃度的蔗糖(8～12g/L)，使不定芽吸收的可溶性糖迅速累積至小籽球中，瓶內的脫毒小籽球得到了高速生長，同時提高了小籽球的品質。
3、在常規的組培脫毒苗培養中，不定芽需誘導出葉片後再進行生根植株的培養。然而常常因為培養瓶內CO2氣體的不足，使培養瓶內的組培苗葉片不僅不能正常進行光合作用積累光合產物，相反還由於葉片的存在，消耗了基部籽球所積累的養分，使組培小籽球的生長受到抑制。另外，常規組培條件中提供的光照，僅是保持組培葉片中的葉綠素生成，在百合的小籽球生成中無利用價值。因此在本發明中，解決的第三個難點是採取在完全黑暗條件下進行脫毒小籽球的培育，抑制葉片的生長，避免養分消耗，從而使培養基中的養分全部累積至小籽球中，提高了小籽球的生長速度。
4、本發明在不同的培養階段，根據不同的培養目的，對培養基、蔗糖濃度、添加活性炭以及培養條件等關鍵因子進行調控，既達到高效增殖，又保證了小籽球的質量，尤其在直接生球階段，採用完全黑暗條件進行培養60～70d，不僅節約了能源的消耗，而且培養環境接近於百合扦插「埋片」生成鱗片球的環境，籽球出瓶後容易處理，移栽成活率高且利於後期生長。
5、本發明利用組織培養中較潔淨的環境，使瓶內脫毒小籽球無病蟲害，移栽成活容易，便於百合種質資源在國內甚至於國際上的交流，避免了病蟲通過種質的交換而發生大爆發。
本發明具有下列優點和效果通過東方百合的瓶內直接生成脫毒小籽球技術，對整個百合種球的生產程序進行調整與優化，簡化了脫毒種球的培育程序，大大縮短了東方百合脫毒的培育時間，在降低了生產成本的同時提高了種球質量，加強了國產自育種球的市場競爭力，適於東方百合脫毒種球的規模化生產。
本發明著重對東方百合瓶內直接生成脫毒小籽球這一步驟中的關鍵因素進行了研究，具體地講，也就是從蔗糖的濃度以及培養環境的調控兩大方面進行試驗研究，其結果報告如下1、試驗材料取東方百合品種「Tiber」的種球作為供試材料。
2、方法與結果外植體的選擇、滅菌、脫毒莖尖的獲得以及增殖、繼代的整個環節同實施例，重點研究了脫毒小籽球在瓶內的直接生成。
(1)蔗糖濃度對瓶內小籽球生成的影響試驗不同的蔗糖濃度對瓶內直接生成小籽球的影響，設計了2％～14％一系列的梯度濃度，在完全黑暗的培養條件下，培養60d，觀察籽球的生長情況及籽球大小，平均直徑的測量是用直尺測量20個小籽球的直徑後，取平均值，平均圍徑的測量先用細棉線繞籽球的最大處，再用直尺測量得出數值，同樣取20個小籽球的平均值，試驗結果見表1。
通過以上的比較試驗，得出蔗糖濃度在10％以下時，籽球大小的增大與蔗糖濃度呈正相關，到10％時各項指標均達到了最優，生產的籽球數量適中，直徑和圍徑達到了最大，超過10％後，雖然每塊外植體所形成的籽球數量有所增多，但單個籽球的指標反而有所下降，且叢生狀，不利於籽球的分離與移栽，至14％時，已有部分籽球發生畸變，扁平狀。因此，在東方百合瓶內直接生成脫毒小籽球的方法中，以添加8％～12％的蔗糖比較適宜。
(2)培養環境的調控採用上述調配出的最適蔗糖濃度，將切塊接入MS+NAA0.1+蔗糖10％+活性炭0.6％的生球培養基內，在下面不同的培養條件(主要是光照的調整)，溫度為20±2℃的環境中進行培養，60d後測量籽球的各項指標，具體結果見表2。
表1不同蔗糖濃度下籽球的生長狀況
通過以上的試驗最終得出東方百合脫毒小籽球生成的培養條件以完全黑暗的條件下進行培養效果較好，生成的籽球數量適中，同時圍徑大於3cm的比率在試驗組合中最高，籽球質量優。
表2不同培養條件下脫毒小籽球的生長狀況
具體實施方式
為了更好地說明本發明的實質內容，下面給出本發明的實施例，但本發明的內容並不僅限於這些。
實施例11)、外植體的選擇與滅菌優選生長健壯、開花性狀好、無病蟲害，無病毒症狀表現的東方百合品種「Tiber」的種球作為外植體，在取材前，將準備接種的鱗莖在4℃的低溫，黑暗條件下貯藏8周後取出，邊剝鱗片邊用自來水衝洗，去除鱗莖外皮和外部2～3層包裹不緊實的鱗片後，用濃度為0.1％的洗衣粉水浸泡2分鐘，自來水清洗乾淨，切去少許頂部及基部，剝成帶部分基盤的單個鱗片，在0.1％的升汞(Hgcl2)溶液中滅菌25分鐘，1％的次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，無菌水衝洗3次後，鱗片切塊接種；2)、誘導培養在無菌條件下，將滅菌後的鱗片切塊接種到下列誘導培養基中MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖 30000mg/L瓊脂 5000mg/LpH 5.5在溫度為25±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000Lx的環境條件下，培養25d，在切口處直接生成不定芽，或通過愈傷組織脫分化形成不定芽；3)、脫毒莖尖的獲得將上述誘導產生的不定芽在36℃條件下氣熱培養30天，在解剖鏡下剝取獲得0.2～0.5mm的脫毒莖尖；4)、增殖培養在無菌條件下，將第3)步獲得的脫毒莖尖轉入下列增殖培養基中MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.2mg/L蔗糖 30000mg/L瓊脂 5000mg/LpH 5.5在溫度為26±2℃，光照時間10小時/天，光照強度2000Lx的條件下，培養20d，可使莖尖生長為不定芽，由1個可平均增殖為4個；
5)、繼代培養將第4)步增殖所得到的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3芽一叢，接入同樣的增殖培養基中，在相同的培養環境下進行培養，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內直接生成脫毒小籽球將繼代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列的生球培養基MS基本培養液萘乙酸(NAA) 0.05mg/L蔗糖 80000mg/L瓊脂 4500mg/L活性炭 500mg/LpH 5.5在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養70d，不定芽切塊及周圍可直接生成小籽球，平均直徑達1cm，平均圍徑達3.0cm以上，每個切塊平均可生成小籽球2.8個。
實施例21)、優選生長健壯、開花性狀好、無病蟲害，無病毒症狀表現的東方百合品種「Acapulco」的種球作為外植體，在取材前，將準備接種的鱗莖在6℃的低溫，黑暗條件下貯藏8周後取出，邊剝鱗片邊用自來水衝洗，去除鱗莖外皮和外部2～3層包裹不緊實的鱗片後，用0.1％洗衣粉水浸泡5分鐘，自來水清洗乾淨，切去少許頂部及基部，剝成帶部分基盤的單個鱗片，在0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中處理15分鐘，3％的次氯酸鈉溶液中處理10分鐘，無菌水衝洗5次後，鱗片切塊接種；2)、誘導培養在無菌條件下，將滅菌後的鱗片切塊接種到下列誘導培養基中MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.5mg/L蔗糖 40000mg/L瓊脂 5500mg/LpH6.0在溫度為25±2℃，光照時間10h/d，光照強度3000Lx的環境條件下，培養20d，在切口處直接生成不定芽，或通過愈傷組織脫分化形成不定芽；3)、脫毒莖尖的獲得以第2)步誘導產生的不定芽作材料，針對在百合種植、生產危害較大的病毒病，通過40℃氣熱培養10天後，在解剖鏡下剝取獲得0.2～0.5mm的脫毒莖尖；4)、增殖培養在無菌條件下，將第3)步獲得的脫毒莖尖轉入下列增殖培養基中MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L萘乙酸(NAA)0.5mg/L蔗糖 40000mg/L瓊脂 6000mg/LpH 6.0在溫度為26±2℃，光照時間12小時/天，光照強度1500Lx的條件下，培養25d，使莖尖生長為不定芽，由1個可平均增殖為5個；5)、繼代培養將第4)步增殖所得到的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3芽一叢，接入同樣的增殖培養基中，在相同的培養環境下進行培養，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內直接生成脫毒小籽球將繼代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列的生球培養基MS基本培養液萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖120000mg/L瓊脂6000mg/L活性炭 600mg/LpH 6.0在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養70d，不定芽切塊及周圍直接生成小仔球，平均直徑為0.96cm，平均圍徑2.58cm，平均可生成小籽球4個。
權利要求
1.一種東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法，其特徵在於經過下列步驟1)、外植體的選擇與滅菌選擇無病蟲害、生長健壯、未檢測到CMV(黃瓜花葉病毒)和LSV(百合隱症病毒)的百合種球，在3～6℃的低溫、黑暗條件下貯藏6～8周後取出，邊剝鱗片邊用自來水衝洗，去除外部2～3層包裹不緊實的鱗片後，用濃度為0.1％的洗衣粉水浸泡2～5分鐘後，用自來水清洗乾淨，在0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中滅菌15～25分鐘，然後在1～3％的次氯酸鈉溶液中消毒10～15分鐘，用無菌水洗3～5次；2)、誘導培養在無菌條件下，將滅菌後的鱗片切塊接種到下列誘導培養基中培養，在溫度為25±2℃，光照時間10～12h/d，光照強度2000～3000Lx的環境條件下，培養20～25d後，在切口處生成不定芽MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L蔗糖30000～40000mg/L瓊脂5000～5500mg/LpH 5.5～6.03)、獲得脫毒莖尖將上述誘導產生的不定芽在36～40℃條件下氣熱培養10～30天後，在解剖鏡下剝取獲得0.2～0.5mm的莖尖；4)、增殖培養在無菌條件下，將步驟3)獲得的脫毒莖尖轉入下列增殖培養基中MS基本培養液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA)0.2～0.5mg/L蔗糖 30000～40000mg/L瓊脂 5000～6000mg/LpH 5.5～6.0在溫度為26±2℃，光照時間10～12小時/天，光照強度1500～2000Lx的條件下，培養20～25d，使1個莖尖生長成多個不定芽；5)、繼代培養將上述增殖的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3個一叢，接入同樣的增殖培養基中，在相同的培養環境下進行培養，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內直接生成脫毒小籽球將繼代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列生球培養基中MS基本培養液萘乙酸(NAA)0.05～0.1mg/L蔗糖 80000～120000mg/L瓊脂 4500～6000mg/L活性炭 500～600mg/LpH 5.5～6.0在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養60～70d，不定芽切塊及周圍直接生成直徑0.8～1.2cm，圍徑3.0～3.5cm的小籽球，每個切塊可生成小籽球2～4個。
全文摘要
本發明提供一種東方百合脫毒小籽球的瓶內生成方法，它經過外植樹體選擇、滅菌，誘導培養獲得脫毒莖尖，再經增殖培養，繼代培養，瓶內直接生成脫毒小籽球。本發明針對東方百合成球周期長，病毒容易累積等難點，使東方百合在瓶內直接生成脫毒小籽球，出瓶後可直接下地種植，且移栽成活率高。通過對整個百合種球的生產程序進行調整與優化，簡化了脫毒種球的培育程序，大大縮短了東方百合脫毒的培育時間，在降低了生產成本的同時提高了種球質量，加強了國產自育種球的市場競爭力，適於東方百合脫毒種球的規模化生產。
文檔編號A01G7/00GK1762205SQ20041007951
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月21日 優先權日2004年10月21日
發明者瞿素萍, 屈雲慧, 熊麗, 王祥寧, 吳學尉, 陳敏 申請人:雲南省農業科學院花卉研究所