通過核糖體蛋白質l3基因的修飾植物和動物對單端孢菌毒素的耐受的製作方法

2023-08-07 19:21:21 2

專利名稱：通過核糖體蛋白質l3基因的修飾植物和動物對單端孢菌毒素的耐受的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種修飾的基因，其中，用所說的基因轉化的宿主對單端孢菌毒素具有抗性，其中所說的基因的野生形式編碼一種核糖體蛋白質L3。本發明也涉及一種用所說的基因轉化植物提高對單端孢菌毒素抗性的方法。本發明也涉及一種用所說的基因轉化動物提高對單端孢菌毒素耐受性的方法。本發明還涉及在轉化中將所說的基因用作選擇性標記的方法。
背景技術：
在全球範圍內，禾穀鐮孢黴(Fusarium graminearum)是一種重要的植物致病原，侵染了許多種類的植物，包括許多重要的糧食作物，例如玉米(穗和主莖腐爛)，大麥，和小麥(頭枯萎)。適宜的環境條件(適宜的溫度和高的溼度)可導致鐮孢黴流行並造成上百萬美元的損失。穀類作物感染禾穀鐮孢黴會降低產量和穀物品質。品質的降低是由於這種真菌產生的真菌毒素作用的結果；這些真菌毒素在收穫後保留在被汙染的穀物中，對可能消費這些穀物的動物和人類的健康造成威脅。
在不流行的年份低水平的汙染仍對安大略的玉米農場造成5％的損失，這一數字意味著使用這些玉米作飼料的養豬工業約$27,000,000的損失。在流行的年份，損失將是這一數字的兩倍或三倍。這些對飼養業主種植業主的直接損失包括作物損失和與飼料減少和飼料質量下降相關的動物的損失。總之，聯合國FOA估計世界上每年約25％的糧食作物被真菌毒素侵襲(Mannon和Johnson，1985，Fungi down on the Farm，New Scientist 10512-16)。鐮孢黴真菌毒素發現於所有的主要的穀類作物，包括玉米，小麥，大麥，燕麥，黑麥和其它的一些作物。這種病在溫和的氣候下最為流行。
真菌毒素是由許多種類的真菌產生的。禾穀鐮孢黴以及結谷木鐮孢黴(F.Sambucinum)，早熟禾鐮孢黴(F.Poae)，擬分枝孢鐮孢黴(F.Sporotrichioides)，大刀鐮孢(F.Culmorum)和F.Crookwellense可產生一類被稱為單端孢菌毒素的化合物。這一大的倍半萜環氧化物家族的化合物密切地相互關聯，而在基本的化學結構上羥基化和取代基的位置和數目有所變化。由禾穀鐮孢黴產生的主要的單端孢菌毒素是脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)，由於它能引起嘔吐因而也被稱為嘔吐毒素。這些化合物是強力的真核細胞蛋白質合成抑制劑，對人類和動物以及其它有機體例如植物均具有毒性。
由於它們的毒性，有人已建議了用於人類食品和動物飼料的DON真菌毒素汙染的安全閾值(Van Egmond，1989，Food Addit.Contam.6139-188；Underhill，CFIA Fact Sheet，Mycotoxins，1996)。如果將家養動物用汙染的穀類飼喂，則對家畜飼養者的威脅是對動物的健康會產生幾個方面的危害，包括飼料攝入量降低，生長速率降低，生育能力降低，免疫抑制，出血，嘔吐和可能造成死亡。這些效應中的一些可直接觀察，因而可進行測定，例如體重降低，而其它一些效應是比較細微的變化，例如免疫抑制，因而難於對其進行定量。總之，豬的懷胎率降低10-20％，生長率降低10-20％，可使飼養業主的利潤降低17-44％。真菌毒素對家禽和牛的影響沒有量化，因為這兩種動物對其飼料中的DON汙染不太敏感，並且還沒有對其經濟性進行評估。
在鐮孢黴流行的年份，用於人類消費品的高於2ppm DON安全閾值的加拿大穀物必降低等級使其成為動物飼料。如果穀物含有高於10ppm DON則不適於用作動物飼料並必須進行處理。由於許多農場主將自己生產的穀物用作農場動物的飼料，它們可能無法評估穀物中真菌毒素汙染的水平，因而可能大量使用了DON汙染的飼料。因而降低食品中單端孢菌毒素的水平非常重要，這可通過控制種植的穀類作物中鐮孢黴的爆發來實現。
過去曾使用化學處理來控制單端菌毒素的生物合成。一種抑制劑是描述於美國專利4816406中的ancymidol。但在現在的環境下人們期望避免使用化學品進行控制，特別是對於食品。因而需要一種通過使用非化學品的方法控制鐮孢黴，特別是禾穀鐮孢黴的方法。
單端孢菌毒素已經顯示是小麥頭部斑點病的致病因子。這是通過使用不產生單端孢菌毒素的禾穀鐮孢黴的突變體接種小麥頭部來證明的，其中通過遺傳工程技術將特異於單端孢菌毒素生物合成途徑的第一個基因破壞掉(Desjardins等，1996，Mol.Plant-Micr.Int.9775-781)。在兩年時間的田間試驗中，不產生單端孢菌毒素的品系與產生單端孢菌毒素的後代或回復變異體相比具有較低的致病性，這是通過幾種疾病參數測定的。用產生和不產生這些單端孢菌毒素的鐮孢黴品系接種田間生長的玉米得到了相似的結果。因而，提高小麥或玉米對單端孢菌毒素的效應的耐受性可降低疾病的發生。
發明概述動物研究的結果表明，對單端孢菌毒素的生物響應是快速的而無論是通過口服、局部或非胃腸道途徑施用的。在它們從身體被排洩之前(通常發生在注射後24至72小時內)，發現在膽汁，膽囊，腎臟，肝臟和小腸中具有最高的濃度。
所有的單端孢菌毒素的作用方式與它們和60S核糖體亞單位的結合能力並基本上抑制肽轉移酶活性相關。這是通過抑制蛋白質合成的起始、合成中的肽的延伸或肽的終止來完成(Freinberg和McLaughlin，1989，單端孢菌毒素p27作用的生物化學機制，In單端孢菌毒素的毒性致病效應，Vol 1 CRC Press，Boca Raton Fl.)。這些毒素對蛋白質合成的效應是在不同的真核細胞例如酵母和哺乳動物細胞系中進行觀察的。每一個核糖體明顯地僅具有一個毒素的結合位點，並且研究工作表明所有的單端孢菌毒素競爭核糖體蛋白質L3上的同一個核糖體結合位點。
由Schindler等分離出的啤酒酵母(酵母)突變體(1974，自然(Nature)，248548-536)顯示出可在單端孢菌毒素藥物木黴素上生長。這種酵母品系顯示出具有改變的60S核糖體亞單位功能，並且當所涉及的基因被克隆後發現它編碼核糖體蛋白質L3(RPL3)(Schultz和Friesen，1983，細菌學雜誌(J.Bacteriol.)1558-14)。
在本發明的一個方面中，通過比較野生型的酵母基因和突變的酵母基因得到的信息被用於修飾來自水稻Oryza sativa(一種穀類作物)的相應的基因。然後使用修飾的水稻基因創建出轉基因菸草，這些植物與野生型的菸草或用野生型的水稻基因轉化的植株相比對單端孢菌毒素具有較高的耐受性。含有修飾的水稻Rpl3基因的轉基因玉米胚胎培養物與含有野生型的水稻Rpl3基因的培養物相比對單端孢菌毒素DON也顯示出較高的耐受性。因而，這種修飾的水稻基因可提供對單端孢菌毒素的保護，因而在另一種植物中提供對鐮孢黴侵襲的抗性。
因而本發明提供了一種修飾的基因，其中，用所說的基因轉化的宿主對單端孢菌毒素的抗性提高，其中所述的基因的野生型形式編碼核糖體蛋白質L3。
在本發明的一個實施方案中，編碼核糖體蛋白質L3的基因來自水稻。
本發明還提供了一種含有所說的修飾的核糖體蛋白質L3基因的適當的克隆載體。
本發明由一方面提供了一種用修飾的Rpl3基因轉化的植物，其中所說的轉化的植物對鐮孢黴侵襲的抗性提高。
本發明也包括來自上述轉化的植物的種子。
本發明再一方面提供了一種用修飾的Rpl3基因轉化的動物，其中所說的轉化的動物對單端孢菌毒素的耐受性提高。
本發明又一方面提供了一種通過用一種修飾的基因轉化一種適當的植物提高對鐮孢黴侵襲的抗性的方法，其中，用所說的基因轉化的植物具有提高的對單端孢菌毒素的抗性，並且其中所說的基因的野生形式編碼核糖體蛋白質L3。
本發明也提供了一種通過用一種修飾的基因轉化一種適當的動物提高對單端孢菌毒素的耐受性的方法，其中，用所說的基因轉化的動物具有提高的對單端孢菌毒素的耐受性，並且其中所說的基因的野生形式編碼核糖體蛋白質L3。
本發明再一個方面提供了一種使用本發明的修飾的基因作為轉化實驗中的可選擇性標記的方法。
附圖簡要說明從下文的敘述參照附圖本發明的這些和其它的特徵將顯而易見。


圖1顯示野生型酵母RPL3胺基酸序列(RPL13PWT；SEQ ID NO1)，上面的一行，和木黴素抗性酵母序列(SCRP 13 PRO；SEQ ID NO2)，下面的一行，之間的比較。顯示了W-255至C-255的胺基酸變化。突變酵母基因在GenBank中的登記號是J01351。
圖2顯示水稻RPL3序列(SEQ ID NO3)，上面一行，和木黴素抗性酵母序列(SEQ ID NO2)，下面的一行，之間的比較。這一比較可以看出為創建真菌毒素耐受性水稻基因Rpl3c258推測的殘基W258(水稻基因編號)至C258的變化。該水稻基因在GenBank的登記號為D12630。
圖3顯示用於植物轉化的Agrobacterium tumefaciens雙重載體(binaryvector)pBin 19的質粒圖譜(Bevan，M.1984，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，128711-8721)。
圖4顯示質粒pCAMterX，它被用於將Rpl3克隆進多克隆位點(MCS)。Rpl3基因在前後排列的(70S啟動子)花椰菜花葉病毒(CAMV35S啟動子)引導下表達。
圖5顯示含有野生型的水稻Rpl3基因(C3細胞；圖5A)或修飾的Rpl3(C4；圖5B)的轉基因菸草的生長率。細胞被生長在不含有毒素或含有25ppm DON的培養基中。
本發明詳細描述本發明提供了一種修飾的核糖體蛋白質L3基因，其基因產物提供對單端孢菌毒素的抗性。以前的研究工作顯示，單端孢菌毒素結合在真核細胞60S核糖體的單一位點上。鑑定出了一個對單端孢菌毒素藥物，木黴菌素，具有抗性的酵母啤酒酵母的自發突變體。對相應的野生型基因進行鑑定的結果發現該突變基因產生於推測的RPL3蛋白質的255位的單個胺基酸變化(圖1)。
這一突變體只是可產生對藥物單端孢菌毒素木黴素抗性的同一個基因的很多突變體的一個例子。因而，本發明涉及一種修飾的核糖體蛋白質L3基因，其中，所說的修飾的基因提供對單端孢菌毒素的抗性。
本發明的發明人沒有局限於任何一種特定的理論，認為該真菌毒素與野生型的蛋白質結合，但不與突變型基因的產物結合。因而，本發明的修飾的Rpl3基因仍允許核糖體複合物中的肽基轉移酶行使功能，但對其修飾的程度應降低真菌毒素的結合能力。如果真菌毒素的影響降低，植物可更好地保護自身抵抗真菌，並降低發病率。
在本發明的這一方面的一個實施方案中，編碼RPL3的基因來自植物。再這一實施方案的一個實施例中，將相應的水稻Rpl3基因進行鑑定和修飾，以反映酵母突變基因中的修飾。這樣得到的Rpl3基因也顯示出對單端孢菌毒素的抗性。選擇一種植物來源的Rpl3基因代替酵母基因，預期植物基因在植物宿主中與酵母基因相比表達較好。選擇水稻是因為它最接近小麥和玉米，這是兩種植物宿主的例子。
作為例子雖然使用的是水稻Rpl3基因，也可使用其它的植物基因。適當的例子包括來自Arabidopsis thaliana和單子葉植物的相應的基因，例如小麥和玉米。對於動物轉化來說，相應的牛的基因將是適當的修飾對象。
如上文所述，本發明不限於使用修飾的植物Rpl3基因來獲得對單端孢菌毒素的抗性。按照本發明，可使用任何一種可賦予對單端孢菌毒素抗性的修飾的動物或植物Rpl3基因，以此轉化植物或動物，獲得對單端孢菌毒素的抗性。
在酵母基因中修飾的區域是高度保守的區域。表1顯示了在該蛋白質的這一關鍵部分的周圍在植物、大鼠、小鼠、人類、酵母、雅致彎梗黴(C.Elegans)和大腸桿菌中存在的胺基酸同源性。它們中的任何一種均可被用作Rpl3基因的原材料。在每一種情況下，將胺基酸序列與突變的酵母基因和在相應的Rpl3基因中產生的相應的突變進行線性排列。由於在胺基酸殘基240和263(基於酵母的胺基酸編號)之間的整個區域是高度保守的，在這一區域中對任何一個胺基酸進行修飾來得到修飾的基因序列都被認為是本發明的一部分。這種修飾可包括替換或短的長度的缺失，增加或顛換。如上文所述，該修飾的基因產物必需也能夠允許肽基轉移酶發揮功能，但對真菌毒素的結合能力降低。
表1在殘基240和263之間各種核糖體蛋白質L3的序列比較胺基酸序列
線條表示與野生型的酵母RPL3序列相同的胺基酸本發明還提供了一種含有所說的修飾的Rpl3基因的適當的克隆載體。可使用任何一種克隆載體。對克隆載體的選擇當然應反映最終進行轉化的宿主。本發明包括轉化的動物和植物。
適當的植物克隆載體包括雙重農桿菌載體，例如Bin 19(Bevan，M.，1984，核酸研究128711-8721)以及用於單子葉植物微彈轟擊的載體。
對於植物轉化來說，克隆載體可還包括3』非翻譯區域。3』非翻譯區域是指一種基因的部分，它含有一種包含聚腺苷酸信號和任何其它的可效應mRNA加工或基因表達的DNA片段。通常聚腺苷酸信號的特徵是引導聚腺苷酸味加入到mRNA前體的3』端。通常聚腺苷酸信號是通過與規範形式的5』AATAAA-3』的同源性的存在識別的，雖然其變異形式是不常見的。
適當的3』區域的例子是含有農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒基因(例如胭脂鹼合成酶(Nos基因))，和植物基因(例如大豆貯存蛋白質基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亞單位基因)的3』轉錄的非翻譯區域。來自本發明的構建體的修飾的Rpl3基因的3』非翻譯區域可被用於在植物中表達，不需要加入額外的區域。
本發明的載體也可含有適當的啟動子。在本發明的植物轉化的例子中可使用任何一種強啟動子。適當的例子包括但不限於花椰菜花葉病毒(CAMV35S)。它可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。
本發明的克隆載體在需要時也可包括增強子，不論是翻譯增強子或轉錄增強子。這些增強子區域對於本領域普通技術人員來說是公知的，可包括ATG起始密碼子和鄰接區域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框同相，以保證整個序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以是多種不同的來源，可以是天然的或合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域，或來自結構基因。該序列也可衍生於被選用來表達該基因的啟動子，並可對其進行特異性修飾，以提高mRNA的翻譯。
為了便於轉化的植物細胞的鑑定，可對本發明的載體進行進一步的基因工程操作以包括植物可選擇性標記。可使用的選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，抗生素包括慶大黴素，潮黴素，卡那黴素等。同樣，可使用可產生通過顏色變化(例如GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶))或發光(例如螢光酶)來識別的化合物的酶。
含有本發明的修飾的Rpl3基因的轉基因植物也被認為是本發明的一部分。從植物細胞產生完整植株的方法是本領域已知的，而得到轉化的和重生的植株的方法不是本發明的關鍵。總之，轉化的植物細胞被培養在適當的培養基中，該培養基中可含有選擇試劑，例如抗生素，其中選擇性標記被用於轉化的植物細胞的識別。在愈傷組織形成之後，可按照已知的方法使用適當的植物激素刺激苗的形成，並將苗轉移至生根培養基中生成植株。然後將該植株用於重複繁殖，或者使用種子或者使用無性繁殖技術來進行。
本發明的載體構建體可通過使用Ti質粒，Ri質粒，植物病毒載體，直接的DNA轉化，微注射，電穿孔等導入植物細胞。對這些技術的綜述參見例如Weissbach和Weissbach，植物分子生物學方法(Method forPlant molecular Biology)，Academy Press，New York VIII，pp.421-463(1988)；和Geiserson和Corey，植物分子生物學(Plant MolecularBiology)，第二版(1988)。
適當的植物宿主包括但不限於玉米，大麥，小麥，水稻，黑麥，燕麥，和穀子。
產生轉基因動物的技術已經建立起來，並使用小鼠(Hogan等，1986，小鼠胚胎的基因操作實驗室手冊。冷泉港實驗室出版社紐約)，羊(Wright等，1991，生物技術，紐約9831-834)，山羊(Ebert和Schindler，1993，Teriogenology，39121-135)和豬(Rexroad和Purcel，1988，Proc.11thint.Congress of Animal Reproduction and Artificial Insem.529-35)進行了進一步的完善。總之，這種方法基於對取自過度排卵雌性動物的受精卵的前核進行微注射。使用幾百個拷貝的這種新的基因構建體對卵子的前核進行微注射，然後轉移至受體雌性動物中完成妊娠。對轉基因整合的證實是通過對取自子代的體細胞組織的Southern雜交，以及對基因產物或基因功能的分析進行的。基因替換實驗可使修飾的Rpl3插入，代替動物的內源性野生型(易感性)基因，從而使動物獲得高水平的對真菌毒素的抗性(Stacey等，1994，分子細胞生物學141009-1016)。
適用的動物宿主包括任何一種其食譜的至少一部分來自上述植物的動物。這些動物包括但不限於牛，綿羊，山羊，豬，馬，家禽以及人。如上所述，豬對真菌毒素特別敏感。在本發明中提及特定序列時，應當理解這些序列包括與所說的特定序列「基本上同源」的序列。當一定長度內至少約70％，優選至少約80％，最優選至少約90-95％的核苷酸相匹配時，則這種序列為「基本上同源的」。「基本上同源」的序列在其序列內包括替換，缺失，和增加中的任何一種。基本上同源的DNA序列可通過Southern雜交實驗進行鑑定，例如在嚴謹雜交條件下進行實驗(參見Maniatis等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室(1982)第387至389頁)。
本發明中提及的特定的序列也包括與所說的特定的序列「功能等同」的序列。在本發明中，功能等同的序列是指一種雖然它與特定的序列不相同但具有相同或基本上相同的功能的序列。功能等同的DNA序列包括在序列中具有替換，缺失和增加中的任何一種。在本發明中功能等同的序列將提供對單端孢菌毒素的抗性。如上文所述，本發明的修飾的基因必須仍然使肽轉移酶具有活性但具有低的與真菌毒素結合的能力。
因而，本發明的另一個方面是一種用修飾的Rpl3基因轉化的植物，其中該轉化植物對鐮孢黴感染的抗性提高。
本發明又一方面提供了一種用修飾的Rpl3基因轉化的動物，其中該轉化的動物對單端孢菌毒素的耐受性提高。
本發明再一方面提供了一種賦予對鐮孢黴感染的抗性的方法，包括以下步驟提供一種修飾的基因，其中所說的基因的野生形式編碼一種核糖體蛋白質L3；並用所說的修飾的基因轉化一種適當的植物。
本發明再一方面提供了一種提高動物對單端孢菌毒素耐受性的方法，包括以下步驟提供一種修飾的基因，其中所說的基因的野生形式編碼一種核糖體蛋白質L3；並用所說的修飾的基因轉化一種適當的動物。
本發明的又一方面是該修飾的基因在轉化實驗中作為選擇性標記的應用。諸如來自細菌轉座子的新黴素磷酸轉移酶npt II，或潮黴素磷酸轉移酶hpt，或者哺乳動物二氫葉酸還原酶基因dhfr的選擇性標記基因已被成功地應用於許多植物系統中(Sproule等，1991，理論應用遺傳學(Theor.Appl.Genet.)82450-456；Dijak等，1991，植物細胞組織和器官培養25189-197)。這些基因在轉基因植物篩選中和在原生質體水平篩選體細胞雜種的情況下，分別允許使用抗生素卡那黴素，潮黴素和氨甲蝶呤。或者選擇策略在進行多重轉化的科學研究中具有實用性，也就是說用幾種不同的基因對一個植物進行重複轉化。為達到這一目的，需要新的和有效的選擇試劑。在轉基因生物體中使用抗生素降解或解毒基因是不允許或不期望的情況下，基於解毒化合物而不是抗生素的基因的新的篩選策略也是有用的。在這種情況下，需要一種基因，它賦予一種作為選擇性標記的有用的表型(疾病抗性)。
根據本發明，暴露於DON的植物或動物細胞在這種毒素的存在下不能增值。用本發明的修飾的基因轉化的細胞系對DON具有較大的抗性，並可在含有0.1ppm至50ppm的DON中生長。在本發明的一個實施例中，在選擇培養基中可使用0.5至10ppm的DON。這樣該修飾的基因可在轉化實驗中被用作選擇性標記，其中，只有被含有該修飾的基因的載體轉化的細胞系可在含有DON的選擇培養基中生長。因而，例如，本發明的修飾的基因可與現在使用的提供對潮黴素、慶大黴素、卡那黴素等抗性的基因相同的方式被用作植物或動物轉化實驗中的選擇性標記。
雖然參照優選的實施方案對本發明進行詳細描述，但所說的實施方案只是為了說明的目的，不限定本發明的範圍。實施例實施例1水稻Rpl3基因的修飾酵母Tcm1基因的野生型DNA序列得自酵母基因組測序項目的M.Bolotin-Fukuhara。將該Tcm1 DNA序列與突變型的tcm1序列比較後發現一個單一的鹼基對的變化。這一變化在推定的PRL3蛋白質(圖1)的殘基255發生一個色氨酸(Tcm1)至一個半胱氨酸的變化(tcm1)。
在本發明的這一實施例中，相應的水稻Rpl3基因發生了一種類似於酵母木黴素抗性基因(tcm1)的形式的轉化。
水稻Rpl3 cDNA含有一個21bp的5』非編碼區域，一個1170bp的編碼區域，和一個177bp的3』非編碼區域(包括部分聚A尾)，它是由Dr.A.Kato(Hokkaido University，Japan)惠贈的。該cDNA(原名為T82，現名為pOSRPL3)是以在pIBI31的SmaI/EcoRI位點的1368bp的插入物接收的。該水稻cDNA是從水稻懸浮培養細胞(Uchimaya等，1992，植物雜誌(Plant J.)21005-1009)中隨機克隆的。資料庫檢索的結果顯示與許多的核糖體蛋白質L3基因序列同源(Nishi等，1993，Biochimicaet Biophysica Acta 1216110-112)。
由水稻Rpl3和酵母Tcm1基因編碼的蛋白質具有65％的胺基酸相同性。在酵母等位基因之間觀察到的色氨酸-至-半胱氨酸的變化位於一個水稻基因中高度保守的區域；在水稻和酵母之間，5』端的第17個胺基酸，該色氨酸本身，和該色氨酸的3』方向的3個胺基酸完全保守(圖2和表1)。
因而，使用定點誘變來修飾水稻Rpl3 cDNA，使其在關鍵的位點類似於酵母tcm1基因。
用XbaI和NaeI消化pOSRPL3，產生一個1722bp的包括Rpl3 cDNA的片斷。將該片斷亞克隆進pALTER-EX1載體(Promega)的XbaI/HpaI位點並將其命名為pALTRPL3。使用一個18bp的寡核苷酸(5』-GGCTGGATGGCAGGCACC；SEQ ID NO4)藉助於Altered Sites kit(Promega)產生所需的突變。DNA測序證實了該誘變是成功的，並將得到的克隆命名為pALTRPLC4。實施例2載體構建和轉化在水稻Rpl3 TAG終止密碼子8bp上遊的XbaI位點和EcoRI位點被用於將沒有修飾或修飾形式的基因亞克隆進pCAMterX。PCAMterX衍生於pBIN19(Bevan，M，1984，核酸研究，128711-8721；圖3)並具有一個70SCaMV啟動子，多克隆位點，並增加了nos 3』終止子。含有亞克隆進pCAMterX的沒有修飾的和修飾的Rpl3基因的質粒(圖4)分別被命名為pCARPL3和pCARPLC4。這兩個克隆被轉化進農桿菌菌株GV3101/pmp90，隨後被用於轉化Nicotiana tabacum培育種Delgold和N.debneyi。轉化的N.tabacum和N.debneyi的品系在含有150mg/L卡那黴素的再生培養基(Sproule等，1991，理論應用遺傳學，82450-456)上進行選擇。實施例3菸草轉化將含有沒有修飾的和修飾的Rpl3基因(分別為pCARPL3和pCARPLC4)的載體用於轉化野生型菸草(Nicotiana tobacum)和一種野生的雙倍體品種N.debneyi。兩種基因以相同的頻率被轉移進這些菸草品種中，這表明它們中沒有一種對生長，再生，或種子生成具有負面效應。例如，分別有70和63個獨立的N.debneyi轉基因品系發現有pCARPL3和pCARPLC4基因。對這些轉基因植物的種子進行的Southern雜交結果和子代檢測被用於證實這些選出的用於進行詳細分析的植物具有單拷貝的插入物。實施例4原生質體分離和培養將從轉基因的N.tabacum和N.debneyi收穫的種子在70％Javex溶液中處理2-3分鐘，然後在無菌蒸餾水中浸洗5次進行表面消毒。將它們種植在(每個60×20mm培養皿上20個種子)瓊脂糖固化的含有150mg/L卡那黴素的B5培養基(Gibco)表面上，並保持在25℃和16小時日長的100uE m sec的光照下。選擇後的兩周之後將發芽並保持綠色的小苗轉移至新的缺乏卡那黴素的半強度MS培養基(Gibco)的培養皿中。這些植物在25℃溫室中和16小時日長的100uE m sec的光照下被保持在無菌Magenta容器內。
從葉肉細胞進行的原生質體分離是按照Sproule等(1991，理論應用遺傳學，82450-456)的方法進行的。將1％(w/v)纖維素酶R-10和解析酶R-10在0.45M甘露醇鹽溶液的酶溶液進行無菌過濾，並將20ml的等份試樣加入無菌的100×15mm培養皿中。剪取每種供體植物的五片葉子，並將背軸面向下飄浮在酶溶液中。用封口膜將培養皿封閉，在一個28℃的暗培養箱中在一個潮溼的盒子中溫浴17小時，並輕微搖動。通過一個無菌的88微米網眼的尼龍漏鬥過濾將解離的原生質體與組織碎片分開。將原生質體-酶溶液的等份試樣裝入圓底的無菌玻璃試管中，並在900轉/分離心10分鐘。將分離的原生質體通過在4ml具有0.5ml的SCM(0.45M山梨糖，10mg/L CaCl2.2H2O，5mg/L MES嗎啉代乙烷磺酸；pH5.8)覆蓋膜的無菌0.6M蔗糖溶液表面上懸浮與細胞碎片分開。從SCM界面中用無菌的吸管收集純化的原生質體。將原生質體用血細胞計數器將濃度在含有0.4M葡萄糖作為滲壓劑的液體NT培養基中(Nagata和Takebe，1991，Planta 9912-20)調整至5×104細胞/ml。
DON的貯存溶液是按照Greenhalgh等的方法製備的(1986，J.Agric.Food Chem.3498-102)，將其用於調整一些原生質體培養物中的DON毒素的濃度，使其濃度為0，0.1，1.0，5.0，或10.0ppm。所有的原生質體培養物為2ml液體，在無菌的60×15mm培養皿中在28℃在黑暗中進行溫浴。在培養一周之後，通過加入0.5ml的含有0.3M葡萄糖的NT培養基調整培養基中的滲壓劑的濃度，並將原生質體培養物轉移至25℃低光照下(10uE m sec)。
野生型植物顯示出對培養基中的0.5至10ppm的DON敏感。DON對這些原生質體的效應是與不存在DON的培養相比降低原生質體重新形成細胞壁的能力，降低分裂頻率(細胞的有絲分裂指數)，和降低鋪板效率(微小集落形成的數目)。
基因型Rpl3c258(C4品系)的原生質體的存活性在添加了0.5至25ppm DON的培養基中培養20天後沒有受到顯著影響。而含有Rpl3c258的原生質體的存活率在不存在DON的情況下為約65％，當這些原生質體被培養在含有25ppm的DON時存活率為56％。來自野生型菸草的原生質體當被培養在添加了25ppm的DON的NT培養基中時的存活率為18％，而來自具有水稻Rpl3基因(C3品系)的轉基因植物的原生質體的存活率低於10％。這種對葉肉原生質體的效應的原因不是每種基因型的總效應，因為在不存在DON時，每種品系在NT培養基中的存活率為58％至66％範圍內。當這些原生質體在真菌毒素DON存在下被培養時基因型之間的顯著差異就變得更為明顯。
也將原生質體培養在60×15mm培養皿內的2ml瓊脂糖底鋪層(0.4％w/v)上。該瓊脂糖底鋪層含有0，0.1，1.0，10，或25ppm DON。在這些培養中的原生質體以1×105/ml的濃度被懸浮在液體NT培養基中，並以Sproule等(1991，理論應用遺傳學82450-456)的方法進行培養。
當原生質體被培養在添加了DON的培養基中時，可觀察到微小集落形成(從分離的原生質體形成的細胞集落)的顯著變化。從含有Rpl3的原生質體形成的集落並不經常發展成愈傷組織，因而不將其轉移至再生培養基，而含有Rpl3c258的微小集落可被轉移至再生培養基。實施例5細胞懸浮培養來自初級轉基因或野生型菸草植物的細胞懸浮培養物是從葉愈傷組織培養物起始的。將兩克的愈傷組織在無菌的研磨器中進行研磨，將勻漿化的組織在無菌的125mlErlenmeyer燒瓶中用於接種33ml的含有2mg/L 2，4-D液體MS培養基。將細胞懸浮液在25℃在16小時日長的條件下保持在一個150轉/分的軌道振蕩器上，每周將5-10ml的細胞在33ml新鮮的培養基中進行亞培養。
在培養物在生長條件下平衡12周後對細胞懸浮物的生長進行測定。對增重的程度是通過將1ml的細胞懸浮物鋪板在無菌的Whatman濾紙上進行測定的，該濾紙放置在10ml瓊脂糖固化的含有0或25ppmDON的MS培養基上。以4天的間隔對每一個濾紙新鮮重量在無菌條件下進行測定，然後將細胞在相同的培養基中進行重新培養。兩種基因型的細胞當轉移至瓊脂糖固化的添加了卡那黴素的培養基中是具有相同的生長能力，表明了這些培養物中轉基因的穩定性和存在。
細胞體積的增長是通過將5ml的細胞接種至35ml添加了0或25ppm的液體MS培養基中進行測定的。以3天的間隔將每個燒瓶的整個內含物轉移至無菌的錐形刻度管中，並記錄群集的細胞的體積(表2)。將細胞放回相同的培養基中進行培養。
表2在DON存在和不存在下轉基因菸草細胞生長12天後的平均體積增長細胞系 DON的濃度(ppm)體積增長的平均％C40 45C30 40C42541C32513DON在25ppm時足以抑制群集細胞體積，以及pCARPL3植物的細胞懸浮物的鮮重增加。這些DON水平對pCARPLC4植物的培養物的群集細胞體積，或細胞鮮重增加的影響較小(表3和圖5a和圖5b)。
表3在DON存在和不存在下轉基因菸草細胞生長16天後的平均生長速率細胞系 DON的濃度(ppm) 重量增長的平均％C40 22.5C30 24.5C425 21.5C325 8.5DON也可抑制從野生型和pCAPRL3植物的葉體外培養的葉外植體上形成愈傷組織，而來自pCARPLC4植物的外植體可在DON的存在下再生。實施例6單子葉植物轉化將沒有修飾的Rpl3和修飾的Rpl3c258基因在水稻肌動蛋白啟動子和內含子元件(由紐約康奈爾大學的吳瑞教授提供的pCORl3)的控制下克隆進單子葉植物表達載體，分別提供pActRPL3和pActRPLC4，以在單子葉植物中進行組成型表達。這些構建體通過粒子轟擊被導入玉米胚發生組織培養物的細胞，這種胚發生組織培養物衍生於玉米A188×B73的不成熟F1胚胎。為了得到轉基因細胞系，每個構建體與含有Bar基因的選擇性除草劑抗性基因pAHC25(由Dr.Peter Quail，UCBerkeley Ca提供)共同轟擊，並建立phosphinothricin抗性培養。對這些培養物進行的Southern印跡分析鑑別出了具有整合進高分子量玉米DNA的RPL3和RPLC4的細胞系。實施例7轉基因單子葉植物培養物許多研究工作表明各種單子葉植物組織的生長被DON抑制。Bruins等(1993，植物科學(Plant Sci.)94195-206)證實DON降低小麥花葯衍生的愈傷組織的生長。10mg/L濃度的DON足以顯著抑制成熟的玉米胚胎的生長(McLean，1996，Mycopathologia 132173-183)。100mg/L劑量的DON對大多數小麥愈傷組織來說是致死性的(Menke-Milczarek和Jimny，1991，Mycotox.Res.7146-149)。
通過Southern分析選擇出具有低拷貝數目轉基因的RPL3和RPLC4的每種中一個細胞系。來自這兩個細胞系的愈傷組織經歷了相同的選擇過程並具有相同的日齡。對這兩個細胞系檢測其在含有0至25mg/L DON的培養基上生長的能力。在含有DON的培養基上生長的愈傷組織顯示出RPLC4細胞系對真菌毒素具有明顯強的耐受性。在5mg/L DON時RPL3的生長降低至對照的15％，而在相同水平的DON時RPLC4降低至對照的63％。為將RPLC4細胞系的生長降低至對照值的15％需要50mg/L DON。這表示RPLC4愈傷組織對DON的耐受性提高了10倍。
表4DON對用pActRPL3和pActRPLC4轉化的玉米胚胎發生培養物(A188×B73)的生長的效應起始乾重-RPL3＝1.4mg，RPLC4＝1.5mg。在25℃在黑暗中培養3周之後的最終乾重。12外植體/處理DON mg/L0510 25 50PActRPL3 31.1 4.9 3.3 3.2 2.2PActRPLC4 29.8 18.7 13.1 7.0 4.4將這些植物進行自交，建立純合子品系，並在野外種植進行鐮孢黴抗性研究。
所有的學術出版物和專利文獻引入本文作為參考。
對本發明的優選實施方案進行了描述。但是，對於本領域普通技術人員來說可以進行多種變化和修改而不脫離本發明權利要求限定的範圍。
序列表(1)總信息(i)申請人(A)名稱加拿大農業和農業食品部(B)街道Central Experimental Farm(C)城市Ottawa(D)州Ontario(E)國家Canada(F)郵編K1A 0C6(A)姓名Linda J.Harris(B)街道6495 Wheatfield Cres.
(C)城市Greely(D)州Ontario(E)國家Canada(F)郵編K4P 1E8(A)姓名Stephen C.Gleddie(B)街道33 Leonard Ave.
(C)城市Ottawa(D)州Ontario(E)國家Canada(F)郵編K1S 4T8(A)姓名John A.Simmonds(B)街道130 Amberwood Cres.
(C)城市Nepean(D)州Ontario(E)國家Canada(F)郵編K2E 7H8(ii)發明名稱通過核糖體蛋白質L3基因的修飾植物和動物對單端孢菌毒素的耐受
(iii)序列數目4(iV)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度387胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO1Met Ser His Arg Lys Tyr Glu Ala Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe1 5 10 15Leu Pro Arg Lys Arg Ala Ala ser Ile Arg Ala Arg Val Lys Ala Phe20 25 30Pro Lys Asp Asp Arg Ser Lys Pro Val Ala Leu Thr Ser Phe Leu Gly35 40 45Tyr Lys Ala Gly Met Thr Thr Ile Val Arg Asp Leu Asp Arg Pro Gly50 55 60Ser Lys Phe His Lys Arg Glu Val Val Glu Ala Val Thr Val Val Asp65 70 75 80Thr Pro Pro Val Val Val Val Gly Val Val Gly Tyr Val Glu Thr Pro85 90 95Arg Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Trp Ala Glu His Leu Ser Asp100 105 110Glu Val Lys Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Tyr Lys Ser Lys Lys Lys115 120 125Ala Phe Thr Lys Tyr Ser Ala Lys Tyr Ala Gln Asp Gly Ala Gly Ile130 135 140Glu Arg Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Val Val Arg Val145 150 155 160Leu Val His Thr Gln Ile Arg Lys Thr Pro Leu Ala Gln Lys Lys Ala165 170 175His Leu Ala Glu Ile Gln Leu Asn Gly Gly Ser Ile Ser Glu Lys Val180 185 190Asp Trp Ala Arg Glu His Phe Glu Lys Thr Val Ala Val Asp Ser Val195 200 205Phe Glu Gln Asn Glu Met Ile Asp Ala Ile Ala Val Thr Lys Gly His210 215 220Gly Phe Glu Gly Val Thr His Arg Trp Gly Thr Lys Lys Leu Pro Arg225 230 235 240Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys Ile Gly Ala Trp His245 250 255Pro Ala His Val Met Trp Ser Val Ala Arg Ala Gly Gln Arg Gly Tyr260 265 270His Ser Arg Thr Ser Ile Asn His Lys Ile Tyr Arg Val Gly Lys Gly275 280 285Asp Asp Glu Ala Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asp Arg Thr Lys Lys Thr290 295 300Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val His Tyr Gly Glu Ile Lys Asn Asp305 310 315 320Phe Ile Met Val Lys Gly Cys Ile Pro Gly Asn Arg Lys Arg Ile Val325 330 335Thr Leu Arg Lys Ser Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Arg Lys Ala Leu Glu340 345 350Glu Val Ser Leu Lys Trp Ile Asp Thr Ala Ser Lys Phe Gly Lys Gly355 360 365Arg Phe Gln Thr Pro Ala Glu Lys His Ala Phe Met Gly Thr Leu Lys370 375 380Lys Asp Leu385(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度387胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser His Arg Lys Tyr Glu Ala Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe1 5 10 15Leu Pro Arg Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Ala Arg Val Lys Ala Phe20 25 30Pro Lys Asp Asp Arg Ser Lys Pro Val Ala Leu Thr Ser Phe Leu Gly35 40 45Tyr Lys Ala Gly Met Thr Thr Ile Val Arg Asp Leu Asp Arg Pro Gly50 55 60Ser Lys Phe His Lys Arg Glu Val Val Glu Ala Val Thr Val Val Asp65 70 75 80Thr Pro Pro Val Val Val Val Gly Val Val Gly Tyr Val Glu Thr Pro85 90 95Arg Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Trp Ala Glu His Leu Ser Asp100 105 110Glu Val Lys Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Tyr Lys Ser Lys Lys Lys115 120 125Ala Phe Thr Lys Tyr Ser Ala Lys Tyr Ala Gln Asp Gly Ala Gly Ile130 135 140Glu Arg Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Val Val Arg Val145 150 155 160Leu Val His Thr Gln Ile Arg Lys Thr Pro Leu Ala Gln Lys Lys Ala165 170 175His Leu Ala Glu Ile Gln Leu Asn Gly Gly Ser Ile Ser Glu Lys Val180 185 190Asp Trp Ala Arg Glu His Phe Glu Lys Thr Val Ala Val Asp Ser Val
195 200 205Phe Glu Gln Asn Glu Met Ile Asp Ala Ile Ala Val Thr Lys Gly His210 215 220Gly Phe Glu Gly Val Thr His Arg Trp Gly Thr Lys Lys Leu Pro Arg225 230 235 240Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys Ile Gly Ala Cys His245 250 255Pro Ala His Val Met Trp Ser Val Ala Arg Ala Gly Gln Arg Gly Tyr260 265 270His Ser Arg Thr Ser Ile Asn His Lys Ile Tyr Arg Val Gly Lys Gly275 280 285Asp Asp Glu Ala Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asp Arg Thr Lys Lys Thr290 295 300Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val His Tyr Gly Glu Ile Lys Asn Asp305 310 315 320Phe Ile Met Val Lys Gly Cys Ile Pro Gly Asn Arg Lys Arg Ile Val325 330 335Thr Leu Arg Lys Ser Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Arg Lys Ala Leu Glu340 345 350Glu Val Ser Leu Lys Trp Ile Asp Thr Ala Ser Lys Phe Gly Lys Gly355 360 365Arg Phe Gln Thr Pro Ala Glu Lys His Ala Phe Met Gly Thr Leu Lys370 375 380Lys Asp Leu385(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度389胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型蛋白質(Xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ser His Arg Lys Phe Glu His Pro Arg His Gly Ser Leu Gly Phe1 5 10 15Leu Pro Arg Lys Arg Ser Ser Arg His Arg Gly Lys Val Lys Ser Phe20 25 30Pro Lys Asp Asp Val Ser Lys Pro Cys His Leu Thr Ser Phe Val Gly35 40 45Tyr Lys Ala Gly Met Thr His Ile Val Arg Glu Val Glu Lys Pro Gly50 55 60Ser Lys Leu His Lys Lys Glu Thr Cys Glu Ala Val Thr Ile Ile Glu65 70 75 80Thr Pro Pro Leu Val Ile Val Gly Leu Val Ala Tyr Val Lys Thr Pro85 90 95Arg Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser Val Trp Ala Gln His Leu Ser Glu100 105 110Glu Val Arg Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Cys Lys Ser Lys Lys Lys115 120 125Ala Phe Thr Lys Tyr Ala Leu Lys Tyr Asp Ser Asp Ala Gly Lys Lys130 135 140Glu Ile Gln Met Gln Leu Glu Lys Met Lys Lys Tyr Ala Ser Ile Val145 150 155 160Arg Val Ile Ala His Thr Gln Ile Arg Lys Met Lys Gly Leu Lys Gln165 170 175Lys Lys Ala His Leu Met Glu Ile Gln Ile Asn Gly Gly Thr Ile Ala180 185 190Asp Lys Val Asp Tyr Gly Tyr Lys Phe Phe Glu Lys Glu Ile Pro Val195 200 205Asp Ala Val Phe Gln Lys Asp Glu Met Ile Asp Ile Ile Gly Val Thr210 215 220Lys Gly Lys Gly Tyr Glu Gly Val Val Thr Arg Trp Gly Val Thr Arg225 230 235 240Leu Pro Arg Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys Ile Gly245 250 255Ala Trp His Pro Ala Arg Val Ser Tyr Thr Val Ala Arg Ala Gly Gln260 265 270Asn Gly Tyr His His Arg Thr Glu Met Asn Lys Lys Val Tyr Lys Ile275 280 285Gly Lys Ser Gly Gln Glu Ser His Ala Ala Cys Thr Glu Phe Asp Arg290 295 300Thr Glu Lys Asp Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Pro His Tyr Gly Val305 310 315 320Val Lys Gly Asp Tyr Leu Met Ile Lys Gly Cys Cys Val Gly Pro Lys325 330 335Lys Arg Val Val Thr Leu Arg Gln Ser Leu Leu Lys Gln Thr Ser Arg340 345 350Leu Ala Leu Glu Glu Ile Lys Leu Lys Phe Ile Asp Thr Ser Ser Lys355 360 365Phe Gly His Gly Arg Phe Gln Thr Thr Asp Glu Lys Gln Arg Phe Phe370 375 380Gly Lys Leu Lys Ala385(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝」寡聚體」(Xi)序列描述SEQ ID NO4GGCTGGATGG CAGGCACC18
權利要求
1.一種修飾的基因，其中所述的基因的野生型形式編碼核糖體蛋白質L3，並且其中用所說的修飾的基因轉化的宿主對單端孢菌毒素的抗性提高，先決條件是所說的基因不是來自啤酒酵母。
2.按照權利要求1所述的修飾的基因，其中該基因是通過鹼基對的替換，缺失，增加或顛換進行修飾的，其中該修飾足以降低真菌毒素的結合能力，但不足以破壞肽基轉移酶的活性。
3.按照權利要求2所述的修飾的基因，其中基於酵母基因的胺基酸編號該修飾發生在胺基酸240和263之間。
4.按照權利要求3所述的修飾的基因，其中該編碼核糖體蛋白質L3的基因來源於水稻，Arabidopsis thaliana，單子葉植物，大鼠，小鼠，人類，酵母，雅致彎梗黴(C.Elegans)或大腸桿菌。
5.按照權利要求4所述的修飾的基因，其中該編碼Rpl3基因的基因是一種水稻基因。
6.按照權利要求5所述的修飾的基因，其中該基因具有編碼示於SEQ ID NO3的胺基酸序列或其功能等同體的序列。
7.一種含有權利要求1所述的修飾的Rpl3基因的克隆載體。
8.按照權利要求7所述的克隆載體，其中該基因是通過鹼基對的替換，缺失，增加或顛換進行修飾的，其中該修飾足以降低真菌毒素的結合能力，但不足以破壞該基因的核糖體蛋白質的功能。
9.按照權利要求8所述的克隆載體，其中該編碼核糖體蛋白質L3的基因來源於水稻，Arabidopsis thaliana，單子葉植物，大鼠，小鼠，人類，酵母，雅致彎梗黴或大腸桿菌。
10.按照權利要求9所述的克隆載體，其中該編碼核糖體蛋白質L3的基因是一種水稻基因。
11.按照權利要求10所述的克隆載體，其中該基因具有編碼示於SEQ ID NO3的胺基酸序列或其功能等同體的序列。
12.一種用權利要求1的修飾的Rpl3基因轉化的轉化植物，其中所說的轉化植物對鐮孢黴侵襲的抗性提高。
13.按照權利要求12所述的植物，其中該基因是通過鹼基對的替換，缺失，增加或顛換進行修飾的，其中該修飾足以降低真菌毒素的結合能力，但不足以破壞該基因的核糖體蛋白質L3的功能。
14.按照權利要求13所述的植物，其中該編碼核糖體蛋白質L3的基因來源於水稻，Arabidopsis thaliana，單子葉植物，大鼠，小鼠，人類，酵母，雅致彎梗黴或大腸桿菌。
15.按照權利要求14所述的植物，其中該編碼核糖體蛋白質L3的基因是一種水稻基因。
16.按照權利要求15所述的植物，其中該基因具有編碼示於SEQ IDNO3的胺基酸序列或其功能等同體的序列。
17.按照權利要求12所述的植物，其中該植物選自下組玉米，大麥，小麥，水稻，黑麥，燕麥和穀子。
18.由權利要求12至17中任意一項所述的轉化植物產生的種子。
19.一種用權利要求1的修飾的Rpl3基因轉化的轉化動物，其中所說的轉化動物對單端孢菌毒素的耐受性提高。
20.按照權利要求19所述的動物，其中該基因是通過鹼基對的替換，缺失，增加或顛換進行修飾的，其中該修飾足以降低真菌毒素的結合能力，但不足以破壞該基因的核糖體蛋白質L3的功能。
21.按照權利要求20所述的動物，其中該編碼核糖體蛋白質L3的基因來源於水稻，Arabidopsis thaliana，單子葉植物，大鼠，小鼠，人類，酵母，雅致彎梗黴或大腸桿菌。
22.按照權利要求21所述的動物，其中該編碼核糖體蛋白質L3的基因是一種水稻基因。
23.按照權利要求22所述的動物，其中該基因具有編碼示於SEQ IDNO3的胺基酸序列或其功能等同體的序列。
24.一種通過用權利要求1所述的修飾的基因轉化一種適當的植物提高對鐮孢黴侵襲的抗性的方法，其中，用所說的基因轉化的植物具有提高的對單端孢菌毒素的抗性，並且其中所說的方法包括以下步驟提供一種修飾的基因，和用所說的基因轉化一種適當的植物。
25.一種通過用權利要求1所述的修飾的基因轉化一種適當的動物提高對單端孢菌毒素的耐受性的方法，其中，用所說的基因轉化的動物具有提高的對單端孢菌毒素的耐受性，並且其中所說的方法包括以下步驟提供一種修飾的基因，和用所說的基因轉化一種適當的動物。
26.一種使用權利要求1所述的修飾的基因作為動物或植物轉化實驗中的選擇性標記的方法。
全文摘要
禾穀鐮孢黴(Fusarium graminearum)是一種植物致病原,侵染了許多種類的植物,包括玉米(穗和主莖腐爛),大麥,和小麥(頭枯萎)。鐮孢黴流行造成上百萬美元的損失。穀類作物感染禾穀鐮孢黴會降低產量和穀物品質。真菌毒素是由許多種類的真菌產生的,因而穀物被這些真菌毒素,例如單端孢菌毒素汙染。主要由禾穀鐮孢黴(Fusarium graminearum)以及大刀鐮孢(F.Culmorum)產生的單端孢菌毒素是一種脫氧瓜蔞鐮菌醇(DON,也被稱為嘔吐毒素)。單端孢菌毒素是強力的蛋白質合成抑制劑,對人類和動物具有毒性。乙鑑定出一種抵抗單端孢菌毒素,木黴素的酵母基因。已製備出相應的植物基因,它被用於轉化植物並適用於轉化動物。這些轉化的植物具有提高的對單端孢菌毒素的耐受性,更能抵抗鐮孢黴的侵染。轉化的動物對單端孢菌毒素的耐受性提高。這種修飾的基因也可用作轉化實驗中的可選擇性標記。
文檔編號C12N15/29GK1268974SQ98808745
公開日2000年10月4日 申請日期1998年7月29日 優先權日1997年8月12日
發明者琳達·J·哈裡斯, 史蒂芬·C·格裡蒂, 約翰·A·西蒙滋 申請人:加拿大農業與農業食品部