攜帶與l-肉鹼生物合成相關基因的腸桿菌科屬微生物和使用該微生物生產l-肉鹼的方法

2023-07-10 04:50:16 2

專利名稱：：攜帶與l-肉鹼生物合成相關基因的腸桿菌科屬微生物和使用該微生物生產l-肉鹼的方法
技術領域：
：本發明涉及包括來源於粗糙脈孢菌(A^"ra^omcra^a)的L-肉鹼生物合成相關基因的腸桿菌科(五^erak^en'acfle)的微生物，和使用所述微生物生產L-肉鹼的方法。
背景技術：
：L-肉鹼(3-羥基-4-三甲基氨基丁酸)在生物體中普遍存在，並且是在線粒體中將活化的長鏈脂肪酸經由線粒體內膜攜帶到線粒體基質中的兩性離子化合物。已知在人體中L-肉鹼可以從賴氨酸或蛋白質賴氨酸合成。在哺乳動物中，蛋白質賴氨酸通常用作L-肉鹼生物合成的前體，然而，在粗糙脈孢菌中，應用游離的賴氨酸。在L-肉鹼的生物合成中，形成s-N,N，N-三甲基賴氨酸，s-N,N，N-三甲基-(3-羥基賴氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛中間體，和Y-丁醯甜菜鹼，並且Y-丁醯甜菜鹼通過Y-丁醯甜菜鹼羥化酶羥基化而成為L-肉鹼。圖1是圖解粗糙脈孢菌中假定的L-肉鹼生物合成途徑的流程圖。L-肉鹼可以通過化學合成法、應用酶反應的半合成法、和應用微生物的方法生產。然而，當應用化學合成法時，存在問題，即獲得DL-肉鹼外消旋混合物，由此必須分離DL-外消旋混合物。作為應用酶反應的半合成法的一個實例，美國專利號4,221,869公開了使用應用NAD作為輔酶的肉鹼脫氫酶(EC1丄U08)，由脫氫肉鹼生產L-肉鹼的方法。然而，脫氫肉鹼極其不穩定並自發分解為丙酮基三甲銨和二氧化碳。另外，德國專利號DE-OS-3123975公開了由Y-丁醯甜菜鹼生產L-肉鹼的方法，該方法使用從粗糙脈孢菌分離的Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(EC1.14.11.1)。然而，存在一個缺點，即在羥基化期間必須將a-酮戊二酸和還原物(g卩，抗壞血酸)加入反應物中。關於應用微生物生產L-肉鹼的方法，例如，美國專利號5,028,538公開了一種從將大腸桿菌(E.coli)044K74培養在含有巴豆酸甜菜鹼(4-N,N,N-三乙基氨基巴豆酸)的培養基之後獲得的培養物而收集L-肉鹼的方法。另外，美國專利號4,708,936公開了通過將木糖氧化產鹼菌(^c/zramok^erjc_y/ayox>^ara)DSM3225(HK1331b)培養在含有巴豆酸甜菜鹼和/或Y-丁醯甜菜鹼的培養基中來生產L-肉鹼的方法。然而，存在缺點，即，應該使用L-肉鹼生物合成的前體，諸如巴豆酸甜菜鹼，或不是中間體的化合物，並且L-肉鹼的產率不高。因此，在應用微生物生產L-肉鹼的方法中仍然存在提高產率的需要。本發明的發明人己經嘗試生產應用廉價前體並且還具有高產率的L-肉鹼的微生物，並且發現來源於粗糙脈孢菌與L-肉鹼的生物合成相關的基因在腸桿菌科的微生物中充分表達，由此完成本發明。附圖描述圖1是圖解粗糙脈孢菌中假定的L-肉鹼生物合成途徑的流程圖。圖2是顯示洗脫溶液的天然或SDS-PAGE分析的結果的圖，所述洗脫溶液通過裂解粗糙脈孢菌培養物並且對裂解的物質進行DEAE柱層析而獲得。圖3是顯示在將圖2的蛋白條帶a、b和c與賴氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反應後通過HPLC檢測三甲基賴氨酸的結果的圖表。圖4是顯示通過HPLC分析通過將條帶a蛋白反應而獲得的樣品、以及三甲基賴氨酸標準物的結果的圖表。圖5是顯示通過PCR擴增LMT基因的電泳結果的圖。圖6圖示pT7-7LMT的產生過程。圖7是顯示裂解的細菌的上清液SDS-PAGE分析結果的圖，所述裂解的細菌通過在IPTG存在下培養含有來源於粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6->^-賴氨酸-甲基轉移酶的大腸桿菌並且將從中獲得的細菌裂解而獲得。圖8圖示pT7-7TMLH的產生過程。圖9圖示pT7-7TMLA的產生過程。圖10圖示pT7-7TMABADH的產生過程。圖11圖示pT7-7BBH的產生過程。圖12是顯示分別插入至UpT7-7TMLH、pT7-7TMLA、pT7-7TMABADH和pT7-7BBH中的每一基因的電泳結果的照片。在圖12中，泳道1代表標記，泳道2代表pT7-7TMLH，泳道3代表pT7-7TMLA，泳道4代表pT7-7TMABADH，並且泳道5代表pT7-7BBH。圖13是顯示粗提物的SDS-PAGE結果的照片，所述粗提物分別獲自用pT7-7TMLH、pT7-7TMLA、pT7-7TMABADH和pT7-7BBH轉化的大腸桿菌BL21(DE3)的培養物。在圖13中，泳道1代表標記，泳道2代表陰性對照組，泳道3代表pT7-7TMLH(52kDa)，泳道4代表pT7-7TMLA(53kDa)，泳道5代表pT7-7TMABADH(55kDa)和泳道6代表pT7-7BBH(49kDa)。圖14圖示pT7-7CarABE的產生過程。圖15圖示pACYC184CarCD的產生過程。發明詳述技術問題本發明提供能夠高效率生產L-肉鹼的微生物。本發明還提供應用所述微生物生產L-肉鹼的方法。技術方案按照本發明的一個方面，提供一種屬於腸桿菌科的微生物，所述微生物包含編碼來源粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶(LMT)活性的多核苷酸；編碼3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶(TMLA)活性的多核苷酸；編碼N-三甲基賴氨酸羥化酶(TMLH)活性的多核苷酸；編碼Y-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)活性的多核苷酸；和編碼Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)活性的多核苷酸。按照本發明的微生物可以是含有編碼所述5種蛋白的多核苷酸的任一種。優選地，所述微生物是大腸桿菌(^c/zen'c&aco/0，並且更優選大腸桿菌(保藏號KCCM-10638)。按照本發明獨立編碼5種蛋白，即，lmt、tmlh、tmla、tmabadh和bbh的多核苷酸可以通過載體或其本身用於微生物。當獨立編碼所述5種蛋白的多核苷酸通過載體用於微生物時，可以將編碼所述5種蛋白的多核苷酸插入到單一載體中爾後應用，或者可以插入到至少一種載體中爾後應用。在本發明中，術語"載體"是本領域的技術人員公知的。載體通常是指用於將核酸引入細胞的核酸構建體。這一核酸構建體可以是衍生於質粒或病毒基因組的核酸構建體。按照本發明的一個實施方案編碼來源於粗糙脈孢菌的s-腺苷甲硫氨酸-6-n-賴氨酸-甲基轉移酶(lmt)的多核苷酸編碼來源於粗糙脈孢菌的s-腺苷甲硫氨酸賴氨酸甲基轉移酶D認為s-腺苷甲硫氨酸賴氨酸甲基轉移酶在粗糙脈孢菌細胞中催化通過將甲基基團附著到賴氨酸上而將賴氨酸轉化成為6-n-三甲基賴氨酸的反應，但是本發明的範圍不限於這一具體的作用機制。編碼s-腺苷甲硫氨酸賴氨酸甲基轉移酶的多核苷酸優選地是編碼胺基酸序列seqidno:11的多核苷酸，並且更優選地是具有核苷酸序列seqidno:16的多核苷酸。按照本發明的一個實施方案編碼來源於粗糙脈孢菌的n-三甲基賴氨酸羥化酶(tmlh)的多核苷酸編碼來源於粗糙脈孢菌的n-三甲基賴氨酸羥化酶(tmlh)。認為n-三甲基賴氨酸羥化酶(tmlh)在粗糙脈孢菌細胞中催化將N-三甲基賴氨酸轉化成P-羥基-s-N-三甲基賴氨酸的反應，但是本發明的範圍不限於這一具體的作用機制。編碼n-三甲基賴氨酸羥化酶(tmlh)的多核苷酸優選地是編碼胺基酸序列seqidno:12的多核苷酸，並且更優選的是具有核苷酸序列seqidno:17的多核苷酸。按照本發明的一個實施方案編碼來源於粗糙脈孢菌的3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶(tmla)的多核苷酸編碼來源於粗糙脈孢菌的3-羥基-6-:^-三甲基賴氨酸醛縮酶0^1^)。認為3-羥基-6-n-三甲基賴氨酸醛縮酶(tmla)在粗糙脈孢菌細胞中催化將(3-羥基-s-N-三甲基賴氨酸轉化成y-N-三甲基氨基丁醛的反應，但是本發明的範圍不限於這一具體的作用機制。編碼3-羥基-6-n-三甲基賴氨酸醛縮酶(tmla)的多核苷酸優選地是編碼胺基酸序列seqidno:13的多核苷酸，並且更優選的是具有核苷酸序列seqidno:18的多核苷酸。按照本發明的一個實施方案編碼來源於粗糙脈孢菌的，三甲基氨基醛脫氫斷TMABADH)活性的多核苷酸編碼來源於粗糙脈孢菌的，三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)活性。認為y-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)在粗糙脈孢菌細胞中催化將Y-N-三甲基氨基丁醛轉化成Y-丁醯甜菜鹼的反應，但是本發明的範圍不限於這一具體的作用機制。編碼Y-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)的多核苷酸優選地是編碼胺基酸序列SEQIDNO:14的多核苷酸，並且更優選的是具有核苷酸序列SEQIDNO:19的多核苷酸。按照本發明的一個實施方案編碼來源於粗糙脈孢菌的Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)活性的多核苷酸編碼來源於粗糙脈孢菌的Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)。認為Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)在粗糙脈孢菌細胞中催化將丁醯甜菜鹼轉化成L-肉鹼的反應，但是本發明的範圍不限於這一具體的作用機制。編碼Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)的多核苷酸優選地是編碼胺基酸序列SEQIDNO:15的多核苷酸，並且更優選地是具有核苷酸序列SEQIDNO:20的多核苷酸。按照本發明的另一個方面，提供生產L-肉鹼的方法，所述方法包括在底物存在下，培養按照本發明的微生物，以在培養物中生產L-肉鹼，所述底物選自由下列各項組成的組L-賴氨酸，N-三甲基賴氨酸，P-羥基-N-三甲基賴氨酸,Y-N-三甲基氨基丁醛,Y-丁醯甜菜鹼，及其混合物。在按照本發明生產L-肉鹼的方法中，選自由L-賴氨酸、N-三甲基賴氨酸、(3-羥基-N-三甲基賴氨酸、Y-N-三甲基氨基丁醛、Y-丁醯甜菜鹼及其混合物組成的組的底物的濃度優選地為基於培養基重量的0.1-10重量％，但是本發明並不特別限於這一範圍。在按照本發明的方法中，從培養物收集L-肉鹼的方法是本領域的技術人員公知的。這樣的方法的實例包括，但不限於，超濾、離心分離、和在將細胞從培養物分離後得到的產物重結晶而收集L-肉鹼的方法諸如傾析法，並且對於從中獲得的上清液進行陽離子交換層析或電滲析。有利效果按照本發明的微生物具有生產L-肉鹼的良好能力，以致它可以有效用於通過發酵生產L-肉鹼的方法。在按照本發明生產L-肉鹼的方法中，使用屬於腸桿菌科的微生物可以高效地生產L-肉鹼。最佳方式以下，將參考下列實施例更具體地描述本發明。這些實施例僅是為了舉例說明目的並不是意圖限制本發明的範圍。實施例產生編碼在粗糙脈孢菌中與由L-賴氨酸生物合成L-肉鹼相關的5種蛋白的多核苷酸，以及包含其的核酸構建體。接著，用所述核酸構建體轉化大腸桿菌，並且將轉化的大腸桿菌在含有通過L-肉鹼生產途徑獲得的中間產物的培養基中培養，以生產L-肉鹼並且收集L-肉鹼。實施例1:分離編碼來源於粗糙脈孢菌的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸分離並且克隆來源於粗糙脈孢菌的編碼LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸，並且分析其鹼基序列。(1)製備粗糙脈孢菌的cDNA文庫從包含粗糙脈孢菌真菌體(包括孢子體)的培養物分離總mRNA，並且使用polyT作為引物進行反轉錄，然後進行PCR擴增cDNA。將擴增的cDNA用￡co/I禾卩扇oI消化，然後將消化的cDNA插入到人AD5克隆載體的I和屈oI位點，以製備來源於粗糙脈孢菌的cDNA文庫。接著，將所述cDNA文庫感染大腸桿菌BNN322，然後培養並且擴增感染的大腸桿菌BNN322。首先，將大腸桿菌BNN322在含有50|ag/ml卡那黴素和0.2%麥芽糖的LB培養基中培養過夜。然後，對於從其獲得的培養物進行離心分離，然後去除得到的產物的上清液，並且之後將細胞沉澱重懸在1ml10mMMgS04溶液中。將從得到的產物獲得的混懸液與5X107PFU的XcDNA文庫在3(TC不振蕩地溫育30分鐘，向培養物中另外加入2mlLB培養基，並且接著將得到的培養物在3CTC在振蕩培養箱中振蕩1個小時。將培養的細胞劃線到含有氨苄青黴素(75嗎/ml)的LB培養平板上，並且在37'C培養8小時。使用Wizard試劑盒從平板的菌落分離cDNA文庫集合(cDNAlibrarypool)。將包含分離的cDNA文庫集合的人用作模板，以擴增編碼LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸。(2)擴增並且克隆編碼LMT的多核苷酸(LMT基因)並且證實LMT生產(a)從粗糙脈孢菌分離LMT基因並且證實所述基因的功能性表達培養粗糙脈孢菌並且收集細胞。然後，使用含有2mMDTT和0.2mMEDTA的lMpH7.4的磷酸鉀緩衝液將細胞裂解，然後提取蛋白。將硫酸鉸緩慢加入到所獲得的上清液中，達到50%終飽和濃度而將蛋白沉澱下來，然後向通過離心沉澱的蛋白加入少量0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液。將得到的溶液使用Tl透析膜進行脫鹽，並且將脫鹽的樣品使用DEAE柱純化。在此時，使用0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液作為洗滌緩衝液和包含0.3MNaCl的0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液作為洗脫緩衝液而進行合併(pooling)。此後，將合併的樣品使用T1透析膜脫鹽。脫鹽樣品使用CM柱純化。將0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液用作所述柱的洗漆緩衝液，並且將沒有吸附到柱上並且從柱上流出的樣品都合併起來。將蛋白樣品再次加載到DEAE柱上，然後使用0.1MpH7.4的磷酸鉀緩衝液，進行密度梯度洗脫，達到0-0.3M的NAC1濃度。使用天然-PAGE和SDS-PAGE對純化的樣品進行蛋白質分析。圖2是顯示洗脫溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的結果的圖，所述洗脫的溶液在將粗糙脈孢菌培養物裂解並且對所裂解的物質進行DEAE柱層析之後獲得。在圖2中，泳道1代表標記，泳道2和3代表DEAE洗脫峰2的天然-PAGE分析的結果，並且泳道4和5代表DEAE洗脫峰3的天然-PAGE分析的結果。在圖2B中，泳道1代表標記，泳道2代表DEAE洗脫峰2的天然-PAGE分析的結果，泳道3代表DEAE洗脫峰3的天然-PAGE分析的結果，泳道4和5代表DEAE洗脫峰2的SDS-PAGE分析的結果，並且泳道6和7代表DEAE洗脫峰3的SDS-PAGE分析的結果。從圖2的結果，將條帶a、b和c選作LMT候選蛋白，並且測量每一蛋白的活性。首先，將與每一條帶對應的凝膠切下，然後用勻漿器將凝膠壓碎。然後，向其中加入5mllg/L賴氨酸(終濃度500mg/L)和2mllg/L甲基供體，S-腺苷甲硫氨酸(終濃度200mg/L)，並且將得到的產物在28。C緩慢攪拌24小時進行反應，然後使用HPLC分析三甲基賴氨酸峰。圖3是顯示在蛋白條帶a、b和c與賴氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反應後通過HPLC測量三甲基賴氨酸的結果的圖表。如在圖3中所示，在與條帶a反應的樣品中，在大約15分鐘的停留時間證實為被視為三甲基賴氨酸的峰。在圖3中，1、2和3代表與每一條帶a、b和c相對應的結果。為了準確地證實所述條帶，將通過與條帶a的反應獲得的樣品與三甲基賴氨酸標準物進行比較。圖4是顯示通過HPLC分析通過與蛋白條帶a反應獲得的樣品和三甲基賴氨酸標準物的結果的圖表。如在圖4中所示，條帶a的峰時，g口，電壓具有最高值的時間，與標準三甲基賴氨酸樣品完全一致。因此，證實條帶a包括S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶，LMT。在圖4中，1和2是指分別與標準物和條帶a相對應的結果。圖2和3的每一圖表是獨立的HPLC圖表整合在其中的圖表。接下來，分析N-端序列，以獲得LMT蛋白的胺基酸序列。首先，將在SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，然後將蛋白條帶切下，以通過Edman方法分析N-端序列。特別地，異硫氰酸苯酯(PTC)與肽在pH值8-9和室溫反應，因此獲得其中N-端被硫代氨甲醯化的PTC-肽。然後，將PTC-肽在酸性條件下反應，以從中僅分離的N-端胺基酸。分離的胺基酸用乙酸乙酯提取，用HPLC鑑定，並且分析。結果，證實N-端序列為AFGKL(SEQIDNO:21)。與此相似，基於所證實的N-端胺基酸序列進行關於己知的粗糙脈孢菌的完整的基因組序列的探尋。結果，證實具有與LMT的N-端序列一致的胺基酸序列的蛋白和基因、以及核苷酸序列。(b)攜帶LMT基因的表達載體和微生物生產收集培養的粗糙脈孢菌，並且使用液氮裂解，然後使用RNA純化試劑盒純化RNA。應用關於在(a)中證實的LMT的胺基酸和鹼基序列的信息而生產SEQIDNOS:l和2的引物，然後，使用在(1)中產生的cDNA文庫，通過使用所述引物對作為引物的PCR而擴增S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶基因(圖5)。圖5是顯示通過PCR擴增的LMT基因的電泳結果的圖。將獲得的PCR產物和pT7-7載體分別用NdeI和BamHI消化，並且使用T4DNA連接酶彼此連接，以產生pT7-7LMT載體(圖6)。圖6圖示pT7-7LMT的產生過程。應用電穿孔用pT7-7LMT載體轉化大腸桿菌BL21DE3。將40(il的大腸桿菌BL21DE3和1|al的pT7-7LMT載體混和，置於具有2mm縫隙的冰冷的小杯中，並且在2.5kV,200q，和25jiF的條件下通過電穿孔進行轉化。將獲得的轉化體劃線到含有氨苄青黴素的固體平板培養基上，然後將質粒從在其中所選的轉化體純化，並且用A^feI和^w^TI消化。結果，通過證實插入的基因和質粒的大小，而證實pT7-7LMT引入到質粒中；這叫作BL21(DE3)/pT7-7LMT。(c)在大腸桿菌中表達S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶並且從賴氨酸產生三甲基賴氨酸將BL21(DE3)/pT7-7LMT在LB培養基中培養至OD600.5，然後在向其中加入1mMIPTG後再培養4小時。對培養物進行離心，並且收集細胞並使用超聲波裂解。通過對細胞裂解物進行SDS-PAGE，證實約25kD的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶(圖7)。圖7是顯示上清液的SDS-PAGE分析結果的圖，其中所述上清液通過在IPTG存在下培養含有來源於粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶的大腸桿菌並且將從中獲得的微生物裂解而獲得。在圖7中，泳道M是指標記，泳道1是指陰性對照組，泳道2和3是指細胞裂解物，並且泳道2和3中的環形部分是指在25kD位置與LMT相對應的條帶。將大腸桿菌BL21(DE3)/pT7-7LMT在其中置有含有50ml氨苄青黴素的LB培養基的裝有擋板的250ml燒瓶中培養至0D6。Q0.6，然後在向其中加入lmMIPTG後，在28。C再培養超過8小時，以形成酶的正確的三級結構，並且防止內含體的形成。在培養過程中，加入500mg/L的L-賴氨酸和200mg/L的S-腺苷甲硫氨酸作為反應溶液，並且測量培養溶液中的三甲基賴氨酸含量。結果在表1中顯示。在下述條件下通過HPLC測量三甲基賴氨酸。來源於Supelco的SUPELCOSILLC-DABS用作柱。A緩衝液這樣製備，以致將0.1%的三氟乙酸(TFA)加入到其中蒸餾水和乙腈以2:8比例混和的緩衝液中，並且B緩衝液這樣製備，以致將0.1X的TFA加入到其中蒸餾水和乙腈以2:8的比例混和的緩衝液中。使用線性濃度梯度方法，保持0.8ml/min的流速，分析三甲基賴氨酸。表l.測定的物質三甲基賴氨酸(pg/ml)大腸桿菌BL21(DE3)/pT7-7(IPTG誘導)+500mg/L賴氨酸+200mg/LAdo-Met0.0大腸桿菌BL21(DE3)/pT7-7LMT(IPTG誘導)+500mg/L賴氨酸+200mg/LAdo-Met20.0如在表1中所示，證實來源於粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶的基因在大腸桿菌中表達，並且從中將L-賴氨酸轉化成三甲基賴氨酸。(3)擴增並且克隆編碼TMLH的多核苷酸(TMLH基因)，並且證實TMLH的產生(a)擴增並且克隆編碼TMLH的多核苷酸(TMLH基因)使用包含(l)的cDNA文庫集合的;M乍為模板，並且使用SEQIDNOS:3和4作為引物進行PCR。然後，對於獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果，證實約1.4kb的需要產物。SEQIDNOS:3和4的引物包括假定編碼來源於粗糙脈孢菌的TMLH的起始密碼子和終止密碼子的序列。通過在從粗糙脈孢菌基因組表達的全蛋白的胺基酸序列和來源於人和大鼠的已知的TMLH的胺基酸序列之間進行同源性搜索而搜索來源於粗糙脈孢菌的潛在的TMLH，從潛在的TMLH的胺基酸序列設計SEQIDNOS:3和4的引物。將PCR產物用EcoRI和Sail消化，並且與用相同的酶消化的pBSKS+(StratageneInc.)連接，然後將大腸桿菌DH5a用其中插入所獲得的PCR產物的pBSKS+(TMLH)轉化。將轉化的大腸桿菌DH5ot在37°。培養8小時，然後分離pBSKS+(TMLH)，並且用EcoRI和Sall消化，以確定PCR產物是否正確插入。接著，將分離的pBSKS+(TMLH)用Ndel和Sail消化，然後在瓊脂糖凝膠電泳之後將NdeI和SalI片段分離。將所述片段與用相同的酶消化的表達載體pT7-7連接，以獲得pT7-7TMLH(參見圖8)。將pT7-7(TMLH)轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中。(b)證實TMLH產生將用獲得的pT7-7(TMLH)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)在37"C在其中置有含有100嗎/ml氨苄青黴素的50mlLB培養基的裝有擋板的250ml燒瓶中培養至OD6oo0.6，並且在向其中加入1mMIPTG之後繼續培養4個小時。將pT7-7(TMLH)從培養物分離，並且用Ndel和Sall消化，然後進行瓊脂糖凝膠電泳。結果在圖12中顯示。如在圖12中所示，證實與Ndel和Sail片段相對應的條帶(泳道2)。接著，分離pT7-7(TMLH)，並且分析TMLH的核苷酸序列。結果，TMLH的核苷酸序列證實是與在NCBI的粗糙脈孢菌基因組資料庫中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:17)。另外，在用pT7-7(TMLH)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)的培養物中證實表達的TMLH蛋白。首先，在4,000xg離心15分鐘對培養物進行離心分離，並且收集細胞沉澱。向獲得的細胞沉澱中加入1ml的裂解緩衝液(140mMNaCl，200gA甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸鈉緩衝溶液中)並且重懸。將細胞混懸液置於冰浴中，並且通過傳送超聲波5次每次IO秒而將細胞使用超聲破碎器裂解。對細胞裂解物進行離心分離，在4。C，10,000g離心20-30分鐘，然後去除細胞碎片，並且收集上清液以獲得細胞粗提物。通過收集來源於獲得的細胞粗提物的樣品而進行8%SDS-PAGE(參見圖13，泳道2)。作為進行SDS-PAGE的結果，證實與TMLH相對應的約52kDa的條帶。(3)擴增並且克隆編碼3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶(TMLA)的多核苷酸並且證實TMLA的產生(a)擴增並且克隆編碼3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶(TMLA)的多核苷酸使用包含(1)的cDNA文庫集合的入作為模板，並且使用SEQIDNOS:5和6作為引物進行PCR。然後，對於獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果，證實約1.4kb的需要產物。SEQIDNOS:5和6的引物包括編碼來源於粗糙脈孢菌的TMLA的起始密碼子和終止密碼子的序列。通過在從粗糙脈孢菌基因組表達的全蛋白的胺基酸序列和來源於人和大鼠的已知的TMLA的胺基酸序列之間進行同源性搜索而搜索來源於粗糙脈孢菌的潛在的TMLA，從潛在的TMLA的胺基酸序列設計引物SEQIDNOS:5禾口6。將PCR產物用EcoRI和Sail消化，並且與用相同的酶消化的pBSKS+(StratageneInc.)連接，然後將大腸桿菌DH5a用其中插入所獲得的PCR產物的pBSKS+(TMLA)轉化。將轉化的大腸桿菌DH5a在37'C培養8小時，然後從中分離pBSKS+(TMLA)，並且用EcoRI和Sail消化，以確定PCR產物是否正確插入。接著，將分離的pBSKS+(TMLA)用Ndel和Sail消化，然後在瓊脂糖凝膠電泳之後將Ndel和Sail片段分離。將所述片段與用相同的酶消化的表達載體pT7-7連接，以獲得pT7-7(TMLA)(參見圖9)。將大腸桿菌BL21(DE3)用pT7-7(TMLA)轉化。(b)證實TMLA產生將用獲得的pT7-7(TMLA)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)在37。C在其中置有含有100嗎/ml氨苄青黴素的50mlLB培養基的裝有擋板的250ml燒瓶中培養至OD6oo0.6，並且在向其中加入ImMIPTG之後繼續培養4個小時。將pT7-7(TMLA)從培養物分離，並且用Ndel和Sail消化，然後進行瓊脂糖凝膠電泳。結果在圖12中顯示。如在圖12中所示，證實與Ndel和Sail片段相對應的條帶(泳道3)。接著，分離pT7-7(TMLA)，並且分析TMLA的核苷酸序列。結果，TMLA的核苷酸序列證實是與在NCBI的粗糙脈孢菌基因組資料庫中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:18)。另外，在用pT7-7(TMLA)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)的培養物中證實表達的TMLA蛋白。首先，在4,000xg離心15分鐘對培養物進行離心分離，並且收集細胞沉澱。向獲得的細胞沉澱中加入lml的裂解緩衝液(140mMNaCl,200g/l甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸鈉緩衝溶液中)並且重懸。將細胞混懸液置於冰浴中，並且通過傳送超聲波5次每次10秒而將細胞使用超聲破碎器裂解。對細胞裂解物進行離心分離，在4。C，10,000g離心20-30分鐘，然後去除細胞碎片，並且收集上清液以獲得細胞粗提物。通過收集來源於獲得的細胞粗提物的樣品而進行8%SDS-PAGE(參見圖13，泳道3)。作為進行SDS-PAGE的結果，證實與TMLA相對應的約53kDa的條帶。(4)擴增並且克隆編碼Y-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)的多核苷酸並且證實TMABADH的產生(a)擴增並且克隆編碼Y-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)的多核苷酸使用包含(1)的cDNA文庫集合的"乍為模板，並且使用SEQIDNOS:7和8作為引物進行PCR。然後，對於獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果，證實約1.5kb的需要產物。SEQIDNOS:7和8的引物包括編碼來源於粗糙脈孢菌的TMABDH的起始密碼子和終止密碼子的序列。通過在從粗糙脈孢菌基因組表達的全蛋白的胺基酸序列和來源於人和大鼠的已知的TMABADH的胺基酸序列之間進行同源性搜索而搜索來源於粗糙脈孢菌的潛在的TMABADH，並且從潛在的TMABADH的胺基酸序列設計引物SEQIDNOS:7和8。將PCR產物用EcoRI和Sail消化，並且與用相同的酶消化的pBSKS+(StratageneInc.)連接，然後將大腸桿菌DH5a用其中插入所獲得的PCR產物的pBSKS+(TMABADH)轉化。將轉化的大腸桿菌DH5a在37。C培養8小時，然後從中分離pBSKS+(TMABADH)，並且用EcoRI和Sail消化，以確定PCR產物是否正確插入。接著，將分離的pBSKS+(TMABADH)用Ndel和SalI消化，然後在瓊脂糖凝膠電泳之後將NdeI和Sail片段分離。將所述片段與用相同的酶消化的表達載體pT7-7連接，以獲得pT7-7(TMABADH)(參見圖10)。將大腸桿菌BL21(DE3)用pT7-7(TMABADH)轉化。(b)證實TMABADH產生將用獲得的pT7-7(TMABADH)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)在37'C在其中置有含有氨節青黴素的50mlLB培養基的裝有擋板的250ml燒瓶中培養至OD6。。0.6，並且在向其中加入1mMIPTG之後繼續培養4個小時。將pT7-7(TMABADH)從培養物分離，並且用Ndel和Sail消化，然後進行瓊脂糖凝膠電泳。結果在圖12中顯示。如在圖12中所示，證實與Ndel禾卩Sail片段相對應的條帶(泳道4)。接著，分離pT7-7(TMABADH)，並且分析TMLH的核苷酸序列。結果，TMABADH的核苷酸序列證實是與在NCBI的粗糙脈孢菌基因組資料庫中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:19)。另夕卜，在用pT7-7(TMABADH)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)的培養物中證實表達的TMABADH蛋白。首先，對培養物進行離心分離，在4,000xg離心15分鐘，並且收集細胞沉澱。向獲得的細胞沉澱中加入1ml的裂解緩衝液(140mMNaCl,200g/1甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸鈉緩衝溶液中)並且重懸。將細胞混懸液置於冰浴中，並且通過傳送超聲波5次每次10秒而將細胞使用超聲破碎器裂解。對細胞裂解物進行離心分離，在4。C，10,000g離心20-30分鐘，然後去除細胞碎片，並且收集上清液以獲得細胞粗提物。通過收集來源於獲得的細胞粗提物的樣品而進行8%SDS-PAGE(參見圖13)。作為進行SDS-PAGE的結果，證實與TMABADH相對應的約55kD的條帶。(5)擴增並且克隆編碼Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)的多核苷酸並且證實BBH的產生(a)擴增並且克隆編碼Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)的多核苷酸使用包含(1)的cDNA文庫集合的X作為模板，並且使用SEQIDNOS:9和IO作為引物進行PCR。然後，對於獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果，證實約1.3kb的需要產物。SEQIDNOS:9和10的引物包括假定編碼來源於粗糙脈孢菌的BBH的起始密碼子和終止密碼子的序列。通過在從粗糙脈孢菌基因組表達的全蛋白的胺基酸序列和來源於人和大鼠的已知的BBH的胺基酸序列之間進行同源性搜索而搜索來源於粗糙脈孢菌的潛在的BBH，並且從潛在的BBH的胺基酸序列設計引物SEQIDNOS:9和10。將PCR產物用EcoRI和Sail消化，並且與用相同的酶消化的pUC19連接，然後將大腸桿菌DH5a用其中插入所獲得的PCR產物的pUC19(BBH)轉化。將轉化的大腸桿菌DH5a在包含100嗎/ml氨苄青黴素的LB培養基中在37。C培養8小時，然後從中分離pUC19(BBH)，並且用EcoRI和Sail消化，以確定PCR產物是否正確插入。接著，將分離的pUC19(BBH)用Ndel和Sail消化，然後在瓊脂糖凝膠電泳之後將Ndel和Sail片段分離。將所述片段與用相同的酶消化的表達載體pT7-7連接，以獲得pT7-7(BBH)(參見圖11)。將大腸桿菌BL21(DE3)用pT7-7(BBH)轉化。將用獲得的pT7-7(BBH)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)在37"在其中置有含有100嗎/ml氨苄青黴素的50mlLB培養基的裝有擋板的250ml燒瓶中培養至OD6。o0.6，並且在向其中加入1mMIPTG之後繼續培養4個小時。將pT7-7(BBH)從培養物分離，並且用Ndel和Sail消化，然後進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。結果在圖12中顯示。如在圖12中所示，證實與Ndel和Sail片段相對應的條帶(泳道5)。接著，分離pT7-7(BBH)，並且分析BBH的核苷酸序列。結果，BBH的核苷酸序列證實是與在NCBI的粗糙脈孢菌基因組資料庫中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:20)。(b)證實BBH蛋白的產生在用pT7-7(BBH)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)的培養物中證實表達的BBH蛋白。首先，在4,000xg離心15分鐘，對培養物進行離心分離，並且收集細胞沉澱。向獲得的細胞沉澱中加入1ml的裂解緩衝液(140mMNaCl,200g/l甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸鈉緩衝溶液中)並且重懸。將細胞混懸液置於冰浴中，並且通過傳送超聲波5次每次10秒而將細胞使用超聲破碎器裂解。對細胞裂解物進行離心分離，在4°C，10,000g離心20-30分鐘，然後去除細胞碎片，並且收集上清液以獲得細胞粗提物。通過收集來源於獲得的細胞粗提物的樣品而進行8。％SDS-PAGE(參見圖13，泳道5)。作為進行SDS-PAGE的結果，證實與BBH相對應的約49kDa的條帶。實施例2:產生包含所有的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH基因的宿主細胞擴增來源於在實施例1中產生的粗糙脈孢菌cDNA文庫的LMT、TMLH和BBH基因，並且產生具有所有這三種基因的pT7-7ABE。另夕卜，產生來自實施例1中產生的粗糙脈孢菌cDNA文庫的TMLA和TMABADH基因，並且產生具有所有這兩種基因的pACYC184-CarCD。將所產生的pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD用於大腸桿菌，以產生具有所有的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH基因的轉化的微生物。將所轉化的微生物叫做大腸桿菌BL21(DE3)CJ2004-2，並且於2004年12月13日保藏在韓國微生物保藏中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms,KCCM)，一個國際保藏機構(保藏號KCCM-10638)。(1)產生具有所有三種基因LMT、TMLH和BBH的PT7-7-CarABE首先，使用來源於粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板，並且使用SEQIDNOS:1和2的寡核苷酸作為引物，從T7啟動子擴增包含終止密碼子的lmt。接著，使用來源於粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板，並且使用SEQIDNOS:3和4的寡核苷酸作為引物，從T7啟動子擴增包含終止密碼子的TMLH。然後，使用寡核苷酸SEQIDNOS:9和10作為引物，從T7啟動子擴增包含終止密碼子的BBH。將LMT、TMLH和BBH的擴增產物引入到pT7-7中。首先，將BBH的擴增產物用限制性酶諸如BamHI和SalI消化，並且從中獲得BamHI和SalI片段，然後，將所述片段與用相同的酶消化的pT7-7連接，以獲得pT7-7BBH。接著，將TMLH的擴增產物用NdeI和EcoRl消化，並且從中獲得NdeI和EcoRI片段，然後，將所述片段與用相同的酶消化的pT7-7BBH連接，以獲得pT7-7CarBE。然後，將LMT的擴增產物用ClaI消化，並且從中獲得ClaI片段，然後，將所述片段與用相同的酶消化的lmt連接，以獲得pT7-7CarABE(參見圖14)。(2)產生具有所有基因TMLA和TMABADH的pACYC184CarCD首先，使用來源於粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板，並且使用SEQIDNOS:5和6的寡核苷酸作為引物，從T7啟動子擴增包含終止密碼子的TMLA。接著，使用來源於粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板，並且使用SEQIDNOS:7和8的寡核苷酸作為引物，從T7啟動子擴增包含終止密碼子的TMABADH。將TMLA禾BTMABADH的擴增產物引入到pACYC184中。首先，將TMLA的擴增產物用BamHI和HindIII消化，並且從中獲得Bamffl和Hindm片段，然後，將所述片段與用相同的酶消化的pACYC184連接，以獲得pACYC184TMLA。接著，將TMABADH的擴增產物用BamHI和Sail消化，並且從中獲得BamHI和Sail片段，然後，將所述片段與用相同的酶消化的pACYC184TMLA連接，以獲得pACYC184CarCD。實施例3:使用包含編碼LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸的微生物生產L-肉鹼將其中弓I入在實施例2中產生的pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者的大腸桿菌BL21(DE3)在含有L-賴氨酸的培養基中培養，並且測量L-肉鹼的產量。pT7-7-CarABE禾卩pACYC184-CarCD引入大腸桿菌BL21(DE3)應用如實施例1所述的電穿孔進行。(1)通過培養用在實施例2中產生的。T7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者轉化的大腸桿菌BL21(DE3)而生產L-肉鹼首先，將用pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者轉化的大腸桿菌BL21(DE3)接種在含有氨節青黴素(100嗎/ml)和氯黴素(50嗎/ml)的LB固體平板培養基中，並且進行培養。將在固體平板培養基上的微生物菌落在含有20mlLB培養基的燒瓶中在37。C培養12小時至OD細1.0，其中所述LB培養基中加入氨苄青黴素(100嗎/ml)和氯黴素(50pg/ml)。將0.1ml所培養的微生物的培養物接種到裝有擋板的250ml燒瓶中，其中含有具有2mML-賴氨酸的20mlLB培養基，並且接著在37。C培養至OD,0.6。當加入IPTG時，在OD6oo值達到0.6後加入1mMIPTG，然後將微生物繼續培養4個小時。將在無L-賴氨酸的LB培養基中培養所述微生物應用上文所述的相同方法用IPTG誘導的組，和在含有L-賴氨酸的LB培養基中培養所述微生物不用IPTG誘導的組，用作對照組。在培養終止後，使用如(1)中相同的方法確定培養物的L-肉鹼含量。結果在表2中顯示。表2.通過單一培養物生產L-肉鹼培養條件濃度(mg/1)LB培養基(IPTG誘導)0含有2mM賴氨酸的LB培養基(無IPTG誘導)0,14含有2mM賴氨酸的LB培養基(IPTG誘導)19.81如表2所示，通過在含有L-賴氨酸的培養基中培養含有編碼LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的所有多核苷酸的微生物，能夠以高效率生產L-肉鹼。另外，在表2中表示的L-肉鹼產量之間相互比較，並且證實當在含有賴氨酸的培養基中培養時L-肉鹼具有更高的產率。tableseeoriginaldocumentpage22涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細貝iJ136&)tableseeoriginaldocumentpage22PCR/RO/134表(1998年7月)權利要求1.一種屬於腸桿菌科(Enterobacteriacae)屬的微生物，所述微生物包含編碼來源於粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶活性的多核苷酸；編碼6-N-三甲基賴氨酸羥化酶活性的多核苷酸；編碼3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶活性的多核苷酸；和編碼γ-三甲基氨基醛脫氫酶活性的多核苷酸與編碼γ-丁醯甜菜鹼羥化酶活性的多核苷酸。2.權利要求1的微生物，其中所述微生物為大腸桿菌(&c/^Wc/n'fl3.權利要求1的微生物，其中所述微生物為大腸桿菌(保藏號:KCCM-10638)。4.權利要求1的微生物，其中所述編碼8-腺苷甲硫氨酸-6-]^-賴氨酸-甲基轉移酶(LMT)活性的多核苷酸是編碼SEQIDNO:11的胺基酸序列的多核苷酸。5.權利要求1的微生物，其中所述編碼6-N-三甲基賴氨酸羥化酶(TMLH)活性的多核苷酸是編碼SEQIDNO:12的胺基酸序列的多核苷酸。6.權利要求1的微生物，其中所述編碼3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶(TMLA)活性的多核苷酸是編碼SEQIDNO:13的胺基酸序列的多核苷酸。7.權利要求1的微生物，其中所述編碼Y-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)活性的多核苷酸是編碼SEQIDNO:14的胺基酸序列的多核苷酸。8.權利要求1的微生物，所述編碼Y-丁醯甜菜鹼羥化酶(BBH)活性的多核苷酸是編碼SEQIDNO:15的胺基酸序列的多核苷酸。9.一種生產L-肉鹼的方法，所述方法包括在底物的存在下培養權利要求1至權利要求8中任何一項的微生物以在所述培養物中生產L-肉鹼，所述底物選自由下列各項組成的組L-賴氨酸，N-三甲基賴氨酸，(3-羥基-N-三甲基賴氨酸，Y-N-三甲基氨基丁酸，"丁醯甜菜鹼，及其混合物。10.權利要求9的方法，其中所述底物的濃度為基於培養基重量的O.l至10重量％，所述底物選自由下列各項組成的組L-賴氨酸，N-三甲基賴氨酸，(3-羥基-N-三甲基賴氨酸，Y-N-三甲基氨基丁醛，Y-丁醯甜菜鹼，及其混合物。全文摘要本發明提供一種屬於腸桿菌科的微生物和應用其生產L-肉鹼的方法。所述微生物包含編碼來源於粗糙脈孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-賴氨酸-甲基轉移酶活性的多核苷酸，編碼6-N-三甲基賴氨酸羥化酶活性的多核苷酸，編碼3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶活性的多核苷酸，和編碼γ-三甲基氨基醛脫氫酶與γ-丁醯甜菜鹼羥化酶活性的多核苷酸。文檔編號C12N1/20GK101213293SQ200680024000公開日2008年7月2日申請日期2006年7月7日優先權日2005年7月7日發明者姜歡求,崔惠真,朱哉映,樸英薰,李炳旭,李真浩,金蕙園,高恩聖申請人:Cj第一製糖株式會社