病理TAU蛋白的免疫靶向的製作方法
2023-07-10 13:16:16
本申請要求2009年6月10日提交的美國臨時專利申請序列No61/185,895的權益，其由此以引用的方式全部併入本文。本發明的主題在來自美國政府的支持在國家衛生研究院下進行，授權No.AG032611。美國政府享有某些權利。
技術領域：
本發明涉及用於在受試者中預防、治療和診斷阿爾茨海默病和相關的tau蛋白病(tauopathy)、以及抑制神經原纖維纏結和/或它們的病理tau前體積聚的免疫學方法和組合物。
背景技術：
：新興的阿爾茨海默病(AD)治療方法是清除β-澱粉樣蛋白(Aβ)的免疫治療。在AD和額顳葉失智症中，另一個重要標誌是神經原纖維纏結和/或它們的病理tau蛋白構象異構體，它們的存在於痴呆程度非常有關係(TerryR.，″NeuropathologicalChangesinAlzheimerDisease，″ProgBrainRes.101：383-390(1994)；GoedertM.，″TauProteinandNeurodegeneration，″SeminCellDevBiol.15∶45-49(2004))。tau病理免疫治療的目的是，抗-tau抗體能清除可影響神經元活性的tau蛋白聚集。其他免疫系統的成分可在所述清除過程中發揮作用。tau是可溶性蛋白，其可以促進微管蛋白組裝、微管穩定性和細胞骨架完整性。雖然根據唐氏症候群研究，tau病理有可能是在Aβ聚集之後發生，但對AD腦和小鼠模型的分析表明這些病狀是具有協同性的(Sigurdssonetal.，″LocalandDistantHistopathologicalEffectsofUnilateralAmyloid-beta25-35InjectionsintotheAmygdalaofYoungF344Rats，″NeurobiolAging17：893-901(1996)；Sigurdssonetal.，″BilateralInjectionsofAmyloid-β25-35intotheAmygdalaofYoungFischerRats：Behavioral，Neurochemical，andTimeDependentHistopathologicalEffects，″NeurobiolAging18：591-608(1997)；Lewisetal.，″EnhancedNeurofibrillaryDegenerationinTransgenicMiceExpressingMutantTauandAPP，″Science293(5534)：1487-91(2001)；Gotzetal.，″FormationofNeurofibrillaryTanglesinP301LTauTransgenicMiceInducedbyA-beta42Fibrils，″Science293：1491-1495(2001)；Delacourteetal.，″NonoverlappingbutSynergeticTauandAPPPathologiesinSporadicAlzheimer′sDisease，″Neurology.59：398-407(2002)；Oddoetal.，″AbetaImmunotherapyLeadstoClearanceofEarly，ButNotLate，HyperphosphorylatedTauAggregatesViatheProteasome，″Neuron43：321-332(2004)；Ribeetal.，″AcceleratedAmyloidDeposition，NeurofibrillaryDegenerationandNeuronalLossinDoubleMutantAPP/TauTransgenicMice，″NeurobiolDis.(2005))。因此，以兩種病理為目標可顯著提升治療效果。迄今，沒有在AD中觀察到tau突變，然而在中額顳葉失智症中，在染色體17(FTDP-17)上的突變是該疾病的誘發因素，其進一步支持基於tau蛋白的治療方案(Poorkajetal.，″TauisaCandidateGeneforChromosome17FrontotemporalDementia，″AnnNeurol.43：815-825(1998)；Spillantinietal.，″FrontotemporalDementiaandParkinsonismLinkedtoChromosome17：ANewGroupofTauopathies，″BrainPathol.8：387-402(1998))。表達突變的轉基因小鼠已經發展出很多該疾病的方面，並且該小鼠對於研究tau病理相關的神經變性的發病機理和評估潛在的療法來說，是有價值的工具。這些模型中的一種，P301L小鼠模型(Lewisetal.，″NeurofibrillaryTangles，AmyotrophyandProgressiveMotorDisturbanceinMiceExpressingMutant(P301L)TauProtein，″NatGenet.25：402-405(2000))，概括了很多額顳葉失智症的特徵，雖然tau蛋白聚集的CNS分布主要地導致了感覺運動異常，其使認知評價複雜化。純合系小鼠模型具有中樞神經病和有關的功能損傷的及早發作，這種特點使它們理想地用於最初評估免疫治療、病理tau構象異構體靶向的可行性。其他tau-相關的治療方案包括：(1)抑制激酶或激活磷酸酶(影響tau磷酸化的狀態)的藥物(Iqbaletal.，″InhibitionofNeurofibrillaryDegeneration：APromisingApproachtoAlzheimer′sDiseaseandOtherTauopathies，″CurrDrugTargets5：495-502(2004)；Nobleetal.，InhibitionofGlycogenSynthaseKinase-3byLithiumCorrelateswithReducedTauopathyandDegenerationInVivo，″ProeNatlAcadSciUSA102：6990-6995(2005))；(2)微管穩定藥物(Michaelisetal.，{beta}-Amyloid-InducedNeurodegenerationandProtectionbyStructurallyDiverseMicrotubule-StabilizingAgents，″JPharmacolExpTher.312∶659-668(2005)；Zhangetal.，″Microtubule-BindingDrugsOffsetTauSequestrationbyStabilizingMicrotubulesandReversingFastAxonalTransportDeficitsinaTauopathyModel，″ProcNatlAcadSciUSA102：227-231(2005))；(3)幹擾tau蛋白聚集體的化合物(Pickhardtetal.，″AnthraquinonesInhibitTauAggregationandDissolveAlzheimer′sPairedHelicalFilamentsInVitroandinCells，″JBiolChem.280：3628-3635(2005))；和(4)促進熱休克蛋白調節tau蛋白清除的藥物(Dickeyetal.，″DevelopmentofaHighThroughputDrugScreeningAssayfortheDetectionofChangesinTauLevels--ProofofConceptwithHSP90Inhibitors，″CurrAlzheimerRes.2：231-238(2005))。雖然全部這些方案肯定值得繼續做，但靶向特異性和毒性是一個關注事項，其強調了同時研發其他tau-靶向治療的重要性，例如免疫治療。本發明涉及克服在本領域這些的和其他的缺點。發明概述本發明的第一個方面涉及在受試者中預防或治療阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的方法。該方法包括有效治療或預防受試者的阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的條件下，向受試者施用任一種或多種免疫原性tau肽，其含有選自由SEQIDNO：2-75組成的組的胺基酸序列，或一種或多種抗體，其識別免疫原性tau表位(包含選自由SEQIDNO：2-75和101-103組成的組的胺基酸序列)。另外一個本發明的方面涉及促進從受試者腦中清除tau蛋白聚集的方法。該方法包括在有效於促進從受試者腦中清除tau蛋白聚集的條件下，向受試者施用任一種或多種免疫原性tau肽，其含有選自由SEQIDNO：2-75組成的組的胺基酸序列，或一種或多種抗體，其識別免疫原性tau表位(包含選自由SEQIDNO：2-75和101-103組成的組的胺基酸序列)。本發明的第3個方面涉及減緩tau病理相關的行為表型進展的方法。該方法包括在有效減緩受試者的tau病理相關的行為表型的條件下，向受試者施用任一種或多種免疫原性tau肽，其含有選自由SEQIDNO：2-75組成的組的胺基酸序列，或一種或多種抗體，其識別免疫原性tau表位(包含選自由SEQIDNO：2-75和101-103組成的組的胺基酸序列)。本發明的第4個方面涉及分離的tau肽，其包含選自由SEQIDNO：2-75和101-103組成的組的胺基酸序列。免疫原性tau肽在受試者中，是有效預防和治療阿爾茨海默病或其他tau蛋白病，促進從受試者腦清除聚集，並且在受試者中減緩tau病理相關的行為表型的進展。對於預防和治療阿爾茨海默病和其他tau-相關的神經變性病，神經原纖維纏結和它們的病理TAU蛋白構象異構體是非常重要的目標。然而，對於靶向和清除神經原纖維纏結和/或病理tau構象異構體，缺乏一種高靶向特異性和少到沒有的毒性的策略。如本文所述，設計免疫原性tau肽和抗體以克服這些缺點。因為本發明的免疫原性tau肽，模擬病理tau的狹義磷酸基-表位，和識別這些相同的狹義磷酸基-表位的抗體，以獲得提高的專一性和安全性。本方案也應用於針對游離的病理tau片段的N-或C-末端產生的如本文所述的抗體。相應地，使用如本文所述的免疫治療，能對病理TAU蛋白產生強烈免疫應答，同時對正常tau蛋白產生不利免疫應答的風險極小。附圖簡述圖1A-1B描述在JNPL3P301L纏結小鼠模型中，對本發明的免疫原性tau肽的免疫應答。2-3個月齡的小鼠以2周為間隔接受最初2次免疫，其後每月接受一次。為評估抗體應答，在首次免疫之前給小鼠抽血，其後定期地在疫苗施用後1周給小鼠抽血，並且在8-9個月齡時處死小鼠以獲得組織。如在圖1A和1B中所示，在第6次免疫(T3)1周後，以及在被處死的8-9個月齡時(Tf＝T最終)，測定IgG和IgM。圖1A顯示：用通過GPSL接頭連接於破傷風毒素T輔助細胞表位(TT947-967)的Tau210-216[P-Thr212-Ser214](SEQIDNO：2)免疫JNPL3P301L小鼠，在該小鼠中產生強烈IgG和IgM免疫應答。圖1B顯：針對破傷風毒素表位產生了強烈的抗體應答，這由以下測試所示，IgG和IgM結合於通過GPSL連接於TT947-967的無關的tau蛋白表位Tau260-264[P-Ser262]。ELISA板塗有0.5μg每孔的肽和稀釋至1∶200的血漿。圖2A-2C顯示：用通過GPSL接頭連接於破傷風毒素T輔助細胞表位(TT947-967)的Tau260-264[P-Ser262](SEQIDNO：3)(也是指T299肽)免疫JNPL3P301L纏結小鼠，該小鼠對免疫原產生了強烈IgG應答。圖2A顯示：用Tau260-264[P-Ser262]肽免疫之後，小鼠中的IgG抗體應答。如上所述，小鼠以2周間隔接受最初的兩次免疫，其後從2-3月齡至8-9月齡每月接受免疫。圖2B顯示：對破傷風毒素表位產生了大量抗體應答，這由以下測試所示，IgG結合於不相關的通過GPSL連接於TT947-967的tau蛋白表位Tau210-216[P-Thr212-Ser214]。圖2c顯示：對tau蛋白表位產生了大量抗體應答，這由以下測試所示，IgG結合於更大的含有Tau260-264[P-Ser262]區域的tau蛋白表位Tau240-270[P-Ser262]。ELISA板塗有0.5μg每孔的肽和稀釋至1∶200的血漿。TO-T最終，分別在接種疫苗之前(T0)，第三次(T1)、第六次(T2)、第七次(T3)免疫後一周，和在獲取組織(Tf)時，對小鼠抽血。圖3顯示：在用連接於破傷風毒素T輔助細胞表位(TT947-967]的Tau229-237[P-Thr231-Ser235](SEQIDNO：4)免疫的JNPL3P301L纏結模型小鼠中，產生了強烈抗體(IgG)應答。從2-3月齡開始免疫小鼠，2周間隔，其後每月免疫，並且在第三次免疫後一周(T1)抽血。ELISA板塗有0.5μg每孔的肽和稀釋至1∶200的血漿。圖4顯示：在用明礬佐劑中的磷酸化的免疫原Tau379-408[Asp396，404](SEQIDNO：57)免疫的JNPL3P301L纏結模型小鼠中，產生了強烈抗體(IgG)應答。重要地，這些抗體識別磷醯基-表位Tau379-408[P-Ser396，404]，並達到相似的程度。從2-3月齡開始對小鼠免疫，最初兩次以2周為間隔，其後每月免疫。在獲取8-9月齡小鼠的組織時，對小鼠抽血(Tf)。ELISA板塗有0.5μg每孔的肽和稀釋至1∶200的血漿圖5A-5B顯示：在Tau免疫治療之後，在纏結小鼠模型的腦幹(圖5)和齒狀回(圖5B)中觀察到病理tau減少。用T299(Tau260-264[P-Ser262](SEQIDNO：3))免疫純合JNPL3tauP301L小鼠，該T299通過GPSL接頭序列連接於破傷風毒素T輔助細胞表位。通過PHF1抗體免疫染色來評估在腦幹和齒狀回中的病理tau。PHF1是識別tau的單克隆抗體，該tau在C-末端的絲氨酸胺基酸404和396上是磷酸化的(Greenbergetal.，「HydrofluoricAcid-TreatedTauPHFProteinsDisplaytheSameBiochemicalPropertiesasNormalTau，」JBiolChem267：564-569(1992)，其由此以引用的方式全部併入本文)。相比只施用佐劑的對照，在用T299肽積極免疫動物的腦幹和齒狀回中，觀察到病理tau染色蛋白的顯著減少。圖6顯示：用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404](SEQIDNO：82)免疫原性肽免疫對htau/PS1進行免疫，使在梨狀皮質中的tau蛋白聚集數量減少56％。在免疫組和對照組之間觀察到顯著的差異(單因素ANOVA，p＜0.01)。析因分析也顯示免疫的htau/PS1小鼠區別於它們的htau/PS1對照(p＜0.01)。**p＜0.01。圖7A-7B顯示：Tau免疫治療在纏結小鼠模型中預防功能損傷。使用通過GPSL接頭序列連接於破傷風毒素輔助T細胞表位(TT947-967)的磷酸化免疫原性Tau299肽(Tau260-264[P-Ser262](SEQIDNO：3))，免疫純合JNPL3P301L小鼠。對照動物只施用佐劑。利用在8月齡時的橫梁測試評估預防功能損傷的Tau260-264[P-Ser262]肽疫苗施用效果，結果顯示相對於對照動物，免疫的動物錄得更少量的失足(圖7A)。另外，通過在5-6月齡和在8-9月齡時的轉杆測試，評估預防功能損傷的Tau260-264[P-Ser262]肽疫苗施用效果(圖7B)。圖8A-8B顯示：用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404](SEQIDNO：82)對htau/PS1小鼠的免疫提高在八臂迷宮(圖8A)和目標識別測試中的表現(圖8B)。如圖8A所示，在八臂迷宮測試中，在免疫組合對照組之間觀察到顯著差異(兩因素ANOVA重複測量，p<0.0001)。Neuman-Keuls析因檢驗顯示：在所有天內，免疫的htau/PS1小鼠比對照htau/PS1小鼠表現更好(即，更少犯錯)(p＜0.01-0.001)。在目標識別測試中，在各組之間觀察到顯著差異(單因素ANOVA，p＝0.005)(圖8B)。Neuman-Keuls析因檢驗顯示：免疫的htau/PS1小鼠比相同的對照小鼠具有更好的短期記憶(p<0.01)。這充分確定相對於舊的目標，認知正常的小鼠用大約它們的70％時間在新目標上。**p＜0.01。圖9A-9C顯示：用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404](SEQIDNO：82)對htau/PS1小鼠的免疫提高在封閉域對稱迷宮測試中的表現。在每個迷宮測試中，在免疫組合對照組之間觀察到關於犯錯次數的顯著差異9A-9C(單因素ANOVA，迷宮A：p＜0.001，迷宮B：p＜0.0001，迷宮C：p＜0.01)。析因分析顯示：處理過的htau/PS1組比它們相同的對照小鼠表現更好(htau/PS1對照)(迷宮A：p＜0.01，迷宮B，C：p＜0.001)。析因分析也發現在一些其他組之間的隨迷宮而定的顯著差異，但這些差異缺乏關聯性，因而不在這裡詳述。錯誤次數顯示，這三個迷宮的複雜性依次上升(注意Y軸刻度不同)。**p＜0.01，***p＜0.001。圖10A-10F中圖表描述：在用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404](SEQIDNO：82)免疫的htau/PS1小鼠和相應的對照中，通過western印跡分析檢測到的可溶性和不溶性tau(總tau和病理Tau)的水平。相對於總tau，Tau免疫治療使病理Tau降低35-43％(圖10C和10D)。如用B19抗體測試所示，免疫治療不影響總tau水平，這對本方法安全性重要(圖10A和10B)。相對於htau/PS1對照，PHF1可溶性tau顯著降低(p＜0.001)而且可溶性tau比例(PHF1/總tau)降低35％(p＜0.05)(圖10E)。在PHF1不溶性tau中也觀察到強烈的下降趨勢(p＝0.06)，並且不溶性tau比例(PHF1/總tau)降低43％(p＝0.08)(圖10F)。*p＜0.05，***p＜0.001圖11A-11C顯示：靶向磷酸化tau396和404表位的被動免疫治療預防功能衰退，以及在P301L纏結小鼠中降低蛋白病。圖11A的圖表顯示：由IgG注射的對照和PHF1免疫的P301L小鼠在橫梁測試中發生的失足次數的顯著差異，當穿越橫梁時對照動物具有更多失足(聯合試驗，p＝0.03)。圖11B的圖表顯示：在免疫的和對照P301L小鼠的齒狀回中的tau免疫染色的比例。相比對照，PHF1免疫的P301L小鼠在齒狀回中PHF1染色的tau病理少58％(p＝0.02)。如圖11C所示，在血漿中的PHF-1抗體(μg/μL)數量在2周之內下降4倍。在對照中沒有觀察到可檢測的抗體，而免疫的動物中的該水平隨時間推移而下降。這裡有免疫的小鼠的平均值。T0：首次免疫之前、T1：第12次注射後24h、T2：第13次和最後一次注射後7天、T3：最後注射後14天。ELISA板塗有Tau379-408[P-Ser396，404]。圖12A-12B的圖表顯示：PHF1抗體和tau病理的血漿水平的逆相關。在腦幹中觀察到顯著相關(圖12A；p＜0.01)，以及在皮層運動區中觀察到相關性的強烈趨勢(圖12B；p＝0.06)。圖13A-13B的圖表描述：針對免疫原性tau肽產生單克隆抗體，該免疫原性tau肽包含胺基酸386-408(SEQIDNO：13)，並含有在第396和404的胺基酸上磷酸化的絲氨酸的表位。如圖13A所示，針對免疫原Tau-386-408[P-Ser396，404]tau位點(紅)，產生非常強的效價，這由血漿系列稀釋檢測而知。血漿抗體優選地識別磷醯基-Ser404表位(藍)和非-磷醯基表位(白)。磷醯基-Ser396表位(綠)被識別的程度較低。檢測到大量強陽性克隆(＞50)。其中，選擇8個磷醯基-特異性克隆用於第一次亞克隆(圖13B)。所有都顯示出穩定，並且選擇其中3個用於第二次亞克隆(全部IgG1)。從不特異性識別磷酸化-表位的克隆中，選擇6個用於初次亞克隆。所有都顯示出穩定，並且選擇其中3個用於第二次亞克隆亞克隆(IgG1、IgG2a和IgM)。圖14A-14B的圖表顯示：第三次亞克隆後，通過ELISA，測定表位結合於穩定的磷醯基-特異性(圖14A)和非-磷醯基-特異性(圖14B)Tau-386-408[P-Ser396，404]抗體克隆。從中選擇磷醯基-特異性單克隆抗體用於進一步亞克隆，6個中的4個維持它們對磷醯基-Ser404表位的特異性(參見圖14A中的克隆1F12C2、1F12G6、4E6E3，和4E6G7)。另外2個克隆具有較差的磷醯基-特異性(8B2D1)或非-特異性(8B2D4)(圖14A)。在進一步亞克隆後，非-磷醯基-特異性單克隆抗體中的6B2E9和6B2G12尤其地維持它們的非-特異性(圖14B)。在培養上清液的1∶810稀釋液中獲得所示數據。圖15A-15B中的western印跡顯示：4個Tau-386-408[P-Ser396，404]磷醯基-特異性(圖15A)和非-磷醯基-特異性(圖15B)單克隆抗體克隆與來自JNPL3P301L小鼠和野生型(Wt)小鼠的腦勻漿的反應。4個磷醯基-特異性克隆中的4E6G7顯示最強的反應，這與圖14A的ELISA結果一致。與也識別tauP-Ser396，404表位的PHF-1抗體不同，相比Wt勻漿，所有克隆更好地與JNPL3P301L腦勻漿反應。如預料的一樣，非-磷醯基-特異性克隆反應更快，正如多數tau是非-磷酸化的。圖16A-16B顯示：針對包含胺基酸260-271(SEQIDNO：12)並含有磷酸化絲氨酸262表位的免疫原性tau肽，產生單克隆抗體。如圖16A所示，針對免疫原Tau260-271[P-Ser262](紫)產生強的效價，但血漿抗體也識別非-磷醯基肽Tau260-271(No-P；白)。選擇8個穩定的磷醯基-特異性克隆用於進一步分析(圖16B)。圖17中的western印跡顯示：3個磷醯基-特異性Tau260-271[P-Ser262]單克隆抗體克隆的反應性。相比其他磷醯基-特異性克隆，2C11抗體克隆識別更高分子量帶，而且它不區分野生型和P301L組織。5F7D10和5F7E9是其他克隆的代表。Tau-5識別總tau並別結合於在tau胺基酸216-227附近的表位。CP27識別人類tau而不是鼠tau。圖18A-18E的免疫組織化學顯微照片顯示：在P301L纏結小鼠腦切片中，利用5F7D10抗體克隆檢測tau病理。在P301L腦切片中，相對於野生型(圖18B)，5F7D10單克隆抗體顯示強組織染色(圖18A)。在同樣的纏結小鼠中，PHF1抗體篩選tau病理(圖18C)，雖然它的圖案與5F7D10抗體的圖案是不一樣的，但這也不奇怪，因為他們識別不同的tau表位。圖18D是圖18A方框區域的放大圖，其描述了帶有聚集的tau的神經元。圖18E是利用5F7D10檢測的纏結-樣病狀(在不同JNPL3P301L小鼠中)的更高的放大圖。發明詳述本發明的第一個方面涉及在受試者中預防或治療阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的方法。該方法包括在有效治療或預防受試者的阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的條件下，向受試者施用任一種或多種免疫原性tau肽，其具有選自由SEQIDNO：2-75組成的組的胺基酸序列，或一種或多種抗體，其識別免疫原性tau表位(包含選自由SEQIDNO：2-75和101-103組成的組的胺基酸序列)。如本文所用tau蛋白病包含任一神經變性病，其包含在腦中微管TAU蛋白的病態聚集。相應地，除了家族性遺傳性和偶發性阿爾茨海默病，能夠用本發明方法治療的其他tau蛋白病，包括但不僅限於，連鎖於17號染色體的伴帕金森病的額顳葉痴呆(frontotemporaldementia，parkinsonismlinkedtochromosome17，FTDP-17)、進行性核上性麻痺、皮質基底節變性(corticobasaldegeneration)、皮克病、進行性皮質下膠質增生、僅痴呆纏結(tangleonlydementia)、伴發鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結、嗜銀顆粒性痴呆(argyrophilicgraindementia)、肌萎縮性側索硬化帕金森-痴呆復徵、拳擊員痴呆、唐氏症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、包涵體肌炎、Creutzfeld-Jakob病、多系統萎縮、C型Niemann-Pick病、朊病毒蛋白大腦澱粉樣血管病、亞急性硬化性全腦炎、強直性肌營養不良、非-guanamian伴發神經原纖維纏結的運動神經元病(non-guanamianmotorneurondiseasewithneurofibrillarytangles)、慢性外傷腦病，和腦炎後帕金森症候群。另外一個本發明的方面涉及促進從受試者腦中清除tau蛋白聚集的方法。該方法包括，在有效於促進從受試者腦中清除tau蛋白聚集的條件下，向受試者施用任一種或多種免疫原性tau肽，其含有選自由SEQIDNO：2-75組成的組的胺基酸序列，或一種或多種抗體，其識別免疫原性tau表位(包含選自由SEQIDNO：2-75和101-103組成的組的胺基酸序列)。清除tau蛋白聚集包括清除神經原纖維纏結和/或神經原纖維纏結的病態tau蛋白前體。神經原纖維纏結經常與神經變性病有關，該神經變性病包含例如，偶發性和家族性阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化、嗜銀顆粒性痴呆、拳擊員痴呆、慢性外傷腦病、伴發鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結、唐氏症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、Hallerworden-Spatz病、遺傳性額顳葉失智症、染色體17(FTDP-17)相關的帕金森病、包涵體肌炎、Creutsfeld-Jakob病、多系統萎縮、C型Niemann-Pick病、皮克病、朊病毒蛋白大腦澱粉樣血管病、偶發性皮質基底節變性、進行性核上性麻痺、亞急性硬化性全腦炎、強直性肌營養不良、有神經原纖維纏結的運動神經元疾病、僅痴呆纏結，和進行性皮質下膠質增生。另外一個本發明的方面涉及減緩tau病理相關的行為表型進展的方法。該方法包括，在有效減緩受試者的tau病理相關的行為表型的條件下，向受試者施用任一種或多種免疫原性tau肽，其含有選自由SEQIDNO：2-75組成的組的胺基酸序列，或一種或多種抗體，其識別免疫原性tau表位(包含選自由SEQIDNO：2-75和101-103組成的組的胺基酸序列)。如本文所用，tau病理相關的行為表型包括但不僅限於，認知損傷、早期的人格改變和失控、冷漠、意志力喪失、緘默症、失用、持續言語、刻板的動作/行為、多言、混亂、無法計劃或組織順序的任務、自私/無情、反社會的特徵、缺乏換位思考、停止、相對保存完好的理解的頻繁錯語和無語法的講話、受損的理解和選詞障礙、緩慢漸進的步態不穩、後退、不動、經常跌倒、非左旋多巴響應的軸向剛性、核上凝視麻痺、方波抽搐、緩慢垂直掃視、假性球麻痺、肢體失用、肌張力障礙、皮質感覺喪失和震顫。根據本發明的方法，在一個實施方案中，向有需要的受試者施用免疫原性tau肽或免疫原性tau肽的聯合物。合適的tau蛋白的免疫原性tau肽包含一種或多種抗原性表位，其模擬tau蛋白的病理型。示例性的免疫原性tau蛋白表位在一種或多種胺基酸上是磷酸化的，其是在tau蛋白的病理型中被磷酸化，而不是在正常的或非病理型tau蛋白中磷酸化。在一個本發明優選的實施方案中，施用免疫原性tau肽，以誘導出針對免疫原性tau肽和tau病理理型的主動免疫應答，從而促進和tau蛋白聚集體相關的清除、減緩tau病理相關的行為進展以及治療潛在的tau蛋白病。根據本發明的這個方面，免疫應答包含良性體液(抗體介導)和/或細胞(由抗原-特異性T細胞或它們的分泌物介導)應答，其直接對抗免疫原性tau肽。通過測試來自受試者生物樣品(例如，血液、血漿、血清、尿液、唾液、腦脊液或淋巴液)，測定和監視體液免疫應答，從而測定和免疫原性tau肽有關的抗體。在生物樣品中檢測抗體的方法是在本領域熟知的，例如ELISA、斑點印跡、SDS-PAGE膠或ELISPOT。通過在該領域已知的增殖試驗(CD4+T細胞)或CTL(細胞毒素T淋巴細胞)試驗，測定細胞介導的免疫反應。分離的本發明的免疫原性tau肽包含任一如下表1所示的SEQIDNO：2-30的胺基酸序列。每個序列的被磷酸化的胺基酸殘基以粗體顯示並用星號標記。表1中肽的名字和這些肽的胺基酸位置相對應，其中最長的人類tau蛋白同種型具有如下所示的胺基酸序列SEQIDNO：1。表1：免疫原性tau肽上述免疫原性肽的變體和類似物，其針對能夠使用的優選的tau蛋白表位，誘導抗體和/或與抗體交叉反應。包含等位基因的型式、種、誘導的變體的類似物，通常在1個、2個或多個位置，而經常藉助連續的取代，區別於自然產生的肽。通常類似物至少具有與天然肽80或90％的序列一致性。一些類似物包含非天然胺基酸，或者在1個、2個或多個位置的N-或C-末端的胺基酸的修飾結構。在本發明的一個實施方案中，變異的免疫原性tau肽是偽-磷酸化肽。通過用酸性胺基酸，例如穀氨酸和天冬氨酸，取代一種或多種tau肽的磷酸化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基，製備偽-磷酸化肽絲氨酸(Huangetal.，「ConstitutiveActivationofMeklbyMutationofSerinePhosphorylationSites，」Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(19)：8960-3(1994)，其由此以引用的方式全部併入本文)。示例性的本發明的分離的免疫原性偽-磷酸化tau肽如下表2所示。在每個表2的序列中，以X說明胺基酸殘基取代的位置，其中x是穀氨酸或天冬氨酸殘基取代表2：免疫原性偽-磷酸化Tau肽每個本發明的tau蛋白，即SEQIDNO：2-75和87-88(下文表3)優選地在N-末端被乙醯化和在C-末端被醯胺化，從而更緊密地組裝相同的完整長度tau蛋白的內部胺基酸。本發明的tau肽也能夠包含一種或多種D-胺基酸殘基以提高肽的穩定性。這些D-胺基酸能以相同的順序以L-型肽型式存在，或以相反於L-型序列的順序組裝，從而維持總體上的天然序列拓撲結構(Ben-Yedidiaetal.，「ARetro-InversoPeptideAnalogueofInfluenzaVirusHemagglutininB-cellEpitope91-108InducesaStrongMucosalandSystemicImmuneResponseandConfersProtectioninMiceafterIntranasalImmunization，」MolImmunol.39：323(2002)；Guichard，etal.，「AntigenicMimicryofNaturalL-peptideswithRetro-Inverso-Peptidomimetics，」PNAS91：9765-9769(1994)；Benkirane，etal.，「AntigenicityandImmunogenicityofModifiedSyntheticPeptidesContainingD-AminoAcidResidues，」J.Bio.Chem.268(35)：26279-26285(1993)，其全部通過引用的方式被併入本文)。每個上面的肽序列可連接於免疫原性載體分子以提高免疫原性。合適的免疫原性載體分子，包括但不限於T輔助細胞表位，例如破傷風類毒素(例如P2和P30表位)，肝炎B表面抗原，霍亂毒素B、類毒素、白喉類毒素、麻疹病毒F蛋白、沙眼衣原體主要外部膜蛋白、惡性瘧原蟲環子孢子蛋白T，P.惡性瘧原蟲CS抗原、磷酸異構酶、百日咳博德特氏菌、破傷風桿菌、Pertusariatrachythallina、大腸桿菌TraT、和流行性感冒病毒紅血球凝集素(HA)(參見授予Wang的美國專利No.6,906,169；授予Wang的美國專利申請公開No.20030068325和授予Wang的WO/2002/096350，其全部通過引用的方式被併入本文)。在本發明優選的實施方案中，T輔助細胞表位是破傷風毒素947-967(P30)表位，其具有胺基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQIDNO：76)。在另一個實施方案中，T輔助細胞表位是破傷風毒素830-843(P2)表位，其具有胺基酸序列QYIKANSKFIGIT(SEQIDNO：77)。利用短胺基酸接頭序列，將本發明的免疫原性tau肽連接於免疫原性載體分子。在一個本發明優選的實施方案中，GPSL(SEQIDNO：78)接頭序列用於將免疫原性tau肽連接到免疫原性載體分子。其他合適的接頭序列包含甘氨酸-富集的(例如G3-5)或絲氨酸-富集的(例如GSG，GSGS(SEQIDNO：79)、GSGSG(SEQIDNO：80)，GSNG)接頭序列，或單性免疫球蛋白接頭，其公布於授予Huangetal的美國專利No.5,516,637)，並由此以引用的方式全部併入本文。可選地，利用化學交聯，將本發明的免疫原性tau肽連接於免疫原性載體分子。將免疫原連接到免疫原性載體分子的技術，包括構造二硫鍵，利用N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸鹽(SPDP)和琥珀醯亞胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)(如果肽缺乏硫基，可以通過添加半胱氨酸殘基的方式提供硫基)。這些藥劑在它們自己和一個蛋白上的肽半胱氨酸殘基之間構建二硫鍵，以及通過在賴氨酸上的ε氨基，或在其他胺基酸上的其他游離氨基的醯胺健。多種這樣的二硫鍵/氨醯鍵形成劑描述於Jansenetal.，「Immunotoxins：HybridMoleculesCombiningHighSpecificityandPotentCytotoxicity」ImmunRev62：185-216(1982)，其以引用的方式全部併入本文。其他的雙官能團偶聯劑形成硫醚而不是二硫鍵。很多這些硫醚形成劑是可從商業途徑獲得的，並且包含6-馬來醯亞胺己酸、2-溴乙酸、2-碘苯甲酸、4-N-馬來醯亞胺-甲基)環己烷-1-羧酸。通過將羰基與琥珀醯亞胺或1-羥基-2-硝基-4-磺酸結合、鈉鹽能激活羰基基團。通過固相肽合成或重組表達系統，能合成本發明的免疫原性tau肽。可以從很多供應商以商業方式獲得自動肽合成器，例如AppliedBiosystems(FosterCity，Ca.)。重組表達系統可包含細菌，例如E.coli、酵母，昆蟲細胞，或哺乳動物細胞。重組表達的方法描述於Sambrooketal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual(C.S.H.P.Press，NY2ded.，1989)，其由此以引用的方式全部併入本文。能夠將本發明的免疫原性tau肽單獨或聯合其他本發明的免疫原性tau肽施用於有需要的受試者。在一個實施方案中，本發明的免疫原性tau肽聯合一種或多種如表3所示的免疫原性tau肽的施用，描述於授予igurdsson的美國專利申請公開No.20080050383，其由此以引用的方式全部併入本文。表3中肽的名字和這些肽的胺基酸位置相對應，其中最長的tau蛋白同種型具有胺基酸序列SEQIDNO：1。每個序列的被磷酸化的胺基酸殘基以粗體顯示並用星號標記。表3：用於聯合施用的免疫原性tau肽序列能夠將本發明的免疫原性tau肽聯合合適的佐劑聯合施用，以在受試者中獲得所需要的免疫應答。能夠在本發明的免疫原性tau肽施用之前、之後或同時施用合適的佐劑。優選的佐劑提高針對免疫原的內在應答，而不在免疫原中引起構象改變，其影響應答定性的形成。優選的的佐劑類別是鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁。這樣的佐劑可和/不和其他特異性免疫刺激性藥劑一起使用，例如3脫-O-醯化單磷醯基脂質A(MPL)或3-DMP、聚合或單體胺基酸，例如聚穀氨酸或聚賴氨酸。這樣的佐劑可和/不和其他特異性免疫刺激性藥劑一起使用，例如胞壁醯基肽(例如，N-乙醯基胞壁醯基-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-非胞壁醯基-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(非-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕櫚醯基-sn-丙三氧基-3-羥基磷醯基氧基)-胺(MTP-PE)、N-乙醯基葡萄糖胺基-N-乙醯基胞壁醯基-L-Al-D-異穀氨酸-L-Ala-二棕櫚醯氧基丙基醯胺(DTP-DPP)theramideTM)，或其他細菌的細胞壁組分。水包油乳液包含MF59(參見授予VanNestetal.的WO90/14837，其由此以引用的方式全部併入本文)，其包含，通過微射流被製備進入亞微微粒的5％鯊烯、0.5％Tween80，和0.5％Span85(可選地包含各種量的MTP-PE)；SAF，包含10％鯊烯、0.4％Tween80、5％聚醚-嵌段聚合物L121，和thr-MDP，其中任一被微射流入亞微乳液或被渦旋以產生更大微粒乳液；和RibiTM佐劑系統(RAS)(RibiImmunoChem，Hamilton，Mont.)，包含2％鯊烯、0.2％Tween80，和一種或多種細菌的細胞壁組分，該組分選自下列的組：單磷醯基脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)，和細胞壁骨架(CWS)、優選地MPL+CWS(DetoxTM)。其他佐劑包含CompleteFreund′s佐劑(CFA)、IncompleteFreund′s佐劑(IFA)，和細胞因子，例如白介素(IL-1、IL-2，和IL-12)、巨噬細胞克隆刺激因子(M-CSF)，和腫瘤壞死因子(TNF)。佐劑的選擇取決於含有佐劑的免疫原性製劑的穩定性、施用途徑、劑量安排、對已接種疫苗的種的佐劑效果，以及在人類中，藥學上可接受的佐劑是一種已經被相關監管機構證明或是可被證明的用於人類施用的佐劑。例如明礬、MPL或IncomplereFreund′s佐劑(Changetal.，AdvancedDrugDeliveryReviews32：173-186(1998)，其由此以引用的方式全部併入本文)單獨地或可選地其所有聯合物是適合於人類施用。本發明的另一個方面涉及含有一種或多種上文所述的免疫原性tau肽的藥物組合物，和藥物載體(如下文所述)。藥物組合物可含有相同免疫原性tau肽的混合物。可選地，藥物組合物含有一種或多種不同的本發明的免疫原性tau肽的混合物。在一個優選的實施方案中，如上文所述，本發明的藥物組合物包含一種或多種合適的佐劑。在另一個本發明的實施方案中，對有需要的受試者施用抗體，該抗體識別一種或多種本發明的免疫原性tau表位。本發明合適的抗體包含任一特異地結合於免疫原性tau表位的免疫球蛋白分子，該表位包含任一SEQIDNO：2-75和101-103的胺基酸序列。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體，特異地針對病理型tau蛋白，識別且結合於表位，而且與正常tau蛋白或非tau蛋白幾乎沒有交叉反應。如本文所述，產生單克隆抗體，其識別包含SEQIDNO：13(Tau386-408[P-Ser396，404])和SEQIDNO：12(Tau260-271[P-Ser262])的免疫原性tau表位。這些抗體是磷酸基特異性的且，因此對病理tau蛋白型具有特異性，而與正常tau蛋白幾乎沒有交叉反應。除了識別磷酸化病理tau蛋白表位的抗體，本發明還涉及抗體，其優選地識別涉及促進神經元毒素和/或強化tau蛋白聚集的病理tau片段。例如，胱天冬酶裂解tau蛋白，優選地在tau蛋白天冬氨酸殘基421(D421)，產生截斷的分子，其與纏結共存並與在阿爾茨海默病中和tau蛋白病動物模型中的進展有關係(參見Calignonetal.，「CaspaseActivationPrecedes和LeadstoTangles，」Nature464：1201-1205(2010)，其由此以引用的方式全部併入本文)。針對裂解的tau蛋白游離D421末端的抗體將是特異於病理tau，且促進病理tau而非正常tau的移除。相應地，本發明涉及抗體，優選地是單克隆抗體，其針對在裂解的病理TAU蛋白游離C-末端的D421，該D421不存在於正常的tau蛋白中。在本發明的一個實施方案中，用本文所述的方法，以包含胺基酸序列HLSNVSSTGSIDMVD(SEQIDNO：101)的免疫原性tau肽，產生抗體。穀氨酸殘基391(E391)的截斷，是與在阿爾茨海默病患者腦中的神經原纖維纏結形成有關。(Basurto-Islasetal.，「AccumulationofAsparticAcid421-andGlutamicAcid391-CleavedTauinNeurofibrillaryTanglesCorrelateswithProgressioninAlzheimerDisease，」JNeuropatholExpNeurol67：470-483(2008)，其由此以引用的方式全部併入本文)。相應地，本發明也涉及抗體，優選地是單克隆抗體，其針對在裂解的病理TAU蛋白游離C-末端的E391，該E391不存在於正常的tau蛋白中。在本發明的一個實施方案中，用本文所述的方法，以包含胺基酸序列RENAKAKTDHGAE(SEQIDNO：102)的免疫原性tau肽，產生抗體。鈣蛋白酶也調節tau蛋白裂解，產生毒性17kDatau片段，其提高Aβ-誘導的神經毒性(Parketal.，「TheGenerationofa17kDaNeurotoxicFragment：AnAlternativeMechanismbywhichTauMediatesβ-Amyloid-InducedNeurodegeneration，」JNeurosci25(22)：5365-75(2005)，其由此以引用的方式全部併入本文)。相應地，本發明的實施方案也涉及抗體，優選地是單克隆抗體，特異性地識別毒性tau片段的游離的N-和/或游離的C-末端，而不識別正常tau蛋白，如下文SEQIDNO：103所示，該抗體包含tau(SEQIDNO：1)的胺基酸殘基45-230。如本文所用，術語「抗體」包含完整免疫球蛋白，其源自自然來源或重組來源，以及完整免疫球蛋白的免疫反應性位點(即抗原結合部分)。本發明的抗體可以多種形式出現，包含，例如多克隆抗體、單克隆抗體、細胞內抗體(內抗體)，抗體片段(例如，Fv、Fab和F(ab)2)，以及單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體和人源化抗體。(EdHarlowandDavidLane，UsingAntibodies：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1999)；Houstonetal.，「ProteinEngineeringofAntibodyBindingSites：RecoveryofSpecificActivityinanAnti-DigoxinSingle-ChainFvAhalogueProducedinEscherichiacoli，」ProcNatlAcadSciUSA85：5879-5883(1988)；Birdetal，「Single-ChainAntigen-BindingProteins，」Science242：423-426(1988))。利用本文所述的或其他在本領域熟知的技術，完成單克隆抗體的製備方法(MonoclonalAntibodies-Production，EngineeringandClinicalApplications(MaryA.RitterandHeatherM.Ladymaneds.，1995)，其由此以引用的方式全部併入本文)。通常，該過程包括從哺乳動物的脾獲得免疫細胞(淋巴細胞)，以有用抗原(即免疫原性tau肽)在體內或體外事先免疫該脾。示例性tau肽如上文所述。為了用SEQIDNO：2-75的tau肽或SEQIDNO：101-103的tau肽產生多克隆抗體，可將半胱氨酸殘基添加到每個序列的N-或C-末端，以促進載體蛋白的連接，該載體蛋白可以在免疫過程中抗體產出。合適的載體蛋白包括但不僅限於鑰孔戚血籃素、藍載體免疫原性蛋白(源自Concholepasconcholepas)、牛血清清蛋白(BSA)、卵白蛋白、陽離子BSA。抗體分泌淋巴細胞與能在細胞培養物中無限複製的骨髓瘤細胞或轉化細胞融合，從而產生永生化的、免疫球蛋白分泌的細胞系。通過標準的熟知的技術，可以完成與能在細胞培養物中無限複製的骨髓瘤細胞或其他融合伴侶的融合，例如利用聚乙二醇(PEG)或其他融合藥劑(MilsteinandKohler，「DerivationofSpecificAntibody-ProducingTissueCultureandTumorLinesbyCellFusion，」EurJImmunol6：511(1976)，其由此以引用的方式全部併入本文)。選擇優選地是鼠科動物，但也可以源自其他哺乳動物種的細胞的永生化的細胞系，該細胞系應該缺乏利用某種營養所必須的酶，應該可以迅速生長，並具有良好的融合能力。篩選所得到的融合細胞，或培養的雜交瘤以及所得到的集落，以產生所需要的單克隆抗體。克隆產生這樣抗體的集落，在體內或體外培養以產生大量的抗體。可選地，利用如授予Cabillv等人的美國專利4,816,567所述的重組DNA方法，製備單克隆抗體，該專利以引用的方式全部併入本文。例如，通過RT-PCR使用寡核糖核酸引物(其特異性地擴增編碼抗體的重和輕鏈的基因)，從成熟的B細胞核雜交瘤細胞分離編碼單克隆抗體的聚核苷酸。然後，將分離得到的編碼重和輕鏈的聚核苷酸克隆進入合適的表達載體，其立刻被轉染進入宿主細胞例如E.coli細胞、類人猿COS細胞、中國地鼠卵巢(CHO)細胞，或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞、宿主細胞產生的單克隆抗體。並且，從噬菌體展示文庫能分離得到所需種類的重組單克隆抗體或其片段(McCaffertyetal.，「Phageantibody：FilamentousPhageDisplayingantibodyVariableDomains，」Nature348：552-554(1990)；Clacksonetal.，「MakingantibodyFragmentsusingPhageDisplayLibraries，」Nature352：624-628(1991)；和Marksetal.，「By-PassingImmunizatio.HumanantibodyfromV-GeneLibrariesDisplayedonPhage，」J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，其全部通過引用的方式被併入本文。利用DNA技術能進一步修飾編碼單克隆抗體的聚核苷酸，以產生可選的抗體。例如，能用小鼠單克隆抗體輕鏈和重鏈的恆定區取代人源抗體的那些區域，以產生嵌合抗體。可選地，能用小鼠單克隆抗體輕鏈和重鏈的恆定區取代非免疫球蛋白多肽，以產生嵌合抗體。在其他的實施方案中，截斷或去除恆定區以產生所需的單克隆抗體的抗體片段。此外，可變區的定向位點或高密度誘變可以用於優化單克隆抗體的特異性和親和力。本發明的單克隆抗體可以是人源化抗體。人源化抗體是含有來自非人源(例如鼠科動物)抗體可變區內的最小序列的抗體。當這樣的抗體被施用於人類受試者時，這樣的抗體在治療上用於降低抗原性和人源抗-小鼠抗體應答。通過用具有所需特異性、親和力和能力的非人源抗體(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)的體互補決定區(CDR)取代人源抗體(CDR)，能夠人源化抗體(Jonesetal.，「ReplacingtheComplementarity-DeterminingRegionsinaHumanantibodyWithThoseFromaMouse，」Nature321：522-525(1986)；Riechmannetal.，「ReshapingHumanantibodyforTherapy，」Nature332：323-327(1988)；Verhoeyenetal.，「ReshapingHumanantibody：GraftinganAntilysozymeActivity，」Science239：1534-1536(1988)，其全部通過引用的方式被併入本文)。通過在Fv構架區中和/或在被代替的非人源殘基中用其他殘基取代，能夠進一步修飾人源化抗體，以提高和優化抗體特異性、親和力和/或能力。在本領域內，能夠使用多種技術製備人源抗體。能夠製備在體外被免疫的或從被免疫個體分離的永生化人源B淋巴細胞，其可以產生直接對抗靶向抗原的抗體(參見例如Reisfeldetal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy77(AlanR.Lissed.，1985)和美國專利No.5,750,373(Garrard)，其全部通過引用的方式被併入本文)。可選地，人源抗體能選自噬菌體文庫，其中噬菌體文庫表達人源抗體(Vaughanetal.，「HumanantibodywithSub-NanomolarAffinitiesIsolatedfromaLargeNon-immunizedPhageDisplayLibrary，」NatureBiotechnology，14：309-314(1996)；Sheetsetal.，「EfficientConstructionofaLargeNonimmunePhageantibodyLibrary：TheProductionofHigh-AffinityHumanSingle-ChainantibodytoProteinAntigens，」Proc.Natl.Acad..Sci.U.S.A.95：6157-6162(1998)；Hoogenboometal.，「By-passingImmunization.HumanantibodyFromSyntheticRepertoiresofGermlineVHGeneSegmentsRearrangedInVitro，」JMolBiol227：381-8(1992)；Marksetal.，「By-passingImmunization.HumanantibodyfromV-geneLibrariesDisplayedonPhage，」JMolBiol222：581-97(1991)，其全部通過引用的方式被併入本文)。也能夠在含有人源免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠中製備人源抗體，該轉基因小鼠可以進行產生全部人源抗體的免疫作用，而不產生內源性免疫球蛋白。這種方法描述於授予Suranietal.的美國專利No.5,545,807；授予Lonbergetal.的5，545，806；授予Lonbergetal.的5,569,825；授予Lonbergetal.的5,625,126；授予Lonbergetal.的5,633,425和授予Lonbergetal.的5,661,016，其全部通過引用的方式被併入本文。製備單克隆抗體的方法是在本領域熟知的。通常，通過向紐西蘭白兔皮下施用含有所需表位的肽(即任一選自由SEQIDNO：2-75或SEQIDNO：101-103組成的組的tau肽)，可以製備這樣的抗體，該白兔已經被抽血以獲得免疫前血清。可以聯合佐劑注射該抗原。在初次注射後大約每兩周對兔抽血，並定期地用相同的抗原每6周執行3次。通過親和色譜法，利用相應的抗原以獲取抗體，從血清中回收單克隆抗體。這種以及其他製備單克隆抗體的方法描述於EdHarlowandDavidLane，UsingAntibodies：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1988)，其由此以引用的方式全部併入本文。除了完整抗體，本方面包括這樣的抗體的結合位點。這樣的結合位點包含單價的Fab片段、Fv片段(例如單-鏈抗體scFv)，和但可變VH和VL區域，和雙價F(ab』)2片段、雙特異抗體、三鏈抗體、微抗體。能夠通過常規方法製備這些抗體片段，例如蛋白水解片段方法，描述於JamesGoding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice98-118(AcademicPress，1983)andEdHarlowandDavidLane，Antibodies：ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory，1988)，其全部通過引用的方式被併入本文，或其他本領域已知的方法。結合於細胞內蛋白(即胞內抗體)的工程化抗體片段也是適合用於本發明。針對免疫原性tau表位(包含任一SEQIDNO：2-75或SEQIDNO：101-103)的胞內抗體，能預防病態tau在神經元或膠質細胞內聚集和積聚，和/或促進聚集清除。胞內抗體技術應用於治療神經疾患，包含tau蛋白病，綜述於Milleretal.，「IntrabodyApplicationsinNeurologicalDisorders：ProgressandFutureProspects，」MolTherapy12：394-401(2005)，其由此以引用的方式全部併入本文。通常，通過從具有2個可變域(即，重鏈可變域和輕鏈可變域的異二聚體)的抗體的可變區選擇單可變域，獲得胞內抗體。對於胞內抗體發展，單鏈Fv片段、Fab片段、ScFv-Ck融合蛋白、單鏈雙特異抗體、VH-CH1片段，和甚至完整IgG分子式適合是合適的形式(KontermannR.E.，「IntrabodiesasTherapeuticAgents，」Methods34：163-70(2004)，其由此以引用的方式全部併入本文)。能夠從噬菌體展示、酵母表面展示或核糖體表明展示，獲得對病理TAU蛋白表位具有抗原特異性的胞內抗體。製備胞內抗體文庫或分離所需胞內抗體的方法進一步描述於授予Zauderer的美國已公布專利申請No.20030104402和授予Rabbitts的美國已公布專利申請No.20050276800，其由此以引用的方式全部併入本文。提高胞內抗體穩定性和結合特性親和力的方法描述於WO2008070363(ZhenpingandContreras-Martinezetal.，)「IntracellularRibosomeDisplayviaSecMTranslationArrestasaSelectionforantibodywithEnhancedCytosolicStability，」JMolBiol372(2)：513-24(2007)，其由此以引用的方式全部併入本文。尤其就抗體片段而言，需要進一步修飾抗體，以提高血清半衰期。這個目的可以通過以下方法達成，例如，通過將結合表位的挽救受體摻入抗體片段、通過在抗體片段中的合適區域的突變，或通過將表位摻入肽標籤，該標籤隨後融合於抗體片段的兩端或中間(例如通過DNA或肽合成)。根據本發明，抗體模擬物適合使用。在本領域已知的大量抗體模擬物包括但不僅限於，那些稱為單體，其源自第10人類III型纖連蛋白域(10Fn3)(Koideetal.，「ThefibronectinTypeIIIDomainasaScaffoldforNovelBindingProteins，」JMolBiol284：1141-1151(1998)；Koideetal.，「ProbingProteinConformationalChangesinLivingCellsbyUsingDesignerBindingProteins：ApplicationtotheEstrogenReceptor，」ProcNatlAcadSciUSA99：1253-1258(2002)，其由此以引用的方式全部併入本文)，和那些稱為親和體，其源自葡萄球菌蛋白A的穩定的α-螺旋細菌受體域Z(Nordetal.，「BindingProteinsSelectedfromCombinatorialLibrariesofanalpha-helicalBacterialreceptorDomain，」NatureBiotechnol15(8)：772-777(1997)，其由此以引用的方式全部併入本文)。本發明進一步涉及藥物組合物，該藥物組合物包含一種或多種識別如上文所述的本發明的免疫原性tau肽的抗體。這種藥物組合物可含有識別相同tau表位的相同抗體的混合物。可選地，該藥物組合物可含有識別一種或多種不同tau表位的一種或多種抗體。本發明的藥物組合物進一步含有，如下文所述的藥學上可接受的載體或其他藥學上可接受的組分。其含有免疫原性tau肽或識別免疫原性tau肽的抗體的本發明的藥物組合物，除有效治療藥劑意外，還包含多種其他藥學上可接受的組分(參見Remington′sPharmaceuticalScience(15thed.，MackPublishingCompany，Easton，Pa.，1980)，其由此以引用的方式全部併入本文)。優選的藥物組合物製劑取決於所需要的施用模式和治療應用。該組合物能夠包含藥學上可接受的非毒性載體或稀釋劑，其被定義為媒介物，通常用於製備藥物組合物(施用於動物或人類)。選擇稀釋劑以便不影響聯合物的生物學活性。稀釋劑的示例是蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer′s溶液、右旋糖溶液，和Hank′s溶液。此外，藥物組合物或製劑也可包含其他載體、佐劑、或非毒性、非治療性、非-免疫原性穩定劑等。藥物組合物可包含大的、緩慢代謝的高分子，例如蛋白、多糖例如殼聚糖、聚胺基酸、聚胺基酸和共聚物(例如，乳膠官能瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素等等)、聚合的胺基酸、胺基酸共聚物和脂質聚集和脂質聚集(例如，油滴或脂質體)。另外，這些載體能夠發揮免疫刺激性藥劑的功能(即，佐劑)。本發明的藥物組合物可能進一步包含合適的遞送媒介物。合適的遞送媒介物包括但不僅限於病毒、細菌、生物可降解的微球體、微粒，納米粒子、脂質體、膠原質微球和螺旋狀。在本發明的一個實施方案中，遞送媒介物是病毒或細菌，而且免疫原性tau肽表現為病毒或細菌作為免疫原性組合物的一部分。根據本發明的這個實施方案，將編碼免疫原性肽的核酸分子摻入病毒或細菌的基因組或游離基因。可選地，用這樣的方法將核酸分子摻入，在該方法中，以分泌蛋白，或與病毒外表面蛋白或細菌跨膜蛋白的融合蛋白的形式，表達免疫原性肽，從而顯示肽。在這樣的方法中使用的病毒或細菌是非病理的或是毒性減弱的。合適的病毒包含，腺病毒、單純皰疹病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒和其他α病毒、水皰性口炎病毒、和其他rhabdo病毒，牛痘和禽痘。腺病毒，單純皰疹病毒，委內瑞拉馬腦炎病毒和其他α病毒，水皰性口炎病毒，和其他rhabdo病毒，牛痘和禽痘。合適的細菌包含沙門氏菌和Shigella。將免疫原性肽與HBV的HbsAg融合是非常合適的。在另一個本發明的實施方案中，藥物組合物包含脂質體遞送媒介物。脂質體包含一種或多種特定順序的脂質脂質雙分子層，其封裝水相。本發明的免疫原性tau肽或針對免疫原性tau肽製備的抗體，可以使用脂質體媒介物膜進行表面包裹、封裝，或與這種膜結合。多種合適於tau肽疫苗遞送的脂質體在本領域是已知的(參見例如Hayashietal.，「ANovelVaccineDeliverySystemUsingImmunopotentiatingFusogenicLiposomes，」BiochemBiophysResCommun261(3)：824-28(1999)和美國專利公開No.20070082043(Michaelietal.)，其全部通過引用的方式被併入本文)。其他製備用於本發明的脂質體的方法描述於Banghametal.，「DiffusionofUnivalentIonsAcrosstheLamellaeofSwollenPhospholipids，」J.Mol.Biol.13：238-52(1965)；授予Hsu的美國專利No.5,653,996；授予Leeetal.的美國專利No.5,643,599；授予Hollandetal.的美國專利No.5,885,613；授予Dzau&Kaneda的美國專利No.5,631,237；和授予Loughreyetal.的美國專利No.5,059,421，其由此以引用的方式全部併入本文。在另一個本發明的實施方案中，利用基因療法遞送系統，施用編碼本發明的免疫原性tau肽或tau抗體的核酸分子。合適的基因療法載體包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、並皰疹病毒載體。能夠迅速製備和應用腺病毒載體遞送媒介物，描述於Berkner，「DevelopmentofAdenovirusVectorsfortheExpressionofHeterologousGenes，」Biotechniques6：616-627(1988)和Rosenfeldetal.，「Adenovirus-MediatedTransferofaRecombinantAlpha1-AntitrypsinGenetotheLungEpitheliumInVivo，」Science252：431-434(1991)，WO93/07283(Curieletal.)，WO93/06223(Perricaudetetal.)和WO93/07282(Curieletal.)，其由此以引用的方式全部併入本文。腺伴隨病毒遞送媒介物能被構建並用於遞送編碼本發明tau抗體的核酸進入細胞，描述於Shietal.，「TherapeuticExpressionofanAnti-DeathReceptor-5Single-ChainFixedVariableRegionPreventsTumorGrowthinMice，」CancerRes.66：11946-53(2006)；Fukuchietal.，「Anti-AβSingle-ChainAntibodyDeliveryviaAdeno-AssociatedVirusforTreatmentofAlzheimer’sDisease，」Neurobiol.Dis.23：502-511(2006)；Chatterjeeetal.，「Dual-TargetInhibitionofHIV-1InVitrobyMeansofanAdeno-AssociatedVirusAntisenseVector，」Science258：1485-1488(1992)；Ponnazhaganetal.，「SuppressionofHumanAlpha-GlobinGeneExpressionMediatedbytheRecombinantAdeno-AssociatedVirus2-BasedAntisenseVectors，」J.Exp.Med.179：733-738(1994)；以及Zhouetal.，「Adeno-associatedVirus2-MediatedTfansductionandErythroidCell-SpecificExpressionofaHumanBeta-GlobinGene，」GeneTher.3：223-229(1996)，其由此以引用的方式全部併入本文。這些媒介物體內用途描述於Flotteetal.，「StableinVivoExpressionoftheCysticFibrosisTransmembraneConductanceRegulatorWithanAdeno-AssociatedVirusVector，」Proc.Nat′l.Acad.Sci.90：10613-10617(1993)和Kaplittetal.，「Long-TermGeneExpressionandPhenotypicCorrectionUsingAdeno-AssociatedVirusVectorsintheMammalianBrain，」NatureGenet.8：148-153(1994)，其由此以引用的方式全部併入本文。其他類型的腺病毒載體描述於授予Wickhametal.的美國專利No.6,057,155；授予Boutetal.的美國專利No.6,033,908；授予Wilsonetal.的美國專利No.6,001,557；授予Chamberlainetal.的美國專利No.5,994,132；授予Kochaneketal.的美國專利No.5,981,225；授予Spooneretal.的美國專利No.5,885,808；和授予Curiel的美國專利No.5,871,727，其由此以引用的方式全部併入本文。已修飾的逆轉錄病毒載體形成的傳染轉化系統，該系統也可用於遞送編碼針對靶向細胞的所需肽或抗體核酸分子。一種這樣類型的逆轉錄病毒載體公開於授予Kriegleretal.的美國專利No.5,849,586，其由此通過引用的方式併入本文。例如通過下列方式將承載編碼免疫原性tau肽或tau抗體的核酸分子的基因療法載體施用於受試者：靜脈注射局部施用(授予Nabeletal.的美國專利No.5,328,470，其由此以引用的方式全部併入本文)；或立體定向注射(參見例如Chenetal.，「GeneTherapyforBrainTumors：RegressionofExperimentalGliomasbyAdenovirusMediatedGeneTransferInVivo，」Proc.Nat』l.Acad.Sci.USA91：3054-3057(1994)，其由此以引用的方式全部併入本文)。基因療法載體的藥物製劑可包括在可接受的稀釋劑中的基因療法載體，或可包含其中嵌入基因遞送媒介物的緩釋基質。在本發明方法的實施中，在施用本發明的免疫原性肽或抗體之前，優選選擇：患有阿爾茨海默病或其他tau蛋白病或處於患有阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的風險中的受試者；腦中具有tau聚集體的受試者；或展現出混亂相關的行為表型的受試者。易於治療的受試者包括處於疾病風險但還沒有表現出症狀的個體、以及目前表現出症狀的患者。就阿爾茨海默病而言，事實上任何人都處於遭受阿爾茨海默病的風險之中。因此，本方法可以預防性應用於普通人群，而不需要評估受試患者的風險。本方法尤其適用於這樣的個體，該個體確定具有已知的阿爾茨海默病的遺傳風險。這樣的個體包括親屬經歷該疾病的那些、以及通過遺傳或生物化學標誌物分析測定的那些。針對阿爾茨海默病的風險的遺傳標誌物包括APP基因中的突變，尤其是717位的突變、以及670和671位的突變，分別稱為Hardy和Swedish突變。風險的其他標誌物包括早老素基因、PS1和PS2、以及ApoE4基因中的突變、AD和高膽固醇血症或動脈硬化症的家族史。目前遭受阿爾茨海默病的個體可以通過存在上述風險因子從特徵性痴呆來識別。另外，可得多種診斷測試用於鑑定具有AD的個體。這些包括測量CSFtau和Aβ42水平。增加的tau和降低的Aβ42水平表示存在AD。遭受阿爾茨海默病的個體還可以通過阿爾茨海默病和相關病患聯合會標準來診斷。在無症狀患者中，可以在任何年齡(例如10，20，30歲的年齡)開始治療。然而，通常不必在患者達到40，50，60或70歲的年齡才開始治療。治療典型地在一定時間期限內需要多種劑量。治療可以通過下列方式來監控：隨著時間的消逝，測定針對治療劑的抗體或激活的T-細胞或B-細胞應答。如果應答下降，表示加強劑量。在潛在唐氏症候群的患者的情況下，可以通過向母體出生前或出生後立即施用治療劑來開始治療。在預防應用中，以這樣的量將含有免疫原性tau肽的藥物組合物施用至易患阿爾茨海默病或其他tau蛋白病或者處於患有阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的風險中的患者，該量足以消除或降低風險、降低嚴重性、或延遲疾病的發作(包括疾病的生物化學、組織學和/或行為症狀)、在疾病發展過程中展現的其併發症和中間病理表型。在治療應用中，以這樣的量將含有tau抗體的組合物施用至患有或已經遭受這些疾病的患者，該量足以治癒或至少部分阻止疾病症狀(生物化學、組織學和/或行為症狀)，包括在疾病發展過程中展現的其併發症和中間病理表型。在一些方法中，施用藥劑會在仍未發展為特徵性阿爾茨海默病理的患者中降低或消除溫和認知損傷。足以實現預防或治療療法的量定義為預防或治療性有效劑量。在預防和治療方案中，藥劑通常以數種劑量來施用，直到已經實現足夠的免疫應答。典型地，免疫應答被監控，並且如果免疫應答開始衰弱則給予重複劑量。為了治療上述病症，本發明組合物的有效劑量取決於多種不同因素而改變，包括施用方式、靶點、患者的生理狀態、施用的其他藥物、以及治療是預防性還是治療性的。治療劑量需要改變以優化安全性和效果。免疫原的量取決於是否還施用佐劑，在不存在佐劑的條件下需要更高劑量。對於人的施用，免疫原的施用量有時從1至500μg/患者變化，更通常從5至500μg/注射變化。偶爾，使用1-2mg/注射的更高劑量。典型地約10，20，50或100μg用於每次人注射。免疫原的質量還取決於免疫原內免疫原性表位的質量和免疫原整體的質量的比。典型地，每微克的免疫原使用10-3至10-5微摩爾的免疫原性表位。注射時間可以從一天一次、一年一次至十年一次顯著地變化。在給予免疫原劑量的任何給定天，如果還施用佐劑，劑量大於1μg/患者，並且通常大於10μg/患者，如果不存在佐劑，劑量大於10μg/患者，並且通常大於100μg/患者。典型方案包括先進行免疫，然後在時間間隔(例如6周間隔)進行加強注射。另外方案包括先進行免疫，然後1，2和12月後進行加強注射。另外方案需要每兩個月進行注射以生存。或者，加強注射可以定期進行，這由免疫應答的監控而指示。對於使用抗體進行被動免疫，劑量為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg的宿主體重。例如劑量可以為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg的範圍內。示例性治療方案需要每兩周施用一次或者每月施用一次或者每3至6個月施用一次。在一些方法中，同時施用具有不同結合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在這種情況下施用的各抗體的劑量落入指示的範圍內。抗體通常在多個間隔內施用。單詞給藥之間的間隔可以為每周、每月或每年。在一些方法中，調節劑量以實現血漿抗體濃度為1-1000μg/lnl，並且在一些方法中為25-300μg/ml。或者，抗體可以作為緩釋製劑來施用，在這種情況下需要施用的頻率更少。劑量和頻率取決於抗體在患者中的半衰期而改變。通常，人抗體顯示最初半衰期，其次是人源化抗體、嵌合抗體和非人抗體。施用的劑量和頻率可以取決於治療是預防性還是治療性的而改變。在預防應用中，在較長時間期限內以相對不頻繁的間隔來施用相對較低劑量。一些患者持續接受治療以度過餘生。在治療應用中，有時需要以相對較短間隔的相對較高劑量，直到降低或終止疾病進展，優選直到患者顯示部分或完全改善疾病的症狀。此後，患者可以按照預防性方案來施用。編碼免疫原的核酸的劑量為每個患者約10ng至約1g、約100ng至約100mg、約1μg至約10mg或約30至約300μg的DNA。傳染病毒載體的劑量為每劑10-100或更多個病毒粒子。用於誘導免疫應答的藥劑可以通過胃腸外、局部、靜脈、口服、皮下、動脈、顱內、腹腔內、鼻內或肌內方式來施用以用於預防和/或治療療法。免疫原性藥劑的最典型的施用途徑是皮下，儘管其他途徑可以是相等效果的。然後最通常的途徑是肌內注射。這種注射途徑最典型地在手或腿肌肉中進行。在一些情況下，可以期望將本發明的治療劑直接注射到其中積聚沉積物的特定組織中，例如顱內注射。肌內注射或靜脈輸注優選用於施用抗體。在一些方法中，特定治療抗體直接注射到顱骨中。在一些方法中，抗體作為緩釋組合物或裝置施用，例如MedipadTM裝置(ElanPharm.Technologies，Dublin，Ireland)。本發明的另一個方面涉及聯合療法，其中識別本發明的免疫原性tau表位的免疫原性tau肽或抗體聯合這樣的藥劑來施用，該藥劑有效地預防或治療和促澱粉樣變蛋白(amyloidogenicprotein)或肽的沉積相關或者源自其的其他病症或疾病。經歷沉積的促澱粉樣變蛋白/肽包括但不限於β蛋白前體，朊病毒和朊病毒蛋白，α-突觸核蛋白(α-synuclein)，tau，ABri前體蛋白，ADan前體蛋白，胰島澱粉樣多肽，載脂蛋白AI，載脂蛋白AII，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，凝溶膠蛋白，心鈉素，降鈣素，角膜上皮素，乳鐵蛋白，免疫球蛋白輕鏈，運甲狀腺素蛋白，A澱粉樣變性(Aamyloidosis)，β2-微球蛋白，免疫球蛋白重鏈，纖維蛋白原α鏈，催乳素，角蛋白和medin。因此，本發明的聯合治療將包括識別免疫原性tau表位的免疫原性tau肽或抗體、和靶向上述促澱粉樣變蛋白或肽中的一種或多種的一種或多種藥劑。在遺傳性澱粉樣病(例如阿爾茨海默病和唐氏症候群)的情況下，免疫調節以清除澱粉樣-β(Aβ)沉積物是脫穎而出的療法。靶向Aβ的免疫療法恆定地導致認知改善。可能的是，tau和Aβ病理學是協同的。因此，同時靶向清除tau和Aβ以及Aβ-相關病理學的聯合療法可比單獨靶向各種的方法更加有效。在帕金森氏症和相關神經變性病的情況下，清除α-突觸核蛋白的聚集形式的免疫調節也是脫穎而出的療法。同時靶向tau和α-突觸核蛋白的清除的聯合療法可比單獨靶向各種蛋白的方法更加有效。在朊病毒病和相關神經變性病的情況下，清除朊病毒蛋白prpSc的疾病相關形式的免疫調節是脫穎而出的療法。因此，同時靶向tau和病理PrpSc蛋白的清除的聯合療法可比單獨靶向各種蛋白的方法更加有效。患有II型糖尿病的個體可更易於發展阿爾茨海默病。因此，聯合療法包括靶向胰島澱粉樣多肽的清除的藥劑和預防阿爾茨海默病的發展或進展(即預防tau沉積)的藥劑，這將對於個體具有增強的治療益處。本發明的另一個方面涉及在受試者中診斷阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的方法。該方法包括在受試者中使用診斷試劑來檢測病理Tau構象異構體的存在情況，其中診斷試劑是本發明的抗體或其活性結合片段。如上所述，抗體對於具有選自SEQIDNo：2-75或SEQIDNo：101-103的胺基酸序列的分離的tau肽具有抗原性特異性。阿爾茨海默病或其他tau蛋白病的診斷基於受試者中病理tau構象異構體的檢測。使用本發明的診斷抗體藥劑在受試者中診斷病理Tau構象異構體的存在情況可以通過下列方式來實現：從受試者中獲得生物樣品(例如血液、尿液、腦脊液)，使生物樣品接觸診斷抗體藥劑，以及在來自受試者的樣品中檢測診斷抗體藥劑和病理Tau蛋白構象異構體的結合。使用本發明的診斷抗體在生物樣品中實施病理Tau蛋白的檢測的測定法是本領域熟知的，並且包括但不限於ELISA、免疫組織化學、western印跡。或者，使用本發明的診斷抗體藥劑在受試者檢測病理Tau蛋白構象異構體的存在情況可以使用體內成像技術來實現。體內成像包括：向受試者施用對於病理Tau肽或表位(即SEQIDNo：2-75和101-103)具有抗原性特異性的診斷抗體，並且體內檢測診斷抗體藥劑和病理Tau蛋白構象異構體的結合。如上所述，優選抗體結合病理Tau蛋白而不結合非-tau蛋白並不結合tau的非-病理形式。診斷抗體或類似藥劑可以通過靜脈注射施用到患者體內，或通過顱內注射直接施加到腦內。抗體劑量應該在治療方法的相同範圍內。典型地，抗體被標記，儘管在一些方法中，對於病理Tau蛋白具有親和性的第一抗體未被標記，並且第二標記藥劑用於結合第一抗體。標記的選擇取決於檢測方式。例如螢光標記適於光學檢測。順磁性標記的使用適於在沒有手術幹預的條件下的X線斷層攝影術檢測。放射活性標記也可以使用PET或SPECT來檢測。通過下列方式來進行診斷：使在來自受試者的樣品中或在受試者中的標記的病理Tau構象異構體、tau聚集體和/或神經原纖維纏結的數量、尺寸和/或強度比較於對應的基線數值。基線數值可以表示未生病個體的群體的平均水平。基線數值還可以表示在相同受試者中測定的之前水平。上述診斷方法還可以用於監控受試者對於療法的應答。在該實施方案中，在受試者中檢測病理tau的存在情況在開始治療之前進行確定。在該時間點受試者中病理tau的水平用作基線數值。在治療過程中的多個時間處重複病理Tau蛋白構象異構體、tau聚集體和/或神經原纖維纏結的檢測，並且此後將測量的數值和基線數值比較。數值相對於基線下降是針對治療的陽性應答的信號。數值還可以在生物流體中暫時增加，因為病理tau從腦中清除。本發明還涉及用於進行上述診斷和監控方法的試劑盒。典型地，這些試劑盒包括診斷試劑，優選對於病理tau肽(即SEQIDNo：2-75和101-103)具有抗原性特異性的本發明的抗體。試劑盒還可以包括可檢測的標記。診斷抗體本身可以含有可檢測的標記(例如螢光分子，生物素等)，其可直接檢測或通過第二反應(例如和鏈酶親和素反應)檢測。或者，可以使用含有可檢測的標記的第二藥劑，其中第二藥劑具有針對第一抗體的結合特異性。在適於測量生物樣品中的病理tau蛋白的診斷試劑盒中，試劑盒的抗體可以預結合固相(例如微量滴定盤的孔)來供應。本發明的診斷試劑盒還包括這樣的試劑盒，其用於在施用本發明的免疫原性tau肽後在受試者中檢測抗體的產生。典型地，這種試劑盒包括含有由受試者產生的抗體的抗原性表位的藥劑。試劑盒還包括可檢測的標記。在優選的實施方案中，標記通常為標記的抗-個體基因型抗體的形式。試劑盒的藥劑可以預結合固相(例如微量滴定盤的孔)來供應。下列實施例示出在本發明的治療方法中用於組合物的多種方法。實施例旨在描述而不以任何方式限制本發明的範圍。實施例實施例1-肽在Keck設施(YaleUniversity)裡，利用BiosearchSAM2合成儀(Biosearch，Inc.，SanRafael，Ca.)，通過固相技術在p-甲基-二苯甲胺樹脂上合成肽免疫原。用HF從樹脂切割肽，並且在凍幹之前用乙醚和醋酸提取。隨後，通過使用反相支持媒介物(Delta-Bondapak)的HPLC，在0.78x30cm柱用上，以在0.1％TFA中的0-66％線性梯度乙腈提純肽。實施例2用於研究的動物在轉基因(Tg)JNPL3P301L小鼠模型中進行研究，該小鼠模型在多個腦區域和脊髓中發展神經原纖維纏結(Taconic，Germantown，NY)(Lewisetal.，″NeurofibrillaryTangles，AmyotrophyandProgressiveMotorDisturbanceinMiceExpressingMutant(P301L)TauProtein，″NatGenet25：402-405(2000)，其由此以引用的方式全部併入本文)。雖然這個模型對AD研究來說並不理想，但對纏結髮展後果研究，以及篩選可預防這些聚集產生的療法來說，它是很好的模型。這些動物其他的優點是相當早的病狀發作。在純合系中，在至少最早3個月齡時，能夠觀察到和tau病理有關的行為異常，而且這些動物在8月齡之前維持相當的健康。換句話說，在8月齡時，該動物可以自主行動和進食，而且能夠有效地完成行為任務，這使得治療效果可以得到監視。除了JNPL3P301L模型，也可以利用htau/PS1(M146L)小鼠模型進行研究(Boutajangoutetal.，「Presenilin1MutationPromotesTauPhosphorylationandAggregationinaNovelAlzheimer’sDiseaseMouseModel，」Alzheimer’sandDementia4：T185(2008)，其由此以引用的方式全部併入本文)。htau小鼠在沒有鼠tau的背景下，表達未突變的人源tau蛋白，而且在發作年齡和腦分布方面，更類似於阿爾茨海默tau病理(Andorferetal.，「HyperphosphorylationandAggregationofTauinMiceExpressingNormalHumanTauIsoforms，」JNeurochem86：582-90(2003)，其由此以引用的方式全部併入本文)。在Presenlin1蛋白中帶有突變(M146L)的PS1模型，當與Tg2576小鼠雜交時，顯示出升高的Aβ水平和促進Aβ沉積(Duffetal.，「IncreasedAmyloid-beta42(43)inBrainsofMiceExpressingMutantPresenilin1，」Nature383：710-713(1996)andHolcombetal.，「AcceleratedAlzheimer-TypePhenotypeinTransgenicMiceCarryingBothMutantAmyloidPrecursorProteinandPresenilin1Transgenes，」NatureMed4：97-100(1998)，其全部通過引用的方式被併入本文)。使表達6種人源tau同種型的htau小鼠與PS1(M146L)小鼠雜交，並維持小鼠tau基因敲除背景(htau/PS1/mtau-/-)。PS1突變促進在這種模型中tau高度磷酸化，這導致比htau模型中更具有攻擊性的更早發作的tau病理(Boutajangoutetal.，「Presenilin1MutationPromotesTauPhosphorylationandAggregationinaNovelAlzheimer’sDiseaseMouseModel，」Alzheimer’sandDementia4：T185(2008)，其由此以引用的方式全部併入本文)。實施例3-疫苗施用以1mg/ml濃度將Phos-tau肽與Adju-Phos佐劑(BrenntagBiosector，Denmark)混合，並在施用之前將溶液在4℃轉動過夜，以使得肽吸附於磷酸鋁微粒。對JNPL3P301L小鼠皮下注射100μl，接著2周之後注射第二次，並且其後每月注射(除非有其他說明)。在2-3月齡時接種疫苗而且繼續接種至8-9個月，此時灌注動物並獲取器官用於分析。在處死之前，在5-6月齡以及8-9月齡時，對小鼠進行感覺運動測試籠飼。對照小鼠只施用佐劑。以磷酸化tau免疫原Tau379-408[P-Ser396，404]免疫htau/PS1/mtau-/-小鼠(n＝12)。3個未-免疫對照組屬於只施用佐劑的組。主對照組包含一樣的未免疫的小鼠(htau/PS1對照；n＝16)。其他對照組是表達小鼠tau(htau/PS1/mtau；n＝8)的htau/PS1小鼠，以及有小鼠tau基因敲除背景的htau同窩出生仔畜(htau對照；n＝10)。htau/PS1/mtau-/-小鼠(3-4月齡)，每隔2周，接受3次在明礬主機中的100μg磷酸化tau衍生物腹膜內(i.p.)注射。其後隔月施用。對照組只施用佐劑。在7-8月齡時，小鼠接受更多的行為測試，以測定治療效果，然後在8-9月齡時處死小鼠用於分析。進行活動能力、橫梁，和轉杆測試，以確定在學習和記憶任務中測量得到的認知障礙是否歸因於感覺運動異常。利用八臂迷宮、封閉域對稱迷宮，和目標識別測試進行認知測試(Sigurdssonetal.，「AnAttenuatedImmuneResponseisSufficienttoEnhanceCognitioninanAlzheimer’sDiseaseMouseModelImmunizedwithAmyloid-betaDerivatives，」JNeurosci24：6277-6282(2004)，Asunietal.，「VaccmationofAlzheimer′sModelMicewithAbetaDerivativeinAlumAdjuvantReducesAbetaBurdenWithoutMicrohemorrhages.」EurJNeurosci.24：2530-42(2006)，andAsunietal.，「ImmunotherapyTargetingPathologicalTauConformersinaTangleMouseModelReducesBrainPathologywithAssociatedFunctionalImprovements，」JNeurosci27：9115-9129(2007)，其全部通過引用的方式被併入本文)。實施例4tau免疫治療產生強烈抗體應答在研究開始之前(T0)、第三次注射一周之後、其後定期地，和在處死時(Tf)，對小鼠抽血。通過利用ELISA測驗血漿稀釋液(1∶200除非有其他說明)，以確定針對疫苗的抗體應答，近期描述於(Sigurdssonetal.，″ImmunizationwithaNon-Toxic/Non-FibrillarAmyloid-βHomologousPeptideReducesAlzheimer′sDiseaseAssociatedPathologyinTransgenicMice，″AmJPathol.159：439-447(2001)andSigurdssonetal.，″AnAttenuatedImmuneResponseisSufficienttoEnhanceCognitioninanAlzheimer′sDiseaseMouseModelImmunizedwithAmyloid-betaDerivatives，″JNeurosci.24：6277-6282(2004)，其全部通過引用的方式被併入本文)，其中將免疫原覆蓋於ImmulonTM微孔(ThermoFischerScientific，Waltham，MA，)。為了檢測，連接於辣根過氧物酶的山羊抗-鼠IgG(Pierce，Rockford，IL)或抗-鼠IgM(Sigma，St.Louis，MO)以1∶3000稀釋使用。四甲聯苯胺(Pierce)是基質。圖1A顯示：用通過GPSL接頭連接於破傷風毒素T輔助細胞表位(TT947-967)的Tau210-216[P-Thr212-Ser214](SEQIDNO：2)免疫JNPL3P301L小鼠，在該小鼠中強烈IgG和IgM免疫應答。2-3個月齡的小鼠以2周為間隔接受最初2次免疫，其後每月接受一次。為評估抗體應答，在首次免疫之前給小鼠抽血，其後定期地在疫苗施用後1周給小鼠抽血，並且在8-9個月齡時處死小鼠以獲得組織。圖1A顯示：在第6次免疫(T3)1周後，以及在被處死的8-9個月齡時(Tf＝T最終)，測定的IgG和IgM抗體應答。圖1B顯示：針對破傷風毒素表位本身產生了強烈的抗體應答，這由以下測試所示，IgG和IgM結合於通過GPSL連結合於TT947-967的無關的tau蛋白表位Tau260-264[P-Ser262]。圖2A顯示：用通過GPSL接頭連接於破傷風毒素T輔助細胞表位(TT947-967)的Tau260-264[P-Ser262](SEQIDNO：3)免疫的JNPL3P301L纏結小鼠，針對免疫原產生了強烈IgG應答。如上所述，小鼠以2周間隔接受最初的兩次免疫，其後從2-3月齡至8-9月齡每月接受免疫。對破傷風毒素表位產生了大量抗體應答，這由以下測試所示，IgG結合於不相關的通過GPSL連接於TT947-967的tau蛋白表位Tau210-216[P-Thr212-Ser214](圖2B)。然而，如圖2c所示，對tau蛋白表位也產生了大量抗體應答，因為測試發現IgG結合於更大的含有Tau260-264[P-Ser262]區域的tau蛋白表位Tau240-270[P-Ser262]。TO-T最終，分別在接種疫苗之前(T0)，第三次(T1)、第六次(T2)、第七次(T3)免疫後一周，和在獲取組織(Tf)時，對小鼠抽血。在用連接於破傷風毒素T輔助細胞表位(TT947-967]的Tau229-237[P-Thr231-Ser235](SEQIDNO：4)免疫的JNPL3P301L纏結模型小鼠中，產生了強烈抗體(IgG)應答(圖3)。從2-3月齡開始免疫小鼠，2周間隔，其後每月免疫，並且在第三次免疫後一周(T1)抽血。在用明礬佐劑中的磷酸化的免疫原Tau379-408[Asp396，404](SEQIDNO：57)免疫的JNPL3P301L纏結模型小鼠中，也產生了強烈抗體(IgG)應答。重要地，這些抗體識別磷醯基-表位Tau379-408[P-5er396，404]，並達到相似的程度。從2-3月齡開始對小鼠免疫，最初兩次以2周為間隔，其後每月免疫。在獲取7-8月齡小鼠的組織時，對小鼠抽血(Tf)。實施例5Tau免疫治療降低在腦中的tau蛋白聚集為了tau病理組織學分析，用戊巴比妥鈉(120mg/kg，i.p.)麻醉並用PBS經皮層灌輸小鼠，以及如前所述地處理腦(Sigurdssonetal.，″ImmunizationwithaNon-Toxic/Non-FibrillarAmyloid-βHomologousPeptideReducesAlzheimer′sDiseaseAssociatedPathologyinTransgenicMice，″AmJPathol159：439-447(2001)；Sigurdssonetal.，″AnAttenuatedImmuneResponseisSufficienttoEnhanceCognitioninanAlzheimer′sDiseaseMouseModelImmunizedwithAmyloid-betaDerivatives，″JNeurosci24：6277-6282(2004)；andSigurdssonE.，″HistologicalStainingofAmyloid-betainMouseBrains，″MethodsMolBiol299：299-308(2005)，其全部通過引用的方式被併入本文)。簡要地說，在高碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛(PLP)中固定浸泡右半腦過夜，而速凍左半腦用於tau蛋白分析。固定之後，將腦移至含有20％甘油和2％二甲亞碸(DMSO)的磷酸鹽緩衝溶液，並保存於4℃直至切片之前。製備一系列冠腦切片(40μn)，並且用PHF1單克隆抗體對每十分之一切片染色，PHF1識別位於在PHFtau蛋白C-末端上的微管結合重複序列之內的磷酸化絲氨酸396和404(Otvosetal.，″MonoclonalAntibodyPHF-1RecognizesTauProteinPhosphorylatedatSerineResidues396and404，″JNeurosciRes39：669-673(1994)，其由此以引用的方式全部併入本文)。完成Tau抗體染色的方法描述於Sigurdssonetal.，″ImmunizationwithaNon-Toxic/Non-FibrillarAmyloid-βHomologousPeptideReducesAlzheimer′sDiseaseAssociatedPathologyinTransgenicMice，″AmJPathol159：439-447(2001)andSigurdssonetal.，″AnAttenuatedImmuneResponseisSufficienttoEnhanceCognitioninanAlzheimer′sDiseaseMouseModelImmunizedwithAmyloid-betaDerivatives，″JNeurosci24：6277-6282(2004)，其由此以引用的方式全部併入本文。簡要地說，在主PHF1抗體1∶100到1∶1000稀釋液中孵育切片。使用鼠-鼠免疫檢測試劑盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)，其中以1∶2000稀釋，使用抗-鼠IgG第二抗體。用Bioquant影像分析系統量化組織切片分析。軟體利用色調、飽和度和強度分割影像區域中的目標。用在標準的系列幻燈片上精確鑑定的目標建立閥值，而且這些分割閥值在整個分析過程中保持恆定。建立這些閥值後，用抓幀器數位化影像區域。Bioquant在背景照明(空白去校正)中校正異質性，並且為整個區域計算參數。為了免疫組組化學量化影像分析，最初選擇齒狀回粒層，其一貫含有神經元內tau蛋白聚集(前纏結和纏結)。觀察結果符合這種模型的最初特點(Lewisetal.，″NeurofibrillaryTangles，AmyotrophyandProgressiveMotorDisturbanceinMiceExpressingMutant(P301L)TauProtein，″NatGenet25：402-405(2000)，其由此以引用的方式全部併入本文)。不考慮研究的實驗條件，所有過程都由個體完成。在組織處理之前，隨機化樣品號碼，並且僅在分析完成之後破壞標號。對來自小鼠腦部的第10個切片取樣，測量值是以X200放大倍數的測量視野中的面積百分率，其由在視野的左側處齒狀回的頂端的反應產物佔據。對每個動物的4到5個切片進行分析。相對於只施用佐劑的對照小鼠，用連接於TT947-967(T299)的Tau260-264[P-Ser262](SEQIDNO：3)對純合系JNPL3tauP301L小鼠進行免疫，該免疫降低在腦幹(圖5A)和齒狀回(圖5B)中的病理tau。相似地，用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404]免疫原性肽免疫對htau/PS1進行的免疫，使在梨狀皮質中的tau蛋白聚集數量減少56％。(圖6，免疫的htau/PS1和htau/PS1對照的對比)。在免疫組和對照組之間觀察到顯著的差異(單因素ANOVA，p<0.01)。後hoc分析也顯示免疫的htau/PS1小鼠區別於它們的htau/PS1對照(p＜0.01)。**p＜0.01。實施例6-Tau免疫治療預防認知衰退為測定是否Tau免疫治療預防或逆轉在P301L中觀察到的年齡相關的感覺運動異常或是否它在htau/PS1小鼠中引起任一運動損傷，用多種如下文所述的感覺運動和認知測試，評估被施用免疫原性Tau260-264[P-Ser262](SEQIDNO：3)或Tau379-408[P-Ser396，404](SEQIDNO：82)的動物。轉杆測試：將動物放置在杆(直徑3.6em)裝置上，以通過測量上肢和下肢運動協調和平衡來評價運動協調和平衡中的區別(Rotarod7650加速模型；UgoBasile，BiologicalResearchApparatus，Varese，Italy)。該方法設計以評價運動行為而沒有混淆的實施。通過接受兩種試驗的訓練階段而使動物習慣於裝置，這足以實現實施的基線水平。然後，使小鼠另外測試三次，其中速度增加。在習慣過程中，轉杆設定為1.0rpm，其每30sec逐漸增加，並且在各階段後也使用30％乙醇溶液清洗乾淨。在該裝置下面放置軟泡沫墊以防止可能的摔傷。各動物對於三個階段都測試(整合數據用於接下來的分析)，其中各個階段間隔15min，並且進行測量從旋轉筒的頂部潛在落入或反轉(通過粘緊)。橫梁：該任務測試平衡和普通運動協調和功能整合。通過下列方式來評價小鼠：測量它們穿過分級的狹窄木樑以達到目標箱的能力(Torresetal.，″Behavioural，HistochemicalandBiochemicalConsequenceofSelectiveImmunolesionsinDiscreteRegionsoftheBasalForebrainCholinergicSystem，″Neuroscience63：95-122(1994)，其由此以引用的方式全部併入本文)。將小鼠放置在1.1cm寬的梁上，該梁為50.8cm長，並且通過兩個相同的柱而懸掛在成墊表面上30cm。在梁的各個末端處附接遮蔽的目標箱。使小鼠以垂直取向放置在梁上以習慣，然後監控最多60sec。在落入或達到目標箱之前，記錄各小鼠的失足數量用於四個連續試驗中的每個。誤差定義為失足並且數字地記錄。八臂迷宮：該迷宮裝置是由膠質玻璃構建的8-臂舉起的放射迷宮。每個臂是35cm長和7cm寬，且在每個臂的末端放置一個直徑1cm的水杯。15cm高的側壁延伸進入每個臂12cm，以防止動物在各個臂之間跨越。中央區域是八邊形的直徑14cm的中心。通過滑輪系統控制各臂的入口，遙控透明的膠質玻璃閘門。將迷宮升至高於地面75cm並安置在一個房間內，在該房間中一些在固定位置的明顯目標起外部暗示的作用。在測試之前，讓小鼠適應5天。在這段時間內，該小鼠每天接受0.1％糖水1小時，適應16小時後讓它可以接近放置於每個臂末端的水杯中的糖溶液。起初2天的適應在Y-迷宮中進行，在該迷宮中小鼠可以自由地探索。其後3天的適應在八臂迷宮中進行，在迷宮中定期地升起和放下閘門，以使動物適應於它們選擇有關的聲音。在9天測試期間，維持同樣的缺水安排。在這段時間內該小鼠保持良好的健康。每次測試開始，都將小鼠置於中央區域，並升起所有的閘門。當小鼠進入一個臂時，所有閘門落下。小鼠吃完糖水後，升起小鼠所在臂的門，讓小鼠回到中央區域。5秒間隔後，同時開啟所有的門，以啟動下一個試驗。這個過程一直持續到該動物進入所有的8個臂，或者直到用完10分鐘。每日的獲取階段持續9天。記錄錯誤次數(進入剛去過的臂)和完成每個階段的時間。目標識別：該自發的目標識別測試應用於測量短期記憶缺陷，並且該測試在正方形開放域盒子中進行(48cm正方形，帶有由黑色膠質玻璃製作的18cm高圍牆)，將盒子升高至裡地面50cm。將光強設置為30lx。測試前一天，使小鼠經歷獨自習慣階段，在該階段小鼠可以探索空盒子15分鐘。在訓練階段，將2個新目標放置於開放域的兩個成對角的角，並且讓動物探索15分鐘。對於特定的試驗，成對的目標是10cm高，且由相同的材質構成，由此它們不能容易地通過嗅覺暗示區別。通過跟蹤系統(SanDiegoInstruments，SanDiego，CA)記錄探索每個目標所用的時間，並且在該訓練階段結束時，將小鼠從盒子移走，維持一段記憶力延遲(RD＝3h)。延遲以後，正常小鼠在1小時之內記住特定目標，而且在記憶力試驗期間，用它們的主要時間探尋新目標。在記憶力測試期間，將動物放回同樣的盒子，在該盒子中放置一個前面訓練期間使用過的相似目標和第二個新目標，並且讓小鼠自由探索6分鐘。不同目標對用於給定動物的各試驗，並且暴露於目標對的順序以及各對的標識樣品和新目標在組內和組間平衡。開發新的和熟悉目標所花費的時間記錄為6分鐘。封閉域對稱迷宮：該裝置為矩形視場30cm正方形，9cm高的壁，分為36個9.5cm正方形，並被透明膠質玻璃蓋覆蓋。將均為11x16x9cm的紙盒(Endboxes)安置在視場的對角線拐角。對稱迷宮是上面討論的Hebb-Williams和Rabinovitch-Rosvold型測試的改進(Asunietal.，「VaccinationofAlzheimer′sModelMicewithAbetaDerivativeinAlumAdjuvantReducesAbetaBurdenwithoutMicrohemorrhages，」EurJNeurosci24：2530-2542(2006)，其由此以引用的方式全部併入本文)。簡言之，主要差別是各個末端隔室是開始箱和目標箱的功能，並且小鼠在交替軌道上沿相反方向跑動，從而消除種族間的處理。將屏障以對稱圖案放置在視場中，使得小鼠面向相同轉變方向，從而在給定問題內沿任一方向進行。在測試前，小鼠適應於限制飲水方案(每天2h接近水)。小鼠分為兩個適應階段，之後開始測試。在第一階段，所有動物在目標箱中被給予糖精味的水10分鐘。在第二階段中，它們放置於開始室中，並允許開發視場和進入目標箱，其中給予水(0.05mL)。當小鼠可靠地從開始室跑向目標箱時，它們在簡單問題上被分為三個實施階段，其中一個或兩個屏障放置在視場的不同位置處，以阻止直接到達目標箱。正式測試包括基於之前的數據展示難以分級的三個問題(Asunietal.，「VaccinationofAlzheimer′sModelMicewithAbetaDerivativeinAlumAdjuvantReducesAbetaBurdenwithoutMicrohemorrhages，」EurJNeurosci24：2530-2542(2006)，其由此以引用的方式全部併入本文)和用於小鼠的公開的基準。一個問題是每天展示，並且在各問題上小鼠被給予五個試驗，其中種族間間隔為2分鐘。通過相同觀察者就誤差而言手動記錄性能(即進入和再進入標識的誤差區段)和時間以完成各個試驗。這些實驗地目的是評價疫苗接種對於感覺運動(即，橫梁和轉杆)和認知行為(即，八臂迷宮、目標識別測試，和封閉域對稱迷宮測試)的作用。純合P301L小鼠早在3月齡時就患有纏結病狀，在5和8月齡時測試這些小鼠。在7-8月齡時測試htau/PS1動物。用連接於破傷風毒素輔助T細胞表位(TT947-967)的磷酸化免疫原性tau肽Tau260-264[P-Set262]，免疫純合JNPL3tauP301L小鼠，預防與神經原纖維纏結髮展有關的功能損傷，這由使用8月齡時的橫梁測試(圖7A)以及5-6月齡和8-9月齡時的轉杆測試(圖7B)評估。對照JNPL3tauP301L小鼠只施用佐劑。用磷酸化Tau379-408[P-Ser396，404]免疫htau/PS1小鼠，預防在全部3個所用測試中的認知衰退：1)八臂迷宮(RAM；兩因素ANOVA重複測量，p＜0.0001，圖8A)，2)目標識別測試(ORT；單因素ANOVA，p＝0.005，圖8B)，和3)封閉域對稱迷宮(CFSM；單因素ANOVA，迷宮A：p＜0.001，迷宮B：p＜0.0001，迷宮C：p＜0.01，圖9A-9C)。在RAM和CFSM中，所有天內(RAM；p＜0.01-0.001)和在所有複雜程度不斷提高的迷宮中，免疫的htau/PS1小鼠比對照htau/PS1小鼠表現好，這由錯誤次數(注意Y軸刻度不同；CFSM迷宮A：p＜0.01，迷宮B、C：p＜0.001)顯示。在ORT中，析因分析發現免疫的htau/PS1小鼠比相同的對照小鼠，具有更好地短期記憶(p＜0.01)。這充分確定相對於舊的目標，認知正常的小鼠用大約它們的70％時間在新目標上(Asunietal.，「ImmunotherapyTargetingPathologicalTauConformersinaTangleMouseModelReducesBrainPathologywithAssociatedFunctionalImprovements，」JNeurosci27：9115-9129(2007)，其由此以引用的方式全部併入本文)。在任一感覺運動任務(轉杆、橫梁、活動能力)中，免疫的htau/PS1小鼠與它們的未免疫的相同對照小鼠沒有顯著區別。這些發現說明免疫後觀察到的認知提高，不能由感覺運動效果解釋，這進一步強化了結果。實施例7-Tau免疫治療降低病理Tau水平在含有0.1mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸、0.5mMMgSO4、1mMEGTA、2mM二硫蘇糖醇、pH6.8、0.75mMNaCl、2mM苄基磺醯氯化物、Completemini蛋白酶抑制劑混合物(1片10ml水；Roche)和磷酸酶抑制劑(20mMNaF和0.5mM原釩酸鈉)的緩衝液中，使腦組織均質。然後以(20,000xg)在4℃離心30分鐘，以分離可溶性性細胞部分(上清液1)和不溶性部分(細胞沉澱1)。用相同體積的緩衝液重懸細胞沉澱，該緩衝液沒有蛋白酶和磷酸酶抑制劑但含有％(v/v)TritonX-100和0.25％(w/v)脫氧膽酸鈉，並且以50,000高速離心30分鐘，以獲得清潔劑-提取的作為不溶性部分分離得到的上清液2。上清液1和2於100℃加熱5分鐘，並且使相同量的蛋白在12％(w/v)聚丙烯醯胺膠上經電泳。在含有0.1％Tween-20的TBS的5％脫脂奶中，阻止印跡，並且與不同的抗體孵育過夜，然後洗滌並與共軛過氧化物酶、抗-鼠或抗-兔IgG在室溫孵育1小時。隨後，用ECL(Pierce)檢測結合抗體。通過NIHImageJ程序完成免疫印跡密度分析，並且相對於總tau蛋白量而不是肌動蛋白水平，將病理Tau水平正常化。一些研究報告病理生理學情況的改變和於胞內基質的交互作用能夠改變肌動蛋白合成，使激動蛋白對內部標準來說成為不合適的。對於Westem印跡分析，用單克隆B19抗體測量總，而用單克隆PHF1抗體檢測病理Tau(圖10A-10F)。總可溶性和不溶性tau的水平在各組之間沒有顯著差異(圖10A-10B)，然而相對於他們一樣的對照，在免疫的小鼠中可溶性PHF1染色的tau水平顯著降低(41％，p＜0.001)(圖10C)。觀察到的趨勢是不溶性PHF1活性tau降低了(22％)(圖10D)。進一步的分析顯示了非常強的趨勢：免疫治療在可溶性和不溶性部分中的PHF1/B19比例分別降低35％和43％(圖10E和10F)。這些發現說明優選地將病理Tau清除。重要的是，觀察到的在接受免疫治療的htau/PS1小鼠中的認知改善和染色的tau聚集的減少(由免疫組織化學測試而知)是相符的。在全部3個記憶測試中，都觀察到顯著的關聯性(RAM(分析測試的最後一天)：r＝0.36，p＝0.01；CFSM：迷宮A，r＝0.33，p＝0.02；迷宮C，r＝0.40，p＝0.01；ORT：r＝-0.31，p＝0.03)。關於western印跡片段，在八臂迷宮模型中，觀察到在可溶性和不溶性部分以及它們相對於總tau的比例之間有顯著的相關性(可溶性PHF1：r＝0.41，p＜0.01；可溶性PHF1/總可溶性tau：r＝0.34，p＜0.05；不溶性PHF1：r＝0.52，p＜0.001；不溶性PHF1/總不溶性tau：r＝0.33，p＜0.05)，但在其他2個認知測試沒有觀察到。實施例8靶向P-396，404表位的被動免疫治療預防功能衰退和在腦中減少Tau聚集為測定被動免疫治療的可行性，對純合P301L小鼠腹膜內(i.p.)注射施用PHF1，該PHF1是一種單克隆tau抗體(由Dr.PeterDavies提供)，其在P301L(JNPL3)小鼠模型和在AD中識別NFT和前纏結(Lewisetal，「NeurofibrillaryTangles，AmyotrophyandProgressiveMotorDisturbanceinMiceExpressingMutant(P301L)TauProtein，」NatGenet25：402-40522(2000)，其由此以引用的方式全部併入本文)。這種單克隆抗體識別tau，該tau在C-末端的絲氨酸胺基酸404和396上是磷酸化的(Greenbergetal.，「HydrofluoricAcid-TreatedTauPHFProteinsDisplaytheSameBiochemicalPropertiesasNormalTau，」JBiolChem267：564-569(1992)，其由此以引用的方式全部併入本文)。因而，它是一種主動免疫方法原型的單克隆類似物(Asunietal.，「ImmunotherapyTargetingPathologicalTauConformersinaTangleMouseModelReducesBrainPathologywithAssociatedFunctionalImprovements，」JNeurosci27：9115-9129(2007)，其由此以引用的方式全部併入本文)，Tau379-408[P-Ser396，404]含有PHF1抗體表位。PHF1的劑量是溶解於PBS的250μg/125μL。向對照注射相同劑量的在PBS中的小鼠IgG。在9到12周齡之間施用首次注射。接著動物每周接受注射，總共接受13次注射，然後在5-6月齡時接受行為測試，其後在6-7月時對其進行組織分析。在P301L小鼠模型中，用PHF1抗體進行的被動免疫預防tau病理相關的運動能力衰退。如圖11A所示，在橫梁測試中，在IgG注射的對照和PHF1免疫的動物之間存在顯著差異，當穿越橫梁時，對照動物比免疫的動物具有更多的失足(試驗合併，p＝0.03)。另外，PHF1免疫的P301L小鼠在齒狀回中PHF1染色的tau病理少58％(p＝0.02)(圖11B)。在腦幹中觀察到在血漿PHF1抗體水平和tau病理之間的逆相關(圖12A；p＜0.01)，以及在皮層運動區中觀察到相關性的強烈趨勢(圖12B；p＝0.06)。在血漿中的PHF-1抗體(μg/μL)數量在2周之內下降4倍(圖11C)。在對照中沒有觀察到可檢測的抗體。這裡有免疫的小鼠的平均值。實施例9-製備單克隆Tau抗體用通過添加到N-末端的半胱氨酸殘基連接於KLH的Tau386-408[P-Ser396，404](SEQIDNO：13)，免疫10隻balb/c小鼠。針對免疫原的tau位點，產生了強抗體效價，這由血漿系列稀釋檢測而知(圖13A)。兩隻小鼠被選擇用於細胞融合，並且初始篩選使用不具有KLH的免疫原肽來進行。第二篩選使用相同肽以及Tau386-408[P-Ser396]、Tau386-408[P-Ser404]和非-磷醯基肽Tau386-408來進行(圖13B)。基於該篩選，克隆被選擇用於第一和第二亞克隆。重要地，鑑定多種強陽性克隆(＞50)，並且已經鑑別穩定克隆，該克隆特異性識別該區域內的磷醯基-表位或結合該區域內的非-磷酸化位點，從而允許在分子的相同區域內結合磷醯基-或非-磷醯基tau表位的抗體的效果和安全性性能的比較。從中選擇磷醯基-特異性單克隆抗體用於進一步亞克隆，6個中的4個維持它們對磷醯基-Ser404表位的特異性(參見圖14A中的克隆1F12C2、1F12G6、4E6E3，和4E6G7)。另外2個克隆具有較差的磷醯基-特異性(8B2D1)或非-特異性(8B2D4)(圖14A)。在進一步亞克隆後，非-磷醯基-特異性單克隆抗體中的6B2E9和6B2G12尤其地維持它們的非-特異性(圖14B)。針對來自JNPL3P301L小鼠和野生型(Wt)小鼠的腦勻漿，測試4個P-Ser396，404tau磷醯基-特異性(圖15A)和非-磷醯基-特異性(圖15B)單克隆抗體克隆的反應。4個磷醯基-特異性克隆中的4E6G7顯示最強的反應(圖15)，這與圖14A的ELISA結果一致。與也識別tauP-Ser396，404表位的PHF-1抗體不同，相比Wt勻漿，所有克隆更好地與JNPL3P301L腦勻漿反應。如預料的一樣，非-磷醯基-特異性克隆反應更快，，正如多數tau是非-磷酸化的。用通過在C-末端上的半胱氨酸殘基連接於KLH的Tau260-271[P-Ser262](SEQIDNO：12)，免疫其他一組10隻balb/c小鼠。雖然針對免疫原Tau260-271[P-5er262]免疫原產生強的效價，但血漿抗體也識別非-磷醯基肽Tau260-271(圖16A)。從第二次亞克隆，選擇8個穩定的磷醯基-特異性克隆用於進一步分析(圖16B)，並且選擇2C11克隆用於抗體產生，因為它是IgG2a的同種型。IgG3具有較短的半衰期，因而對被動免疫研究來說是不理想的。測試3個磷醯基-特異性P-Ser262tau單克隆抗體克隆針對來自JNPL3P301L和野生型(Wt)小鼠腦勻漿的反應(圖17)。相比其他磷醯基-特異性克隆，2C11抗體克隆識別更高分子量帶，而且它不區分野生型和P301L組織。5F7D10和5F7E9是其他克隆的代表。Tau-5識別總tau並別結合於在tau胺基酸216-227附近的表位。CP27識別人類tau而不是鼠tau。如圖18A-18E所示，在P301L纏結小鼠腦切片中，5F7D10抗體克隆易於檢測tau病理。在P301L腦切片中，相對於野生型(圖18B)，5F7D10單克隆抗體顯示強組織染色(圖18A)。在同樣的纏結小鼠中，PHF1抗體篩選tau病理(圖18C)，雖然它的圖案與5F7D10抗體的圖案是不一樣的，但這也不奇怪，因為他們識別不同的tau表位。圖18D是圖18A方框區域的放大圖，其描述了帶有聚集的tau的神經元。圖18E是利用5F7D10檢測的纏結-樣病狀(在不同JNPL3P301L小鼠中)的更高的放大圖。雖然本文詳細地描寫和敘述了優選的實施方案，但對相關領域熟練的技術人員來說，非常明白的是在不脫離本發明精神的條件下可以做很多修飾、添加、替換等等，而且如在權利要求所定義，這些都被認為是在本發明的範圍之內。當前第1頁1 2 3