一種檸檬酸的生產方法

2023-07-09 13:14:31 1

專利名稱：一種檸檬酸的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種檸檬酸的生產方法。
背景技術：
檸檬酸是有機酸中第一大酸，由於物理、化學等方面的優異性能，廣泛應用於醫藥、化學、電子、紡織、石油、皮革、建築、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業領域。檸檬酸的生產方法主要有兩種一種是從天然含檸檬酸的果汁中提取；另一種是用發酵法進行生產，目前工業上主要以黑麴黴發酵法生產檸檬酸為主。具體的做法是將黑麴黴接種到發酵培 養基中，發酵培養基中含有澱粉質原料酶解產物和氮源，經過發酵和固液分離得到檸檬酸的溶液。目前，工業上發酵法生產檸檬酸常用3 X IO5L的發酵罐，每次發酵使用的澱粉質原料為5. 6 X IO4千克，最終發酵得到的檸檬酸為32. 5X 103-3. 4X IO3千克。如果想要擴大產能，只能增大發酵罐的體積、增加發酵罐的數目或者其他改變現有設備的方法，這樣勢必造成工業生產成本的極大增加。因此，迫切需要開發一種不改變現有設備就能使黑麴黴發揮其最大效用、提高檸檬酸產能的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠有效提高檸檬酸產能的檸檬酸的生產方法。本發明的發明人經過研究發現，目前黑麴黴發酵法整體工藝產能較低的原因在於黑麴黴的利用率不高，黑麴黴的發酵過程大致可以分為三個階段，一是發酵前期，主要是黑麴黴的生長階段，同時菌體產生糖化酶，糖化酶將原料中的多糖轉化為黑麴黴可以利用的葡萄糖，葡萄糖經過一系列代謝途徑，將葡萄糖轉化為檸檬酸，由於糖被黑麴黴利用合成了有機酸使PH值下降而進入主發酵期；二是主發酵期，即產酸階段，在此階段中，檸檬酸大量積累；三是發酵後期，即自溶階段，隨著養分的耗盡，菌體蛋白酶變得活躍，致使PH值又呈上升趨勢，此時菌體趨於自溶而代謝活動終止。在整個發酵過程中，進入第二階段後，由於 PH值下降，糖化酶的活性受到抑制，導致在主發酵期過程中，部分黑麴黴沒有足夠的葡萄糖可以進行轉化，造成了生物能源和設備的極大浪費。本發明提供了一種檸檬酸的生產方法，該方法包括在生成檸檬酸的條件下，將黑麴黴接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液，其特徵在於，該方法還包括向發酵液中添加具有6個碳原子的單糖，添加具有6個碳原子的單糖的時間在將黑麴黴接種到發酵培養基後24小時至發酵完成前5小時的時間段內。本發明通過添加單糖，充分利用了黑麴黴的轉化功能，在不改變設備和反應條件等能耗的前提下，得到了較高的檸檬酸產能，如實施例1和對比例2中，使用同樣的300L型號的設備，發酵同樣重量的澱粉質原料，實施例1可以得到45. 69千克檸檬酸，而對比例2 僅獲得33. 32千克檸檬酸。由此可見，相比現有技術，本發明提高了整體設備的利用率，進而提高了整體工藝的產能。
具體實施方式
本發明提供了一種檸檬酸的生產方法，該方法包括在生成檸檬酸的條件下，將黑麴黴接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液，其特徵在於，該方法還包括向發酵液中添加具有6個碳原子的單糖，添加具有6個碳原子的單糖的時間在將黑麴黴接種至發酵培養基後24小時至發酵完成前5小時的時間段內。其中，所述發酵培養基為本領域技術人員公知的概念，指微生物發酵所需的供微生物生長和維持用的人工配製的養料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。所述發酵液也為本領域技術人員公知的概念，指接入微生物菌種的液體培養基(該液體培養基也即本發明中所稱發酵培養基)，經過一段時間的培養後所得產物。根據本發明，所述單糖的添加量可以在較大範圍內變化，考慮到既要充分利用黑麴黴的轉化功能，又要結合成本因素，優選情況下，所述單糖的添加量與發酵液總量的重量比為1 8-100，進一步優選為1 10-50，最優選為1 13-28。添加單糖是為了充分利用黑麴黴的轉化功能，添加的時間點很關鍵，過早的添加反而造成了轉化效率的降低，本發明的對比例1在黑麴黴接種到發酵培養基之前就在在發酵液中添加了單糖，對比例1中檸檬酸的轉化效率僅為92. 5%,比不添加單糖的對比例2 中檸檬酸的轉化效率93. 31%還低。究其原因可能有兩方面，第一，對比例1中碳源過多， 造成單糖轉化為檸檬酸的速率過快，PH值降低的速率也過快，導致菌體生長不足和菌體早衰；第二，對比例1中補加了單糖，在發酵高泡沫期時容易產生溢料現象，從而造成原料的損失。而過晚的添加，黑麴黴已經到了生長的衰敗期，將單糖轉化為檸檬酸的功能變弱，即使添加單糖也難以得到很好的效果。因此，優選開始添加具有6個碳原子的單糖的時間為將黑麴黴接種至發酵培養基後24-56小時，進一步優選為40-50小時，優選結束添加具有6個碳原子的單糖的時間為將黑麴黴接種至發酵培養基後60-70小時，這樣能夠在不改變設備和運轉條件的情況下，提高檸檬酸的產能，從而提高整體設備的利用率。根據本發明，對於所述單糖或含有單糖的水溶液的添加方式沒有特殊的限定，可以一次添加，多次添加或連續添加。多次添加和連續添加能夠使發酵液中總糖保持在一定範圍內，因此，添加方式優選為多次添加或連續添加。當添加方式為多次添加時，優選使多次添加均勻分布在添加時間段內，相鄰兩次添加的時間間隔不大於8小時，優選地，相鄰兩次添加的時間間隔不大於4小時，每次添加的單糖的量可以相同或不同，優選情況下，每次添加的單糖的量相同。為了獲得更高的檸檬酸產能和發酵反應的穩定性，所述添加方式進一步優選為連續添加，所述連續添加的單糖的量使得所述發酵液中總糖保持為2-5重量％。根據本發明，對於所述添加的單糖的形態沒有嚴格的要求，可以為單糖固體和/ 或含有單糖的水溶液。發酵液中總糖保持在一定範圍內能夠提高最終的檸檬酸產能，因此， 優選添加的含有單糖的水溶液中單糖的濃度為25重量％以上。根據本發明，所述單糖可以為任何含有6個碳原子的單糖，如葡萄糖，果糖，半乳糖等，優選為葡萄糖和/或果糖，由於葡萄糖是黑麴黴發酵生成檸檬酸過程中的天然原料單糖，同時考慮到成本因素，所述單糖優選為葡萄糖。

根據本發明，所述含有單糖的水溶液為各種含有單糖的水溶液，優選地，所述含有單糖的水溶液為葡萄糖母液。所述葡萄糖母液為本領域人員公知的概念，指的是工業上結晶法生產葡萄糖時，結晶後剩下的葡萄糖溶液。比較實施例1和實施例2可以看出，實施例 1利用葡萄糖母液作為添加的單糖，實施例2利用純的葡萄糖水溶液作為添加的單糖，實施例1與實施例2能夠得到相當的檸檬酸產能，而利用葡萄糖母液作為添加的單糖能夠更有效地降低生產成本，因此本發明優選使用葡萄糖母液作為添加的單糖。根據本發明所述的方法，該方法還包括向發酵液中添加氮源，添加氮源的時間在將黑麴黴接種至發酵培養基後24小時至發酵完成前5小時的時間段內，添加氮源的作用是為了更好的維持黑麴黴的生長，因此優選情況下，以氮元素計，所述氮源的添加量可以為所述添加的單糖的量的0. 033-0. 35重量％，進一步優選為0. 1-0. 2重量％。根據本發明，在將黑麴黴接種至發酵培養基後24小時內，對添加所述氮源的具體時間並沒有特別的限定，可以與單糖的添加時間相同或不同，優選地，所述氮源的添加時間與所述單糖的添加時間相近，更優選地，所述氮源與單糖同時添加。需要明確的是，同時添加的氮源的量與單糖的量符合上述氮源添加總量與單糖添加總量之間的比例關係。根據本發明，所述氮源可以為任何能夠作為黑麴黴生長所需氮源的物質，包括有機氮源和/或無機氮源。優選地，所述氮源為尿素、硫酸銨、硝酸銨、玉米蛋白和玉米漿中的至少一種。有機氮源中含有其他的營養成分，對於黑麴黴發酵生產檸檬酸有更好的促進作用，因此更優選地，所述氮源為有機氮源，如玉米蛋白和/或玉米漿。發酵過程就其本質來說是由微生物參與的生物化學反應過程，因此微生物細胞的數量、狀態、代謝情況對產物的生物合成有著重要的影響。菌體濃度的大小對發酵產物的產率有著重要的影響。理論上菌體濃度越大，產物的產量也越大，但是菌體濃度過高會產生其他影響，如營養物質消耗過快，發酵液中的營養成分發生明顯的改變，有毒物質的積累等， 這些可能改變菌體的代謝途徑。因此，對於檸檬酸發酵，接種量為2. 4X IO4個菌落形成單位才能達到最佳的產酸率，更多的接種量非但不會提高最終的檸檬酸產能，反而會影響檸檬酸產能。但是本發明的發明人在研究中發現，在本發明中，接種比常規量高的黑麴黴菌種反而得到了更高的檸檬酸轉化率和單次產量。如本發明的實施例1中，接種了 3. 5X104個黑麴黴菌種形成單位，並且添加了單糖和氮源，實施例1中檸檬酸的轉化率和單次產量分別為96. 77%和45. 69千克；對比例2與實施例1接種相同量的黑麴黴，但是沒有添加單糖和氮源，對比例2中檸檬酸的轉化率和單次產量分別為93. 31%和33. 32千克；實施例4接種常規量的黑麴黴菌種，添加了單糖和氮源，實施例4中檸檬酸的轉化率和單次產量分別為95. 60%和42. 88千克；對比例3接種常規量的黑麴黴菌種，但沒有添加單糖和氮源，對比例3中檸檬酸的轉化率和單次產量分別為94%和33. 57千克；分別比較實施例1與對比例2和實施例4與對比例3可以看出，在添加單糖和氮源的條件下，無論是否提高發酵罐中接種的黑麴黴的量，都能夠提高檸檬酸的轉化率和單次產量，比較實施例1和實施例4可以看出，在添加單糖和氮源的情況下，提高發酵罐中接種的黑麴黴的量能夠提高檸檬酸的轉化率和單次產量，但是比較對比例2和對比例3可以看出，沒有添加單糖和氮源的情況下， 只是單純的提高發酵罐中接種的黑麴黴的量反而造成檸檬酸的轉化率和單次產量的降低。
因此，本發明中，以每克發酵培養基為基準，所述黑麴黴的接種量可以為 1. 8X104-5. 3 X IO4個菌落形成單位，優選地，以每克發酵培養基為基準，所述黑麴黴的接種量為2. 5 X 104-4. 0 X IO4個菌落形成單位。本發明中，所述發酵的條件沒有特別的限制，可以為本領域常規的發酵條件，例如，所述發酵的條件可以包括溫度為30-40°C，優選為30-35°C ；pH值為1_7，優選為2_4， 通氣量為0. 1-1體積體積·分鐘；優選為0. 2-0. 8體積體積·分鐘；時間為75-95小時， 優選為80-90小時。所述菌落形成單位的定義為將稀釋後的一定量的菌液通過澆注或塗布的方法，讓其內的微生物單細胞一一分散在培養基平板上，待培養後，每一活細胞就形成一個菌落。即每毫升菌液中含有的單細胞的數目。

所述菌落形成單位可以通過本領域公知的方法測定，例如，通過血球計數板計數。根據本發明，對發酵培養基的成分沒有特別的要求，只要可以用於檸檬酸發酵的發酵培養基即可。優選地，所述發酵培養基含有澱粉質原料酶解產物碳源含量為13-21重量％，氮源含量為0. 06-0. 14重量％，磷源含量為0. 005-0. 07重量％，無機鹽含量0. 1-2. 6 重量％，水含量為77-86重量％。一般地，澱粉質原料酶解得到澱粉質原料酶解殘渣和澱粉質原料酶解液化清液，通常可以將澱粉質原料酶解液化清液用於製備發酵培養基，也可以將澱粉質原料酶解液化清液與澱粉質原料酶解殘渣混合後用於製備發酵培養基。本發明所述澱粉質原料酶解產物優選由澱粉質原料酶解殘渣和澱粉質原料酶解液化清液與水混合或不與水混合得到，且進一步優選以所述發酵培養基的總重量為100重量份為基準， 所述澱粉質原料酶解液化清液的用量為80-95重量份，所述澱粉質原料酶解殘渣的用量為 0. 5-10重量份，水的用量為0-15重量份。根據本發明，所述澱粉質原料酶解液化清液可以通過多種方法製備得到，例如，可以通過如下方法製備得到將澱粉質原料粉碎，將粉碎後的產物進行酶解，得到酶解產物， 將酶解產物固液分離，得到澱粉質原料酶解液化清液和澱粉質原料酶解殘渣，所述固液分離的條件使澱粉質原料酶解殘渣的固含量為5-60重量％，更優選為30-50重量％。根據本發明，所述澱粉質原料可以為本領公知的各種可以用於酶解、發酵製備檸檬酸的含有澱粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種，優選情況下，所述澱粉質原料為玉米。所述酶解步驟可以通過本領域常用的方法完成，比如向粉碎產物中添加產酶微生物和/或酶，在產酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產酶微生物為能夠分泌澱粉酶的產酶微生物。所述酶包括澱粉酶。由於微生物生長會產生副產物，因此優選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出於成本考慮，優選以每克粉碎後的粉碎產物的乾重計，所述澱粉酶的用量為15-50個酶活力單位。本發明所述酶的酶活力單位的定義為在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫克澱粉轉化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。所述酶解的溫度可以在很大範圍內改變，優選為70_105°C，更優選為80_95°C。所述酶解的時間理論上越長越好，考慮到設備利用率，優選所述酶解的時間為90-150分鐘， 更優選為100-120分鐘。所述酶解的pH值可以在很大範圍內改變，優選為5. 0-7.0，更優選pH 值為 5. 4-5.7。澱粉酶是指能夠分解澱粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述澱粉酶一般包括α -澱粉酶、β-澱粉酶、糖化酶和異澱粉酶。根據本發明，優選使用α -澱粉酶和/或異澱粉酶。根據本發明，所述固液分離的方法與裝置為本領域技術人員所公知，例如，壓濾機或離心機。所述黑麴黴可以採用常規的方法接種，例如，在被接種至發酵培養基中之前，將所述黑麴黴經過種子培養處理，之後將得到的種子液加入到發酵培養基中。黑麴黴種子培養的程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑麴黴的生長進行觀察，當pH在 2. 0-2. 5、酸度0. 5-2. 0%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時停止培養。優選情況下，所述種子培養處理的方法包括將黑麴黴接種在黑麴黴培養液中進行培養，所述黑麴黴培養液中含有10-17重量％的玉米粉，接種後黑麴黴培養液中黑麴黴的濃度為3Χ105-4Χ105個/毫升。根據本發明，所述黑麴黴培養液的製備方法沒有特別的限制，只要得到的培養液能夠適用於黑麴黴的培養即可。根據本發明，所述黑麴黴的培養條件可以在很大範圍內改變，例如所述培養的條件可以包括培養的溫度可以為25-45°C，pH值可以為1-7，通氣量可以為0. 05-0. 5體積 體積 分鐘，培養的時間可以為45-65小時；更優選的情況下，所述培養的條件可以包括培養的溫度可以為30-40°C，pH值可以為2-4，通氣量可以為0. 1-0. 3體積體積 分鐘，所述培養的時間可以為50-60小時。術語「通氣量」一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(ν/ν ·π η)，例如通氣比為1 0. 1-1，簡稱通氣量為0. 01-1體積體積 分鐘。所述培養的設備為本領域技術人員所公知，例如，可以使用發酵罐進行培養。按照本發明的方法製備得到的發酵產物檸檬酸可以用常規的方法，根據不同工業產品的要求分離並精製，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝。下面結合實施例對本發明進行更詳細的說明。實施例1本實施例用於說明本發明提供的檸檬酸的生產方法。(1)將收穫的56千克玉米在熱水槽潤燜，直至玉米的含水量為15重量％，然後進行粉碎，得到平均粒子直徑為400微米的粉碎後產物。(2)將粉碎後的產物按25重量％的濃度調漿，相對於每克粉碎後的產物，加入20 個酶活力單位的澱粉酶(諾維信公司，α-澱粉酶，本發明實施例中均為此澱粉酶)，進入噴射器，在85°C、pH為5. 5的條件下酶解100分鐘，得到酶解產物Al。(3)將酶解產物Al通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出酶解液化清液和酶解濾渣，其中，酶解殘渣的含水量為50%。(4)配製發酵培養基，將170千克的上述 酶解液化清液、2. 0千克的酶解殘渣和13 千克的水滅菌後加入到300L的發酵罐中，得到發酵培養基Bi，其中碳源含量為16重量％， 氮源含量為0. 095重量％，磷源含量為0. 06重量％，無機鹽含量0. 4重量％，水含量為83. 4%。(5)將步驟(2)中的部分酶解液化液，加水稀釋至總糖的10重量％，得到培養液， 將培養液投入種子罐，加熱到121°C消毒，維持30分鐘後快速降溫至36°C，接入黑麴黴菌種 (黑麴黴T01，天津工業微生物所，本發明實施例中均為此黑麴黴菌種，接種量為每克酶解液化液3X IO5個菌落形成單位)，在36°C、0. 4體積體積·分鐘的通氣條件下進行菌種培養；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑麴黴的生長進行觀察，當pH在2. 0、酸度 1 %、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養。(6)將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，並在發酵過程中檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基3. 5X104個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為 35°C，pH值為3，通氣量為0. 4體積體積 分鐘，當發酵進行到第45小時的時候(從將黑麴黴接種到發酵罐中開始計算，本發明的實施例中的發酵時間均如此計算)， 採用連續添加的方式，勻速地加入28千克的添加溶液，所述添加溶液為尿素濃度為0. 16重量％的葡萄糖母液，其中葡萄糖的濃度為50重量％，當發酵進行到第65小時的時候停止加入，加入添加溶液的過程中發酵液的總糖含量為3. 5重量％，發酵進行到第80小時的時候進行固液分離，得到檸檬酸溶液。根據GB 1987-2007標準檢測實施例1中所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉化率和單次產量，轉化率(％ )=檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)X檸檬酸溶液的體積/總糖的重量X100%，檸檬酸的單次產量=檸檬酸溶液的濃度X檸檬酸溶液的體積，結果如表1所示。對比例1根據實施例1所述的方法生產檸檬酸，不同的是，步驟(6)中與實施例1相同量的葡萄糖和尿素在發酵之前加入到發酵罐中，即步驟(6)為在發酵罐中加入28千克的添加溶液，所述添加溶液為尿素濃度為0. 16重量％的葡萄糖母液，其中葡萄糖的濃度為50重量％，將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4) 的發酵罐中開始發酵，並檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基3. 5X104個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為35°C，pH值為3，通氣量為0. 4體積體積 分鐘，發酵進行到第80小時的時候進行固液分離，得到檸檬酸溶液。對比例2根據實施例1所述的方法生產檸檬酸，不同的是，在步驟(6)中不添加糖和尿素， 而是添加28千克的發酵培養基Bi，即對比例2的步驟(6)為將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，並檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基3. 5X IO4個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為 35°C，pH值為3，通氣量為0. 4體積體積 分鐘，當發酵進行到第45小時的時候，採用連續添加的方式，勻速地加入28千克的發酵培養基Bi，發酵進行到第80小時的時候進行固液分離，得到檸檬酸溶液。實施例2本實施例用於說明本發明提供的檸檬酸的生產方法。(1)將收穫的56千克的玉米在熱水槽潤燜，直至玉米的含水量為20重量％，然後進行粉碎，得到平均粒子直徑為800微米的粉碎後產物。
(2)將粉碎後的產物按25重量％的濃度調漿，相對於每克粉碎後的產物，加入45 個酶活力單位的澱粉酶，進入噴射器，在90°C、pH為5的條件下酶解90分鐘，得到酶解產物 A2。(3)將酶解產物A2通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出酶解液化清液和酶解濾渣，其中，酶解殘渣的含水量為30%。(4)配製發酵培養基，具體組成為160千克的酶解液化清液、9千克的酶解殘渣和 16千克的水滅菌後加入到發酵罐中，得到發酵培養基B2。其中碳源含量為18. 6重量％，氮源含量為0. 1重量％，磷源含量為0. 055重量％，無機鹽含量0. 17重量％，水含量為81%(5)將步驟(2)中得到的部分酶解液化液，加水稀釋至總糖10%，得到培養液，將培養液投入種子罐，投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為培養液總重量的0. 35%，加熱到120°C消毒，維持20分鐘後快速降溫至36°C，接入黑麴黴菌種(接種量為每克酶解液化清液3. 5X IO5個菌落形成單位)，在36°C、0. 4體積體積·分鐘的通氣條件下進行菌種培養；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑麴黴的 生長進行觀察，當pH在2. 0、酸度 1 %、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養。(6)將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，並在發酵過程中檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基2. 5 X IO4個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為30°C，pH值為2，通氣量為1體積體積·分鐘，當發酵進行到第40小時的時候，採用連續添加的方式，勻速地加入30千克的添加溶液，所述添加溶液為尿素濃度為 0. 125重量％的葡萄糖水溶液(即添加溶液中只有尿素，葡萄糖和水)，其中葡萄糖的濃度為30重量％，當發酵進行到第60小時的時候停止加入，加入添加溶液的過程中發酵液的總糖含量為4. 5重量％，發酵進行到第83小時的時候進行固液分離，得到檸檬酸溶液。實施例3本實施例用於說明本發明提供的檸檬酸的生產方法。(1)將收穫的56千克玉米在熱水槽潤燜，直至玉米的含水量為10重量％，然後進行粉碎，得到平均粒子直徑為500微米的粉碎後產物。(2)將粉碎後的產物按25重量％的濃度調漿，相對於每克粉碎後的產物，加入30 個酶活力單位的澱粉酶，進入噴射器，在80°C、pH為6的條件下酶解120分鐘，得到酶解產物A3。(3)將酶解產物A3通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出酶解液化清液和酶解濾渣，其中，酶解殘渣的含水量為15%。(4)配製發酵培養基，具體組成為155千克的酶解液化清液、12千克的酶解殘渣和18千克的水，滅菌後加入到發酵罐中，得到發酵培養基B3。其中碳源含量為14. 75重量％，氮源含量為0. 12重量％，磷源含量為0. 015重量％，無機鹽含量2. 4重量％，水含量為 82. 7%。(5)將步驟(3)中的部分酶解液化清液，加水稀釋至總糖10%投入種子罐，得到培養液，將培養液投入種子罐，加入尿素，尿素的加入量為種子罐培養液總重量的0. 35%，力口熱到120°C消毒，維持20分鐘後快速降溫至36°C，接入黑麴黴菌種(接種量為每克酶解液化清液4X IO5個菌落形成單位)，在36°C、0. 4體積體積·分鐘的通氣條件下進行菌種培養；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑麴黴的生長進行觀察，當pH在2. 0、酸度1 %、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(6)將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，並在發酵過程中檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基4X IO4個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為32°C，pH值為4，通氣量為0. 1體積體積·分鐘，當發酵進行到第50小時的時候，採用連續添加的方式，勻速地加入18千克的添加溶液，所述添加溶液為尿素濃度為 0. 088重量％的葡萄糖母液，其中葡萄糖的濃度為40重量％，當發酵進行到第70小時的時候停止加入，加入添加溶液的過程中發酵液的總糖含量為2. 5重量％，發酵進行到第88小時的時候進行固液分離，得到檸檬酸溶液。實施例4本實施例用於說明本發明提供的檸檬酸的生產方法。按照實施例1所述的方法生產檸檬酸，不同的是，步驟(6)中黑麴黴的接種量為 每克發酵培養基2. 4 X IO4個菌落形成單位。對比例3按照實施例4所述的方法生產檸檬酸，不同的是，步驟(6)中不添加糖和尿素，即對比例3的步驟(6)為將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，並檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基2. 4X IO4個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為 35°C，pH值為3，通氣量為0. 4體積體積 分鐘，發酵88小時後進行固液分離，得到檸檬酸溶液。實施例5本實施例用於說明本發明提供的檸檬酸的生產方法。按照實施例2所述的方法生產檸檬酸，不同的是，步驟(6)中，添加30千克的濃度為30重量％的果糖水溶液代替30千克的濃度為30重量％的葡萄糖水溶液。實施例6本實施例用於說明本發明提供的檸檬酸的生產方法。按照實施例1所述的方法生產檸檬酸，不同的是，步驟(6)中不添加尿素，即實施例6的步驟(6)為將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，並檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基3. 5X IO4個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為 35°C，pH值為3，通氣量為0. 4體積體積 分鐘，當發酵進行到第45小時的時候，採用連續添加的方式，勻速地加入28千克的添加溶液，所述添加溶液為葡萄糖濃度為50重量％的葡萄糖母液，當發酵進行到第65小時的時候停止加入，發酵進行到第80小時的時候進行固液分離，得到檸檬酸溶液。實施例7本實施例用於說明本發明提供的檸檬酸的生產方法。按照實施例1所述的方法生產檸檬酸，不同的是，步驟(6)中的單糖和氮源分多次添加，即實施例7的步驟(6)為將步驟(5)培養的黑麴黴菌種加入到步驟(4)的發酵罐中開始發酵，並在發酵過程中檢測發酵液中的總糖，接種量為每克發酵培養基3. 5 X IO4個菌落形成單位，發酵條件包括溫度為35°C，pH值為3，通氣量為0. 4體積體積·分鐘，當發酵進行到第45小時的時候分6次加入28千克葡萄糖母液，其中葡萄糖的濃度為50重量％，平均每4小時添加一次，在每次添加葡萄糖固體後的10分鐘內，一次性添加0. 15千克濃度為20%的玉米蛋白， 當發酵進行到第65小時的時候停止加入，當發酵進行到第80小時的時候進行固液分離，得到檸檬酸溶液。表 權利要求
1.一種檸檬酸的生產方法，該方法包括在生成檸檬酸的條件下，將黑麴黴接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液，其特徵在於，該方法還包括向發酵液中添加具有6個碳原子的單糖，添加具有6個碳原子的單糖的時間在將黑麴黴接種至發酵培養基後24小時至發酵完成前5小時的時間段內。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述單糖的添加量與發酵液總量的重量比為 1 8-100。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述單糖的添加量與發酵液總量的重量比為 1 13-28。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，開始添加具有6個碳原子的單糖的時間為將黑麴黴接種至發酵培養基後24-56小時。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，開始添加具有6個碳原子的單糖的時間為將黑麴黴接種至發酵培養基後40-50小時。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，結束添加具有6個碳原子的單糖的時間為將黑麴黴接種至發酵培養基後60-70小時。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述單糖分多次添加，相鄰兩次添加的時間間隔不大於8小時，每次添加的單糖的量相同。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述添加的方式為連續添加。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述連續添加的單糖的量使得添加過程中所述發酵液的總糖含量為2-5重量％。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述單糖以單糖固體和/或含有單糖的水溶液的形式添加，所述含有單糖的水溶液中單糖的濃度為25重量％以上。
11.根據權利要求1或10所述的方法，其中，所述單糖為葡萄糖，所述含有單糖的水溶液為葡萄糖母液。
12.根據權利要求1-6、8-10和11中任意一項所述的方法，其中，該方法還包括向發酵液中添加氮源，添加氮源的時間在將黑麴黴接種至發酵培養基後24小時至發酵完成前5小時的時間段內，且以氮元素計，所述氮源的添加量為所述添加的單糖的量的0. 033-0. 35重量％。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述氮源與單糖同時添加。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述氮源為尿素、硫酸銨、硝酸銨、玉米蛋白和玉米漿中的至少一種。
15.根據權利要求1所述的方法，其中，以每克發酵培養基為基準，黑麴黴的接種量為1.8X 104-5.3X 104個菌落形成單位，所述發酵的條件包括溫度為30-40°C，通氣量為 0. 1-1體積體積·分鐘，發酵的時間為75-90小時。
16.根據權利要求1所述的方法，其中，以每克發酵培養基為基準，黑麴黴的接種量為 2. 5X 104-4. OX IO4個菌落形成單位。
17.根據權利要求1所述的方法，其中，所述發酵培養基含有澱粉質原料酶解產物，所述澱粉質原料酶解產物中碳源含量為13-21重量％，氮源含量為0. 06-0. 14重量％，磷源含量為0. 005-0. 07重量％，無機鹽含量0. 1-2. 6重量％，水含量為77-86重量％。
全文摘要
本發明提供了一種檸檬酸的生產方法，該方法包括在生成檸檬酸的條件下，將黑麴黴接種至發酵培養基中進行發酵，得到發酵液，其特徵在於，該方法還包括向發酵液中添加具有6個碳原子的單糖，添加具有6個碳原子的單糖的時間在將黑麴黴接種到發酵培養基後24小時至發酵完成前5小時的時間段內。本發明通過添加單糖，充分利用了黑麴黴的轉化功能，在不改變設備和反應條件等能耗的前提下，得到了更大量的檸檬酸，相比現有技術，本發明提高了整體設備的利用率，進而提高了整體工藝的產能。
文檔編號C12P7/48GK102443611SQ20101051195
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月13日 優先權日2010年10月13日
發明者盧宗梅, 葉志晨, 周勇, 周永生, 張繼學 申請人:中糧生物化學(安徽)股份有限公司