用於治療和預防腸道細菌感染的方法及組合物的製作方法

2023-07-08 22:26:41 1

專利名稱：用於治療和預防腸道細菌感染的方法及組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及胃腸道紊亂的治療或預防，涉及包含有胃腸道病原體抗原的疫苗，涉及從注射所述疫苗的動物(包括家畜和家禽)的血液、乳汁和禽蛋中獲得的免疫物質及其製備方法。具體地，本發明涉及用於治療和預防胃腸道紊亂的化合物和組合物，例如由諸如腸毒性大腸桿菌(E.coli)的革蘭氏陰性菌引起的腹瀉，本發明還涉及腹瀉的治療或預防方法。
背景技術：
本發明可以用於治療和預防由一系列微生物所引起的胃腸道疾病，這些微生物包括大腸桿菌(E. coli)、沙門氏菌(Salmonella)、彎曲狀桿菌(Campylobacter)、螺旋桿菌(Helicobacter)、弧菌(霍亂菌，Vibrio)、志賀氏菌(Shigelia)、耶爾森鼠疫桿菌(Yersinia)和氣單胞菌(Aeromonas)。然而,為了公開起見,本發明將以其針對人體內腸毒性大腸桿菌(ETEC)的應用為例進行說明。應當理解，本發明的範圍並不限於這ー個特定的應用。腸毒性大腸桿菌(ETEC)引起的腹瀉會給成人帶來極大的不適，並能導致未成年人和老年人的脫水死亡。很大一部分前往墨西哥、非洲和東南亞的旅遊者所遭受的腹瀉就是由ETEC引起的。對於旅遊者腹瀉，常用的治療方法是預防性抗生素治療，例如用阿莫西林治療。然而，抗生素耐藥性降低了抗生素治療的效果，便秘或腹瀉等副作用是常有的。症狀性治療用於治療嘔吐和腹瀉，例如用鹽酸洛哌丁胺、硫酸阿託品和鹽酸地芬諾酷。然而洛哌丁胺和阿託品的使用不當會導致嚴重的便秘，而地芬諾酯的使用不當會導致依賴性。這些藥劑對於孩子們來說也是不適用的。進ー步的治療包括使用等滲壓飲料的流體替代治療。然而，流體替代治療幾乎不能減輕病情，並且不會減少臨床腹瀉。進ー步的症狀治療和流體治療能夠治療症狀，但不能根除病因。乳汁和禽蛋製品在減輕胃腸道紊亂疾病的症狀中顯示出潛在的治療和預防作用。Peterson和Campbell在美國專利US 3，376，198中介紹了免疫產乳汁的蹄類動物以生產抗細菌和病毒的抗體或「保護性成分」。Carlendar等在BioDrugs, 2002,16 (6) :433-7中介紹了源於雞蛋黃的抗體在減少胃腸道開ロ部分(口腔)中巴斯德氏細菌中的應用。Shimamoto 等在 Hepatogastroenterology, 2002,49 (45) :709-714 中介紹了雞蛋中產生的抗幽門螺旋桿菌的特異性抗體在減少胃病患者體內幽門螺旋桿菌數量中的應用。
Linggood等在美國專利US 4，971，794中介紹了高免疫牛初乳作為抗大腸桿菌的抗體源的用途。母牛用混合菌株的菌毛製品進行疫苗接種。該專利介紹該疫苗必須包含表達Type I菌毛、CFA I菌毛、CFA 2菌毛和K88菌毛的多種大腸桿菌菌株的抗原。K88菌毛與豬的ETEC有夫。Hastings在美國專利US 5,017, 372中介紹了蹄類動物的高免疫初乳作為大腸桿菌抗體源的用途。蹄類動物的疫苗用下述方法製造不同類型的大腸桿菌在一定條件下生長得到CFA I或CFA 2，或者兩者同時得到。然後細菌用超聲波裂解以釋放出這些抗原，並加熱不穩定的毒素。Freedman 等在 The Journal of Infection Diseases 1998,177 :662-7 中介紹了高免疫初乳作為抗大腸桿菌的抗體源的用途。疫苗的製備是讓細菌菌株在肉湯培養基中生長以優化CFA的表達，然後使用沉降法及隨後的排阻色譜法或離子交換色譜法純化CFA。Teckett 等在 The New England Journal of Medicine,1988,5,12. ppl240_1243中描述了在牛的疫苗中引入多種失活(用甲醛或戊ニ醛處理)的細菌完整細胞懸液。所 述完整細胞懸液包含 O 型血清組06, 08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148, 0153和0159的大腸桿菌以及熱不穩定的腸毒素、霍亂毒素、CFAl和大腸桿菌表面抗原 3。大腸桿菌的 O 型抗原如 06，08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153和0159是熱穩定的抗原，位於細菌的細胞壁上而不是諸如菌毛(纖毛)或鞭毛的突出結構上。這些O型抗原由與通常為大多數革蘭氏陰性菌細胞壁材料的核脂多糖複合物相連接的多糖的一部分所組成。由於O型抗原與細胞壁之間的緊密聯繫，基於O型抗原的疫苗可以由細胞壁或完整的失活細菌製得。脂多糖內毒素是細菌細胞外壁的一個常規部分，它們的毒性區域包埋在細胞壁中(參見Endotoxins in Health and Disease. 1999,第12章和其他章節)。在常規的獸醫實踐中，使用完整細胞細菌抗原優於使用単一 O型抗原組分這樣ー個事實的深層原因在於O型抗原是內毒素一就動物福利和產量而言，在孕期牲畜身上使用高濃度內毒素在實踐中被認為是有問題的。現有技術中使用乳製品和蛋製品預防胃腸道紊亂症狀存在諸多問題。霍亂毒素(參見Teckett等，1988)很可能由於他們的高毒性而難以註冊。此外，熱不穩定性毒素，儘管有很高的免疫性也難以獲得保護。上述方法生產得到的抗體的保護範圍難以令人滿意。一個附帶的問題是要產生令人滿意的預防效果需要大量的免疫濃縮物。當使用完整細胞抗原時，會產生許多不同類型的抗體反應，並且抗體滴定度的化驗難以標定。一個關鍵的問題是特定檢測的抗體是否有保護性。完整細菌細胞有許多未必與保護性有關的抗原。另外，包含革蘭氏陰性菌的疫苗極有可能產生不利的疫苗反應，從而表現出由於不利的動物倫理報告和治療物品的不利反應報告所帯來的調節問題。不利的疫苗反應很可能會使牛奶廠的農場主停止參與任何生產牛奶抗體的冒險。這裡對於本發明背景的討論用於解釋本發明內容。這不應認為是承認任何相關的物質是公開、公知的，或者是任何國家的普通常識部分。

發明內容
發明人驚奇地發現，通過對動物體或人體施以ー種疫苗或抗所述疫苗產生的高免疫物質可以改善對革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的治療或預防。其中所述疫苗的特徵在於該疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵的細胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。因此，本發明一方面提供了一種治療或預防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的方法，該方法包括向一個個體施以ー種疫苗或者一種抗所述疫苗產生的高免疫物質的步驟，其中所述疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵的細胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。另ー方面，本發明提供了一種用於治療或預防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的組合物,該組合物含有通過用ー種疫苗免疫宿主動物而製得的高免疫物質,所述疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵的細胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。另ー方面，本發明提供了一種用於治療或預防諸如ETEC的產腸毒素的革蘭氏陰性菌引起的胃腸道功能障礙的高免疫物質的製備方法，所述高免疫物質是抗ー種疫苗而產 生的，所述疫苗包含有ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵的細胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。另ー方面，本發明提供了一種細胞壁抗原用於製備治療或預防諸如大腸桿菌(ETEC)的革蘭氏陰性菌引起的胃腸道疾病的高免疫物質的應用，其中所述細胞壁抗原具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特性，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。另ー方面，本發明提供了一種製備治療或預防動物胃腸道疾病的免疫球蛋白的方法，包括用一種疫苗免疫宿主動物，所述疫苗包含ー種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵的細胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的，從而誘導宿主動物產生含有所述免疫球蛋白的高免疫物質。根據本發明的方法生產的高免疫物質可以是高免疫初乳或高免疫初乳提取物，或者是高免疫蛋黃或高免疫蛋黃提取物。所述細胞壁抗原中的至少一部分是指從完整細菌細胞壁或者細胞壁碎片中分離得到的，在離心除去完整細胞或者固形細胞碎片後，至少10%的所述抗原能夠在上清液中被檢測到，該離心步驟應當在下述條件下進行a)所述抗原未形成微團或其他聚集結構，b)沒有危及細胞壁的完整性。優選的，至少20%的所述抗原能夠在上清液中被檢測到，更優選的是至少30%的所述抗原能夠被檢測到。所述抗原優選的主要從完整細菌細胞壁中分離得到。另ー個用於確定細胞壁抗原是獨立的還是從完整細菌細胞壁或細胞壁碎片中分離的方法如下所述1)通過使用劇烈的條件使細胞壁結構降解並釋放出O型抗原，對含有O型抗原和革蘭氏陰性細菌細胞壁或細胞壁碎片的水溶液進行分析，以確定每毫升中O型抗原的總含量；2)通過培養基培養，革蘭氏陰性菌達到特定濃度，使其O型抗原含量與步驟I確定的O型抗原含量相等；3)測量每毫升步驟2的細胞培養液中細胞壁的含量(數量)。所述細胞壁含量自然包含步驟I中測得的O型抗原的水平；4)比較步驟3中細胞壁的含量以及初始溶液中細胞壁的含量。如果相等，則可以推斷初始溶液中所有O型抗原都是與細胞壁相結合的。但是，如果初始溶液中細胞壁的含量低於步驟3中細胞壁的含量，則初始溶液中所含的O型抗原的含量大於細胞壁中預期的O型抗原的含量，因此一部分O型抗原是與細胞壁或細胞壁碎片相分離的。如果步驟3中革蘭氏陰性細胞壁物質(每毫升)的重量為W，那麼每毫升初始溶液中革蘭氏陰性細胞壁物質的重量優選的是低於O. 8W，較優選的是低於O. 3W，更優選的是低於O. 1W。水相中脂多糖相關抗原(O型抗原)的量可以用本領域中已知的方法進行測定，這些方法例如加熱、蛋白酶K消化以及在苯酹存在下進ー步加熱(見實施例11)。Lyngby等描述了其他測定脂多糖相關抗原的方法。一個簡單的標定脂多糖相關抗原的方法是與每毫升含有特定量的革蘭氏陰性菌或每毫升含有特定量的革蘭氏陰性細胞壁物質的細胞培養物相比較。較為有利的是與每毫升含有IO4UO6或108、或者更多微生物的細胞培養物相比較。對於水相中革蘭氏陰性細胞壁物質(完整細胞壁或碎片)的量的測定可以使用現有技術中已知的用於特定細胞壁的標準物來分析。例如肽聚糖是與革蘭氏陰性菌的細胞壁相關聯的，肽聚糖的分析方法Li等已作了描述。


圖I顯示了由水相製備的LPS分析的銀染SDS-PAGE凝膠圖譜。SDS-PAGE凝膠顯示苯酚預處理前後的樣品。處理後凝膠呈現出典型的LPS梯度。作為對照的左邊的條帶是煮沸後的細菌溶菌液。
具體實施例方式在本發明的下述詳細描述中，發明人主要針對從適當的免疫母牛獲得的高免疫初乳和高免疫初乳提取物的生產及應用進行描述。但是，本發明的範圍不應局限於此，應當理解，本方法同樣適用於高免疫雞蛋黃和高免疫雞蛋黃提取物的生產。高免疫初乳的製備方法通常包括以ー種疫苗免疫宿主動物，典型的是蹄類動物，所述疫苗含有O組血清型細胞壁抗原，其中至少一部分是從完整細胞壁分離得到。所述疫苗用於在宿主動物體內誘導免疫球蛋白的產生，再從宿主的乳汁中獲取免疫球蛋白。高免疫初乳可以用於治療或預防動物、包括人和非人動物的胃腸道功能紊亂。初乳在人類包括成人和嬰幼兒的治療或預防中尤其有用。初乳還可以用於非人類動物比如小豬的治療或預防。源自以細胞壁抗原疫苗免疫的宿主動物的高免疫初乳可以直接以乳汁的形式服用，同樣的，含有高免疫初乳的乳汁也可以用現有技術已知的方法進行處理，以富集或分離免疫球蛋白。這些產品可以是全脂奶、脫脂奶或乳清蛋白質。高免疫初乳衍的產品可以製成食品添加剤、水溶液、油類製品、乳液、凝膠等等，這些製品可以通過ロ服、局部、直腸、鼻吸、口腔、陰道給藥。所述製品的藥劑處方可以含有傳統的無毒的可接受的載體，並且還可以含有ー種或多種可接受的添加劑，包括可接受的鹽、聚合物、溶剤、緩衝劑、賦形劑、膨脹劑、稀釋劑、賦形劑、懸浮劑、潤滑剤、佐劑、載色劑、釋藥系統、乳化剤、崩解劑、吸收劑、防腐剤、表面活性剤、色素、香味劑或甜味劑。本發明優選的劑型是加入飲料中的粉劑、丸剤、糖漿、膠囊、片劑、顆粒、滴丸、可咀嚼的藥錠或食品添加齊U，使用本領域已知的技術製備。
如果上述組合物以片劑給藥，則所述片劑可以由活性成分和ー種或多種任意的附加成分通過壓制或者模製製成。壓製片劑可以使用合適的機器壓制而成，活性成分處於自由流動的形式，例如粉末或顆粒狀，可以選擇與粘結劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性劑或分散劑相混合。模製片劑可以採用ー種合適的機器，將粉狀活性成分和適當的載體的混合物用惰性液體稀釋劑潤溼後模製。 O型抗原可以採用有效量的剪切、勻漿、加熱或者它們的有效結合從細菌細胞壁中分離。用於分離的優選條件可以通過進行以下試驗來確定將完整細胞懸液進行有利於分離的處理後離心，移去完整細胞和固形細胞碎片。收集無細胞的液相產物，根據下列方式上凝膠A)無細胞液體中LPS的分析在前述得到的液體樣品中加入等體積的標準苯酚溶液，在65°C水浴中旋轉振蕩培養15min,姆隔5min旋轉振蕩一次以使液體中蛋白質變性。在4°C下離心lOmin，回收水相至ー個新的試管中。將I體積的3X的Laemmli緩衝液加入到2倍體積的樣品中，在15%的SDS-PAGE凝膠上分離。B) LPS 的銀染下述步驟優選的用於LPS的染色(Hitchook和Brown, 1983)(i)在200ml含有25% (v/v)異丙醇的7% (v/v)醋酸溶液中定色過夜；(ii)於150ml蒸懼水中以I. 05g高碘酸和4mI含有25% (v/v)異丙醇的7% (v/V)醋酸溶液(使用前臨時配製)氧化5min ；(iii)用200ml的蒸懼水洗漆30min,共洗漆8次；(iv)在組成為 O. IM NaOH(28ml)，濃縮(29. 4% )氨水，20% (w/v)的硝酸銀(5ml)以及蒸餾水(115ml)的溶液(使用前臨時配製並不斷攪拌)中銀染IOmin ；(V)用200ml的蒸餾水洗滌lOmin，共洗滌4次；(vi)在250ml顯影液(梓檬酸[50mg]、37%的甲醒[O. 5ml]，蒸懼水[カロ至I升])中顯影5 IOmin,溶液使用前臨時配製並最好在26°C下操作以優化LPS的染色；(vii)浸入終止液(200ml蒸懼水中加入IOml的7% [v/v]醋酸溶液)中Ihr ;(viii)在5%甘油中保存凝膠，並在纖維素膜間乾燥。在本發明的一個特別優選的實施例中，O型抗原從細菌細胞壁的分離是通過攪拌液體，例如，通過可以使用勻漿器，特別是安有一個轉子和一個定子的勻漿器。優選的，轉子外圍速率(m/s)與轉子-定子間隙(mm)的比值範圍為O. 2 20，優選的為O. 4 12，更優選的為O. 8 6，最選的為I 4。可以使用其他勻漿器，只要它們的最大剪切範圍內的剪切值與上述轉子-定子間隙的剪切值相似。在一個優選的例子中，所述O型抗原從細胞壁的分離是通過在40 80°C的範圍內進行加熱處理，優選的是在50 70°C的範圍內。處理的時間優選的為10 200分鐘，更優選的是30 60分鐘。優選的，所述疫苗還包含菌毛或類菌毛抗原CFA-UCFA-2或其它CFA，或其它工人的CFA，或者是它們的混合物，所述抗原至少一部分是從完整細菌細胞壁分離的。這些抗原可以與從細胞壁上脫落的菌毛有夫。製備所述分離的抗原或菌毛的方法在現有技術中已有描述，比如Linggood的美國專利US 4，971，794。
優選的，從中分離每個類型的O型抗原的細菌是在単獨的細菌培養系統中培養，並且在O型抗原從細菌分離後，所述抗原成分加在一起組成疫苗的成分。優選的，疫苗中血清型O 型抗原選自06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153和0159，以及其它與腸毒性大腸桿菌相關的血清型O型抗原。最優選的，疫苗中血清型O型抗原包含078。含有O型抗原的液體可以含有外來的物質。在一個優選的實施例中，所述液體用硫酸銨沉澱外來蛋白質以進ー步純化，純化時硫酸銨的濃度從O逐漸增加到20%,並離心除去外來物質。在一個優選的實施例中，所述分離的O型抗原被進ー步濃縮。在一個優選的實施例中，上述液體中加入20 %的硫酸按後，進一步加入硫酸按至終濃度為40 %,並尚心以使O型抗原存在於沉澱中。硫酸銨可以通過重懸和透析除去，例如通過ー種截留尺寸範圍為 1500 10000分子量單位(道爾頓)的薄膜。所述透析物質優選的組成為O. I 10mg/ml的蛋白質,更優的是O. 3 3mg/ml的蛋白質，將其加入到疫苗佐劑中，這些佐劑例如Montanide (銷售商Seppic,法國巴黎)、氫氧化招(購自Sigma化學公司，St Louis, MO, USA)或QullA(—種由抗原修飾的阜角苷/膽固醇微團組成的ISC0M，在美國專利US 6，383，498中有描述)、或其它現有技術已知的疫苗佐劑。在本發明的一個優選方案中，用於製備疫苗乳劑的佐劑為「Montanide ISA 206」，ー種NRA批准的獸醫學的佐劑，由Seppic生產，並由澳大利亞的Tall Bennet供應。Montanide ISA 206是ー種免疫促進複合物，包含有含十八烯酸和無水甘露醇的油性溶液。該產品已被開發用於混合油型疫苗的生產，並且是毒理學控制的，且純度較高。該佐劑允許製備混合型「油包水包油(w/o/w) 」免疫原/佐劑的乳劑，有效、穩定性好、流動性佳且易於注射。這種類型的配方通過水相中快速起效的抗原產生快速的免疫反應並通過油相中封閉的抗原產生持久的免疫應答。在一個優選的實施例中，I體積獲得的透析物質加入到0. 3 3體積的疫苗佐劑中，優選的是0. 7 I. 5體積的疫苗佐劑中。蛋白質分析的許多方法是現有技術已知的，例如 Lowrey 蛋白質分析法(J. Bio. Chem. 1951，193 :265-275)。接種疫苗導致高免疫初乳的產生，優選的是在動物分娩前對動物注射2到8次疫苗，注射量為0.3 15ml。連續兩次免疫的時間間隔為I 4周，更好的是2 3周。初乳是從哺乳動物，優選的是從蹄類動物，更優選的是從奶牛獲得的。美國專利US 5，780，028提供了初乳的生產和加工，在此引作參考。經處理的高免疫初乳可以製成片劑、膠囊內的粉劑或加入飲料內的添加剤，如美國專利US 5，780, 028中所描述。優選的，含有高免疫初乳的配方還含有ー種食品級的抗菌劑組分，比如柑橘提取物以及碘基防腐剤。在一個優選的實施例中，所述抗菌劑組分是雙酚羥基苯化合物家族中的葡萄柚種子提取物，美國佛蒙特州Ripton的Nutribiotics公司有售，商品名為Citricidal0優選的用於ロ服製劑配方高免疫初乳包含有抗多種抗原的抗體。所述優選的高免疫初乳的獲得是通過分離所述抗原加入到兩批或多批疫苗中，並用單ー批次的疫苗免疫兩批或多批家畜，並將從家畜獲得的的初乳混合。在一個優選的實施例中,所述疫苗包含大腸桿菌O型抗原,這些抗原選自06,08,09，015，020，025，027，029，030，063，064，078，088，0105，0114，0115，0126，0127，0128，0148，0153，0159。優選的，一個批次的疫苗含有大腸桿菌078抗原和CFA I菌毛抗原，而其他批次的疫苗包含以下抗原06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型O型抗原和CFA2菌毛抗原。在一個優選的實施例中，所述血清型O型抗原選自06，08，078，0128。

本發明最廣闊的前景是應用於治療和預防多種微生物引起的胃腸道疾病，特別適合於治療胃腸道毒性大腸桿菌感染，並特別適用於治療和預防旅遊者腹瀉。因此，本發明的ー個特別優選的實施例涉及ー種上述的方法或應用，其中革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。在最優選的實施例中，所述方法用於預防和治療腹瀉。以下結合實施例對本發明進行說明。應當理解，以下實施例僅用於說明本發明而不用於限定本發明的範圍。實施例I、單ー菌株大腸桿菌疫苗的生產本實施例描述了本發明的疫苗的製備方法，其中的細胞壁抗原為078，菌毛抗原為CFA I方法。過程如下第O 天步驟A、菌株的復壯將被復壯的菌株是E.coli H10407 (Taurchek等，PNAS USA. 2003,99 :7066-7071)。從培養基冰箱取2個CFA平板(Evens等，InfectImmun. 1977，18 =330-337)，置於生物安全操作櫃。將裝有E.coli H10407的小瓶從液氮罐中取出，放入生物安全操作櫃。打開小瓶，用滅菌的接種環取出少量凍化物，在CFA平板上劃線。「復壯平板」於培養箱中在通氣條件下37°C培養過夜。第I 天步驟B、「初始懸液」的接種檢測每個「復壯平板」是否染菌，如未染菌則繼續。操作在生物安全操作櫃中進行，用滅菌的接種環從ー個「復壯平板」上取出少量菌落，接種到ー個含有20ml pH 7. 2磷酸緩衝溶液(PBS)的McCartney瓶中。所用的McCartney瓶和PBS均經過高壓滅菌。步驟C、「疫苗平板」的接種將50 μ L 「初始懸液」接種到每一個複合CFA平板上(配製成微生物營養平板以產生CFA)。CFA平板的配製以I %酸解酪素(BD Difco)和O. 15%酵母提取物(Oxoid)加入含有O. 005 ^MgSO4 (無水)和O. 0005% MnCl2 (四水合物)的2%瓊脂中，見Evens等的培養基製備(Evens等，InfectImmun. 1977，18 =330-337)。「疫苗平板」置於37°C培養箱中，通氣條件下培養18 24小時。第2 天步驟D、「疫苗平板」上用於測試菌毛產量的血凝實驗
進行血凝實驗(Evens等，InfectImmun. 1977,18 :330-337)。為批次中將被使用的每ー個菌株測試ー個「疫苗平板」。如為陽性則繼續。步驟E、「疫苗平板」的洗滌將「疫苗平板」從培養箱中取出，檢測每個平板以防止染菌，棄去染菌的平板。操作在生物安全操作櫃中進行，用I. 5 2. Oml滅菌的O. IM磷酸鈉緩衝溶液(pH7. 2)洗下「疫苗平板」表面的細菌培養物，加入到滅菌的Schott瓶中。緩衝溶液使用前在冰浴中預冷。將疊氮鈉加到「疫苗洗液」中使之終濃度為0.05%。在「疫苗洗液」開始勻漿前在冰浴中保持至少30分鐘。步驟F、「疫苗洗液」的計數對「疫苗洗液」進行計數。確保所用物料被充分攪拌以使細菌團塊分散，並且所選稀釋液與每批製備的洗液中細菌細胞的濃度相適應。 步驟G、純度取樣收集足夠的物料用於測試每ー個「疫苗洗液」的純度(即3個HBA平板，3個TSA平板和3個MAC平板)。操作在生物安全操作櫃中進行，用每ー個「疫苗洗液」在3個HBA平板，3個TSA平板和3個MAC平板上劃線，用於平板篩選單ー菌落。將這些平板置於37°C培養箱在通氣條件下培養。第3 天步驟H、「純度試驗平板」的第一次檢杳對「純度試驗平板」進行第一次檢查。如平板上僅含有E. coli菌落，則繼續。步驟I、「疫苗洗液」的勻漿將「疫苗洗液」在勻漿器中，每隔I分鐘勻漿一次，共15分鐘，毎次間隔的I分鐘置於冰浴中冷卻。將「勻漿的疫苗洗液」在高速離心機中於12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留上清液(HVW上清I)，於4°C下儲藏I 3天。第4天步驟T、「純度試驗平板」的第二次檢杳對「純化實驗平板」進行第二次檢查。如平板上僅含有E. coli菌落，則繼續。第6天步驟K、LPS組分的分離將HVW上清I在高速離心機中於12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留上清液(HVW上清2)。在I個小時內往HVW上清2中緩慢加入滅菌的飽和硫酸銨溶液至達到20%的飽和度。加入硫酸銨飽和溶液的過程中，將HVW上清2置於磁力攪拌器上攪拌。加料結束後讓物料平衡30分鐘。將HVW上清2在高速離心機中於12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留上清液(HVW上清3)。在I小時內往HVW上清3中慢慢加入滅菌的飽和硫酸銨溶液至達到40 %的飽和度。加入硫酸銨飽和溶液的過程中，將HVW上清3置於磁力攪拌器上攪拌。加料結束後讓物料平衡30分鐘。
將HVW上清3在高速離心機中於12000Xg、4°C下離心20分鐘。保留沉澱(LPS組分)。將LPS組分用冷的O. 05M pH 7. 2的磷酸鈉緩衝溶液重懸，懸浮比率是每250個CFA平板IOml緩衝溶液，所述CFA平板用於產生「疫苗洗液」，LPS組分最初就是從「疫苗洗液」獲得。步驟L、LPS糹目分的誘析透析LPS組分，用截留量3500麗的透析膜 在4°C下於250 1000倍體積的O. 05MpH7. 2的磷酸鈉緩衝溶液中透析24 48小時。透析過程中，每2 8小時更換緩衝溶液。透析結束後，將「LPS透析液」置冰浴保藏直至用於蛋白質含量分析。第7天步驟M、「LPS透析液」的蛋白質含暈分析用Lowry蛋白質分析法測量每一「LPS透析液」中的蛋白質含量。在分析結果的基礎上稀釋每一「LPS透析液」，直至O. 05M pH 7. 2的磷酸鈉緩衝溶液中蛋白質含量為lmg/ml,然後置於滅菌的Schott瓶中保存。步驟N、疫苗的滅活在每一「LPS透析液」中加入甲醛直至甲醛的終濃度為3%。將「福馬林化的LPS透析液」於4°C下保藏3天。第10 天步驟O、無菌檢測部分I通過將O. 5ml「福馬林化的LPS透析液」接種入3個TSB試管肉湯中，對每個「福馬林化的LPS透析液」進行基本的無菌檢測。「無菌檢測試管」置於37°C培養箱中在通氣條件下培養。第14 天步驟P、無菌檢測部分2檢測「無菌檢測試管」是否生長缺乏。如純生長缺乏則繼續。(步驟Q)「福馬林化菌毛/LPS透析液」的保存將「福馬林化的LPS透析液」置於20°C以下以長時間保存。第14天或以後步驟R、輔佐階段I將「福馬林化的LPS透析液」置於水浴中至30°C。同時將等體積的佐劑(Montanide ISA 206)置於水浴中至 30°C。將佐劑倒入經高壓蒸汽滅菌的大燒杯中(S13)。用有3個葉片槳的Ika混合器以200rpm的速率攪拌佐劑。在2分鐘內逐漸加入「福馬林化的LPS透析液」。將轉速提高至2000rpm維持10分鐘。於40°C保存24小時。第15天或以後步驟S、輔佐階段2在上述步驟L後的第一天，將「階段I輔佐的疫苗」置於水浴中至30°C。將加熱後的物料倒入經高壓蒸汽滅菌的大燒杯中(S13)。用有3個葉片槳的Ika混合器以200rpm的速率攪拌物料2分鐘。將轉速提高至2000rpm維持10分鐘。在4°C下保存24小吋。
步驟T、檢測乳化液的質暈在步驟M後的第一天，用巴斯德吸管吸取一小份「階段2輔佐的疫苗」。用大約200ml的水裝入250ml的燒杯中。將一滴「階段2輔佐的疫苗」滴在水面上。如果液滴部分自稀釋，在水面上呈現牛奶狀表面，則它是水包油包水的，是可接受的。在4°C下保存24小時。 第16天或以後步驟U、裝裡在生物安全操作櫃中，用經高壓蒸汽滅菌的漏鬥和量筒量取適當體積的疫苗。對於250ml的枕頭包，其體積為253 255ml。將該物料倒入經Y -射線滅菌的枕頭包中，然後用經高壓蒸汽滅菌的橡皮塞和金屬蓋封閉枕頭包的上ロ。重複該過程直至每批枕頭包達到合適的數量。步驟V、保留取樣取ー個保留樣品。步驟W、用於無菌測試和游離的福馬林水平測試的QC取樣用裝填結束後剩餘的物料,取20ml樣品裝入經蒸汽滅菌的McCartney瓶中。使用裝填剰餘物料的同樣的漏鬥和量筒。該樣品來進行無菌測試和游離福馬林水平測試。步驟X、貼標籤將甸批樣品貼上標籤。於冰箱中保存。步驟Y、第一次無菌檢測裝填結束後第四天，如無菌檢測所述對「無菌檢測試管」和「無菌檢測平板」進行第一次檢測。步驟Z、第二次無菌檢測裝填結束後第七天，如無菌檢測所述對「無菌檢測試管」和「無菌檢測平板」進行第二次檢測。步驟AA、第三次無菌檢測裝填結束後第十一天，如無菌檢測所述對「無菌檢測試管」和「無菌檢測平板」進行第三次檢測。步驟AB、第四次無菌檢測裝填結束後第十四天，如無菌檢測所述對「無菌檢測試管」和「無菌檢測平板」進行第四次檢測。步驟AC、產品應用如果滿足下述規格，所述批次是可以應用的 物理形態塑料枕頭包中呈奶油狀的液體，貼有包含名稱為「 Anadis E.coliVaccine」的經核准的標籤。 純度第一和第二次純度檢測中，每ー菌株的所有純度試驗平板上均呈現E. coli的純生長現象。 無菌性在無菌性檢測和初始正式的無菌檢測時，平板上或試管中均沒有任何生長的跡象，或者在描述的無菌檢測的再次檢測過程中也沒有任何生長的跡象。
效カ:得到的產品中每毫升含有大於或等於I. Oml蛋白質。 游離的福馬林水平QC樣品中該水平不超過O. 002% w/v ο 乳化質量一滴乳化的疫苗滴於水面上，部分自稀釋，在水中呈現奶油狀。實施例2、高免疫初乳的製備實施例製得的疫苗按以下方法用於製備高免疫初乳讓註冊獸醫用乳化的含有佐劑的疫苗以2ml的注射量 通過脖子側面的肌肉注射免疫母牛。妊娠期為6 8. 5個月的母牛每隔2周注射一次，共注射5次，於分娩前I個月停止。取挑選的免疫母牛的血液進行檢測，並分析以確定特定抗體的水平。分析結果用於確定是否達到了令人滿意的滴定度。為了限制自主接種的可能性，免疫只讓註冊獸醫實施，並讓有經驗的牲畜飼養人員協助。免疫期間，應對母牛進行適當限制，比如避免賽跑、擁擠、處於旋轉的擠奶場，以保持脖子肌肉的清潔。注射部位在免疫前進行修剪並消毒，隨後的注射在同一牲畜的交替部位上進行。收集首次擠奶得到的新鮮高免疫初乳後的製備方法如下所述。實施例3、疫苗的製備本實施例描述的疫苗的製備根據現有技術的典型過程進行。牛疫苗和抗E. coli H10407、菌毛抗原以及毒素的初乳抗體按照下述方法製備初乳抗體的製備。從用腸毒性E. coli菌株H10407、一種挑選的菌毛抗原和熱不穩定的腸毒素(LT)免疫的母奶牛的初乳中分離抗體。母牛處於獸醫的監管下，並圈養在試驗用的奶牛場。參見J. Husu等(1993)。疫苗製備。用於生產疫苗的細菌抗原由腸毒性E.coli菌株H10407 (078 :H11 CFA/I+ ST+ LT+)製得。三個抗原由該菌株純化而得(i)福馬林滅活的完整細胞懸液(IO9個細菌/ml)(ii)熱不穩定的腸毒素(2mg/ml)(iii) CFA/I (2mg/ml)疫苗的製備是將等體積的每種抗原與等體積的Freund不完全佐劑進行乳化而得。除了上述抗原外，還用到一種市售的含有從E. coli K88ac、K99和987P的菌毛抗原提純的油性佐劑疫苗(E. coli Vaccine ；Commonwealth Serum Laboratories Ltd)。初乳的加工和乳清免疫球蛋白的分離。收集哺乳期第一周的免疫母牛的初乳。乳液收集到単獨的容器中，冰凍保存直至加工。簡而言之，離心除去牛奶脂肪，脫脂牛奶用巴氏德法在56°C消毒30分鐘，然後通過凝乳而凝結。除去含有酪蛋白的凝乳，將乳清離心，棄取細小的沉澱。在持續攪拌下將等體積的飽和硫酸銨溶液慢慢加入到乳清中。離心後，收集得到的沉澱，棄去含有乳糖和鹽的上清液。沉澱物溶於相當於原溶液體積的30%的0. 32M NaCl中。該溶液進ー步在具有螺旋式透析膜SIY 30筒的Amicon設備中用5體積的鹽液透析。抗體溶液濃縮至固體含量為10%，快速冷凍，並凍幹。最後，凍幹的抗體粉末用 射線(25KGrays)滅菌。參見 Hilpert (1984) ,Antibodies-A Laboratory Manual (1988)
和 Cravioto 等(1982)。
實施例4、從細胞壁分離的O型抗原的測定本實施例提供了一種產生106CfU/ml革蘭氏陰性菌、從這些細菌提取O型抗原以及檢測從這些細菌的細胞壁分離的O型抗原的量的方法。本實施例的方法能夠計算出「LPS-細菌當量」ー這是含有給定量的LPS的細菌的數量值。以下實施例中，3mg/ml的LPS等同於106cfu/ml的革蘭氏陰性菌ETEC。試劑磷酸緩衝液鹽(PBS)按下表製備的SDS-PAGE裂解緩衝液(20ml)
最終
2 M Tris-HCL pH 6.8 10.0 ml(IM)
dH202.4 ml
10% SDS4.0 ml(2%)
甘油2.0 ml(10%)
0.05% 溴酚藍0.8 ml(0.002%)*在使用前每960 μ L緩衝液中加入40 μ L 2_巰基こ醇(4% )步驟I、細菌菌株在營養瓊脂平板(NA)上於37°C下培養過夜。2、第二天收集細菌加入到PBS,並達到O. 5McFariane當量(I X 108cfu/ml)。3、細菌懸液用PBS稀釋100倍至I X 106cfu/ml。4、稀釋液等分成Iml的式樣量至滅菌的Eppendorf試管中，於13000rpm離心3分鐘形成菌團。5、離心後棄去上清，菌團在50μ L SDS-PAGE裂解液中重懸。6、然後將樣品煮沸10分鐘，迅速用冰冷卻，並在離心機中脈衝以收集濃縮液。7、將2. 5μ L蛋白酶K(20mg/ml)加入到每個試管中，於60°C水浴中保溫I小時。8、保溫結束後，向每個試管中加入等體積的苯酚，旋轉振蕩，然後進ー步在65°C的水浴中保溫15分鐘，每5分鐘旋轉振蕩一次。9、樣品於4°C下離心10分鐘，取水相加入到新的試管中用於LPS的定量分析。LPS的定量分析色原內毒素檢測(LAL)是ー種革蘭氏陰性菌的內毒素定量測試方法。將樣品與試劑盒中提供的LAL混合併於37°C保溫10分鐘。然後將底物溶液與LAL樣品混合併進一歩於37°C保溫6分鐘。然後加10%的SDS終止反應。如果樣品中有內毒素，將檢測到吸光度為405nm的黃色。利用內毒素標準曲線測算樣品中內毒素的量。I、苯酚抽提的LPS樣品用LAL試劑水稀釋到1ml，另外的稀釋液用於LAL分析(1/10，1/50，1/250，1/1250)。2、用LAL試劑水製備兩份連續稀釋液，製備的內毒素標準稀釋液用於製作標準曲線(3 O. 02 μ g/ml)。
3、96 孔板法
樣品空白
測試樣品或內毒素標準50 μ -
LAL試劑水-50 μ
LAL50 μ 50 μ
混合併在37°C下保溫10分鐘
顯色底物100 μ 100 μ混合併在37°C下再保溫6分鐘
終止緩衝液(10% SDC)50 μ 50 μ 在ELISA平板閱讀器上讀取OD 405nm的數值4、繪製得到OD測量值的標準曲線(0D對內毒素濃度)。5、通過讀取標準曲線的OD計算未知樣品的內毒素濃度，然後計算所含內毒素的量。實施例5、高免疫初乳提取物用於人的治療通過ロ服用源於經細菌抗原和毒素免疫的牛的牛初乳提取物製備的藥片防止由腸毒性大腸桿菌(ETEC H10407)引起的腹瀉。藥片由Anadis有限公司用經多種細菌抗原和毒素免疫的奶牛的初乳製備得到。兩項雙盲試驗包括總共90個健康志願者，通過服用對抗劑量為1-2 X IO9E. coli 078的藥片(和安慰劑)來測試保護效果。有30個參與人員的第一次研究評估含有400mg用碳酸氫鈉緩衝液提取的初乳提取物的藥片的效果。該治療組的保護效果為93.4%，相比之下，安慰劑治療組的保護效果僅為26. 7%。第二次研究試驗，含有400mg用緩衝液提取的初乳提取物的藥片的保護效果為85. 7%，非緩衝液提取的初乳提取物的藥片的保護效果為80% ;含有200mg非緩衝飲料提取的初乳提取物的藥片的保護效果為64. 3% ;相比之下，安慰劑治療組的保護效果僅為14. 3%。在防止志願者對抗致病劑量的腸毒性大腸桿菌引起的腹瀉臨床症狀時，有活性的藥片組方的治療效果明顯(P <0.001)好於安慰劑。研究表明，含有對抗多種腸毒性細菌和毒素的抗體的牛初乳提取物的藥片組方具有潛在的防止與這些細菌有關的臨床性腹瀉的作用。緩衝液提取物和非緩衝液提取物的差別不是很大。實施例6、高免疫初乳提取物用於人的治療本實施例描述的對人的保護試驗使用的初乳藥片通過實施例3描述的疫苗誘導的高免疫初乳製備得到。招募了 22個健康成年志願者並予以登記以進行雙盲試驗。其中一半服用以碳酸氫鈉溶液提取的大腸桿菌特異性牛免疫球蛋白藥片，另一半服用以碳酸氫鈉溶液提取的脫脂乳安慰劑。志願者進行分派治療，每天服用3次，共7天。第七天一種挑戰性的IXlO9E. coli菌株H10407(ETEC 078)作為飲料發放給所有參與者。然後觀察參與者的ETEC誘導的胃腸道疾病症狀。
各組中腹瀉的發病率為產品組4/11，安慰劑組7/11 (P = 0.2)。與安慰劑組相比，(高免疫初乳藥片的)治療提供了 44%的抗ETEC H10407引起的腹瀉的預防功效。實施例7、抗體滴定度檢測方法本實施例描述了完整E.coli細胞塗覆於微量滴定平板上的Elisa分析方法。該分析方法是ー種抗體滴定度的分析方法，顯色反應是由羊抗牛IgG-過氧化物酶共軛物催化的。含有O. 5微克的加熱致死的E. coli細胞的100 μ L碳酸鈉-碳酸氫鈉塗覆緩衝溶液分配於96孔Maxisorp免疫平板(Nunc, Roskilde,Denmark)的姆個孔中，4°C過夜。孔板以含有 137mM NaCl，I. 5mM KH2PO4,0. 8mM Na2HPO4,pH 7. 4 的 PBS-0. 05% Tween 緩衝液洗滌6次。將100 μ I每種測試血清或初乳用含有12mg/ml酪素的PBS-Tween稀釋，加入每個孔中並於37°C下保溫2h。孔板用PBS-Tween緩衝溶液洗滌6次，此後100 μ I羊抗牛IgG-過氧化物酶共輒物(Southern Biotacnology Associates, Inc. , Birmingham, AL, USA)用PBS-Tween-酪素按I : 4000的比例稀釋，加入到每個孔中。孔板於37°C保溫lh，並洗滌6 次。將 100 μ I 過氧化物酶底物(Kirkgaard and Perry Lab, Inc. , Gaithersburg,MD, USA)加入姆個孔中並置室溫直至顯色。加入2M硫酸終止反應,孔板在Diagnostics PasteurLP400孔板讀取器(Sanofi,Mames-la-Coquette,France)於450mm讀取。結果通過對至少兩個獨立樣品的重複孔的平均剰餘O.D.值(減去空白樣讀數後)的分析來表示。實施例8、選擇性的免疫方案使用實施例I的方法製備的抗原生產血清抗體。母牛的免疫方法如實施例2所述，只是三次注射的中間間隔為2周。最後一次注射兩周後，取血樣進行抗體滴定度檢測。實施例9、使用完整細胞抗原生產血清抗體為了比較分離的細胞壁抗原和完整細胞抗原的免疫反應的目的，使用下述方法生產抗完整細胞抗原的血清抗體。完整細胞抗原按下述方法製備將E. coli H10407接種在IOOml Luria肉湯培養基中，在振蕩下37°C保溫過夜。得到的培養物通過離心得到細菌小球，再懸浮於IOOml滅菌的PBS緩衝液中，並於100°C加熱2. 5小吋。蛋白質濃度的測量用Bio-Rad蛋白質分析法，並調節至lmg/ml。使用佐劑如實施例I所描述。母牛用實施例7的方法進行免疫，血樣的收取如實施例7所描述。實施例10、完整細胞抗原與分離的細胞壁抗原的比較按照實施例7的方法取自A組(18頭母牛)的血清按照實施例7所描述的方法進行Elisa分析。按照實施例9的方法取自B組(14頭母牛)的血清按照實施例6所描述的方法進行Elisa分析。結果為
A組B組
EIA單位(平均)86096
EIA 單位(範圍)300-160030-300用本發明的疫苗(A組)產生的抗體的滴定度明顯高於用完整細胞疫苗(B組)產生的抗體的滴定度。該結果令人驚奇，因為該滴定度是用完整細胞固定在Elisa平板上而檢測得到的。實施例11、動物安全性通過對根據實施例2的方案免疫的1200頭奶牛的ー項調查顯示，沒有明顯的福利問題或者副反應或者產量的減少。實施例12下述分析基於母牛初乳中抗體的應用來進行定居因子(colonisation factor)的免疫印跡分析。根據本發明的方法製得的抗體，附帶將CFA(菌毛)合併入疫苗。籲緩衝液和試劑
IOXTris/甘氨酸/SDS電泳緩衝液Tris 15g甘氨酸 72gSDS5g用dH20製成I升，以1/10稀釋以製備「工作溶液」。轉移緩衝溶液(IOOml)
Tris0.56 g
甘氨酸0.30 g
dHiO80 ml
甲醇20 ml
10% SDS360 μ 按上述順序混合各試劑並冷藏直至使用。3 X Laemmli 緩衝液(8ml)
dH200.8 ml
0.5 M Tris-HCl pH 6.83.0 ml
甘油2.4 ml
SDS0.48 g
2-β_巰基乙醇*1.2 ml
0.05% (w/v)溴釀藍0.6 mlt*使用時加入。將I體積的Laemmli緩衝液與2體積的樣品混合。籲粗製定居因子的製備將腸毒性大腸桿菌(ETEC)菌株接種在一式兩份的CFA培養平板上，於37°C培養過夜(CF生產)，然後置室溫下(CF生產抑制)。刮取一半平板的細胞加入Iml的PBS中，上下吸取以重懸。簡單旋振。
將細胞懸液置於60 °C水浴中保溫30min以釋放定居因子。離心(14，000rpm/20min)得到細胞小球，回收上清液移至乾淨的試管中。製備的粗製品中應當含有定居因子和LPS,這是所用菌株表達的。· SDS-PAGE將15% SDS-聚丙烯醯胺凝膠和4%積層凝膠按下表灌膠
權利要求
1.抗ー種疫苗所產生的高免疫物質在製備治療或預防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的ロ服藥物製劑中的應用，其特徵在於，所述疫苗含有一種或多種細胞壁抗原，該抗原具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵，所述抗原的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
2.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述疫苗包含ー個水相，且所述抗原為ー種脂多糖相關抗原，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相關抗原的量大於每毫升104/ml的革蘭氏陰性菌培養液中脂多糖相關抗原的量。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相關抗原的量大於每毫升io6/mi的革蘭氏陰性菌培養液中脂多糖相關抗原的量。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，每毫升所述疫苗的所述水相中脂多糖相關抗原的量大於每毫升108/ml的革蘭氏陰性菌的培養液中脂多糖相關抗原的量。
5.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原中的至少20%是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原中的至少40%是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原中的至少60%是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
8.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述疫苗包含ー個水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關抗原的重量與每毫升細胞壁物質重量為W的革蘭氏陰性菌培養液中發現的脂多糖相關抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細胞壁或細胞壁碎片的重量小於O. 8ffo
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述疫苗包含ー個水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關抗原的重量與每毫升細胞壁物質重量為W的革蘭氏陰性菌培養液中發現的脂多糖相關抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細胞壁或細胞壁碎片的重量小於O. 3ffo
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在幹，所述疫苗包含ー個水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關抗原的重量與每毫升細胞壁物質重量為W的革蘭氏陰性菌培養液中發現的脂多糖相關抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細胞壁或者細胞壁碎片的重量小於O. 1W。
11.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述疫苗進ー步含有菌毛或類菌毛抗原CFA-I或CFA-2、或者其它定居因子或公認的定居因子、或者是它們的組合，所述抗原中至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
12.如權利要求11所述的應用，其特徵在於，所述疫苗包含ー個水相，每毫升所述水相中CFA的量大於每毫升在促進CFA生成的培養條件下生長的IO4革蘭氏陰性菌的培養液中CFA抗原的量。
13.如權利要求12所述的應用，其特徵在幹，每毫升所述水相中CFA的量大於每毫升在促進CFA生成的培養條件下生長的IO6革蘭氏陰性菌的培養液中CFA抗原的量。
14.如權利要求13所述的應用，其特徵在幹，每毫升所述水相中CFA的數量大於每毫升在促進CFA生成的培養條件下生長的IO8革蘭氏陰性菌的培養液中CFA抗原的量。
15.如權利要求11所述的應用，其特徵在於，所述CFA抗原中的至少20%是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
16.如權利要求15所述的應用，其特徵在於，所述CFA抗原中的至少40%是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
17.如權利要求16所述的應用，其特徵在於，所述CFA抗原中的至少60%是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
18.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原從細菌細胞壁的分離是通過勻漿或者加熱的方式、或者是它們的有效組合。
19.如權利要求18所述的應用，其特徵在於，所述勻漿是在轉子-定子裝置中進行的，其中轉子的外圍速率(m/s)與轉子-定子間隙(mm)的比值在O. 2 20的範圍內。
20.如權利要求19所述的應用，其特徵在於，所述轉子的外圍速率(m/s)與轉子-定子間隙(mm)的比值在O. 4 12的範圍內。
21.如權利要求20所述的應用，其特徵在於，所述轉子的外圍速率(m/s)與轉子-定子間隙(mm)的比值在O. 8 6的範圍內。
22.如權利要求18所述的應用，其特徵在於，勻漿器中高剪切區域的剪切速率與權利要求19的轉子-定子裝置所產生的剪切速率相當。
23.如權利要求18所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原從細胞壁的分離是通過在40 80°C的範圍內持續加熱處理10 200分鐘。
24.如權利要求23所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原從細胞壁的分離是通過在50 70°C的範圍內加熱處理。
25.如權利要求23或24所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原從細胞壁的分離是通過持續加熱處理30 60分鐘。
26.如權利要求I 25中任ー項所述的應用，其特徵在於，所述革蘭氏陰性菌選自螺旋菌屬、弧菌屬、腸桿菌屬。
27.如權利要求26所述的應用，其特徵在於，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。
28.如權利要求27所述的應用，其特徵在於，所述大腸桿菌為ETEC、EHEC或EPEC。
29.如權利要求28所述的應用，其特徵在於，所述革蘭氏陰性菌是ETEC，且所述脂多糖相關抗原選自以下 O 型抗原組06, 08，015，020，025，027，063，078，0114，0115，0128，.0148，0153，0159和其它與腸毒性大腸桿菌相關的血清型O型抗原。
30.如權利要求29所述的應用，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原包含078。
31.如權利要求29所述的應用，其特徵在於，所述分離的O型抗原通過硫酸銨沉澱法純化。
32.如權利要求31所述的應用，其特徵在於，初始的沉澱作用用於去除外來蛋白質，而最後的沉澱作用用於從沉澱物獲取O型抗原。
33.如權利要求29所述的應用，其特徵在於，所述疫苗包含至少兩種O型抗原，単一的O型抗原是在單獨的細菌培養基中生長並分離的，在単一的O型抗原從細胞壁分離後，所述抗原被一起加入疫苗中。
34.如權利要求33所述的應用，其特徵在於，所述疫苗還包含CFA-I和/或CFA-2。
35.如權利要求34所述的應用，其特徵在於，所述至少兩種O型抗原包括大腸桿菌078抗原和CFA I菌毛抗原，所述至少兩種O型抗原選自以下組06，08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型 O 型抗原和 CFA 2 菌毛抗原。
36.如權利要求35所述的應用，其特徵在於，所述疫苗包括ー種佐劑，該佐劑選自Montanide、QullA、氫氧化鋁中的ー種或多種。
37.如權利要求I 36中任ー項所述的應用，其特徵在於，所述高免疫物質的製備是通過用所述疫苗免疫宿主動物以弓I發對所述疫苗的免疫反應，然後從所述免疫動物收集高免疫物質。
38.如權利要求37所述的應用，其特徵在於，所述高免疫物質包括高免疫初乳或高免疫蛋黃。
39.如權利要求38所述的應用，其特徵在於，所述高免疫初乳的製備是通過將所述抗原分成兩批或多批單ー的疫苗，井分別以單ー批次的疫苗免疫兩批或多批牲畜，接著將來自牲畜的初乳混合。
40.如權利要求39所述的應用，其特徵在於，所述高免疫物質至少通過過濾、巴氏德消毒和/或除去異相的方法被部分純化。
41.如權利要求40所述的應用，其特徵在於，所述高免疫物質還包含ー種食品級的抗菌劑組分。
42.如權利要求41所述的應用，其特徵在於，所述食品級的抗菌劑組分選自由乳鐵傳遞蛋白、柑橘提取物或碘基防腐劑中的ー種或多種。
43.一種用於治療和預防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的組合物，其特徵在於，該組合物含有具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特性的高免疫物質，該高免疫物質是通過用ー種含有一種或多種細胞壁抗原的疫苗免疫宿主動物而製得，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
44.如權利要求43所述的組合物，其特徵在於，所述疫苗包含ー個水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關抗原的重量與每毫升細胞壁物質重量為W的革蘭氏陰性菌培養液中發現的脂多糖相關抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細胞壁或細胞壁碎片的重量小於O. 8W。
45.如權利要求44所述的組合物，其特徵在於，所述疫苗包含ー個水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關抗原的重量與每毫升細胞壁物質重量為W的革蘭氏陰性菌培養液中發現的脂多糖相關抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細胞壁或細胞壁碎片的重量小於O. 3W。
46.如權利要求45所述的組合物，其特徵在於，所述疫苗包含ー個水相，每毫升該水相中所含脂多糖相關抗原的重量與每毫升細胞壁物質的重量為W的革蘭氏陰性菌培養液中發現的脂多糖相關抗原的重量相等，而每毫升該水相中革蘭氏陰性菌細胞壁或細胞壁碎片的重量小於O. 1W。
47.如權利要求46所述的組合物，其特徵在幹，所述高免疫物質是高免疫初乳或高免疫初乳提取物，或者是高免疫蛋黃或高免疫蛋黃提取物。
48.如權利要求47所述的組合物，其特徵在於，所述革蘭氏陰性菌選自螺旋菌屬、弧菌屬、腸桿菌屬。
49.如權利要求46所述的組合物，其特徵在於，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。
50.如權利要求49所述的組合物，其特徵在於，所述大腸桿菌為ETEC、EHEC或EPEC。
51.如權利要求50所述的組合物，其特徵在於，所述革蘭氏陰性菌為ETEC，並且脂多糖相關抗原選自以下 O 型抗原組06, 08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159以及其它與腸毒性大腸桿菌相關的血清型O型抗原。
52.如權利要求51所述的組合物，其特徵在於，所述脂多糖相關抗原包含078。
53.如權利要求51所述的組合物，其特徵在於，所述疫苗包含至少兩種O型抗原，単一的O型抗原是在單獨的細菌培養基中生長並分離的，在単一的O型抗原從細胞壁分離後，所述抗原一起被加入疫苗中。
54.如權利要求53所述的組合物，其特徵在於，所述疫苗還包含CFA-I和/或CFA-2。
55.如權利要求54所述的組合物，其特徵在幹，所述至少兩種O型抗原包括大腸桿菌078抗原和CFA I菌毛抗原，所述至少兩個O型抗原的其它抗原選自06，08，015，025，027，063，078，0114，0115，0128，0148，0153，0159 血清型 O 型抗原和 CFA2 菌毛抗原。
56.如權利要求55所述的組合物，其特徵在於，該化合物含有經過處理以富集或分離抗體的高免疫初乳。
57.如權利要求56所述的組合物，其特徵在於，所述經處理的高免疫初乳配製成ロ服劑型配方。
58.如權利要求57所述的組合物，其特徵在於，所述經處理的高免疫初乳配製成藥片或者包裹於膠囊中的粉劑。
59.如權利要求58所述的組合物，其特徵在於，還包含ー種食品級的抗菌劑組分。
60.如權利要求59所述的組合物，其特徵在幹，所述食品級的抗菌劑組分選自乳鐵傳遞蛋白、柑橘提取物或碘基防腐劑中的ー種或多種。
61.如權利要求60所述的組合物，其特徵在於，用於旅遊者腹瀉的治療或預防。
62.如權利要求43 61中任一項所述組合物在治療或預防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病中的應用。
63.細胞壁抗原在製備用於治療或預防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的高免疫物質中的應用，其特徵在幹，所述細胞壁抗原具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。
64.如權利要求63所述的應用，其特徵在於，所述革蘭氏陰性菌是腸毒性大腸桿菌。
65.ー種免疫球蛋白的製備方法，該免疫球蛋白用於治療或預防動物體內革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的，其特徵在於，該方法包括用一種疫苗免疫宿主動物，該疫苗含有ー種或多種具有O組血清型作用特徵或脂多糖相關抗原作用特性的細胞壁抗原，所述抗原中的至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的，由此誘導宿主動物產生含有所述免疫球蛋白的高免疫物質。
全文摘要
本發明公開了一種治療和預防革蘭氏陰性菌引起的腸道疾病的方法。該方法包括向一個個體施以一種疫苗或者一種抗所述疫苗產生的高免疫物質的步驟，所用疫苗包含有一種或多種具有O組血清型作用特性或脂多糖相關抗原作用特徵的細胞壁抗原，所述抗原中至少一部分是從細菌細胞壁或細胞壁碎片分離的。本發明還公開了含有高免疫物質的組合物，以及所述組合物和疫苗的用途。
文檔編號A61K35/74GK102698258SQ20121005540
公開日2012年10月3日 申請日期2004年3月4日 優先權日2003年3月4日
發明者戈特弗裡德·利希蒂, 格蘭特·託馬斯·羅林, 羅伊·麥可·羅賓斯-布朗 申請人:阿納迪斯有限公司