青蒿4-(5』-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤蘚醇合酶編碼序列的製作方法

2023-07-08 11:28:21

專利名稱：青蒿4-(5』-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤蘚醇合酶編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程技術領域的編碼序列，具體是一種青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列。
背景技術：
青蒿(^^棚hi'3 L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從
其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能，可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。
目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，為0.01%-1%，低含量使得青蒿素的大規模商業化生產受到了限制。由於青蒿素結構複雜，人工合成難度大、產量低、成本高，因此人工生產缺乏可行性。也有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中的含量低於乾重的0.1%，在芽中含量最高也只有乾重的0.16%，大多數研究沒有檢測到青蒿素。因此，利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的也不具備可行性。Dahua Chen等在《Plant Science》(植物科學)2000年155期179-185頁發表了題為"Expression of a chimeric farnesyl diphosphatesynthase gene in Artemisia annua transgenic plants via Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation"(通過農桿菌介導轉化在青蒿植株中表達法尼基焦磷酸合酶基因)的論文，文中評述，通過過量表達法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase, FPS)可在原有基礎上提高青蒿素含量2倍-3倍，達到1%左右。
隨著近年來植物基因組學的發展，青蒿素合成途徑的基因分離、克隆和功能
3性研究已經取得了突破性的進展。人們已經初步完成了對參與青蒿素合成途徑關鍵基因的分離和功能驗證工作，並分析了青蒿素合成途徑概貌。
經對現有技術的文獻檢索發現，尚未見與青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列有關的報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列。本發明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的異戊二烯類化合物含量，可以使含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的轉基因植物成為生物反應器，實現青蒿素的大規模生產和其他異戊二烯類化合物的生產。
本發明是通過以下技術方案實現的，
本發明涉及一種青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列，該序列如SEQ ID NO: 3中第18 926位所示或者是SEQ ID NO: 3序列中第18 926位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼
子取代後產生的序列。
所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列如SEQ ID
NO: 3中第18~926位所示。
本發明還涉及一種多肽，序列如SEQ ID NO: 4所示。
本發明還涉及一種利用所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，包括如下步驟
步驟一，將青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列連於植物表達調控序列上，構建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的植物表達載體；
步驟二，將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，將農桿菌轉入青蒿；
步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的轉化細胞，再生轉基因植株。
步驟二中，所述轉入採用凍融法。
本發明中，構建步驟一中含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的植物表達載體時可選用本領域已知的各種載體，例如質粒，粘粒等。本發明中，步驟三中，含有青蒿4-(5， -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的轉化細胞為真核細胞。進一步地，真核宿主細胞為酵母細胞、擬南芥的生殖細胞或愈傷組織細胞、其他植物的生殖細胞或愈傷組織細胞。
術語"簡併"是指編碼胺基酸的大部分密碼子具有簡併性，即兩個或多個密碼子編碼同一胺基酸。例如GAA和GAG都編碼穀氨醯胺。
本發明具有如下的有益效果本發明可提高青蒿素含量；同時本發明可使含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的轉基因植物成為生物反應器，實現異戊二烯類化合物的大規模生產；利用本發明的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶蛋白發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發明涉及的根癌農桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細良，田雲龍，郭萍，朱昌雄；根癌農桿菌介導的哈茨木黴菌遺傳轉化的研究，中國生物工程雜誌，2008， 28 (3) : 38-43》文獻中公開。根癌農桿菌EHA105可通過公開市售的商業渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambarl。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊見New York: ColdSpring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例
步驟一，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列《#5)的克隆
(1) RNA的提取(RNA extraction)
取青蒿葉片組織，置於液氮中研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL E卯endorf (EP)離心管中，充分振蕩後，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。
(2) 基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據擬南芥中相關基因所編碼的胺基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，採用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech公司SMART RACE試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行
① 首鏈cDNA的合成
利用SMART RACE試劑盒所提供的5，-CDS primer A和SMART II A oligo引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成5，-RACE -Ready cDNA;利用Clontech試劑盒所提供的3，-CDS primer A為引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成3，-RACE-Ready c廳。
② 3，-RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物2 (GSP2) (SEQ ID NO: 1)進行3， -RACE PCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測並對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體上進行測序。
③ 5， -RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區設計的基因特異引物1 (GSP1) (SEQ ID NO: 2)進行5'-RACE PCR反應。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測並對產物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載體上進行測序。將測序結果的重疊區拼接，得到該基因的完整編碼區序列。BLAST分析結果證明從青蒿中得到的基因確為一個4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶的相關基因。
通過上述步驟，獲得了青蒿中參與異戊二烯類化合物合成的4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO: 3)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。
步驟二，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶相關基因的序
列信息與同源性分析
步驟一中得到的青蒿C#5t4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶)的全長cDNA長度為1108bp (SEQ ID NO: 3),其中開放閱讀框位於第15-1214位核苷酸，根據所獲得的cDNA推導出青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-0-赤蘚醇合酶的胺基酸序列(見SEQ ID NO: 4)，共302個胺基酸殘基，分子量為33522. 35，等電點為7. 81 。利用vectorNTI 9. 0軟體對來源於各種植物的4- (5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶的相關胺基酸序列進行同源比對，結果 發現，克隆到的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列與 擬南芥(Arabidopsis thaliana)，菸草(Nicotiana langsdorffii x Nicotiana sanderae)，蓖麻(Ricinus communis)， 巴西橡膠樹(Hevea Brasiliensis), 甜葉菊(Stevia rebaudiana)以及長春花(Catharanthus Roseus)中同源基因 所編碼的胺基酸序列相似性分別為83%, 78%， 66%， 78%， 82%， 88%。由此可 見，青蒿基因與其他高等植物中的OZ5"相關基因在所編碼的胺基酸水平上 存在較高的同源性，可以認為它們的產物在功能上也有較高的相似性。
步驟三，青蒿4-(5， -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶相關蛋白或多 肽在青蒿細胞中進行真核細胞表達
(1) 含目的基因(青蒿CMS基因)的表達載體的構建
根據青蒿G^的全長編碼序列(SEQ ID NO: 3)，設計擴增出完整編碼閱讀 框的引物，並在正反引物上分別引入5a/zHI和&cI限制性內切酵位點，以便構 建表達載體。以青蒿cDNA為模板，經PCR擴增後，將青蒿0^的編碼區序列連 接至中間載體pMD18-T中進行測序。將測序正確的Of的編碼區序列進一步克 隆到表達載體pCAMBIA2300中，接著將其轉入根癌農桿菌EHA105，並進行PCR 驗證。結果表明，含青蒿0^基因的植物表達載體已成功構建到根癌農杆茵菌株 中。
(2) 根癌農桿菌介導CMS"基因轉化青蒿
① 外植體的預培養
青蒿種子用75% (v/v)乙醇浸泡1 min;再用20% (w/v) NaClO浸泡20 min; 無菌水衝洗3-4次；用無菌吸水紙吸乾表面水分；接種於無激素的MS ，該MS 培養基採用Murashige和Skoog在1962年發明的固體培養基，可以通過商業 渠道獲得；25'C、 16小時的日光和8小時的黑夜培養，即可獲得青蒿無菌苗。 待苗長至5cm左右後,剪取無菌苗葉片外植體用於轉化。
② 農桿菌與外植體的共培養
將所述的葉片外植體，轉到1/2 MS和100 Mmol/L AS組成的共培養培養基 中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌 工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28'C暗培養3d。以滴加在不 帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2 MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照。③ 抗性再生植株的篩選
將所述的共培養3d的青蒿外植體轉入到MS、0. 5 mg/L 6-BA、 0. 05 mg/L NAA、 50 mg/L Kan和500mg/L Cb組成的發芽篩選培養基上，於25'C、 16小時的日 光和8小時的黑暗中培養，每兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代後即可獲得 Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入1/2MS0知125mg/L Cb組成 的生根培養基上培養至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。
④ 轉基因青蒿植株的PCR檢測
根據目的基因所在表達盒p35s-CMS-nos序列p35s和C^分別設計正向引 物設計和反向引物對0^基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引 物，能擴增出特異DNA片段，而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增 出任何片段。
步驟四，利用HPLC-ELSD測定轉基因青蒿中青蒿素含量
(1) HPLC-ELSD條件及系統適用性以及標準溶液的配製
HPLC:採用water alliance 2695系統，色譜柱為C-18反相矽膠柱(SymMet ryShieldTM C18， 5 ^m, 250x4.6咖，Waters),流動相甲醇(Methanol):水 為70%:30%，柱溫30。C，流速1. 0 mL/min，進樣量10 ^L，靈敏度(AUFS:l. 0)， 理論塔板數按青蒿素峰計算不低於2000。
ELSD:採用water alliance 2420系統，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40 'C，放大係數(gain)為7，載氣壓力5bar;
精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2.0 mg用1 mL甲醇完全溶解，得到 2 mg/mL青蒿素標準品溶液，保存於-2(TC備用。
本實施例中流動相甲醇(Methanol):水為70%:30%時，青蒿素的保留時間 為5.1 min,峰型良好。理論塔板數按青蒿素計算不低於2000。
(2) 標準曲線的製作 將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2 nL， 4 nL， 6 nL， 8 pL，
IOHL記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X， pg)進行回歸分 析。通過研究，本實施例中青蒿素在4 20 pg範圍內呈現良好的log-log線性 關係。青蒿素對照品的log-log線性回歸方程為Y=l. 28e+000X+4. 71e+000， R=0.979546。
8(3)樣品的製備和青蒿素含量的測定
青蒿素的提取過程基於Van Nieuwerburgh et al. (2006)中報導的方法取 少量新鮮的青蒿葉片(1 2g鮮重)，於50 ml試管中將其浸沒在10 ml氯仿中 搖蕩l分鐘，將浸出液倒入新的試管中使氯仿揮發完全，取3ml無水乙醇充分 溶解提取物，用於HPLC檢測。同時，氯仿提取後的葉片收集放入60度烘箱進 行烘乾，稱重(計算青蒿葉片的乾重)；
採用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 ^L，根據峰面積代入 線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉乾重(g)， 從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。
在本實施例中編碼4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶(CF5^基 因的轉化顯著提高了青蒿葉片中青蒿素含量，這使得轉基因植株中青蒿素的含量 超過對照非轉化普通青蒿的50%以上。由此可見，4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤蘚醇合酶基因可作為一種獲得了青蒿素髙產的青蒿植株的候選基因，用於 利用轉基因技術提高植物青蒿素含量和其他異戊二烯類化合物的研究和產業化 生產中。序列表
上海交通大學
〈120〉青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶蛋白編碼序列 4
〈170〉 Patentln version 3.3
1 <211〉 29 DNA
青蒿(Artemisia annua L.) 1
caagattccg tgtacagtgg acttcagac 29
<210〉 2 28 DNA
〈213> 青蒿(Artemisia annua L ) < 2
aacaccaaga actgatgctc caactcgc 28
3 1108 DNA
<213〉 青蒿(Artemisia annua L ) 3
ggaaaaccaa aaccaaaatg attcttcagg ttatctctcc gtcatcca!ta ctaataatcc 60 cccgtcgtca agtagcaccc aattccatct actttcaccc tcaattatca tcatctgtta 120 agtattctta ttccttacca cccaaaacaa acaatttcag acaaaaaaac atcacttgtt 180 ctgctaataa tcccaccgtt acaactgaga ggtctgaaga tgttgttaaa gagaaaagtg 240 tatcggtggt tcttctcgcc ggagggaagg gaaaaagaat gggcgcaagc atgccaaagc 300 agtatcttcc acttttagga caaccaattg ctttgtatag tttctacact ttttcacgaa 360 tgcctgaagt taaggaaatt gtcgtagttt gcgatccatc ttaccaggac atttttgaag 420 atgccagaga aaagatcaac gtggacctaa aatttgcgtt gccaggaaag gaaagacaag 480attccgtgta cagtggactt cagacaattg atttgaactc tgaacttgta tgcgtccatg 540
attctgcaag acctttggta acgtctagtg atgtagaaaa ggttctgaag gatggattgc 600
gagttggagc atcagttctt ggtgttcctg ctaaagctac tataaaagag ggaaatagtg 660
aatcttttgt ggtgaagaca ttggacagga aaacactttg ggaaatgcag actccacagg 720
ttstcaagcc tg3gttgttg 33gaaaggtt ttgagcttgt aaatagsgaa ggccttga鄧 780
tcacggatga tgtgtccatt gttgagcacc ttaaacatcc tgtatacatc actgaaggat 840
cctatactaa catcaaggtc acaactcctg atgatctatt acttgctgaa agaatattaa 900
atacggcctc gtttgtgcca gcttaatcat tcattttatt tacaatatac atgatgagct 960
atatgacagt gaagggacac tgaacaacaa gaaacgaatt tatacgtgtt ttcactgcat 1020
gcttagtaga aacggcattg gtacgattag tgcaaaatga aatttatgat tctgaaataa 1080
tttttttgaa ccaaaaaaaa aaaaaaaa 1108
〈210> 4 〈211〉 302 PRT
<213〉 青蒿(Artemisia annua L.) 4
Met lie Leu Gin Val lie Ser Pro Ser Ser lie Leu lie lie Pro Arg
Arg Gin Val Ala Pro Asn Ser lie Tyr Phe His Pro Gin Leu Ser Ser 20 25 30
Ser Val Lys Tyr Ser Tyr Ser Leu Pro Pro Lys Thr Asn Asn Phe Arg 35 40 45
Gin Lys Asn lie Thr Cys Ser Ala Asn Asn Pro Thr Val Thr Thr Glu 50 55 60
Arg Ser Glu Asp Val Val Lys Glu Lys Ser Val Ser Val Val Uu Leu
65 70 75 80
Ala Gly Gly Lys Gly Lys Arg Met Gly Ala Ser Met Pro Lys Gin Tyr85
90
95
Leu Pro Leu Leu Gly Gin Pro lie Ala Leu Tyr Ser Phe Tyr Thr Phe 100 105 110
Ser Arg Met Pro Glu Val Lys Glu lie Val Val Val Cys Asp Pro Ser 115 120 125
Tyr Gin Asp lie Phe Glu Asp Ala Arg Glu Lys lie Asn Val Asp Leu 130 135 140
Lys Phe Ala Leu Pro Gly Lys Glu Arg Gin Asp Ser Val Tyr Ser Gly 145 150 155 160
Leu Gin Thr lie Asp Leu Asn Ser Glu Leu Val Cys Val His Asp Ser 165 170 175
Ala Arg Pro Leu Val Thr Ser Ser Asp Val Glu Lys Val Leu Lys Asp 180 185 190
Gly Leu Arg Val Gly Ala Ser Val Uu Gly Val Pro Ala Lys Ala Thr 195 200 205
lie Lys Glu Gly Asn Ser Glu Ser Phe Val Val Lys Thr Uu Asp Arg 210 215 220
Lys Thr Leu Trp Glu Met Gin Thr Pro Gin Val lie Lys Pro Glu Uu 225 230 235 240
Leu Lys Lys Gly Phe Glu Uu Val Asn Arg Glu Gly Leu Glu Val Thr 245 250 255
Asp Asp Val Ser lie Val Glu His Leu Lys His Pro Val Tyr lie Thr 260 265 270
Glu Gly Ser Tyr Thr Asn lie Lys Val Thr Thr Pro Asp Asp Leu Leu 275 280 285
12Uu Ala Glu Arg lie Leu Asii Thr Ala Ser Phe Val Pro Ala 290 295 300
權利要求
1、一種青蒿4-(5』-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列，其特徵是，該序列如SEQ ID NO3中第18～926位所示或者是SEQ ID NO3序列中第18～926位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子取代後產生的序列。
2、 根據權利要求1所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列，其特徵是，該序列如SEQ ID NO: 3中第18 926位所示。
3、 一輛多肽，其特徵在於，序列如SEQ ID NO: 4所示。
4、 一種利用權利要求1所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，其特徵在於，包括如下步驟步驟一，將青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列連於植物表達調控序列上，構建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的植物表達載體；步驟二，將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，將農桿菌轉入青蒿；步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列的轉化細胞，再生轉基因植株。
5、 根據權利要求4所述的利用青蒿4-(5， -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，其特徵是，步驟二中，所述轉入具體為採用凍融法進行轉入。
全文摘要
一種基因工程技術領域的青蒿4-(5』-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶編碼序列，該序列如SEQ ID NO3中第18～926位所示或者是SEQ ID NO3序列中第18～926位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子取代後產生的序列；利用所述編碼序列提高植物青蒿素含量的方法將所述編碼序列連於植物表達調控序列上，構建含所述編碼序列的植物表達載體；將步驟一中的表達載體轉入農桿菌，將農桿菌轉入青蒿；通過抗生素篩選，獲得含有所述編碼序列的轉化細胞，再生轉基因植株；本發明還涉及一種多肽，序列如SEQ ID NO4所示。本發明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的異戊二烯類化合物含量。
文檔編號C12N15/52GK101665793SQ20091019517
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月4日 優先權日2009年9月4日
發明者唐克軒, 可 楊, 王玥月, 翁純純 申請人:上海交通大學