核糖核苷酸標記核酸檢測的製作方法

2023-07-08 10:29:41 4

專利名稱：核糖核苷酸標記核酸檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及核酸檢測領域。具體而言，本發明提供了具有多^卩接序列段的多核苷酸，其中^t^序列段的5'-末端核苷酸 是,列段中獨特的並在每個序列段中是相同的，且提供了所述多核苷翻於檢測耙核酸的方法。
背景技術：
已知剤艮多檢測耙核酸的方法(如SNP基因型分型)。目前可用於SNP基因型分型的均相測定包括TAQMAN， AMPLIFLUOR，染料結合、等位基因選擇動態PCR (allele-selective kinetic PCR)以及SCORPION⑧引物測定。這些觀啶在每個反應孔中提供一個或至多兩iX如果應用四種不同的螢光染料)SNPs(如染料結合動態PCR對於一個SNP需要兩個孔)。SNP基因型分型的可用方法在/A^些在反應孔中允許單個SNP基因型分型的方法，至娜些允許單個孔中數千個SNPs基因型分型的方法(如GOLDEN GATE⑧測定，Hlumina)的範圍內。目前的基因型分型測定程序不易多重化，這歸因於每種類型的等位基因需要不同的染料，並因耐艮制了其改善的可能。GOLDEN GATE^測定需要複雜的分析設備，諸如纖維光學陣列讀數器。SNP基因型分型的讀取分析儀在從板讀數器(任選地，帶有包含的PCR機器)至測序儀(如毛細管測序儀)、陣列讀數器以及質譜儀的範圍內。此外，在質譜儀已用於基因型分型的程度上，目前可用的fOT不允許真實的多重化。

發明內容
本發明提供了用於一個或多個革巴核酸的有效且高靈敏度的並行檢測的多核苷酸。所述的多核苷酸設計為具有包含一個、兩個或更多^瞎序列段的5'部分，從而序列段或其互補體的質量，鑑別靶核酸鄉E核酸內的耙核苷酸。在一些實施方案中，所述的序列段是等質量的。等質量的序列段可以但不需要具有相同的序列。序列段切割自多核苷酸的互補體，並且其質量被測量，測以鑑另脾巴核酸的存在、不存在或存在的水平。
因此，在第一個方面，本發明提供了包含一個、兩個或更多個序列段的多核苷酸。在一些實施方案中，多核苷離含5'部分和3'部分，其中
a) 5'部他含至少一個或至少兩W階序列段，其中每個序列段包含至少三個核苷酸鹼基，具有相等質量，並且每個序列段的5'-末端核苷酸鹼 —個序列段中是獨特的並在^h序歹暇中是相同的；並且
b) 3'部^S含至少5個核苷酸，其中所述的多核苷酸的長度少於約100個核苷酸鹼基。在一些實施方案中，所述的多核苷酸的長度少於約75、 50或25個核苷酸。
在雌的實施方案中，^h序列段具有相同的核苷辦列。在其它優選的實 案中，5，部分包含至少3、 4、 5、 6、 7或8^K階序列段。在一，選實施方案中，^序列段包含至少3、 4、 5、 6、 7或8個核苷酸。
在同樣雌的實施方案中，3'-末端包含可去除的封閉部分，其基本上阻止多核苷酸的延伸。在特別雌的實施方案中，3'-末端包含2'終止子部分。
在另一方面，本發明提供了檢測靶核酸的方法。在一些實施方案中，所述的方法包括
a) 將耙核酸與多核苷酸、核苷酸集以及核苷酸^生物催化組分接觸，
其中
(0所述的多核苷,含5'部分和3'部分，所述的5'部*含至少一個或至少兩個鄰接序列段，其中每個序列段包含至少三個核苷酸鹼基，並且每個序列段的5'-末端核苷酸鹼基在一個序列段中是獨特的並在每個序列段中是相同的；並且3'部他含足以與耙核麟交並在擴增條件下延伸的基本上互補的序列段；
(u)所述的核苷,包含至少兩種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)形式的核苷酸 ，並且至少一種核苷酸M的大多數是核糖核苷酸(rNTP)形式，其中所
述的核糖核苷酸m與所述多核苷酸^h序列段的獨特5'核苷酸鹼基互補；以
及
(iii)所述核苷酸M生物催化組^含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷M合活性；
b) 在擴增條件下擴增耙核酸以產生包含與該多核苷酸5'-部分互補的3'序歹暇(即3'-部分)的擴增子，其中所述3'序列段包含至少一個或至少兩個序列段，其中齡序列段的3'末端核苷酸鹼基是具有和核苷酸集中NTP相同鹼基 的核苷一磷酸(NMP);
c) 將針NMP3'的擴增子切害U為片段，其中所述切割釋放作為個別片 段的序列段；以及
d) 檢測擴增子片段，其中檢測的序列段的片段指示耙核,列的擴增， 從而檢測耙核,列。
在優選的實施方案中，5'部分序列段是等質量的。
在其它優選的實船案中，至少一種核苷酸鹼基的至少80%是核糖核苷酸 (rNTP)的形式。
在其它優選的實施方案中，通過使擴增子經受鹼性溶液進行所述切割。 在優選的實施方案中，鹼性溶液包含下面的至少一種:NaOH、 KOH、 RbOH、
Mg(OH)2、 Ca(OH)2或NH4OH。在更優選的實施方案中，鹼性溶液包含下面的
至少一種NaOH、 KOH或NH(OH。
在同樣優選的實施方案中，所述的方法進一步包括將耙核酸序列與多核苷
W"相接觸的步驟，其中所述多核苷fet中的^多核苷酸包含等質量的5'部
分序列段。
在其它優選的實施方案中，所述的方法進一步包括將靶核酸與至少一個多 核苷酸相接觸的步驟，其中從多核苷酸或其互補微測到序列段片尉旨示革巴核 酸序列中存在多態性核苷酸等位基因。
在其它優選的實施方案中，所述的方法進一步包括將耙核酸與至少兩個不
同多核苷酸相接觸的步驟，其中所述多核苷酸僅在3'-末端核苷酸鵬上不相同，
其中每個多核苷酸的3'-末端核苷酸i^對應於獨特質量的序列段，並且，其中 從至少一個多核昔酸或其互補皿測到序列段片段指示靴核酸序列中多態性核
苷酸的等位基因的存在。
在其它優選的實施方案中，許多不同耙核酸序歹i」與許多不同多核苷酸相接 觸，每種不同的多核苷酸包含獨特質量的序列段，其中多核苷酸的序列段是許 多不同靶核酸序列之一的鑑定劑(identifier),由此，從至少一個多核苷酸或其 互補體中檢測到序列段片段指示許多不同靶核酸序列中至少一個的存在。
在其它優選的實施方案中，所述核苷酸整合生物催化組分包含單個催化結 構域，所述的催化結構域包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸整合活性。根據本發明進一步優選的是，核苷酸整合生物催化組分包含第一和第二催化結構域， 其中第一催化結構域包含脫氧核糖核苷酸整合活性，且第二催化結構域包含核 糖核苷酸M^活性。
在優選的實施方案中，通過質譜分析法進行所述檢測。在一靴選的實施 方案中，通過氣相離子質譜分析法進行檢測或備選地，通過雷射解吸電離質譜 分析法進行檢測。
在其它優選的實施方案中，多核苷酸包含基本上阻止多核苷酸延伸的封閉 部分，並且其中所述的方法進一步包括在擴增前從多核苷酸中去除封閉部分的 步驟。
在另一方面，本發明提供了反應混合物，如用於進4於上文所述檢測的創造 性方法的反應混合物。在 的實施方案中，反應混合物包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一多核苷酸，其中所述的5'部，含至少一個 或至少兩^卩接序列段，其中每個序列段包含至少三個核苷酸鹼基，其中每個 序列段的5'-糊核苷酸^SE—個序歹暇中是獨特的並在^^序列段中是相同 的；並且3'部他含足以與靶核麟交並在擴增條件下延伸的基本上互補的序 列段；
b) 核苷酸集，其包含至少兩種脫氧核糖核苷酸(dNTP)形式的核苷酸M， 且至少一種核苷酸鹼基的大多數是核糖核苷酸(rNTP)的形式，其中所述的作 為核糖核苷酸提供的核苷酸鹼基互補於^^序歹煅的獨特5'核苷酸鵬；以及
c) 核苷酸齡生物催化組分，其包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷,合活性。
在，的實施方案中，反應混合物包含至少一個耙核酸序列。 在相關的方面，本發明提供了試劑盒。在雌的實施方案中，試劑盒包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一多核苷酸，其中所述的5'部他含至少 一個或至少兩^K卩接序列段，其中*序列段包含至少三個核苷酸鹼基，且每 個序歹暇的5'-末端核苷酸鹼驗一個序列段中是獨特的並在針序歹暇中是相 同的；並且3'部他含足以與耙核酸雜交並在擴增斜牛下延伸的基本上互補的 序列段；
b) 核苷,，其包含至少兩種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)形式的核苷酸 tt，且至少一種核苷酸M的相當大多數是核糖核苷酸(rNTP)的形式，其中所述的作為核糖核苷酸提供的核苷酸f藤互補於每個序列段的獨特5'核苷酸 鹼基；以及
c) 核苷酸整合生物催化組分，其包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸整 合活性。
反應混合物和試劑盒的實施方案如上文對於多核苷酸和方法的描述以及如 此處所描述。根據本發明的1腿試劑盒例如是這樣的試劑盒其中齡5'部分 序列段是等質量的，並且所述多核苷酸的5'部分序列段包含至少三個序歹煅， 更優選的至少四個核苷酸鹼基，以及最優選的至少七個核苷酸鹼基。在試劑盒 的其它雌實施方案中，所述的3'-末端包含可去除的封閉部分，其基本上阻止 多核苷酸的延伸，更{ 地多核苷酸的3'- 包含2'終止子部分。
在其它方面，本發明提供了擴增子。在一些實施方案中，擴增子包含雙鏈 多核苷酸，所述雙鏈多核苷酸包含
a) 包含5'部分和3'部分的第一鏈，其中5'部^含至少一個或至少兩^P接序 列段，其中每個序列段包含至少三個核苷酸鹼基，具有相等質量，並且針序 列段的5'-末端核苷酸鹼 —個序列段中是獨特的並在每個序列段中是相同 的；並且3，部，含至少五個核苷酸，以及
b) 與第^S補並且包含3'部分的第二鏈，所述3'部分包含這樣的序列段，所 鵬列段包含至少一個或至少兩W階序列段，其中每個序列段的3'-末端核苷 酸鸝是NMP。
在另一方面，本發明提供了系統。在一些實施方案中，所述的系統包含至 少一個容器救持物，其包含
a) 包含本發明擴增子的組合物；
b) 至少一個配置來與所述容器或支持物熱交流以調節容器內或支持物 上、溫度的熱調節器；
c) 至少一個轉移試劑至容器或支持物和/或從容器^s:持物轉移試劑的
試劑轉移部件；以及
d) 至少一個配置來檢測容器中或支持物上產生的一個或多個序列段質 量的檢測器。
在雌的實施方案中，所述的檢測器包含氣相離子光譜觀啶儀。 在 的實施方案中，所述系統包含至少一個控制器，所述控制器可操作
10鵬接於
-實現調節容器中^S:持物上溫度的熱調節器， -實現轉移試劑至容器救持物和/或從容器救持物轉移試劑的試劑轉移 部件，和/或，
-實現檢測容器中鼓持物上產生的序列段質量的檢測器。
定義
術語"核酸或"多核苷酸'可互換地應用於對應於核糖核酸(RNA)或脫氧 核糖核酸(DNA)聚合物或其類似物的聚合物。這包括核苷酸聚合物諸如RNA 和DNA及其修飾形式、肽核酸(PNAs)、鎖定核酸(LNATM)等等。在某些實 施方案中，核酸可以是包括多個單體類型，例如包括RNA亞單位和DNA亞單 位兩者的聚合物。核酸可以是或可包括如染色體或染色體區段、載體(如表達 載體)、表達盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合^l連反應(PCR)的產物、寡核 苷酸、探針、引物等等。核酸可以是如單鏈、雙鏈、三鏈等等並且其不限於任 何特定長度。除非另有指定，除明確指明的任意序列之外，特定核酸序列還任 ^i也包含或編碼互補序列。
核酸不限於具有天然存在的多核苷酸序列或結構、天然存在的主鏈、和/或 天然存在的核苷酸間鍵的分子。例如，含有一個或多個碳環糖的核酸也包括這 一定義之內(Jenkins等(1995) C/^w. 他v. 169-176頁)。為進一步說明， 儘管核酸將通常包含磷酸二酯鍵，但在一些情況下，包括那些具有另外的主鏈 的核酸類似物。這^括但不限於磷醯胺(Beaucage等(1993) r欲"/^ra" 49(10):1925及其中的參考文獻；Letsinger (1970) J. 0《.Ctew. 35:3800; Sprinzl 等(1977) Ew/:J歷oc/^m.81:579; Letsinger等(1986) iVwc/. A:幼/feU4:3487; Sawai等(1984) O^w.丄成805; Leteinger等(1988)J J附.5bc.ll0:4470; 以及Pauwels等(1986) C/ 柳/ca&n》to26:1419)、硫代磷酸酯(Mag等(1991) M^to'cA^i^. 19:1437以及美國專利No. 5,644,048)、 二硫t代磷酸酯(Briu等
111:2321 )、 O-甲基亞磷,鍵(Eckstein. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach. Oxford University Press(1992))、以及肽核酸 主鏈和鍵(Egholm (1992) J. 4m. O 柳.114:1895;Meier等(1992) Ozew. /脫 M 31:麵;Nielsen (1993)油詢365:566;以及Carlson等(1996)淑,380:207)。
另外的類似t/t亥,括具有正電荷主鏈(Denpcy等(1995) AM &/. USA 92:6097);非離子主鏈(美國專利Nos. 5,386，023、 5,637，684、 5,602,240、 5,216,141以及4,469,863; Angew(1991)Chem. Intl. Ed. English 30:423; Letsinger 等(1988) J. 乂附.O/ew. 110:4470; Letsinger等(1994)M^feas/6fe &7Vwc/e^<ie 13:1597;第二章和第三章，ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y S. Sanghvi禾口 P Dan Cook; Mesmaeker 等(1994 )及owg朋/c & A/o/,c/ra/ O^m. 4:395; Jeffs等(1994 )J.說owo/ecw/ar 泌漢34:17; 7^ra/^ah "Z成37:743(1996))以及非核糖主鏈的那些，包括那些 描述於美國專利Nos. 5,235,033和5,034,506，以及第6和第7章，ASC Symposium Series 580 ， Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed Y S. Sanghvi禾口 P. Dan Cook中的。幾禾中核酸類似物還描述於，如Rawls, C & E News 1997年6 月2日，第35頁。可進行核糖磷酸主鏈的修飾以，附加部分(諸如標記部 分)的添加，或改變該針在生理環境下的穩定性和半衰期。
除了天然存在的通常發現於核酸的雜環鹼基(如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧 啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外，核酸類似物還包括那些非天然存在的雜環或其它 修飾的鹼基。為了說明，任選地包括用於核苷酸中作為解鏈溫度(Tm)調節物 的某些鹼基。例如，這些鵬中的一鮑括7-脫氮嘌呤(如7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑[3，4-d]嘧啶、丙'J^S-dN (如丙炔基-dU、丙'^S-dC等) 等等。參見例如美國專利No. 5,990,303。其它fW性雜環M^括如次黃嘌 呤、肌苷、黃嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、 肌昔和黃嘌呤的8-M^衍生物；腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、 2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的7-脫氮-8-氮雜衍生物；6-氮雜胞
嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞啼啶；5-
丙'J^S胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶(5-bromovinyluracil); 5-MM嘧啶；5-繊嘧
啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿噴啶；5-乙
'^S尿嘧啶；5-丙'^S尿嘧啶等等。許多非天然存在的 也描述於例如Seela 等(1991 ) //e/v (3^.爿cto 74:1790,Grein等(1994)歷cwg A/ed C/iew. Leff.4:971-976，以及Seela等(1999)//e/v CA,m.爿cto 82:1640。修飾的鹼凝口核 苷酸的其它實例也描述於例如美國專利Nos. 5,484,908、 5,645，985、 5,830,653、6,639,059、 6,303,315以及美國專利申請公開No. 2003/0092905。
"核苷酸指的是核苷的酯，如核苷的磷酸酯。為了說明，核苷酸可包括l、 2、 3個或更多共j條接至所述核苷的糖部分(如5'位、3'位、2'位等等)的磷 酸基團。
"核苷酸整合生物催化劑"指的是催化核苷酸整合入核酸的催化劑。核苷酸 整合生物催化劑通常是酶。"酶"是基於蛋白質的催化劑，其發揮作用以減少涉 及其它化合物或'底物'的化學反應的活化能。"核苷M合酵'指的是催化核苷酸 M入核酸的酶。實例性核苷1 ^,括，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、 終端轉移酶、逆轉錄酶、端粒酶、多核苷酸磷酸化酶等等。其它的生物催化劑 可以是基於DNA的("DNA核酵0或基於RNA的("核酶')。"耐熱酵'指的 是對熱穩定的酶，當經，擇的時間段的升高的溫度時是熱抗性的，並保留足 夠的催化活性。例如，當經受實現雙鏈核酸變性所需時間的升高糹顯度時，耐熱 聚合謝呆持足夠的實現隨後的弓卿延伸反應的活性。核酸變性必需的加熱條件 是本領域所熟知的，並且例示於題為"PROCESS FOR AMPLIFYING NUCLEIC ACID SEQUENCES"、1987年7月28日授權給Mullis的美國專利No. 4,683,202， 以及題為"PROCESS FOR AMPLIFYINQ DETECTINQ AND/OR-CLONING NUCLEIC ACID SEQUENCES"、 1987年7月28日授豐又給Mullis等的美國專利 No. 4,683,195中。本發明所使用的耐熱聚合酶通常適合在溫度循環反應諸如 PCR或5'-核酸酶反應中應用。對於耐熱聚合酶，酶活性指的是以正確的方式催 化核苷酸聚合以形成互補於模板核酸的弓l物延伸產物。
示例性的核苷酸齡生物催化齊抱括，如G46E E678G CS5 DNA聚合酶、 G46EL329AE678GCS5 DNA聚合酶、G46EL329AD640G S671F CS5 DNA聚 合酶、G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶、G46EE678GCS6 DNA聚合酶、AZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、Hffi熱菌(77^^t^ 聚合酶、TMA-25聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、TMA-30聚合酶、E678G TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶、棲熱菌屬(7^emmO物種SPS-17聚合酶、 E615G Taq聚合酶、棲熱菌屬Z05R聚合酶、T7 DNA聚合酶、科恩伯格 (Komberg) DNA聚合酶、克列諾(Klenow) DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、 微球菌DNA聚合酶、a DNA聚合酶、逆轉錄酶、AMV逆轉錄酶、M- MuLV 逆轉錄酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、大腸桿菌(EcW) RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7RNA聚合酶、RNA聚合 酶n、末端轉移酶、多核苷酸磷酸化酶、核糖核苷酸齡DNA聚合酶，等等。
術語"序列段"指的是本發明多核苷酸的5'-部分的多核苷酸子序列(即5' 尾)。5'-部分包含一個、兩個或更多個序列段，每個序列段具有位於5'-末端的 獨# ，它們在一種多核苷酸5'-尾J^t於所有序列段是相同的。序列段可具 有約3-10個或更多鹼基的長度，例如，約3-8、 3-6、 4~6、 4-8或7-8 M的長 度，並且5'-部分可包含2個至約10個或更多序列段。序列段可以是但不需要 是等質量的。等質量的序列段可以是但不需要具有相同的序列。共享相同核酸 序歹啲5'-尾中的序歹煅是重複。
術語"5'-末端"和"3'-末端"可互換指代多核苷^h的核苷酸位置，其處於5'-端或3'-端(即5'-或3'-^ )，鄉巨離核酸或其子序列^的一個或兩個核 苷酸鵬位置(即，處於距5，-或3，-末端(-1)或(-2)的位置)。
術語"封閉部分"或'封閉基團"指的是附著至多核苷酸3'-末端的化學基團或 部分，其阻止核酸的延伸，如通過至少一個核苷M合生物催化齊啲延伸。示 例性的封閉部分包括在3'-末端核苷酸鵬的2'位的取代基即2'終止子核苷酸。
"2'終止子核苷酸"指的是在核苷酸糖部分2'位包含封閉基團(BG)的核苷 酸類似物。2'終止子核苷酸可以是不可被一個或多個核苷酸齡生物催化劑延伸 的。那就是， 一旦2，終止子核苷酸被^入核酸(如在核酸的3，終末端)，封閉 基團就阻止通過至少一個核苷酸整合催化齊啲核酸的進一步延伸。示例性的封 閉基團是磷酸基團。示例性的2'終止子核苷,括2'-單磷酸-3'-羥基-5'-三磷酸 核苷和2，-單磷酸-3，-羥基-5，-二磷酸核苷。2'終止子核苷酸詳細描述於，例如美 國專利公開Nos. 2007/0219361和2007/0154914。
術語"耙核酸'指的是任何包括待檢子序列的核酸。耙核酸可以是DNA或 RNA。靶核酸可以是任意來源，包括基因組DNA、 mRNA、 cDNA。革巴核酸可 以是天然存在的或合成的(如擴增子、載體等等)。耙核酸可以是但不需要是純 化或分離的。取決於檢測測定的性質，靶核酸可以是來源於植物或動物組織， 或取自反應混合物。耙核酸在長度上沒有限制，儘管耙核酸可以在由目前的方 法檢測或鑑定之前暴露於限制性內切核酸酶。對於本發明方法的目的而言，靶 核麟用本領域己知的方法製備。
術語"擴增劍牛"指的是擴增反應(如PCR擴增、RT-PCR擴增)的割牛，
14所述的擴增反應允許可延伸多核苷瞰例如，引物)與靶核苷酸的雜交，以及可延 伸多核苷酸的模板依賴的延伸。如本發明所〗頓的，"擴增條件"鵬於擴增靶
核酸的充足^f牛是本領域熟知的。參見例如K^Pr/mwJI^orato^Mwwa/, Dieffenbach和Dveksler,編輯,20(B, Cold Spring Harbor Press;以及屍O 屍ratoco&， Bartlett和Stirling,編輯,20(B, Humana Press 。


圖1示例說明了本發明的多核苷酸以及方法的示意^。在lt際例性實施 方案中，多核苷酸包含具有3個相同序列段(即"重複")的5'-部分或5'-尾 (5'-NTAATAATAAT-3';SEQ ID NO:l )。所述的多核苷酸用於檢測耙核酸內的多 態性核苷酸。所述的核苷,可包含約50%至100%的核糖核苷酸，所述的核糖 核苷酸互補於每個序列段的5'-末端位置的核苷酸(如rATI^A)。核糖核苷酸被 整合入互補於多核苷酸的擴增子鏈。使擴增子經受片段化，從而釋放序列段。 接著，檢測釋放的序列段的質量。核糖核苷酸也將齡入耙核酸的互補鏈(3，-^ATTATTATTA-5，;SEQIDN0:2)。因此，革巴核酸的擴增鏈也將在核糖核苷酸 被M^的位置經受切割。
圖2示例說明了應用於此以及實施例1所描述的方法在H19基因內SNP的 C等位基因的成功基因型分型。"GTCTTA"指的是詢問弓,(interrogating primer) 中重駄聚體的反向互補核辦列。"噪聲表明沒有檢觀倒可辨另啲信號。
圖3示例說明了應用於此以及實施例1所描述的方法在H19基因內SNP的 T等位基因的成功基因型分型。"GCTCTA"指的是詢問引物中重複六聚體的反 向互補核,列。"噪聲表明沒有檢測到可辨別的信號。
圖4示例說明了應用於此以及下面的實施例1所描述的方法在H19基因內 SNP的C和T等位基因的成功並行基因型分型。"噪聲表明沒有檢測至何辨別 的信號。
圖5示例說明了應用80%或90%核糖核苷酸(此處是rATP)以及脫氧核糖 核苷酸dU和dC對HIV轉錄物的成功鑑定。未從不具有糹鎌的樣品中獲得信號。 參見實施例2。 "CCUA"指的是上遊引物中重複四聚體的反向互補核酸序列 (4xCCUA=SEQ IDNO:6)。 "GUGA"指的是下遊引物中重複四聚體的反向互補 核Mi^列(4xGUGA=SEQIDNO:7)。"噪聲表明沒有檢觀倒可辨別的信號。
圖6示例說明了應用80%或90%核糖核苷酸(此處是rATP)以及脫氧核糖核苷酸dU和5-Me-dC對HIV轉錄物的成功鑑定(4xCmeCmeUA= SEQ ID NO:8; 4xGUGA=SEQIDNO:7)。未從不具有模板的樣品中獲得信號。參見實施例2。
"噪聲表明沒有檢測到可辨另啲信號。
圖7總結了圖5和圖6示例說明的測i辦品的結果(4xCmeCmeUA: SEQ ID NO:8; 4xCCUA=SEQ ID NO:6)。
圖8A-C示例說明了 N0S1_361的SNP R的ATP核糖-PCR的7-聚體區域 的質譜。A，對應於純合子A的3片段GTTTCTA(3xGTTTCTA-SEQIDNO:9)。 B，對應於雜合子AG的3片段GTTTCTA和GTTTTTA(3xGTTTTTA= SEQ ID NO:IO)。 C，對應於純合子G的三片段GTTTTTA。
具體實施例方式
1、導言
本發明提供了多重檢測程序，其要求最小數目的反應步驟並允許方便和真 實的多重化。該禾旨利用M^核糖核苷酸鹼基的反應(如包含四種核苷酸(A、 C、 G、 T)至少之一全部或部分作為核糖鹼基(ribobase) (rNTP)的擴增反應)。 採用了對耙核Mf寺異的引物。弓卿中的一個或兩個具有5'-尾，所述5'-尾帶有一 個、兩個或更多^^勺3-10個或更多個鵬的序列段，並且帶有位於齡序列段 5'-末端的與核糖鹼基互補的鹼基。序列段可以但不需要是等質量的。擴增導致 引物序列包括其5'部他括入擴增子(即擴增產物)。擴增子也將包含齡的核 糖鹼基。為了通過質譜分析法進行分析，使擴增產物經歷片段化，例如，通過 暴露於鹼。所述的鵬擇性地切害螺在齡的核糖鹼基3'的DNA主鏈。因此， 擴增產物中的弓l物序列的整合，以遊列段，使得可通過檢測序列段的不同質 量而檢測產物的存在。弓l物的使用轉化為具有拷貝並擴增的序列段的質量的產 物的存在。
為用於多重化，用於多個革E核酸(如不同的等位基因)的引物尾端具有不 同的5，部分序列段，其在切害U後生成不同質量的產物。所有新合成的DNA含有 整合的核糖鹼基並因而在經受鹼的時候產生片段。為方便解釋，可設計整個系 統，從而使得從引物以及其他核酸的雜交部分通常出現的質量信號不同於5'-尾 序列段或其互補體的質量。單個尾中的序列段可以是等質量的，並且可以是相 同序列的(即重複)。重餅歹暇的重複導致了鵬衍生自弓卿與耙核酸退火或 拷貝耙核酸的部分的序列的信號的清晰信號。根據權禾腰求1的方法，其中每個5'部分序列段是等質量的，因而是本發明的 實施方案。
禾聘允許單個孔中具有最少數目的反應步驟的10個或更多個樣品的有效多
重基因型分型。所述的步驟通常需要DNA模板和主混合物(mastermix)的混
合。在熱循環之後，加入鹼溶液，且測量片段化的序列段的質量，例如，通過
質譜分析法。可採用任意已知用於質量測量的方法。當應用質譜分析法時，任
一種類的質譜儀都適合用於分析。
弓,可任逝也包含可去除的3'-末端封閉劑(即，"熱啟動")以使得相同的
耐熱DNA聚合酶能實現'熱啟動'，從而提高特異性以及允許更^f呈度的多重化。
在實施目前方法的一個實例中，核糖PCR (ribo PCR)可用對於旨耙核 酸(如^SNP，每個等位基因)的DNA樣品、兩個正向引物以及一個反向 引物實施。正向弓卿設計為特異於一個耙核酸(如一個SNP， 一個等位基因)， 其3'-末端或3'-末端倒數第二個^S特異互補於耙核社的識別鹼基。針正向 弓卿具有特異的5'-尾，其包含一個、兩個或更多個具有相同質量的序歹暇，其 中針序列段的5'-末端鵬互補於PCR擴增混合物中的核糖核苷酸(NTP)。 序列段的質量設計為在不同的等位基因、SNP以及其他可檢測耙核酸中是不相 同的並且可區別的。
為生成具有可區別質量的序列段，弓l物的5，-尾可包含，例如，約2-10個約 為3-10個^^長度的序列段，或約4-7 ^i勺為4^6個^^長度的序列段，或約 2-3個約為7-8個 長度的序列段。
核糖陽PCR (Ribo-PCR)或核糖擴增(ribo國amplification)是具有脫氧核苷酸 以及至少一個核苷酸(核糖核苷酸或rNTP)的混合物的PCR反應或擴增反應。 這種反應的例子是包含dGTP、核糖核苷酸rTTP (即5-甲蟇UTP)、 dCTP以 及dATP，以及在合適緩衝液中有效整合及延伸核糖核苷酸的DNA聚合酶的 PCR混合物。所述的反應可fflil任意延伸反應包括熱循環反應來實施。熱循環 之後，可以用鹼處理反應混合物。所述的鹼可以是強鹼，例如NaOH或KOH。 所述的鹼切害螺在齡的核糖M3'的DNA主鏈，並導致片段的生成。革巴核酸 的存在導致特異於耙核酸的正向弓嫩的應用並且因此存在擴增的5'-尾序列。拷 貝並切害啲尾的互補體具有獨特的質量。所述的質量用於確定測試樣品中靶核 酸的存在。對應於被切割的互補，歹啲質量信號的存在被用於鑑定測試樣品
17中靶核酸的存在。為用於多重化，應用了許多不同的尾序列，旨尾序列具有
切割後產生特定質量的DNA的M組成。 2、多核苷酸
本發明的多核苷酸包含5，-部分或5，-尾，所述5'-部分或5，-尾包含一個、兩 個或更多個串聯序列段，以及設計為足夠互補以與靶核酸退火以允許核苷酸基 於模板延伸的3'部分。
a 5,-部分
5，-部分或5，-尾包含一個、兩個或更多個串聯(即鄰接的)序列段，M序 列段包含獨特的核苷酸鹼基(即在該段中僅用一次)，其位於每個序列段的5，-末端。在 的實 案中，5'-部分或5'-尾中的每個序列段具有相等的質量。 在另一個優選的實施方案中，5'-部分或5'-尾中的每個序列段具有相同的(意味 著同樣的)的核苷li^列。將具有相同的核苷,列的串辦列段稱為重複。 獨特的核苷酸鹼基可接著最後一個(第二個職三個鄉四個，等等)串辦 列段。例如，具有3個相同質量、每一個4個核苷酸長度的序列段的5'-部分或 5'-尾的序列可以是5'-TAGCTAGCTAGCT-3，(SEQIDNO:3)，其中核苷酸 "T"互補於反應混合物中的核糖鹼基。
如同上文的示例，在一些實施方案中，5'-部分或5'-尾的3'-末端核苷酸鹼 基互補於反應混合物中的核糖鵬。因為鹼性溶液切害螺在齢的核糖M 3' 的鍵，包括在5'-部分的3'-末端，互補於反應混合物中核糖M的核苷酸^S使 得所有序列段釋放。保留在切割的擴增子3'-末端的是齢的具有2'或3'磷酸的 核糖鵬。參見圖l。如果5'-部分僅包含一個序列段，貝腰求位於5'-部分3'-末端的互補於反應混合物中核糖鹼基的核苷酸鹼基。如果兩個鞭多個序列段 具有不同質量，則也要求位於5'-部分3'-末端的互補於反應混合物中核糖 的 核苷酸鹼基。然而，如果靶互補部分的末端5'-核苷酸也是相同盼'獨特"核苷酸 鵬，或者如果5'-部始有兩個或更多個相等質量的序列段，貝啦於5'-部分3'-末端的互補於反應混合物中核糖M的核苷酸M是任選的。
在雌的實船案中，附加的核苷酸 &含於5'-部分的5'-末端。附力啲 5'-末端核苷酸鹼基可以是任意的鹼基。示例性的具有附加5'-末端核苷酸 的 5'-部分可以是5'-NTAGCTAGCTAGCT-3'(SEQIDNO:4)。包括附加的5:末端 核苷酸鹼基增加了釋放的片段質量的均勻性與準確性。這是因為，當鹼性溶液切割緊在齡的核糖鹼基3'的鍵時，2'或3'磷酸部分保持附著於核糖 。參 見圖1 。當應用不進行模板非 性延伸的核苷,合生物催化劑時，包含在5'-部分5'-末端的附加核苷酸鹼基找到了用途。
在其它雌的實施方案中，5'-部分或5'-尾中的序列段具有相同的質量但序 列不同。例如，具有3個相同質量、每一個四個核苷酸長度的序列段的5'-部分 或5'-尾的序列可以是5'-TAGCTCAGTGCAT-3'(SEQIDNO:5)，其中所述的核 苷酸M^'T'互補於反應混合物中的核糖鹼基。
在進一步4，的實施方案中，5'-部分或5'-尾中的序列段可以是不同長度 (如3、 4和/或5個核苷酸鹼基)和不同質量的，但當擴增子進行切割時，齡 5，-部分或5，-尾產生可被例如質譜分析法鑑定的可區分的"特徵"模式。
5'-部分或5'-尾可包含有如所需的2到約10個序列段，或更多個，例如， 約2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或更多個串聯序列段。每個序列段可以是約3 個到約10個核苷酸M長度，或更長，例如，約3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10或 更多個核苷酸鹼基長度。通常，序列鵬長，需要包含於5'-尾中的就越少。相 忠也，序列鵬短，將包含於5'-尾內的就越多。例如，5'-尾可以包含約24個 約7-8個核苷酸鵬長度的序列段，或約4-6 ^^勺4-6個核苷酸m長度的序列 段，或約5-8個約3-5個核苷酸鹼基長度的序列段。
多核苷酸用作耙核膨趙申以及擴增反應中的引物。位於每個5'-尾序列段的 5'-末端的獨特核苷酸鹼基互補於包括在反應混合物中的核糖核苷酸itt，所述 反應混合物用於被本發明的多核苷酸雜交的耙核酸的延伸或擴增。
b, 3,-部分
多核苷酸的3'-部分被設計為具有足夠互補以與耙核,列雜交並延伸的核 ,列。3'-部分如所需的至少是5個核苷酸鵬長度，且可以更長，例如，約 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50個核苷酸鹼基長度。3，畫部分的3，陽末端 或3'-末端的(-1)爽-2)位核苷酸 ，可根據本領域已知的方法，用於區分耙核 酸中的特定等位基因或SNPs。示例性的例如用於弓卿延伸或熱循環的反應^f牛 包括約50mMA42-羥-U-二羥甲基乙基]甘氨酸-KOH (丁ricine-KOH)， pH7.5， 100mMKOAc， 3.0mMMg(OAc)2，以及200nM的各種dNTP;退火或雜交 鵬 可以為約5(TC-70°C，例如為約60^5"C。
在iM的實施方案中，3'-部分的3'-末端任選地具有封閉基團^m閉部分，
19其可鄉也阻止多核苷酸的延伸。示例性的可3l^t閉部他括附著於3'-鄉核苷 酸的2'位置的取代基(即2'終止子)。在特別優選的實施方案中，2'-終止子部分 是磷酸或磷酸類似物，例如甲基氨基磷酸。
通常，在糖部分2'位置利用的封閉基團(BG)可包括各種不同的實施方案。
的，例如，所述的BG是負電荷基團柳駄^IR基團。為進一步解釋說明， BG任iMki^自如CN、 N02、 N3、卣基團、醚基、縫、羧酸基團、酯基團、 氨基基團、OCH3、 OCH2COOH、 O-甲矽烷醚基團、酮基基團、O內酯基團、 0-烷基基團、O-環烷基基團、0-| ;希基基團、O-'鵬(alkynl)基團、氮基甲酸 酯基團、 胺基團、醐安基團及其組合。更特別地，BG任;^i也包含式(I):
其中Q是O、 S或NH; X是H、 OH、 CH3、 BH3、 F或SeH;並且Z是O、 S或Se。為進一步解釋說明，BG任選地包含式(m):
其中Q是O、 S或NH; X是O、 S或NH; Z是O、 S或Se;並且R是烷 基基團、鏈烯基基團或炔基基團。在另一個示例性雌的實施方案中，BG包含 式(IV):
在其它 的實 案中，BG包含式(E):Z
X——L-R
其中Q是O、 S或NH; X是O、 S或NH; Z是O、 S或Se; L是 -CONH(CH2)nNH-、國國CO(CH2)nNH-誦、或-CONH(CH2CH20)nCH2CH2NH-; n 是大於零的整數，並且R是NH2、 SH、 COOH、猝滅部分、報導部分、生物素 或親和部分。
示例性有用的2'-終止子核苷飽括2'-單磷酸-3'-羥基-5'-三磷酸核苷以及 2，-單磷酸-3，-羥基-5，-二磷酸核苷。2'-終止子可逆封閉基團詳細描述於，例如美 國專利公開Nos. 2007/0219361以及2007/0154914。
本發明的多核苷酸可任選地含有非天然存在的核苷酸主鏈鍵、核苷酸鹼基 以及核苷酸鹼基類似物，如本發明所述。多核苷酸可以是單鏈^5l鏈的。在優 選的實施方案中，多核苷酸在它們的全長均是單鏈。多核苷酸可以含有但時常 不含有任何標記，例如附著的螢光團、放射性同位素、酶或其它鑑定劑。多核 苷酸可以是分離的、合成的或重組的。多核苷酸，包括5'-和3'-部分，可以是任 意長度的並且通常是約200個核苷酸頗短，例如，約150、 125、 100、 75、 50 或25，或更少的核苷酸長度。
3、檢測方法
a 4吏革巴核酸與本發明的多核苷酸接角蟲
實施檢測方法的第一步涉及將耙核酸與本發明的多核苷酸、核苷酸集以及 核苷M合生物催化組分接觸。 i.核苷,
用於本方法的核苷 包含至少一個核糖核苷酸 形式的 (如A、U、 G或C或另一個核糖核苷酸，rNTP)。在一些實施方案中，核苷麟含有至少 兩個核糖核苷酸鹼基形式的鹼基。所述的一個或多個作為核糖核苷酸 被包 括的MS，可以是全部(如100%的核糖核苷酸)或部分地(如少於100%的核 糖核苷酸，如鹼基的殘餘部分是脫氧核苷酸或dNTP)作為核糖核苷酸^S被包 括在核苷酸集中的。在 的實施方案中， 一個或多個核苷酸tt以大部分作
21為核糖核苷酸(rNTP)存在，即 150%，如60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%，以及以小部分作為脫氧核糖核苷酸(dNTP)存在(即少於50%)。在特 別優選的實施方案中，至少一種核苷酸鹼基的至少80%是核糖核苷酸的形式。 一個或多個核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸一起被包括在內以完成完整的核苷酸 集(A、 T、 C和G核苷酸存在)。 ii.生物催化組分
本發明的方法採用的核苷,合生物催化組分包含脫氧核糖核苷酸和核糖 核苷M合活性。在優選的實施方案中，相同的催化結構域可催化脫氧核糖核 苷酸禾啦糖核苷酸齡活性。在其它雌的實施方案中，生物催化組分包含至 少兩個催化結構域， 一個具有脫氧核糖核苷酸整合活性，另一個具有核糖核苷
適合用於本發明方法的示例性生物催化組分包括，但不限於，作為修飾的 Z05、 CS5、 CS6或Taq聚合酶的聚合酶。CS5、 CS6嵌合聚合酶進一步描述於， 如美國專利申請公開No. 2004/0005599。棲熱菌屬(7 2emm)物種Z05已在PCT 國際專利公開No. WO 92/06200中公開。示例性的修飾酶包括，如G46EE678G CS5DNA聚合酶、G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶、G46EL329AD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329AT606S D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46EE678GCS6DNA聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶等等。 例如相對於缺乏一個或多個這些突變的酶，這些修飾的酶包括增強核糖核苷酸 齡的、以及增強核糖核苷酸2'-斷布類似物齡的、禾口/或減少或消除5'-3'外 切核酸酶活性的突變，。
涉及有用的核苷酸整合生物催化劑的其它細節也在如美國專利申請Na 11/873,896以及美國專利Nos. 5,939,292、 4,889,818、 5,374,553、 5,420,029、 5,455,170、 5,466,591、 5,618,711、 5,624,833、 5，674,738、 5，789,224、 5,795,762、 7,148,049以及7,179,590中提供。
可通過各種方法，如位點定向誘變、化學修飾等，來完成具有如整合核糖 核苷酸以及2'-終止子核苷酸的增強效率或其他所需性質的修飾酶的生產。更具 體地，位點定向誘變通常通過位點特異性弓,指導的誘 完成。這種技術可 採用除了代表所需突變的都艮錯配外互補於待誘變的單鏈噬菌體DNA的合成 寡核苷酸引物來實施。簡而言之，合成的寡核苷酸用作引物以指導互補於質粒或噬菌體的鏈的合成，並且將所得的雙鏈DNA轉化進入支持噬菌體的宿主細 菌。所得的細菌可艦如DNA序列分析或探針雜交來測定，以鑑定那些攜帶所 需突變基因序列的噬菌斑。為進一步解釋說明，也可利用許多其它的修飾核酸 的方法，諸如"重組PCR"方法。
在本發明的實踐方面(如生產修飾的酶、實施測序反應等等)，任i^t也應用 ^f生物學以及重組DNA的許多常規技術。這些技術是公知的並且解釋於，例 如，Q/w加屍ratoco^ /" Mo/ecw/ar 5,o/ogy,1997-2007(F.M.Ausubel編輯),Wiley Interscience;Sambrook等,2001jM /ecw/ar C/o"/"- /aZ)orato y Mo^wa/,第三 脫Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y;Berger禾卩Kimmel, GW<afe to M /ecw/ar C7o"/"g 7fec/2"—es A/e&Ofis1 ￡h^>wo/ogv巻152 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)^DA64 C7cra) g:^4屍rac"ca/ ^4pjwoac/7,巻I禾卩 n,1985(D.N.Glover ed);(9//gowwc/eofefe S>^/2a^,1984(M.L.Gait ed); 7Viwc/e/c爿c/d /^^r/<^a^'ow, 1985,(Hames禾口 Higgins);rraracn)^o" <m/ 7h3m7af/ow, 1984(Hames禾口 Higgjns eds.);4幽a/ Ce〃 Q^,，1986(R.I.Freshney ed); //w膨緣!ze(i Oto朋d E^was,1986(IRL Press); Perbal,1984^4屍rac"c"/ Gw/(ie to M /ecw/ar C7ow/"g;系 歹U 5Mef/20 ^vmo/ogy巻154禾口巻155(分另lj為Wu禾口 Grossman,以 及Wu，編輯)。
ni.多核苷酸
用於本方法的5'-加尾的多核苷酸如上文和此處描述。在 的實施方案中， 耙核酸與許多(如兩個或更多個)5'-加尾的多核苷酸相接觸。在其它優選的實 施方案中，這些許多多核苷酸中的每一個通過具有包含一個、兩個或更多個等 質辦列段的5'-部分分另哋可識別。在此情況下，齡5'-加尾的多核苷,補 序列的擴增子或互補體的片段化產生不同的質量信號或牛寺徵質量概況。在迸一 步優選的實施方案中，多核苷酸作為一個或多個弓卿對與耙核酸相接觸。弓卿 對中的一個或兩個多核苷酸可包括包含串聯序列段的5'-尾。還可以提供作為一 個或多個弓l物對與耙核酸接觸的多重多核苷酸，其中弓l物對中的每個弓卿包含 含有相同質量的串聯序列段的5'-部分。在此情況下，用於產生擴增子的引物對 中每個引物的5'-部分的互補體的片段化生產更大(如，約兩倍)強度的單質量信號。備選地，引物對中的每個弓卿可包含一個序列段，引物對中每個引物中 的序列段是相同質量的。
在方法的 實施方案中，5'-加尾的多核苷酸可包含具有不同質量的一個 序列段以產生可檢測的切害U產物。 iv.耙核酸
革巴核酸可來源於任意來源，如來源於動物、植物、細菌鵬毒的組織樣品，
或者可以是例如從反應混合物合成的。耙核酸可以是，如基因組DNA、染色體 或染色體節段、mRNA、 cDNA、載體(如表達載體)、表達盒、裸DNA或RNA 聚合物、聚合酶鏈反應(PCR)的產物、寡核苷酸、探針、引物等等。靶核酸 可以是，如單鏈、雙鏈、三鏈等等，並且不限於任何特定的長度。用於本發明 方法的靶核酸時常地將包含一個或多個單核苷酸多態性(SNP)、插入、缺失、 置換或其它辨別特徵。革巴核酸通常在樣品中提供。
在優選的實施方案中，以辨別一個或多個SNPs的目的接觸革E核酸(即實施 的方法)。在這樣的應用中，採用了至少兩個不同的等位基因-辨別性5'-加尾的 多核苷酸，它們的3'-部分不相同，從而使得它們特異性地與特定等位基因退火， 並且，它們的5'-部分也不相同，從而使得一個或多個序列段具有對應於並獨特 地鑑別被3'-部分結合的等位基因的質量。
在其它優選的實施方案中，以檢測靶核酸中一個或多個稀有突變的目的接 觸靶核酸。在這樣的應用中，存在一個或多個具有特異性與靶核酸中特定位置 的突變退火的3'-部分的多核苷酸(具有特異性與野生型在相同位置退火的3'-部分的多核苷酸，可任選地存在於相同或分開的反應中)。當評估耙核,列中 的一個突變時，可以應用一個、兩個或更多個區分不同突變的5'-加尾的多核苷 酸，其在3'-部分不同，從而使得它們特異性與野生型或一個或多個突翅退火， 並且，它們在5'-部分也不同，從而使得一個或多個序列段具有這樣的質量，所 艦量對應於並獨特地鑑別被3'-部分結合的等位基因。在評估一個耙核酸中的 兩個或更多個突變的應用中，具有特異性檢測耙核酸中第一位置的突變的3'-部 分的多核苷酸，可以具有全部是第一質量的5'-部分序歹煅；具有特異性檢測耙 核酸中第二位置的突變的3'-部分的多核苷酸，可以具有全部是第二質量的5'-部分序列段。備選地，多核苷酸5'-部分序列段的質量可以彼此不同，作為獨特 的鑑定劑操作。在其它 的實施方案中，如那些涉及多重擴增^伸的，作為兩個或更
多個弓,對提供多核苷酸。在第一引物對中，引物對中的齡弓l物的5'-部始 有第一質量的序列段;第二弓卿對中針弓l物的5'-部始有第二質量的序歹峨， 其可檢測地不同於第一質量；第三弓,對中針弓胸的5，-部船有第三質量的 序列段，其可檢測地不同於第一和第二序列段的質量；後續引物對中每個引物 的5'-部，含具有可檢測地不同於前面所有的或其它弓l物對的質量的序列段。 弓l物對的數目以及擴增或延伸反應受反應混合物中游離核苷酸鹼基可用度的限 制。在一M^的實驗案中，反應混合物可包含有2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物對。這種策略允許多個耙核酸或單個耙核酸當中的多個 靶的並行檢測。
b.擴增革E核酸以生產擴增子
l擴增方法
可採用一個或多個本發明的多核苷酸，應用本領域已知的任意的多核苷酸 延伸或擴增的方法來擴增耙核酸。應用聚合M反應(PCR)的任意己知變化， 包括RT-PCR、定量PCR、多重以及實時PCR的擴增在本發明的方法中是有用 的。擴增也包括了等溫擴增方法和本領域已知的多核苷ME伸方法。實施PCR 的規程是本領域所熟知的，且其描述於，例如PO 屍hmerv4I^orato^M朋^^ Dieffenbach禾口 Dveksler,編輯,2003,Cold Spring Harbor Laboratory Press;爿-Z q/" 0/07 故加've屍C尺,Bustin，編輯,2004,Intemational University Line; EdwardsrRea/-7l, 屍C7 .vlw _&扁如/ Gw/cfe，2004，Taylor& Francis; Wea/ 7 ,屍C尺Do喊ed.,2006, Taylor & Francis;屍CA屍rotoco&:爿Gw/<afe to Me^o<iy朋c/ ^4p/ //caft'ora, Innis,等,編 輯，1990,Academic Press, San Diego;PO Srrategz^,Innis,等,編輯,1995,Academic
編輯，1999,Academic Press,San Dieg。耙核酸擴增跑正伸足夠的時間量或足夠 數目的循環以產生可檢測量的擴增子。
如上文所討論那樣，可擴增一個或多個耙核酸，或者可擴增單個耙核酸中 的一個或多個耙位置。由於基本上對具有可區別質量的序列段的不同5，-部分的 數目沒有限制，所以方法特別適合於多重擴增測定。 一個或多個用於擴增靶核 酸或耙核酸中特異位置的多核苷酸可具有不同的帶有唯一可識別質量序列段的 5'-部分。用作引物對的多核苷酸對可具有帶有相同質量的序列段的5'-部分。在
25具體的實施方案中，序列段共有相同的序列。多重擴增測定可並行確定至少5、 10、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100個頗多個不同革巴核酸鄉巴核 酸中的位置的存在(或不存在)，如同所需的那樣。
本發明的擴增以及多核苷酸延伸反應採用生物催化單位(如聚合酶)，其包 括齡核糖核苷I^A待延伸核勝連的酶活性(如，"核糖-PCR"、"核糖-擴增"或'核 糖-延伸(ribo-extension)")。示例性的具有核糖核苷酸整合活性的生物催化單 位包括G46E CS6R DNA聚合酶以及KB17 DNA聚合酶，其可從Roche Molecular System獲得，並描述於，例如Mauger等^wcfe/c爿c/A 仏warc/2(2007)35(8):e62以及Mauger等^wc/e/c爿c她尺e犯arc/2 (2006)34(3):el8。 可用的其它生物催化組分在上文以及此 行了討論。也可參見美國專利No. 5，939，292。
ii.擴增子產生
耙核苷,歹啲擴增將產生雙鏈的擴增子，其中互補於多核苷酸5'-部分的 擴增《將包括含有一個或多個序列段的3'-部分，其中序列段的3'-^核苷酸 M^含有^的核糖核苷單磷酸(rNMP)。
c.切割jf增子
可應用本領域已知的任意方法切割擴增子的序列段。在根據本發明的ttit 實施方案中，通過使擴增子經受鹼(即鹼性溶液)，在整合的NMP3，的鍵切割 擴增子。擴增子tt^暴露於鹼性溶液以被切割，特別地是暴露足以實現切害蝤 合的NMP3'的鍵的時間段和溫度。通常，溫度越高，鹼處理所需的時間,短。 例如，切割或片段化步驟可在7(TC施行約1.5小時，或在約55。C施行約8小時 (即過夜)。鹼鵬糹鵬可以低至冷凍、鵬(如4"C)以及高至鄰近沸點糹鵬(如 約95。C)。在優選的實施方案中，鹼性溶液可以是pH大於約8.5的任意溶液， 例如，pH至少是約9.0、 9.5、 10.0、 10.5、 11.0、 11.5、 12.0、 12.5、 13.0頓高。 在一些實施方案中，鹼性溶液將包含至少約0.2M、 0.3M、 0.5M、 0.8M、 1.0M 或更多的鹼性化合物。
鹼性溶液將通常含有至少一種強鹼。在一些實施方案中，可採用弱鹼，例 如，如果以較高濃度包含在鹼性溶液中的話。通常，鹼性溶液將包含至少一個 具有約5.0或更小pKb的鹼性化合物，例如，約4.5、 4.0、 3.5、 3.0、 2.5、 2.0、 1.5、 1.0、 0.5或更小的pKb。示例性的用於在M的NMP3'的鍵片段化擴增子的鹼性化合物包括，例如NaOH、 KOH、 RbOH以及NH4OH， tfci^NaOH、 KOH 或NH4OH。其它的自鹼性化合物也可^ffl。參見例如Mauger等Wwcfe/"d^/ i^earc/z(2007)35(8):e62以及Mauger等^wc/e/c爿c/A Ae犯arc/z (2007)34(3):el8的
鹼鵬呈序。
d.檢測擴增子片段
可應用本領域已知的任何方法來檢測擴增子片段或切割且釋放的序列段。 在 的實施方案中，通過質量鑑定來檢觀徹割的片段。序列段也可在切割之 前或之後例如用螢光團或放射性同位素進行可1^測地標記。可在5'-末端或3'-末端或在從頭到尾的任意的核苷酸 標記片段。示例性的檢測方法包括但不
限於質譜分析法、電泳分離、時間分辨螢光檢測、自旋共振檢測以及帶有之
後的檢測的與固相(如陣列)雜交。
在 的實施方案中，採用質譜分析法檢測從擴增子釋放的切害啲序列段。
質譜分析法方法是本領域所熟知的。任何質譜分析法技術均可應用，包括例如
雷射解吸電離質譜分析法(如基質輔助雷射解吸電離質譜分析法(MALDI)， 以及表面增強雷射解吸電離質譜分析法SELDI)、氣相離子光譜測定法、氣相層 析質譜分析法、串聯質譜分析法以及其他質譜分析法技術。質譜分析法方法是 本領域所熟知的，並描述於例如Gross^oxs S,/r騰吵:」7MooA:,2006, Springer Verlag; 以 及 Dass斥"6famewtoZy q/" Co"tew/ ora^v Mks1 ^ec加膨吵,2007,Wiley Interscience。
檢測的擴增子片段可以是AAS補於或擴增自多核苷酸5'-部分的擴增子的切 割的序列段。當然，應當理解可切害啲序列段可從擴增子長度從頭至幅產生。 在鹼性條件下，緊在已齡核糖核苷酸處3'的HJS行切割。在雌的實施方案 中，擴增子片段可從擴增的耙核酸檢測(如，AAS補於多核苷酸3'-部分的序列 段)。如所需的，可檢測從多核苷酸的5'-部分和/或3'-部分或其互補體切害啲序 列段。來自檢測的擴增子片段的信號產生指示待鑑定耙核酸的,寺徵。
4、反應混合物
本發明也提供了本發明方法涉及的反應混合物。可產生上文所描述的任意 反應混合物。示例性的反應混合物包括，例如 一個或多個本發明的多核苷酸， 其包括包含一個、兩個或更多個串辦列段的5'-部分或5'-尾，以及設計為足夠 互補以與耙核酸退火的3'-部分；包含dNTP的核苷,，其中至少一種M的
27大多數是核糖核苷酸；以及具有核糖核苷酸整合活性的生物催化組分。在一些實施方案中，反應混合物包含一個或多個革巴核,列。本發明的反應混合物還可包含通過本發明方法所生產的擴增子，所述的擴增子包含具有互補於本發明多核苷酸5'-部分的序列段的3'-部分，其中每個序列段的3'-末端核苷酸 是核苷一磷酸(NMP)。本發明的反應混合物ttit包含含有與多核苷酸相同的5'位置的擴增子。反應混合物中的許多多核苷酸可以作為多核苷酸對提供，如引物對，其中每個多核苷酸對中的每個多核苷IM^包含等質量的5'位置序列段。反應混合物中組分的實M案在上文以及此處描述。
在優選的實施方案中，反應混合物包含兩個或更多個引物對。在第一引物對中，引物對中的每個弓嫩的5'-部分包含具有第一質量的序列段；第二引物對中齡弓l物的5'-部他含具有第二質量的序列段，其可檢測地不同於第一質量-,第三弓,對中每個弓卿的5，-部他含具有第三質量的序列段，其可檢測地不同於第一和第二序列段的質量；後續弓卿對中針弓卿的5'-部他含具有可檢測地不同於前面所有的或其它弓l物對的質量的序列段。在特別優選的實施方案中，反應混合物可包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物對。
在其它優選的實施方案中，反應混合物包括核苷酸集，其包含非常規或非天然存在的核苷酸鵬或標記的核苷酸鹼基，如帶有螢光團^^鄉性同位素。反應混合物也可如需要的那樣包含緩衝組分和鹽。在其它優選的實施方案中，反應混合物包含鹼性組分，如上文所述，例如NaOH或KOH。與此處描述的方法相一致， 一般已將含有高濃度的鹼性組分(如約0.1M-0.2M或更高)的反應混合物進行擴增。
進一步im地，反應混合物包含由本發明的方法所生產的擴增子以及鹼性組分，如本文所描述。5、試劑盒
本發明還提供了用於本發明方法的試劑盒。 一般地，為使用方便，試劑盒進行了區室化並含有提供實施本發明方法的組分的容器，例如， 一個或多個本發明的核苷酸，其包括包含一個、兩個或更多個串辦列段的5'-部分或5'-尾，以及設計為足夠互補以與耙核酸退火的3'-部分；包含dNTPs的核苷酸集，且其中至少一種減基的大多數是核糖核昔酸；以及具有核糖核苷酸整合活性的生物
催化組分。在^她的實施方案中，試劑盒包含一個或多個耙核,列，包括對照核酸序列(用於陽性和/或陰性對照)。試劑盒可以提供實施分離的對照反應的試劑，包括對照多核苷酸和對照靶核酸序列。試劑盒中許多多核苷酸可以作為多核苷fet如弓l物對而提供。試劑盒中組分的實施方案如上文和此處所述。
在4，的實旅方案中，試劑盒包含兩個或更多個引物對。在第一引物對中，引物對中的齡弓胸的5'-部她含具有第一質量的序列段；第二引物對中齡弓卿的5，-部他含具有第二質量的序歹暇，其可檢測地不同於第一質量；第三弓嫩對中齡弓嫩的5'-部分包含具有第三質量的序列段，其可檢測地不同於第一和第二序歹暇的質量；後續弓l物對中針弓嫩的5'-部他含具有可檢測地不同於前面所有的或其它引物對的質量的序列段。在特別優選的實施方案中，試劑盒可包含2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20或更多引物對。
還可以包括一個或多個附加的提供附加試齊啲容器。這樣的附加容器可包括被熟練技術人員識別的、用於根據上文所述方法的引物延伸或擴增程序的任意試劑或其它成分，包括用於如核酸擴增程序(如PCR、 RT-PCR)、 DNA測序禾，或DNA標記程序所用的試劑。在其它的非互斥的變體中，試劑盒包括一個或多個提供游離核苷酸(常規的和/或非常規的)的容器。在具體的實歸案中，試劑盒包括a^t代磷酸酯dNTPs、 dUTP、 dTTP禾口/或標記的dNTPs諸如，如螢光素-或花,染料家族dNTPs。在其它的非互斥變體中，試劑盒包括一個或多個提供適合弓l物延伸反應的緩衝液的容器。在 的實施方案中，試劑盒包含鹼性組分，如上文所述，例如NaOH或KOH。
6、 擴增子
本發明還提供了本發明方法產生的擴增子。PCR擴增子，例如，通常皿鏈的並且包含互補於本發明多核苷酸的鏈。擴增^&含互補於本發明多核苷酸5'-部分的3'序列段，其中所述擴增子的3'序列段包含至少一個、兩個或更多個序列段，其中所述序列段的3'-末端核苷酸鵬是具有與用於生產擴增子的核苷自中的NTP相同的itt的核苷一磷酸(NMP)。
7、 系統
本發明進一步提供了自動實施本發明方法的系統。所述系統包含至少一個包含組合物的容器或支持物，所述組合物含有本發明的多核苷酸或擴增子或反應混合物；配置以在一個或幾個溫度與包含所述多核苷酸或擴增子的組合物熱交流的熱調節器(如核酸熱循環糹幾器；培養箱)；至少一個轉移試劑至容^l^:
29持物或從容器或支持物轉移試劑的試劑轉移裝置；以及至少一個配置以檢測片段化的序列段質量的檢測器(如質譜儀；螢光計)。在雌的實施方案中，系統包含至少一個與熱調節器、試劑轉移裝置和配置以檢測質量的1^測器的至少一個可操作交流的控制器。
實施例
下面的實施例提供來解釋說明而不限制本發明。實施例1-用於高通量SNP基因型分型的Flag-標籤
製備含有人類H19基因中SNP的擴增子用於分析。靶序列是gtgagga卿ggagtaggyGCCCAGGCATCGTGCagacagggcgacatcagc(SEQ IDNO:ll)(小寫字母指示與弓l物退火的序列，'y'指示SNP位置，C或T)。在20^1的總體積中實施PCR，其中2^1來源於稀釋至10ng/Ml的基因組DNA樣品。PCR擴增含有下述組分50mM A42-羥-l,l-二羥甲基乙基]甘氨酸,pH7.5、 100mMKOAc、 2.75mMMg(OAc)2、以及1.6%的存儲緩衝液，其依次含有50%體積比的甘油、100mM KC1、 O.lmM EDTA、 20mM Tris pH8.0、 ImM DTT以及0.5yoTween20。還包括在PCR內的是各0.2mM的5-甲基-dCTP和dGTP、0.4mMdUTP、 0.18mMrATP、 0.02mM dATP以及0.1mM焦磷酸。核苷酸MS混合物含有90%rATP和10%dATP。 PCR擴增中應用的酶是0.02U/|nl尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)以及20nMGLTDSEDNA聚合酶。參見例如，PCT
發明者D·H·蓋爾芬德, F·莫傑, I·G·古特, K·A·鮑爾 申請人:法國國家基因中心;霍夫曼-拉羅奇有限公司