抗流感病毒抗體及其使用方法

2023-07-18 05:04:01

專利名稱：抗流感病毒抗體及其使用方法
技術領域：
本發明通常涉及抗病毒抗體及其使用方法。背景流感大流行代表了對人類健康的最大急性傳染威脅之一。1918-1919流感大流行 在美國引起了估計500，000人死亡，使得其成為全美國歷史中最為致命的事件。橫跨亞洲 並且現在到達中東和北非的高致病性禽流感(HPAI)H5m流感的蔓延造成了出現新的大流 行的重大風險。天然變異以及逃逸突變體(escape mutants)提示病毒的持續進化應影響關於哪 些病毒株應被用於被動和主動免疫的決定。儘管已經報導了許多重要表位定位和中和逃逸 研究，但是仍需要新的中和抗體和相關結構研究來開發針對HPAI H5W的免疫策略。開發 抗HPAI H5N1的保護性疫苗的挑戰是艱難的，需要新的手段來預防和治療不斷變化的敵人 引起的人感染。需要快速開發治療策略來引起保護性宿主免疫，不論是被動的還是主動的。在人抗體(Ab)工程化領域中已有巨大進展。基於單克隆抗體(Mab)的免疫療法 現在已成為數量不斷增加的、包括RSV在內的人類疾病的護理標準。向從頭開始的人Mab 分離及其臨床使用的轉變在某種程度上是由於新的抗體展示和其它庫篩選技術，它們現在 已被利用來創建具有高親和力和特異性的人抗體。人Mab免疫療法可在人類疾病的臨床處 理方面起到越來越重要的作用。發明概述本發明基於發現了中和流感病毒如流感A病毒的單克隆抗體。流感A病毒為組I 流感A病毒，例如Hl簇流感病毒。該Hl簇流感病毒為Hla簇或Hlb簇。該單克隆抗體為 完全人的。在多種方面，該單克隆抗體為二價抗體、單價抗體、單鏈抗體或其片段。具體地， 這種單克隆抗體結合血凝素蛋白(HA)如HAl或HA2多肽的莖區上的表位。該表位為非線 性的。任選地，該表位包含HA-I和HA-2兩者。該表位為非線性的。在一些實施方案中， 該表位包含HAl多肽的胺基酸位置18、38、40、291和HA2多肽的位置18、19、20、21、38、41、 42、45、49、52、53 和 56 處胺基酸。示例單克隆抗體包括單克隆抗體D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、或H98 或者與D7、D8、FlO、G17、H40、A66、D80、E88、E90、或H98結合相同表位的抗體。本發明的單克隆抗體可具有單克隆抗體D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E88、E90、
6或H98的結合親和力。可選擇地，該結合親和力可在約IpM至約200mM的範圍。本發明的 單克隆抗體起抑制病毒和細胞膜融合的作用。該單克隆抗體具有包含SEQ ID NOS :2、6、12、18、24、28、32、和36的重鏈可變氨基 酸序列和/或包含SEQ ID NOS :4、8、14、16、20、22、26、30、34、和38的輕鏈可變胺基酸序列。該單克隆抗體具有包含SEQ ID NOS :1、5、13、15、21、23、29、33、37、和40的重鏈可 變核酸序列和或包含SEQ ID NOS :3、9、11、17、19、25、27、31、35、39、和42的輕鏈可變核酸序列。本發明還提供了單克隆抗流感血凝素蛋白抗體或其片段，其中該抗體具有具 有胺基酸序列 SYAFS、TNAFS、AYAFT、SFAIS、SYAIS、GYYIH、MTAFT、或 DNAIS 的 Vh CDRl 區；具有胺基酸序列 GIIPMFGTPNYAQKFQG、GVIPLFRTASYAQNVQG、GIIGMFGTANYAQKFQG、 GISPMFGTPNYAQKFQG、GIIGVFGVPKYAQKFQG、WINPMTGGTNYAQKFQV、GISPIFRTPKYAQKFQG、 或 GIIPIFGKPNYAQKFQG 的 Vh CDR2 區；具有胺基酸序列 SSGYYYGGGFDV、SSGYHFGRSHFDS、 GLYYYESSLDY、SPSYICSGGTCVFDH、EPGYYVGKNGFDV、GASVLRYFDffQPEALDI, TLSSYQPNNDAFAI、 或 DSDAYYYGSGGMDV 的 Vh CDR3 區；具有胺基酸序列 TGSSSNIGNYVA、TGSSSNIAANYVQ、 TGTSSDVGGYNSVS 、 TGNSNNVGNQGAA、 TGDSNNVGHQGTA、 GGNNIGGYSVH、 RASQSVSSYLA、 RASQSLSSKYLA、TGSSSNIGNYVA、SGSSSNIGSNTVN、RASQSISSYLN、或 TLSSGHSNYIIA 的 \ CDRl 區；具有胺基酸序列 SNSDRPS、EDDRRPS, EVTKRPS、RNNDRPS、RNGNRPS、DDKDRPS、DASNRAT、 GASSRAT, SNNQRPS, AASSLQR、SNEQRPS、或 VNSDGSHTKGD 的 \ CDR2 區和 / 或具有胺基酸 序列 QSYDSLSAYV、QSYDTNNHAV、CSYAGHSAYV、STffDSSLSAVV, SVWDSSLSAWV, QVffDSGNDRPL, QQYGSSPQV、QQYDGVPRT、QSYDSRLSASL、QQYDSSPYT、ASWDDNLSGWV、或 ETWDTKIHV 的 VLCDR3 區。在其它方面，本發明提供了分離的單克隆抗流感血凝素蛋白抗體或其片段，其中 該抗體具有VH種系基因IGHV1-69*01編碼的VH胺基酸序列，並且胺基酸在位置a)27為 纈氨酸；b) 28為蘇氨酸；c) 30為絲氨酸；d) 31為絲氨酸；e) 54為甲硫氨酸；f) 55為苯丙氨 酸；g) 58為蘇氨酸；h) 100為脯氨酸；i) 101為絲氨酸；j) 102為酪氨酸；k) 103為異亮氨酸 以及105為絲氨酸。另一方面，本發明提供了預防或治療流感病毒引起的疾病或病症的方法，其通過 向有患所述疾病或病症風險的人給予治療有效量的本文描述的單克隆或scFV抗體來進 行。該單克隆抗體或scFV抗體以足以中和流感病毒的劑量給予。在本發明的實施方案中， 該方法還包括給予抗病毒藥物、病毒進入抑制劑或病毒附著抑制劑。該抗病毒藥物為神經 氨酸酶抑制劑如扎那米韋或磷酸奧司他韋，HA抑制劑，唾液酸抑制劑或M2離子通道如金剛 烷胺或金剛烷乙胺。該抗體在暴露於流感病毒之前或之後給予。另一方面，本發明提供了檢測樣品中流感病毒的存在的方法，其通過讓樣品與本 文描述的單克隆抗體接觸，並檢測是否存在抗體-抗原複合物，由此檢測樣品中流感病毒 的存在。該測試樣品一般從血液、毛髮、頰刮屑或拭樣、唾液、活檢組織、尿、糞便、痰、鼻抽吸 物或精液中獲得。本發明還基於發現了產生靶向HA莖區中高度保守表位的廣泛中和性人抗體的方 法。通過採用吸附在塑料表面上的在產生短N-聚糖和不帶電荷甘露糖的杆狀病毒中表達 的三聚體H5胞外結構域，使得能優勢呈遞莖表位，同時掩蓋了通常為免疫優勢的球狀頭 部。
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因此，本發明還包括產生特異結合致病性包膜病毒的分離抗體的方法，其通過將 單鏈或Fab表達庫暴露於該病毒的膜融合蛋白，鑑定庫中特異結合所述蛋白的抗體；以及 從庫中分離該抗體。優選地，該融合蛋白被固定在固體表面如塑料上。在多種方面，該融合 蛋白與野生型融合蛋白相比具有經修飾的糖基化。例如，該融合物在非哺乳動物細胞如昆 蟲細胞中產生。該融合蛋白例如為三聚體血凝素(HA)蛋白。本發明還提供了為抗致病性包膜病毒如流感病毒而接種個體的方法，其通過給予 所述個體包被在或包埋在生物學相容的基質中的膜融合蛋白(例如，三聚體血凝素(HA)蛋 白)進行。在多種方面，該融合蛋白與野生型融合蛋白相比具有經修飾的糖基化。另一方面，本發明提供了包含如本文所述的單克隆抗體的組合物以及包含容納在 一個或多個容器中的該組合物及使用說明書的試劑盒。除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術 人員所通常理解相同的含義。儘管類似或等同於本文所描述的方法和材料可用於實施或測 試本發明，但在下文描述了適合的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利以 及其它參考文獻都通過引用其整體併入本文。衝突時，以本說明書(包括定義)為準。另 外，這些材料、方法和實例都僅是闡釋性的，無意進行限制。本發明的其它特徵和優勢將由於以下詳細的描述和權利要求書而明晰。附圖簡要說明圖IA顯示了 A/越南1203/04三聚體的結構。在單體上突出了受體結合位點和抗 原變異位點。圖IB顯示了陽性選擇下H5W流感病毒的HA中胺基酸殘基的位置。圖2示意性顯示了針對H5m的綜合免疫療法(convergentcombination Immunotherapy)。圖3顯示了本發明抗流感抗體的VH和VL兩者的框架區1-4(FR1_4)和互補決定 區1-3(⑶R1-3)的胺基酸序列比較。採用Kabat資料庫定義FR和⑶R區。VH和VL基因名 稱顯示在右側(採用IMGT資料庫)。圓點表示序列與共有序列一致。連字符表示空位。圖4顯示了抗H5抗體的體外中和。(a)(上方插圖)10種nAb被轉變為可溶性 scFv-Fc (與鉸鏈區、CH2和CH3連接的可變區單鏈片段)並評估對H5-TH04假型病毒的中和 活性。顯示了兩個濃度的帶標準誤差條的中和百分比。mAb 80R16用作對照(Ctrl.)。(中間 和下方插圖)，採用噬斑減少測定法進行的10種scFv-Fcs在三個濃度下對野生型H5-VN04 和H5-IN05的中和。結果與從微中和測定法獲得的結果一致(數據未示出)。(b)交叉亞型 中和。nAb D8、F10 和 A66 都中和 H5-TH04、H1_SC1918 ((A/ 南加利福尼亞 /1/1918 (HlNl))、 H1-PR34 (A/ 波多黎各 /8/34 (HlNl))、H2-JP57 (A/ 日本 /305/57 (H2N2))和 H6-NY98 (A/ 雞 /紐約/14677-13/1998 (H6N2))假型病毒。(c)微中和測定。FlO抗野生型H5N1、HlNl (A/ 俄亥俄/83 ( 「H1-0H83」))和 H2N2 (A/Ann Arbor/6/60 ( 『H2-AA60」))的中和滴度與 H5N1 和對照80R產生的鼠科mAb 21G8.6(lmg/mL Ab儲備液)比較。「<」表示滴度小於20。結 果表示兩次獨立實驗。圖5顯示了中和機制。(a)採用H5-TH04假型病毒化HIV-I病毒的全長HA進行 的病毒結合抑制測定。將Ab處理組中病毒與細胞的結合與缺乏Ab時的細胞結合(定義為 100%)相比較。三種nAb(D8、F10和A66)都不抑制病毒結合細胞，而都抑制血凝並可能結
8. 1.2和雪貂抗H5m血清顯著減少結合。(b)nAb對合胞體形 成的抑制。以H5-TH04表達質粒轉染HeLa細胞。通過短暫暴露於pH 5. 0緩衝液誘導的合 胞體形成被20 μ g/ml的nAb D8、F10和A66完全抑制，而對照和抗HAlmAb (2A)在相同濃度 下無作用。圖6顯示了 H5-F10表位的結構以及序列/結構保守性。(a)結合FlO(scFv)的 H5三聚體的結構。H5非常類似於未複合的結構21 (對兩個獨立的三聚體，成對的RMSD (C α ) =1.0 和0.63 A )。ΗΑ1、ΗΑ2、ΗΑ2 的 α A 螺旋、「融合蛋白」(FP)以及 FlO (VH 和 VL)為彩 色標註的。第三FlO隱藏在莖後。注意VL不與Η5接觸。(b)中央莖區的表面。一個單體 由鏈著色；概述了 FP穿過表位的通路(紅色)；不影響結合的突變為青色。融合肽(FP和 FP，)在兩單體中是可見的。表位殘基標記為白色(HA2)或黃色(HAl)。(c)顯示了 FlO的 末端(紅色帶)和所選擇的CDR側鏈的表位的近處觀察。在界面處1500人2的掩埋表面 中，有43%參與了疏水相互作用。(d)HA亞型的重疊HI、H5和H9(組1)處於紅/黃陰影 (1RU7、2IBX和1JSD) ；H3和H7 (組2)處於藍色陰影(1MQL和1TI8)。成對重疊的RMSD為 0.56土0.11人(觀察到的範圍，組1) ；0.75 A (組2)；以及組間的1.21 士0.12人。組間的一 致差異包括W212的方向(其與181和381處交錯側鏈方向相連)、17i處較大酪氨酸(組1) 對組氨酸(組2)的掩埋、以及掩埋的Hislll2 (組1)向W21J々包裝。其它的表位殘基由編 號的白色圈指出。H3和H7簇中N38i被糖基化。(e) 16HA亞型的序列。圓圈表示計算的結 合能強=藍色，中等=桔色；弱=藍色；不利的=黑色。彩色突出表示簇和組內的序列保 守性。穩定致融合(fusogenic)結構29的螺旋間接觸網絡在序列下方指出。圖7顯示了抗H5nAb在小鼠中的預防和治療效果。在致命性病毒攻毒之前或之 後以不同劑量的nAb處理小鼠。預防效果(a、b、g*h)。在以10倍半數致死劑量(MLD5tl) 的H5m或Hmi鼻內(i. η.)致命攻毒之前24小時，以抗H5nAb或對照mAb處理小鼠。(a) 腹膜內(i. P.)注射10mg/kg的三種nAb中任一種對H5-VN04 (A/越南/1203/04 (H5N1)，進 化枝1)攻毒的小鼠提供完全保護。較低的抗體劑量(2.5mg/kg)也是高度保護性的。(b) 在80-100%的經10mg/kg的三種nAb中任一種處理的小鼠中觀察到針對H5-HK97 (A/香港 /483/97 (H5N1)，進化枝0)病毒的預防性保護。(g)三種nAb中任一種(在10mg/kg單次注 射時)對H1-WSN33(A/WSN/1933 (HlNl))病毒攻毒小鼠提供完全保護。(h)當以10mg/kg單 次注射給予時，D8和FlO完全保護了 H1-PR34(A/波多黎各/8/34 (Hmi))攻毒的小鼠。當 25mg/kg的抗體作為單次注射給予時，A66提供了對小鼠的完全保護。治療效果(c_f)。讓 小鼠接種H5-VN04並在接種後24、48、72小時(c、e和f)注射nAb或在接種後24小時(d) 注射H5-HK97。在接種後24小時(hpi)以15mg/kg(人體中治療上可實現的劑量)的三種 nAb中任一種I. p.處理保護了 80-100%的經10倍MLD5tl的H5-VN04或H5-HK97病毒攻毒 的小鼠。圖8顯示了 HA蛋白的SDS-PAGE和凝膠過濾分析。(a)從針對H5-TH04的HAl (殘基 11-325)片段的單獨的HAl靶向選擇獲得抗體2A(左側插圖)。用於庫選擇的H5HA(H5-VN04 株)顯示在右側插圖中，(b)H5-VN04(H5)和scFv FlO複合物。通過與弗林蛋白酶(furin) 共表達，HAO被完全切割為HAl和HA2 (左側插圖)。通過首先以1 10的摩爾比混合H5 和F10，然後通過凝膠過濾純化，來形成複合物。圖9顯示了藉助ELISA和競爭ELISA的抗H5scFv_Fc與H5或HAl的結合。(a)
9相繼將1 μ g/mL的抗H5scFv-Fc和HRP-抗人IgGl用於檢測抗H5scFv_Fc與包被在ELISA 板上的HA1(H5-T_或H5(H5-VN04)的結合。針對HAl亞基選擇的抗體mAb 2A scFv-Fc 結合HAl和H5。10種強中和性scFv-Fc結合H5但不結合HA1。(b) 1012pfu的抗H5噬菌 體-scFv與5 μ g/mL的抗H5scFv_Fc混合併添加至經H5 (H5-VN04)包被的板，洗滌，接著通 過HRP-抗M13檢測結合至H5的噬菌體-scFv。mAb 2A_Fc不競爭10種H5選擇的Ab所識 別的表位。所有H5選擇的scFv-Fc都交叉競爭。其中，Ab FlO (噬菌體-scFv)與H5三聚 體的結合最少被其它scFv-Fc所抑制，說明其在所有所測試Ab中具有最高的親和力。

圖10顯示了 H5與nAb D8、F10和A66_IgGl結合的動力學和熱力學表徵。nAb通 過抗人IgGl被捕獲在CM4晶片上；將多種濃度(20,10,5,2.5,2.5,1.25,0. 625nM)的三聚 體H5(H5-VN04)注射在晶片表面上。採用1 1 Langmuir結合模型評估結合動力學。記 錄的結合曲線(減去空白參照)和計算曲線緊密可重合。每個ka、kd和Kd值代表了三個 實驗的均值和標準誤差。圖11顯示了 HA亞型之間的系統發生關係和序列比較。基於胺基酸序列的流感A 病毒的16種HA亞型的系統發生樹。將HA亞型的4個簇描成不同顏色。用於分析的序列 為=Hl (A/ 南加利福尼亞 /1/1918)、H2 (A/ 日本 /305/1957)、H3 (A/ 愛知 /2/1968)、H4 (A/ 鴨 /捷克斯洛伐克/56)、H5 (A/越南1203/2004)、H6 (A/ 雞 / 加利福尼亞 /431/00)、H7 (A/ 荷蘭 /219/03)、H8 (A/ 火雞 / 安大略 /6118/68)、H9 (A/ 豬 /HK/9/98)、HlO (A/ 雞 / 德國 /N49)、Hl 1 (A/ 鴨 / 英格蘭 /56)、H12 (A/ 鴨 / 阿爾伯達 /60/76)、H13 (A/ 區鳥 / 馬裡蘭 /704/77)、H14 (A/ 野鴨 / 阿斯特拉罕 /263/1982)、H15 (A/ 海鷗(shearwater) / 西澳大利亞 /2576/79)和 H16(A/紅嘴鷗(black-headed gull)/ 瑞典/2/99)。圖12顯示了在H5-VN04攻毒後經抗H5nAb處理的小鼠肺、脾和腦中的病毒滴度。 通過在i. η.感染10MLD5QH5-VN0424、48或72小時後，注射15mg/kg的mAb來處理BALB/c 小鼠(η = 5)。在接種後96小時收集的肺、腦和脾中確定病毒滴度。數據以盒須圖形式顯 示，其中盒從第25延伸至第75百分位，水平線在中位值處。盒的上須和下須表示極值。學 生T檢驗統計分析的結果注有單星號(*)用於ρ <0.05，雙星號(**)用於ρ <0.01。穿 Y軸的箭頭表示滴定檢測限。圖13顯示了抗H5nAb結合包括Η1、Η2、Η5、Η6、Η11、Η13和Η16在內的全部Hl簇HA 的FACS分析。用不同HA表達質粒瞬時轉染293Τ細胞，並通過FACS分析mAb與HA表達細 胞的結合。將抗SARSmAb 80R用作對照。2A_Fc為H5HA特異抗體。也顯示了缺乏與組2HA、 H7的結合。H11、H13和H16的病毒株細節為:H11_MP74 (A/鴨/孟菲斯/546/74 (H11N9))， H13-MD77 (A/ 鷗 /MD/704/77 (H13N6))和 H16-DE06 (A/ 濱鳥 /DE/172/06 (H16N3))。發明詳述流感A為反義單鏈RNA病毒，具有8節段基因組，編碼10種蛋白。它屬於正粘病 毒科，該病毒科包括流感病毒A、B和C屬，這由核衣殼蛋白和基質蛋白的抗原性來定義。通 常，流感A病毒與人類更嚴重的疾病相關。流感A病毒還根據兩種表面蛋白血凝素(HA)和 神經氨酸酶(NA)進一步分出亞型，其中血凝素將毒粒附著到宿主細胞，用於細胞進入，神 經氨酸酶通過切割附著於子代病毒或細胞表面的宿主唾液酸而促進子代病毒的傳播。
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存在16種HA亞型和9種NA亞型，它們通過HA和NA的多種組合構成了流感A病 毒的所有亞型。在水禽中發現了 16HA和9NA病毒亞型的所有組合。在禽流感A病毒的幾百 個病毒株中，僅4種已知引起了人感染H5m、H7N3、H7N7和H9N2。一般而言，人感染這些病 毒產生溫和症狀，極少重度疾病H7N7僅導致了 1個肺炎致死病例。但是，高度致病性H5W 病毒是例外，因為人體內沒有天然免疫。RNA聚合酶的失真和宿主免疫的選擇壓力可導致突 變的積累和這些蛋白的表面抗原性的改變。這種抗原性改變稱為抗原性漂移。另外，作為 這種節段基因組的結果，如果兩不同亞型的流感A病毒感染同一細胞，則可發生基因節段 的重新排列。例如，如果人H3N2病毒和禽H5W病毒共感染人或哺乳動物物種的其它成員， 則這種事件可產生新的H5N2。然後這種新病毒可有效地在人與人之間傳播，因為大部分基 因節段的全部都來自人病毒。這種基因重排(reassortment)會導致主要抗原變化，也稱為 抗原性漂移，其意味著全世界人群大多數都不具有任何針對該重排病毒的中和抗體。這種 情形與流感H5W肺炎的高致病性偶聯為公共衛生領域中最令人擔憂的局面之一。流感病毒血凝素(HA)為流感病毒的最易變抗原，負責病毒進入細胞。它作為三聚 體前體多肽HAO而被合成，該HAO在翻譯後被切割為通過單一二硫鍵連接的兩多肽HAl和 HA2。HA的HAl鏈負責將病毒附著到細胞表面。HA2介導了病毒和細胞膜在胞內體的融合， 使得能將核糖核蛋白複合物釋放進細胞質。與HAl不同，HA2分子代表了 HA的相對保守部 分。另一免疫原性流感蛋白為神經氨酸酶(NA)。這種四聚體糖蛋白負責從生產細胞上的表 面唾液酸釋放毒粒，並且還可能在促進進入氣管內的靶細胞中起作用。雖然針對NA的中和 性抗體在動物和人中是保護性的，但是缺乏它們作用機制的資料。關於m神經氨酸酶的晶 體結構的最近報導證實，在其活性位點附近存在穴，其可以被利用來開發新的抗流感藥物， 包括抗體。鑑於H5W病毒出現對奧司他偉(Tamiflu)和扎那米韋(Relenza)的抗藥性的 報導，這種發現是尤其重要的。HA的HAl和HA2鏈都是抗原性的，並且證實了人體內天然感染後與兩鏈均有反應 性的抗體。儘管特異於HAl的抗體幾乎是中和性的，但是已描述了 HAl特異單抗在體外的 不同病毒中和機制，包括阻斷HAl上的受體位點、細胞內抑制病毒-細胞融合、或同時附著 抑制和病毒_細胞融合抑制，這取決於抗體濃度。儘管研究還不充分，但已報導了抗HA2抗 體對細胞融合的抑制。二十年前，通過對抗原性漂移變體和逃逸突變體的HA的測序表徵了 H3亞型的HA 分子，並在分子的三維結構上繪製了抗原表位。從那時起，禽致病病毒的HI、H2和H5上的 抗原性位點被繪製在H3的三維結構上。在1997年香港爆發人H5W感染以及1999年從人 病例分離出H9N2病毒之後，解析了兩種蛋白的X射線結構。但是，被用於解析結構的1997 豬分離物(A/鴨/新加坡/3/97)的抗原性漂移，以及最近分離的高致病株，是有重要意義 的。實際上，豬分離物(A/鴨/新加坡/3/97)和HPAI H5N1株(A/越南1203/04)之間有 28個小變化和兩個潛在的主要變化。對來自2004-2005年疾病爆發的H5HA基因進行的系統發生分析顯示了 HA基因的 兩個不同譜系，稱為進化枝1和2。HPAI H5m(A/越南1203/04)株為進化枝1的成員。這 些進化枝每一個中的病毒都分布在亞洲不相重疊的地理區域中。來自印度支那的H5W病 毒在進化枝1內緊密成簇，而分離自幾個周圍國家的H5W與進化枝1分離株不同，屬於更 發散性的進化枝2。從越南、泰國和柬埔寨的人和鳥類分離出進化枝1病毒，但僅從寮國和
11馬來西亞的鳥類分離出進化枝1病毒。在僅從中國、印度尼西亞、日本和韓國的鳥類分離出 的病毒中發現進化枝2病毒。最近的流行病學研究分析了分離自遍及印度尼西亞和越南的 家禽的82種H5W病毒以及來自越南南部的11個人分離株，連同從公共資料庫可獲得的序 列數據，以便闡釋與病毒導入、地方性和演變相關的問題36。系統發生分析顯示，來自印度 尼西亞的全部病毒形成了 H5W基因型Z病毒的獨特亞系，提示這種爆發很可能由於單次導 入通過在過去兩年傳遍該國而引起。印度尼西亞的持續病毒活動歸因於家禽在國內流動導 致的傳播，而不是通過鳥遷移導致的重複導入。在印度尼西亞和越南，H5W病毒隨時間演 變為每一國家中地理上獨特的群。最近，解析了來自A/越南1203/4的HA的結構。將其胺基酸序列與來自進化枝1 和2病毒的HPAI 2004和2005分離株的HA基因進行比較，鑑定了 13個抗原變異位置，它 們主要簇集在受體結合結構域周圍，而剩下的處於痕跡酯酶結構域(vestigual esterase domain)內。在Hl和H3血清型中已鑑定了抗原變異區(圖ΙΑ)。對於Η1，這些位點命名 為Sa、Sb、Ca和Cb，而對於H3，位點命名為A、B、C和D。H5HA的逃逸突變體可簇集在三個 表位中；位點1 與H3的抗原位點A和H2的Ca2重疊的暴露環(HAl 140-145)；位點2 =HAl 殘基156和157，其對應H3血清型中的抗原位點B ；以及3)HA1129-133，其局限在Hl HA和 H9血清型中的Sa位點。在Smith進行的近期研究中，對胺基酸水平上的陽性選擇的檢測表 明了 HA蛋白中的八個殘基處於陽性選擇下(圖1B)。這些殘基包括抗原位點A和E中的五 個(位置83、86、138、140和141)；參與受體結合的兩個(位置129和175)；以及位置156， 其為接近受體結合位點的用於潛在N連接糖基化的位點。結果還揭示，與雞或鴨分離株相 比，HA中的三個殘基(Val 86,Ser 129和Thr 156)更經常地在人分離株中被觀察到，並且 很可能代表了 H5W基因型Z對人的早期適應。這些研究的另一重要發現是，印度尼西亞和 越南亞系之間的系統發生差異也反映在這兩組病毒之間抗原交叉反應方面的顯著差異。具 體地，來自印度尼西亞的病毒不與針對A/越南1203/04的雪貂抗血清反應，且來自越南的 代表性病毒不與針對印度尼西亞病毒IDN/5/06和Dk/IDN/MS/04的雪貂抗血清反應。這些 發現與以免疫人血清以及人1997和2003H5m病毒進行的較早研究吻合，所述病毒株不僅 在系統發生上、還在抗原性上是獨特的。因此，天然變異以及逃逸突變體提示，病毒的持續 演變應影響到決定哪種(哪些)病毒株應被用於被動和主動免疫。本發明提供了鑑定、產生和表徵人抗流感單克隆抗體的方法。鑑定和表徵scFv和單克隆抗體已鑑定了高親和性、跨亞型、廣泛中和性人抗HA mAb。這些nAb通過在一位置識別 莖區域內新的和高度保守的中和性表位來抑制附著後的融合過程，在該位置構象變化的關 鍵元件-融合肽和螺旋α A的暴露表面-達到靠近並置。對全部16ΗΑ亞型的結構和序列 分析表明該表位僅存在兩個變體，對應HA的兩系統發生分組(組1和2)。這些結果提出了 這樣的可能性，即源自每組的亞類的nAb的少量混合物可提供針對季節性和大流行性流感 的廣泛保護。最近的報導利用了來自H5W感染患者的免疫細胞來分離抗HAnAb。但是，沒有報 道它們的表位和作用模式。引人注目的是，我們從非免疫庫重複分離了 nAb，其利用了相同 的VH種系基因IGHV1-69*01，並編碼在與Y102等同位置處含酪氨酸的⑶R3環。這提示在H5 純真(naifve)群中預先存在廣泛抗HA交叉免疫，這可能是由於之前暴露於H1，和對於1968
12年之前出生的庫供體，為H2亞型。兩項研究中均發現的這種種系VH節段的重複使用、通過 N插入和/或種系D基因組裝引入CDR3酪氨酸的共同特性以及nAb對VL基因的雜亂使用 (promiscuoususe)，表明了可識別該表位的重排VH節段的前體頻率是顯著的。這提出了這 樣的可能性，即通過適當暴露於本文鑑定的FlO表位，這些廣譜nAb可以容易地在體內被誘 導。儘管仍未知針對兩組內病毒亞型提供普遍保護所需的nAb的基因和結構複雜性，但是 我們的數據看起來指出了出人意料簡單的解決方案。對58個HA-I陽性克隆的測序分析鑑定了三個獨特的抗HA_1 ScFv0這些scFv命 名為38B和1C。2A的VH和VL胺基酸序列顯示在圖4中。對97個HAO陽性克隆的測序分析鑑定了十個獨特的抗HAOscFv。這些scFv命名 為7、8、10、17、40、66、80、88、90和98。揭示了 6個不同的VH和10個不同的VL基因。某些 scFv具有相同的VH基因。6個不同VH基因中的5個屬於IGHV1-69基因家族。10個VL基 因中的3個為κ鏈。2A scFv為中度中和性抗體，38B和IC為非中和性抗體。10個scFvs，7、8、10、17、 40、66、80、88、90、和98為強力中和性抗體。(圖6)中和性流感抗體的核酸和胺基酸序列提供如下
權利要求
分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結合流感病毒血凝素(HA)蛋白的莖區中的表位並中和流感A病毒。
2.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述流感病毒為組I流感病毒。
3.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述流感病毒為Hl簇流感病毒。
4.如權利要求3所述的單克隆抗體，其中所述Hl簇流感病毒為Hla簇流感病毒或Hlb 簇流感病毒。
5.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述表位為非線性的。
6.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述表位包含HAl和HA2多肽。
7.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述表位包含HAl多肽的位置18、38、40、291 處的胺基酸和HA2多肽的位置18、19、20、21、38、41、42、45、49、52、53和56處的胺基酸。
8.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體抑制病毒和細胞膜融合。
9.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與單克隆抗體D7、D8、F10、 G17、H40、A66、D80、E88、E90 或 H98 結合所述 HA 蛋白競爭。
10.如權利要求1所述的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體為完全人抗體。
11.分離的SCFv抗體，其中所述抗體結合流感病毒的血凝素(HA)蛋白的表位並中和流 感A病毒。
12.如權利要求11所述的抗體，其中所述流感病毒為組I流感病毒。
13.如權利要求11所述的抗體，其中所述流感病毒為Hl簇流感病毒。
14.如權利要求13所述的抗體，其中所述Hl簇流感病毒為Hla簇流感病毒。
15.如權利要求11所述的抗體，其中所述表位為非線性的。
16.如權利要求11所述的抗體，其中表位包含HAl和HA2多肽。
17.如權利要求11所述的抗體，其中所述表位包含HAl多肽的位置18、38、40、291處的 胺基酸和HA2多肽的位置18、19、20、21、38、41、42、45、49、52、53和56處的胺基酸。
18.如權利要求11所述的抗體，其中所述抗體抑制病毒和細胞膜融合。
19.如權利要求11所述的單克隆抗體，其中所述抗體與單克隆抗體D7、D8、F10、G17、 H40、A66、D80、E88、E90或H98結合所述HA蛋白競爭。
20.預防流感病毒引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向有患所述疾病或病症風 險的人給予治療有效量的權利要求1的單克隆抗體或權利要求11的SCFv抗體。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述方法還包括給予抗病毒藥物、病毒進入抑制 劑或病毒附著抑制劑。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述抗病毒藥物為神經氨酸酶抑制劑、HA抑制劑、 唾液酸抑制劑或M2離子通道。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述M2離子通道抑制劑為金剛烷胺或金剛烷乙胺。
24.如權利要求22所述的方法，其中所述神經氨酸酶抑制劑為扎那米韋或磷酸奧司他韋。
25.如權利要求20或權利要求21所述的方法，其中所述方法包括給予兩種或更多種特 異於組I流感病毒的抗體。
26.如權利要求20、權利要求21或權利要求25所述的方法，其中所述方法還包括給予2特異於組II流感病毒的抗體。
27.如權利要求20所述的方法，其中所述抗體在暴露於流感病毒之前或之後給予。
28.如權利要求20所述的方法，其中所述抗體以足以中和所述流感病毒的劑量給予。
29.治療流感病毒引起的疾病或病症的方法，所述方法包括向有患所述疾病或病症風 險的人給予治療有效量的權利要求1的單克隆抗體或權利要求11的scFv抗體。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述方法還包括給予抗病毒藥物、病毒進入抑制 劑或病毒附著抑制劑。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述抗病毒藥物為神經氨酸酶抑制劑、HA抑制劑、 唾液酸抑制劑或M2離子通道。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述M2離子通道抑制劑為金剛烷胺或金剛烷乙胺。
33.如權利要求31所述的方法，其中所述神經氨酸酶抑制劑為扎那米韋或磷酸奧司他韋。
34.如權利要求29或權利要求30所述的方法，其中所述方法包括給予兩種或更多種特 異於組I流感病毒的抗體。
35.如權利要求29、權利要求30或權利要求34所述的方法，其中所述方法還包括給予 特異於組II流感病毒的抗體。
36.如權利要求29所述的方法，其中所述抗體在暴露於流感病毒之前或之後給予。
37.如權利要求29所述的方法，其中所述抗體以足以中和所述流感病毒的劑量給予。
38.組合物，其包含權利要求1的單克隆抗體或權利要求11的scFv抗體以及載體。
39.如權利要求38所述的組合物，還包含抗病毒藥物、病毒進入抑制劑或病毒附著抑 製劑。
40.如權利要求39所述的組合物，其中所述抗病毒藥物為神經氨酸酶抑制劑、HA抑制 劑、唾液酸抑制劑或M2離子通道。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述M2離子通道抑制劑為金剛烷胺或金剛烷乙胺。
42.如權利要求40所述的方法，其中所述神經氨酸酶抑制劑為扎那米韋或磷酸奧司他韋。
43.如權利要求38所述的組合物，還包含一種或多種特異於組I流感病毒的抗體。
44.如權利要求38、權利要求39或權利要求42所述的組合物，還包含特異於組II流 感病毒的抗體。
45.鑑定特異於流感病毒的抗體的方法，包括使三聚體血凝素(HA)蛋白與測試抗體 接觸並檢測HA蛋白-抗體複合物，其中所述HA蛋白被固定在固體表面。
46.如權利要求45所述的方法，其中所述固體表面為塑料的。
47.如權利要求45所述的方法，其中所述HA蛋白在非哺乳動物細胞中產生。
48.如權利要求45所述的方法，其中所述HA蛋白在昆蟲細胞中產生。
49.如權利要求45所述的方法，其中所述HA蛋白包含與野生型HA蛋白相比經修飾的 糖基化。
50.如權利要求45所述的方法，其中所述HA蛋白被固定在所述固體表面以掩蓋所述3HA蛋白的球狀頭部。
51.產生特異結合三聚體血凝素(HA)蛋白的分離的抗體的方法，(a)將單鏈或Fab表 達庫暴露於所述HA蛋白，其中所述HA蛋白被固定在固體表面；鑑定所述庫中特異結合所述 蛋白的抗體；以及(c)從所述庫分離所述抗體。
52.如權利要求51所述的方法，其中所述固體表面為塑料的。
53.如權利要求51所述的方法，其中所述HA蛋白在非哺乳動物細胞中產生。
54.如權利要求51所述的方法，其中所述HA蛋白包含與野生型HA蛋白相比經修飾的 糖基化。
55.如權利要求51所述的方法，其中所述HA蛋白被固定在所述固體表面以掩蓋所述 HA蛋白的球狀頭部。
56.如權利要求51所述的方法，其中所述表達庫為非免疫庫。
57.如權利要求51所述的方法，其中所述表達庫為H5純真(nai_ve)庫。
58.為抗流感病毒而接種個體的方法，包括向所述個體給予包被在或包埋在生物學相 容的基質中的三聚體血凝素(HA)蛋白。
59.如權利要求58所述的方法，其中所述HA蛋白具有非哺乳動物碳水化合物結構。
60.如權利要求58所述的方法，其中所述HA蛋白包含與野生型HA蛋白相比經修飾的 糖基化。
61.如權利要求58所述的方法，其中所述HA蛋白被包被在或包埋在所述生物學相容的 基質中以便掩蓋所述HA蛋白的球狀頭部。
62.產生特異結合致病性包膜病毒的分離抗體的方法，(a)使單鏈或Fab表達庫暴露於 所述病毒的膜融合蛋白，其中所述蛋白被固定在固體表面；(b)鑑定所述庫中特異結合所 述蛋白的抗體；以及(c)從所述庫分離所述抗體。
63.如權利要求62所述的方法，其中所述固體表面為塑料的。
64.如權利要求62所述的方法，其中所述膜融合蛋白在非哺乳動物細胞中產生。
65.如權利要求62所述的方法，其中所述膜融合蛋白具有非哺乳動物碳水化合物結構。
66.如權利要求62所述的方法，其中所述膜融合蛋白包含與野生型膜融合蛋白相比經 修飾的糖基化。
67.如權利要求62所述的方法，其中所述表達庫為非免疫庫。
68.如權利要求62所述的方法，其中所述表達庫為H5純真(nai_ve)庫。
69.為抗致病性包膜病毒而接種個體的方法，包括給予所述個體包被在或包埋在生物 學相容的基質中的所述病毒的膜融合蛋白。
70.如權利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白具有非哺乳動物碳水化合物結構。
71.如權利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白包含與野生型膜融合蛋白相比經修 飾的糖基化。
72.檢測樣品中流感病毒存在的方法，所述方法包括a)使所述樣品與權利要求的單克隆抗體接觸；以及b)檢測是否存在抗體-抗原複合物，由此檢測樣品中流感病毒的存在。
73.如權利要求72所述的方法，其中所述檢測發生在體內。
74.如權利要求72所述的方法，其中所述樣品從血液、毛髮、頰刮屑、唾液、活檢組織或 精液獲得。
75.分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含VH種系基因IGHV1-69*01編碼的VH 胺基酸序列，其中胺基酸在位置a) 27為纈氨酸；b) 28為蘇氨酸；c) 30為絲氨酸；d) 31為絲 氨酸；e) 54為甲硫氨酸；f)55為苯丙氨酸；g)58為蘇氨酸；h) 100為脯氨酸；i) 101為絲氨 酸；j) 102為酪氨酸；k) 103為異亮氨酸以及105為絲氨酸，其中所述單克隆抗體結合流感 病毒血凝素(HA)蛋白莖區中的表位並中和流感A病毒。
全文摘要
本發明提供了中和流感病毒的人scFv抗體和單克隆抗體。所述抗體識別血凝素(HA)蛋白的莖區中的表位。還提供了治療和/或預防流感相關疾病或病症如禽流感的方法。本發明還提供了為抗流感而接種患者的方法。還提供了診斷流感相關疾病或病症的方法以及檢測樣品中流感存在的方法。
文檔編號G01N33/544GK101970483SQ200880126332
公開日2011年2月9日 申請日期2008年12月8日 優先權日2007年12月6日
發明者威恩·A·瑪拉斯科, 羅伯特·C·李丁頓, 隋建華 申請人:達納-法伯癌症研究公司;伯納姆醫學研究所