免疫球蛋白e的特異性核酸配體及其作為過敏性疾病治療的應用的製作方法

2023-07-12 10:13:21

專利名稱：免疫球蛋白e的特異性核酸配體及其作為過敏性疾病治療的應用的製作方法
技術領域：
該發明主要涉及核酸領域，尤其是能夠結合免疫球蛋白E(IgE)，用於治療和診斷過敏性疾病和/或與IgE相關的其他疾病或不適的適體領域。該發明進一步涉及能夠結合免疫球蛋白E(IgE)的適體的給藥材料和方法。
背景技術：
適體是核酸分子，這類分子除了通過經典的Watson-Crick鹼基配對作用以外還通過相互作用對分子有特異的結合親合力。
適體，像通過噬菌體展示生產的肽或單克隆抗體(mABs)一樣，能夠特異的結合所選中的靶點並調節靶點活性，例如，通過結合的適體可以阻礙靶點發揮功能活性。從寡核苷酸隨機序列庫中通過體外篩選方法創建的適體，可以產生一百多種蛋白，其中包括生長因子、轉錄因子、酶、免疫球蛋白和受體。一個典型的適體，有10-15kDa大小(30-45個核苷)，通過亞納摩爾米親合力結合到靶點上，能夠排斥密切相關的其它靶點(例如，適體通常不能結合同一個基因族的其它蛋白)。一系列的結構研究表示，適體能夠使用同一類型的結合作用(例如，氫鍵，靜電互補，疏水接觸，空間排阻)，增強抗原-抗體複合物的特異性和親合性。
適體在治療和診斷應用中有很多理想的特性，包括高特異性和高親合性，生物活性，和極好的藥物代謝動力學屬性。另外與抗體和其它製劑相比，它們能夠提供特異競爭性優勢，比如 1)速度和控制 適體可通過完整的體外過程產生，允許迅速產生起始引導物，包括治療的引導物。體外篩選方法可以嚴格控制適體的特異性和親和力，允許生成引導物，包括對有毒的和非免疫原性的引導物。
2)毒性與免疫性 適體已證明是一類少毒性或無毒性或無免疫原性的分子。以小鼠和鴨為實驗對象，持續以高劑量適體給藥(每天10mg/kg，給藥90天)，通過臨床、細胞學、生化測定未觀察到毒性。然而由於對自身抗體的免疫應答，許多單克隆抗體療效受到嚴重限制，很難得到對適體的抗體，最可能的原因是T細胞無法通過MHC遞呈適體，免疫應答不能識別核酸片段。
3)給藥雖然目前大多數抗體療法是通過靜脈輸液(通常超過2-4小時)、適體可皮下注射(以猴科為研究對象，皮下給藥，適體生物有效性＞80％，參見(Tucker等人的文獻J.Chromatography B.732203-212，1999))給藥。這個差異主要是由於抗體相對較低的溶解度，從而需要大量治療性單克隆抗體mAbs。具有好的溶解度(150mg/mL)和相對低分子量(適體10-50kDa；抗體150kDa)的適體，每周的劑量可以以小於0.5mL的體積注射給藥。此外，小分子的適體可以滲透進入不允許抗體或抗體片段滲透的構象收縮區，展現了基於適體治療或預防的另一優勢。
4)可測性和成本治療性適體是化學合成的，因此容易根據生產的需求進行規模化生產。而目前規模化生產中的困難限制了一些生物製品的生產，並且大型蛋白製品工廠投資巨大，單一大型核苷酸合成儀的產量可達100公斤/年，需要一個相對適度的初期投資。與高度優化的抗體相比，目前適體合成原料的成本以千克規模計算大約500美元/克，隨著工藝的不斷改進，預計未來五年原料成本降低至小於100美元/克。
5)穩定性治療性適體顯示化學惰性。它們暴露於例如受熱或接觸到變性試劑等因素後，自身可重新獲得活性，適體以凍乾粉形式在室溫下儲存可長達一年以上。
IgE和過敏症 遺傳性過敏症具有產生過敏原特異的IgE的遺傳傾向，是最重要的誘發哮喘和其他過敏疾病的因素之一。遺傳性過敏症疾病，如過敏性鼻炎(花粉症)、哮喘、皮炎在美國普遍流行且發病率日益上升。過敏性疾病的症狀包括血管舒張、平滑肌收縮、局部炎症、血管通透性。過敏症的主要特點是環境過敏原刺激IgE水平增高。常見的過敏原包括糞便渣、花粉、食物、動物皮屑、真菌孢子。肥大細胞通過IgE介導釋放各種化學介質如組氨酸、三烯、前列腺素，在過敏症的速發相反應中發揮主要作用。T淋巴細胞、嗜鹼性粒細胞和嗜酸性粒細胞被認為負責誘導遲發相反應。肥大細胞和接觸帶有抗原的過敏原特異的IgE的嗜鹼性粒細胞引起速髮型超敏反應，速髮型超敏反應是一個強大的哺乳動物免疫效應系統。這些IgE介導反應能導致疾病，如過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、蕁麻疹、食物過敏、氣喘、而在最嚴重的情況下，可導致過敏性休克而死亡。
並不是有意受任何理論的約束，過敏介導IgE的反應機制已經被檢測。簡言之，IgE結合於肥大細胞和嗜鹼性粒細胞上的高親和性IgE受體的α鏈，FcεRI。這些細胞類型上的FcεRI是由一條α鏈，一條β鏈，γ鏈同質二聚體組成的四聚體。β鏈和γ鏈是FcεRI的信號轉導區。結合肥大細胞的IgE的變態合反應刺激FcεRI，激活一批信號轉導通路，導致一系列炎性介質和細胞因子的釋放，細胞因子包括支氣管縮窄性及血管活性物質，如組織胺、白三烯等(見

圖1)。IgE、FcεRI和肥大細胞的作用已經在動物過敏反應模型證實IgE加上特異性抗原的系統運輸(或僅用抗IgE治療)引起正常小鼠過敏反應，但在肥大細胞缺陷或FcεRI缺陷的小鼠中立即引發全身反應。
目前一些臨床評估的治療方法幹預潛在的致過敏性病理免疫機制，比如，一種抗IgE的免疫球蛋白，它直接靶向於IgE血清抗體，從而抑制速髮型超敏反應的主要機制。此外，目前人們的興趣在於開發過敏原特異性免疫治療方法，因為它具有治療過敏症的潛力。但是，無論抗IgE的免疫球蛋白還是過敏原特異性免疫治療都受到高成本、永久治療或每個季節治療的限制。
適體作為一種新型的治療試劑除了具有前述的優點，還因為適體是核酸，因而能與一些基序結合，這些基序在治療過敏症及其它免疫性疾病方面具有另人滿意的免疫刺激效應。這些基序包括具有免疫調節作用CpG基序，如可以抑制II型T輔助淋巴細胞(TH2)介導的變態反應，研究表明CpG在純化B淋巴細胞時快速誘導表達T-bet mMA的量(參見Liu等人2003發表在Nature Immun.VoI 4，no.7，p.687-693上的文獻)。
因此，獲得能夠破壞IgE的生物功能的材料和方法將有益於治療發病機理上與IgE有關的疾病。本發明提供材料和方法以滿足這些需求和其它需求。

發明內容
本發明提供治療，預防和/或減輕過敏症的材料和方法，在一個實施方案中，提供與PEG基團結合的包括以下序列mGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)的適體。在一些實施方案中，聚乙二醇(PEG)基團選自由60kDa，40kDa，30kDa和20kDa組成的組。在一些實施方案中，聚乙二醇(PEG)部分區域是分支狀的，而在另一些實施方案中是線性的。
在一些特別實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示 其中～～～表示接頭適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)
其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示 其中～～～表示接頭適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示 其中～～～表示接頭適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示 其中～～～表示接頭適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體包括一個非烷基接頭。在一些實施方案中，本發明的適體包括一個烷基接頭。在一些實施方案中，烷基接頭包括2到18個連續CH2基團，特別是2至12個連續CH2基團，更特別是3到6個連續CH2。
在一些實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示
適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示 適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧鳥嘌呤，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示
適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體包括結構如下所示 適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe分別dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3』反向脫氧胸腺嘧啶。
在一些實施方案中，本發明的適體具有調節特別是抑制IgE或其變異體的功能。在一些實施方案中，本發明的適體在體外抑制IgE或其變異體的功能。在一些實施方案中，本發明的適體在體內抑制IgE或其變異體的功能。在一些實施方案中，本發明的適體抑制IgE結合其受體的能力。在一些實施方案中，提供了治療預防和/或改善IgE介導的疾病的方法，包括對脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人類施用本發明所得適體或其鹽。
在一些實施方案中，本發明提供治療組合物，包括有效劑量的任意上述適體或其鹽。在一些實施方案中，治療組合物可進一步包括藥學可接受的載體和稀釋劑。
在一個實施方案中，提供了IgE介導的疾病的治療方法，包括對脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人類施用本發明適體，特別是治療性組合物。在一些實施方案中，治療的疾病是過敏性疾病。在一些特殊實施方案中，治療的疾病包括如下過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、哮喘，急性蕁麻疹，食物過敏，花生過敏，全身過敏，過敏性結膜炎、春季角結膜炎、異位性角結膜炎，巨乳頭狀結膜炎、嗜酸性胃腸炎。在一特別實施方案中，治療的疾病是哮喘。
在一些實施方案中，對脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人類，使用免疫刺激核酸序列與本發明抗IgE適體聯合用藥，所述免疫刺激核酸序列比如包括CpG基序的第二適體。
在一些實施方案中，適體給藥的方式有皮下給藥、鼻腔給藥及靜脈注射。在特殊的實施方案中，對患有或可能患有過敏症的病人通過皮下給藥方式施用治療組合物。
在一些實施方案中，診斷方法包括將本發明中與PEG連接的適體和疑似包括IgE或其變異體的組合物接觸，檢測IgE或其衍生物的存在或缺失。在一些實施方案中，提供了用作體外診斷的本發明適體，而在其它一些實施方案中，提供了用作體內診斷的本發明適體。在一些實施方案中，提供了用於治療、預防和/或改善體內疾病的本發明適體。
在一些實施方案中，特異結合IgE的適體包括的核酸序列對於選自由序列11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96和98-102所組成的組中的任何一個序列都至少有80％的同源性，特別是有90％的同源性，。
在一些實施方案中，特異結合IgE的適體包括的核酸序列對於選自由序列11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-89所組成的組中的任何一個序列都至少有80％的同源性，特別有90％的同源性。
在一些實施方案中，提供了特異結合IgE的適體，所述適體包括的30個比鄰的核苷序列與選自由序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-96所組成的組中的任何一個適體酸序列的比鄰的30個核苷序列是一樣的。在一些特殊的實施方案中，提供了一種適體，所述適體包括的20個比鄰的核苷序列，它與這些適體的獨特區域的序列20個比鄰的核苷序列是一樣的序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102。在更特殊的實施方案中，提供了一種適體，所述適體包括的8個比鄰的核苷序列與這些適體的獨特區域的序列中的8個比鄰核苷序列是一樣的序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102。優選地，包括的8個比鄰核苷序列與序列號為11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102的適體獨特區域序列中8個臨近核苷序列一致的適體特異地結合IgE，優選人類的IgE，並且在一些實施方案中調節IgE，優選人類IgE的功能。在一些實施方案中，提供了一種適體，所述適體選自由序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102，119-124，126-136，139-157，158-176，178-190，194-201，206-243，247，249-259，261-267，269-290和292所組成的組。
在一些實施方案中，本發明適體是單鏈核酸，在一些實施方案中，本發明適體與高分子量，無免疫原性的化合物或親脂性化合物相連。在一些實施方案中，本發明適體與聚烷基乙二醇基團，尤其是聚乙二醇基團連接。在一些實施方案中，聚乙二醇基團是分枝狀的，而在另一些實施方案中是直鏈的。
在一些實施方案中，本發明適體包括化學修飾，所述化學修飾選自由糖基位點化學取代，磷酸鹽位點化學取代，核酸鹼基位點化學取代，3』端帶有反向核酸序列，5』端帶有反向核酸序列所組成的組。在一些實施方案中，本發明適體進一步包括免疫刺激核酸序列，如CpG基序。
在一些實施方案中，本發明適體調節特別是抑制IgE或其變異體的功能。在一些實施方案中，本發明的適體在體外抑制IgE或其變異體的功能。在一些實施方案中，本發明的適體在體內抑制IgE或其變異體的功能。在一些實施方案中，本發明的適體抑制IgE與其受體的結合。在一些實施方案中，治療，抑制和/或改善IgE介導的疾病的方法包括對脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人類施用本發明適體或其鹽。
在一些實施方案中，提供了一種治療組合物，包括有效劑量的本發明適體或它的鹽，以及藥劑學上可接受性載體和稀釋劑。在一些實施方案中，提供了用來治療預防和/或改善IgE介導的疾病的方法，包括對脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人類施用本發明適體，優選本發明治療組合物。
在本發明一些實施方案中，治療的疾病是過敏症，尤其是這樣一些疾病過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、哮喘、急性蕁麻疹、食物過敏、花生過敏，全身過敏，過敏性結膜炎、春季角結膜炎、異位性角結膜炎，巨乳頭狀結膜炎、嗜酸性胃腸炎。
在一些實施方案中，本發明抗IgE適體與免疫刺激核酸序列，比如包括CpG基序的第二適體聯合用藥，給藥對象是脊椎動物，優選哺乳動物、更優選人類。在一些實施方案中，免疫刺激核酸序列併入或附加到本發明抗IgE的適體上。
在一些實施方案中，本發明適體通過皮下給藥、鼻腔給藥及靜脈注射的方式對治療對象給藥。
在一些實施方案中，提供了一種診斷方法，包括將本發明適體與疑似包括IgE或其變異體的組合物接觸，檢測IgE或其變異體的存在或缺失。在一些實施方案中，提供了用作體外診斷的本發明適體，而在其它實施方案中，提供了用作體內診斷的本發明適體。在一些實施方案中，提供了用於治療、預防和/或改善體內疾病的本發明適體。
本發明的另一方面，提供增加適體對靶點的結合親和力的方法，其中，適體能夠形成多聚體。在一個實施方案中，此方法包括以下步驟，由阻斷集合體形成的核苷取代形成集合體的適體核苷，從而使產生的取代適體對其靶點的結合親和力相對於母適體的結合親和力有所增加，母適體含有相同的核苷酸序列但是沒有核苷取代。在一些實施方案中，選擇的用來防止集合體形成的核苷是修飾核苷。在一些實施方案中，修飾核苷是次黃嘌呤。
本發明的另一方面，提供一種增加適體對靶點親合力方法，包括以步驟，用次黃嘌呤，在某一位置取代至少一種核苷，相對於母適體對同一靶點的結合親合性而言，次黃嘌呤取代適體對靶點的結合親合性有所增加，母適體有相同的核酸序列，但缺少次黃嘌呤修飾。在被提供的方法的一些實施方案中，取代步驟包括，對於四、三、二個核苷而言，取代的次黃嘌呤分別不多於四個、三個、兩個，由此而得到的適體相對於母適體而言，增加了對靶點的結合親合性。在一些實施方案中，次黃嘌呤取代的核苷是嘌呤。在一些特別的實施方案中，次黃嘌呤取代的核苷酸是鳥嘌呤核苷，在其它一些實施方案中，本發明的方法包括選自下列基團的第二個化學取代步驟糖基位點的化學取代，磷酸基位點的化學取代，鹼基位點的化學取代。特別是，進一步取代適體的實施方式包括，增加了除缺少二次化學取代的適體之外，與進一步取代適體相一致的適體對靶點的結合親和性。
在一些實施方案中，取代步驟包括用合適的取代物化學合成適體。
在一些實施方案中，次黃嘌呤取代的適體對靶點的結合親合性，相對於母適體而言，增加至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少25倍，至少50倍，至少75倍，至少85倍，至少95倍，至少100倍，至少150倍，至少200倍。在一些實施方案中，取代步驟包括化學合成適體。
本發明的一方面，通過本發明取代的方法，提供了一種適體，這種適體對靶點具有增加的結合親合性。在一特別的實施方案中，適體包括對IgE，尤其是人類的IgE的有增加的結合親合性。
附圖簡述 圖1是一個IgE介導的信號傳遞活動示意圖。
圖2是一個示意圖，代表了從由核糖核酸組成的寡聚核苷酸隨機序列庫中體外篩選適體(SELEXTM)的過程。用於體外篩選適體(SELEXTM)的寡聚核苷酸隨機序列庫由脫氧核糖核酸組成，反轉錄及轉錄步驟被省略。
圖3顯示一個40kDa的分支狀PEG。
圖4顯示40kDa的已經附著到適體5』末端的分支狀PEG。
圖5是一個描繪各種PEG化策略的插圖，表示了標準單聚乙二醇化、多聚乙二醇化，和通過聚乙二醇化完成的二聚作用。
圖6是示意了序列庫經過第6輪和第7輪的克隆篩選之後對h-IgE結合能力。
圖7顯示了對ARC445(序列號101)及其衍生物的直接結合力曲線和結合親合力，描繪了修飾產物對h-IgE結合能力增加的比例。
圖8描繪了抗IgE適體ARC445(序列號101)和其衍生物的離子交換HPLC痕量分析。
圖9顯示在ARC445(序列號101)中NMM螢光增加，在ARC445衍生物與ARC909-911(序列號191-193)中NMM螢光的降低，ARC909-911包括脫氧鳥嘌呤(dG)的7-脫氮-G取代物。
圖10顯示在ARC 183中(陽性對照)的增加，在ARC1346中(陰性對照)NMM螢光的降低。
圖11顯示了與其衍生物比較，ARC445(序列號101)的直接結合曲線，描述了用7-脫氮-G取代脫氧鳥嘌呤(ARC909-911(序列號191-193))明顯的減少了與h-IgE結合的比例。
圖12表示了與ARC1384(序列號181)，包括2′-氧-甲基和硫代硫酸鹽取代物，但沒有dG的次黃嘌呤取代物(序列號101)的ARC445衍生物相比較，以下適體在NMM螢光中降低ARC445衍生物ARC 1641，1642，和1666(序列號分別是212，213，和216)，它們包括dG的次黃嘌呤取代物。
圖13是一種結構示意圖預測rRfY，dRmY和DNA最小化適體的二級結構，DNA最小化適體表明IgE:FcεR1之間的最高結合力，該力受到FACS的抑制。圖13(A)顯示根據序列號91的rRfY克隆，殘基是2′-F，圖13(B)顯示ARC445(序列號101)，一個rRfY克隆，黑色殘基是2′-脫氧，灰色殘基是2』-OMe，圖13(C)顯示ARC475(序列號151)，DNA克隆，下劃線是灰色殘基是2′-脫氧。
圖14顯示SX38細胞中，ARC445(序列號101)和ARC656(序列號157)阻礙h-IgE誘導組氨酸的釋放。
圖15A描述存在於人類和小鼠血漿中作為孵育功能的ARC1384和ARC1666全長的百分率。圖15B描述存在於人類和小鼠血漿中作為孵育功能的ARC1384，ARC1572和ARC1573全長的百分率。
圖16是表格，給出對小鼠靜脈給藥10毫克/公斤後PEG化抗-IgE適體ARC1785(序列號295)，ARC1787(序列號293)，ARC1788(序列號294)，和ARC1790(序列號296)的藥代動力學設計。
圖17是對小鼠靜脈(IV)給藥10毫克/公斤後，PEG化抗-IgE適體ARC1785(序列號295)，ARC1787(序列號293)，ARC1788(序列號294)，ARC1790(序列號296)的藥代動力學圖形。
圖18是對小鼠皮下給藥10毫克/公斤後，PEG化抗-IgE適體ARC1785(序列號295)，ARC1787(序列號293)，ARC1788(序列號294)，和ARC1790(序列號296)的藥代動力學研究設計概括表格。
圖19是對小鼠皮下(SC)給藥10毫克/公斤後，PEG化抗-IgE適體ARC 1785(序列號295)，ARC1787(序列號293)，ARC1788(序列號294)和ARC1790(序列號296)的藥代動力學圖。
圖20是一個表，總結了對小鼠靜脈(IV)和皮下(SC)給藥10毫克/公斤後，PEG化抗-IgE適體ARC1785(序列號295)，ARC1787(序列號293)，ARC1788(序列號294)和ARC1790(序列號296)的非劃分PK參數估計。
具體實施例方式本發明一個或一個以上實施方案的細節在下面進行了完整的描述。雖然任何與這裡描述的相似或相同的方法或材料可以用於實現或檢測本發明，但這裡描述的是優選的方法和材料。本發明的其他特點，對象和優點從說明書中顯而易見。在說明書中，除非文意另有明確指出，單數形式也包括複數的形式。除非另有規定，這裡使用的所有科學技術名詞與本發明所屬技術領域普通技術人員的通常理解具有同等的意義。如果發生衝突，以本說明書的解釋為準。
SELEXTM方法 生成適體的一種合適的方法是被命名為″指數富集的配體系統進化″(″SELEXTM″)的過程，在圖2中主要描述了該方法的核糖核酸篩選(使用脫氧核糖核酸序列庫的篩選，圖2中省略掉反轉錄和轉錄步驟的描述)。SELEXTM過程是一種與靶分子有高特異結合能力的核酸分子體外進化的方法，在文獻，例如1990年6月11日提交，現已放棄的美國專利申請第07/536,428號，美國第5,475,096號名為「核酸配體」的專利和美國第5,270,163號(也可參見WO91/19813)名為″核酸配體″專利中所述。每種SELEXTM鑑定的核酸配體，如每種適體，都是給定靶點化合物或分子的一種特異配體。SELEXTM過程是基於這樣一種獨特觀點，即核酸足夠能形成多種二維或三維結構，且其單體具有足夠的多功能性，可以用作幾乎各種化學化合物，不管是單體還是聚合體的配體。任何大小的分子或組合物都可作為靶點。
SELEXTM依賴於包括隨機核酸序列的單鏈寡核苷酸庫上的起始點。寡核苷酸可以是被修飾或未被修飾的DNA，MA或DNA/MA雜和體。在一些實施方案中，核苷酸庫包括100％隨機或部分隨機的寡核苷酸。在另一些實施例中，核苷酸庫包括的隨機或部分隨機寡核苷酸中含有至少一個被加入到隨機化序列中的固定序列和/或保守序列。在另一些實施例中，核苷酸庫包括的隨機或部分隨機寡核苷酸在5』和/或3』端含有至少一個固定序列和/或保守序列，在該固定序列或保守序列中含有與寡核苷酸庫中其他分子相同的序列。固定序列是寡核苷酸庫中的常見序列，在寡核苷酸庫中加入固定序列是為了實現預篩選目的，如下面進一步描述的CpG基序，PCR引物雜交位點，MA聚合酶啟動子序列(如T3，T4，T7和SP6)，限制位點，或例如聚A或聚T尾的同聚序列，催化核心，選擇性結合親和柱的位點，和其他便於寡核苷酸克隆的序列和/或與之有利害關係的序列測序。保守序列是一種與上述的固定序列不同的序列，是許多能與同一靶點結合適體的共有序列。
序列庫中的寡核苷酸優選地包括隨機化序列部分和有效擴增所必需的固定序列。典型的，起始序列庫的寡核苷酸包含固定的5′和3′末端序列，所述末端序列在內部區域與30-50隨機核苷側面相接。這個隨機化的核苷可通過多種方法產生，包括化學合成和從隨機被清除的核酸中的大小篩選。檢測核酸的序列變化可在反覆篩選/擴增之前或之中通過突變被引入或增加。
寡核苷酸的隨機序列部分可以是任意長度，並且可包括核苷酸和/或脫氧核苷酸，還可包括修飾或非天然核苷或核苷類似物。參見美國專利第5,958,691號；美國專利第5,660,985號；美國專利第5,958,691號；美國專利第5,698,687號；美國專利第5,817,635號；美國專利第5,672,695號；和PCT刊物WO92/07065號。使用本領域已知的固相寡核苷酸合成技術從磷酸二脂鍵連接的核苷中合成隨機寡核苷酸。參見Froehler等人在Nucl Acid Res.145399-5467(1986)上發表的文獻和Froehler等人在Tet.Lett.275575-5578(1986)上發表的文獻。也可使用溶液方法如三酯合成法合成隨機寡核苷酸。參見例如Sood等人在Nucl.Acid Res.42557(1977)上發表的文獻和Hirose等人在Tet.Lett.，282449(1978)上發表的文獻。在自動DNA合成儀器中進行的經典合成產生了1014-1016個獨立的分子，數量上足夠進行大多數SELEXTM實驗。序列設計中隨機序列足夠大的區域增加了每個被合成分子代表特異序列的可能。
通過在DNA合成儀上自動化學合成寡核苷酸起始序列庫。為了合成隨機化序列，在合成過程中，在每個核苷填加步驟中加入四種核苷的混合物，使得核苷加入隨機化。如上所述，在一種實施方案中，隨機寡核苷酸包括全部的隨機序列；但是在其他實施方案中，隨機寡核苷酸包括非隨機或部分隨機序列的延長鏈。部分隨機序列可通過在每個添加步驟中加入不同比率的四種核苷而合成。
寡核苷酸起始序列庫可能是MA，DNA或MA/DNA雜和體。在MA庫作為起始序列庫的情況下，MA庫通常是通過的T7 MA聚合酶或經修飾的T7 MA聚合酶在過體外轉錄DNA並純化而獲得的。然後，MA或DNA庫與靶點在適宜於結合的條件下混合，並使用同樣的篩選方案經過反覆的結合，分離或擴增以符合結合親和力和選擇性的理想標準。更具體的，當以包含核酸起始序列庫的混合物開始時，SELEXTM方法包括步驟(a)混合物與靶點在適宜於結合的條件下接觸(b)從與靶分子特異結合的核酸中分離出未結合核酸；(c)分離核酸-靶點複合物；(d)擴增從核酸-靶點複合物分離出的核酸，產生富集配體的核酸混合物；(e)多次循環重複結合，分開，分離，和擴增步驟以產生對靶分子具有高特異性高親和力的核酸配體。在MA適體被篩選的情況下，SELEXTM進一步包括步驟(i)步驟(d)中的擴增之前，反轉錄從核酸-靶點複合物中分離出的核酸；(ii)重新開始過程之前轉錄步驟(d)中擴增的核酸。
在含有許多可能序列和結構的核酸混合物中，對給定的靶點的結合力在一個很大的範圍內。如包括20個核苷的隨機化片段的核酸混合物，有420種可能。對靶點有較高親和力常數的最可能結合到靶點上。分開，分裂和擴增之後，產生了又一核酸混合物，富集於較高親和力的核酸。另外進行幾輪篩選進一步優化最適配體直到產生的核酸混合物主要由一個或少數序列組成。這些核酸作為純配體或適體可被克隆，測序並逐個檢測其結合親和力。
重複篩選和擴增循環直到達到所需目的。在最常規的情況下，重複篩選/擴增，一直到循環所得物的結合強度沒有明顯的改善為止。這種方法典型的用於接近1014個不同核酸種類的樣品，也用於1018個不同的核酸種類的樣品。通常，核酸適體要經過5-20輪篩選。在一種實施方案中，異質只是在初始的篩選階段被引入，並不是在整個複製過程中都發生。
SELEXTM的一種實施方案中，篩選過程對分離那些與選定靶點有最強結合能力的核酸配體非常有效，因此只需要一個篩選或擴增循環。這種有效的篩選可能發生在例如色譜分析過程，其中，核酸與柱上固定的靶點有結合能力，通過這種操作方式，柱子有效的分開或分離具有最高親和力的核酸配體。
在很多情況下，並不需要進行SELEXTM的重複步驟直到鑑定出單一的核酸配體。靶特異核酸配體溶液可能包括核酸結構或基序族，在此族中有很多保守序列和許多可被替換或增加而不明顯影響核酸配體和靶點結合的序列。提前結束SELEXTM過程，確定核酸配體溶液家族中許多成員的序列是可能的。
已知存在多種多樣的核酸一級結構，二級結構和三級結構。非Watson-Crick型相互作用最常見的結構或基序被稱為髮夾環，對稱或不對稱的凸出，假扭結結構和無數相同結構的結合。幾乎所有含有這種基序的情況都表明他們可在不超過30核苷的核酸序列內形成。因此，伴有相鄰隨機化片段的SELEXTM優選由20-50個核苷的隨機化片段引發。在一些實施方案中是由30大約40個核苷引發。在一個實施例中，5′被固定隨機3′被固定的序列包含大約30-50核苷的隨機序列。
核心SELEXTM方法被修改以獲得許多特異目標。例如，美國專利第5,707,796號描述了聯合使用SELEXTM和凝膠電泳篩選結構特異的核酸分子，如，彎曲DNA。美國專利第5,763,177號；描述了基於SELEXTM的方法，篩選含有反應基團的核酸配體，該反應基團能結合靶分子，和/或交叉連接到靶分子，和/或激活靶分子。美國專利第5,567,588號和第5,861,254描述了基於SELEXTM的方法，高效分離與靶點有高親和力和低親和力的寡核苷酸。美國專利第5,496,938描述了SELEXTM過程進行之後獲取改進核酸配體的方法。美國專利第5,705,337號描述了將配體共價結合靶點的方法。
SELEXTM可用於獲得與靶分子有一個以上結合位點的核酸配體，和獲得包括非核酸類與靶點結合的核酸配體。SELEXTM提供了用於分離和鑑定能與任何可預見靶點結合的核酸配體的方法，所述可預見靶點包括大或小的生物分子，如核酸結合蛋白和未知的作為它們部分生物功能的蛋白質以及協同因子和小分子。如，美國專利第5,580,737號揭示了通過SELEXTM鑑定的核酸序列，SELEXTM能高親和力的結合到咖啡因並與類似物，如茶鹼密切相關。
Counter-SELEXTM是一種通過減少能與一個或多個非靶點分子發生交叉反應的核酸配體序列從而改進核酸配體和靶點特異性的方法。Counter-SELEXTM的步驟包括步驟(a)製備核酸侯選混合物(b)侯選混合物與靶點結合，其中相對於侯選混合物，對靶點有增加的親和力的核酸，可能從侯選混合物的剩餘物中分離出來；(c)從候選混合物的剩餘物中分離出親和力增加的核酸；(d)從靶點中分離出親和力增加的核酸；(e)將親和力增加的核酸與一個或一個以上非靶分子相互接觸，對非靶點分子有特異親和力的核酸配體可被清除掉；和(f)擴增只對靶分子有特異親和力的核酸產生核酸混合物，富集於對靶分子有相對較高親和力和特異性的核酸序列。如上述對SELEXTM的描述，篩選和擴增的循環數不斷被重複直到達到目的。
使用核酸作為藥物和疫苗遇到的一個可能問題是磷酸酯形式的寡核苷酸在顯示作用前，在體液中可被細胞內酶和細胞外酶如核核酸內切酶和核酸外切酶迅速降解。因此SELEXTM方法包括含有修飾核苷的高親和力核酸配體的鑑定，所述修飾核苷能改變配體特性，比如改變了體內穩定性或改善運輸特性。這種修飾的例子包括核糖和/或磷酸和/或鹼基的化學取代。SELEXTM鑑定含有修飾核苷的核酸配體都有描述，如在美國專利第5,660,985號中描述到的寡核苷酸含有在核糖2』位，嘧啶5位，嘌呤8位化學修飾的核苷衍生物，在美國專利第5,756,703號中描述的寡核苷酸包含了嘧啶2』位的各種修飾，在美國專利第5,580,737號中描述的寡核苷酸能是高親和力的特異核酸配體含有一個或多個2』-氨基(2′-NH2)，2』-氟(2′-F)和/或2』-OMe(2′-OMe)的核苷修飾 本發明中預期核酸配體的修飾包括，但不限於，那些能夠提供其他化學基團的修飾，這些化學基團能增加核酸配體鹼基或核酸配體整體額外電荷，極化性，疏水性，氫鍵，靜電作用和流動性。產生抗核酸酶的寡核苷酸混合物的修飾包括一個或多個核苷間連接的取代，修飾的糖基，修飾的鹼基，或它們的組合。這種修飾包括，但不限於，2′位糖修飾，5-位嘧啶修飾。8-位嘌呤修飾，環外氨基修飾，4-硫尿(嘧啶核)苷取代修飾，5-溴或5-碘尿嘧啶修飾；骨架修飾，硫代磷酸或烷基磷酸鹽修飾，甲基化物，和非正常鹼基對組合如等鹼基異胞苷和異鳥糞素。修飾還包括3』和5』修飾如帽子。
在一種實施方案中，提供的寡核苷酸中P(O)O基團被P(O)S(″硫代″)，P(S)S(″丁醯胺″)，P(O)NR2(″乙咪酯″)，P(O)R，P(O)OR′，CO或CH2(″甲醯基″)或3′-氨基(-NH-CH2-CH2-)取代，其中R或R′是單獨的H或被替換的或未被替換的烷基。連接基團可通過-O-，-N-，或-S-聯接接連接到臨近的核苷。並不是寡核苷酸中所有的聯接都需要相同。
在進一步的實施方案中，寡核苷酸包括修飾的糖基，如，一個或一個以上羥基被滷素基團，脂肪族基團或有酯或氨基功能的基團所取代。在一個實施方案中，2′位的呋喃糖殘基被O-甲基，O-烷基，O-烯基，S-烷基，S-烯基，或滷素基團任意一個取代。2′修飾的糖的合成方法在例如，即，Sproat，等人的文獻Nucl.Acid Res.19733-738(1991)；cotton等人的文獻Nucl.Acid Res.192629-2635(1991)和Hobbs等人的文獻Biochemistry 125138-5145(1973)中進行了描述。另一些修飾對本領域普通技術人員是已知的。這種修飾可能是pre-SELEXTM過程修飾或post-SELEXTM過程修飾(前面鑑定未修飾配體的修飾)或通過向SELEXTM中加入修飾。
Pre-SELEXTM過程的修飾作用和向SELEXTM過程加入的修飾作用產生的核酸配體對SELEXTM靶點有特異親和力，和改善了的穩定性，如在體內的穩定性。對核酸配體Post-SELEXTM過程修飾也可能改善穩定性，如體內穩定性，而且對核酸配體結合能力沒有負面影響。
SELEXTM方法將篩選的寡核苷酸與其他篩選的寡核苷酸和非寡核苷酸功能單位連接起來，如在美國專利第5,637,459號和第5,683,867號中描述。The SELEXTM方法進一步包括將篩選的核酸配合和診斷或治療中的親脂的或非免疫原性的高分子化合物連接起來，如美國專利第6,011,020號和第6,051,698號和PCT刊物第WO98/18480號中敘述。這些專利和申請指導我們各種形狀和特性的結合，結合寡核苷酸有效擴增和複製的特性，和其他分子的理想特性。
通過SELEXTM方法對小靈活肽核酸配體的鑑定也進行了研究。小肽有靈活的結構通常在溶液中以多種結構的平衡狀態存在，因此起初認為由於結合靈活肽而減小的構象熵會限制結合親和力。但是在溶液中鑑定小肽核酸配體的可行性在美國專利第5,648,214號中有說明。在這項專利中，鑑定出了底物P，一種11胺基酸多肽的高親和力MA核酸配體。
對本發明靶點有特異性和高親和結合力的適體通過這裡描述的SELEXTM過程進行篩選。然後，作為SELEX過程的一部分，篩選出的結合靶點的適體任選的最小化以確定有理想結合親和力的小序列。被選出的序列和/或最小化的序列通過隨機或定點突變任選的進行修飾以增加結合親和力或確定序列中結合活性的必需序列。另外，通過加入修飾核苷進行篩選以使適體分子對體內的降解更穩定。
2』修飾的SELEXTM 為了使適體適合用作治療，優選廉價合成適體，並使其在體內的安全和穩定。由於他們的敏感性，易被核酸酶降解，野生型MA和脫氧核糖核酸適體在體內通常並不穩定。通過修飾2』位可大大增加抗核酸降解的能力。
氟基和氨基已成功併入寡核苷酸庫中，隨後從此寡核苷酸庫中篩選適體。但是，這些修飾費用大大增加由此合成的適體的成本。同時，因為在修飾寡核苷酸的降解和隨後將苷酸作為DNA合成的底物的過程中，修飾寡核苷酸可能被循環進入宿主DNA同，從而引起在某些情況下的安全問題。
這裡提供的含有2′-氧-甲基(″2′-OMe″)核苷的適體克服了上述很多弊端。含有2』-氧-甲基核苷的寡核苷酸可抵制核酶降解，廉價合成。雖然2』-氧-甲基核苷在生物系統中普遍存在，天然聚合酶在生理條件下不接受2』-氧-甲基NTPs作為底物，因此對循環的2』-氧-甲基核苷酸進入宿主的DNA後，沒有安全上的顧慮。產生2′-修飾適體的SELEX方法已作描述，例如，2002年12月3日提出的美國臨時專利申請編號第60/430,761號，2003年7月15日提出的美國臨時專利申請編號60/487,474；2003年11月4日提出的美國臨時專利申請編號60/517,039；美國專利申請編號10/729,581；2004年7月21日提出的美國臨時專利申請編10/873,856標題″體外篩選2′-氧-甲基取代核酸的方法″，這裡提到的每個專利通過在此引證全部併入本文。
本發明包括可結合到IgE和調節IgE功能的適體，其中IgE能包含修飾的核苷(如有2′位修飾)，從而使寡聚核苷酸比未修飾的寡核苷酸在酶降解、化學降解、熱降解和物理降解方面更穩定。雖然文獻裡有一些包含2′-OMe適體的例子(參見，例如，Green等人在Current Biology 2，683-695，1995上發表的文獻)，這些都是通過修飾轉錄混合物體外篩選產生的，修飾混合物中C和U殘基是2』-氟(2′-F)取代的，A和G殘基是2′-OH。一旦每個功能序列都被鑑定出，測試每個A和G殘基對2′-Ome取代的耐受力，重新合成的適體，所述適體含有的所有A和G作為2』-氧-甲基殘基能容受2』-氧-甲基取代。大多數兩步法生成的A和G殘基能容受2』-氧-甲基殘基的取代，儘管平均20％不能容受。因此這種方法產生的適體一般含有2-4個2′-OH殘基，因此合成的穩定性和成本比較恰當。通過向產生穩定化處理寡核苷酸的轉錄反應中加入修飾核苷，本發明的方法減少了穩定化處理被篩選適體寡核苷酸的必要(例如，通過使用修飾核苷重新合成適體寡核苷酸)，穩定化處理的寡核苷酸用於使用SELEX篩選和富集的寡核苷酸轉錄混合物(和/或其衍生物或改進產物，包括在此描述的這些適體)。
在實施方案中，本發明提供由2′-OH，2′-F，2′-脫氧和2』-OMe修飾的ATP，GTP，CTP，TTP以及UTP核苷酸的混合物組成的適體。在另一些實施方案中，本發明提供由2′-OH，2′-F，2′-脫氧，2′-OMe，2′-NH2，和2′-甲基修飾的ATP，GTP，CTP，TTP以及UTP核苷酸的混合物組成的適體。在另一個實施方案中，本發明提供由56個2′-OH，2′-F，2′-脫氧，2′-OMe，2′-NH2和2′-甲基修飾的ATP，GTP，CTP，TTP以及UTP核苷酸混合物組成的適體。
發明的2′修飾適體是由經修飾過的聚合酶創建的，如，經修飾過的T7聚合酶能結合呋喃糖2′位被大量取代的修飾鹼基，其結合速率比野生型聚合酶高。例如，突變體T7聚合酶(Y639F)的639位的酪氨酸殘基突變為苯丙氨酸，該酶很容易利用2′-脫氧，2′-氨基和2′-氟-核苷三磷酸作為底物，已被廣泛應用於合成修飾MAs，開拓了廣闊的應用前景。但是，據現有報導，這種突變體T7聚合酶還不能利用(即，併入)2′位被2′-OMe或2′-疊氮(2′-N3)大量取代的核苷三磷酸作為底物。突變體T7聚合酶(Y639F/H784A)，除了發生上述Y639F突變外，還在784位組氨酸突變為丙氨酸殘基。該酶已被用於限制條件下嘧啶核苷三磷酸的結合。參見Padilla，R.和Sousa，R.的文獻Nucleic Acids Res.，2002，30(24)138.描述了突變體T7聚合酶(H784A)在784位將組氨酸突變為丙氨酸殘基。Padilla等人Nucleic Acids Research，2002，30138。突變體T7聚合酶Y639F/H784A和H784A在其突變位點都變為更小的胺基酸殘基。正是這種變化使其結合了更多的核苷底物，如2』-OMe取代的核苷酸底物。
通常，在此公開的條件下，Y693F突變體可用於結合2』-OMe取代的除GTP外核苷三磷酸NTPs，Y639F/H784A突變體可用於所有2』-OMe取代的包括GTP在內的NTPs。可以預見，在此公開的條件下，突變體H784A與Y639F和突變體Y639F/H784A性質相似。
2′修飾的寡核苷可完全由經過修飾的核苷合成或用一部分經修飾過核苷的合成。修飾可相同的可不同的。所有的核苷均可被修飾，所有的核苷都可能含有相同的修飾。所有的核苷均可被修飾，但包含不同的修飾，比如，所有含有相同鹼基的核苷都只有一種修飾，而含有其他鹼基的核苷則可能有其他的類型的修飾。所有的嘌呤核苷可能只有一種類型的修飾(或不被修飾)，而所有的嘧啶核苷酸則含有另外類型的修飾，或沒有被修飾。這樣，轉錄進行或轉錄產物的形成的過程中，可以利用任何修飾組合，例如包括嘧啶核苷(2′-OH)，脫氧嘧啶核苷(2′-脫氧)，2′-F和2′-氧甲基核苷。包含2』-OMe C和U與2′-OH A和G的轉錄混合物被稱為″rRmY″複合物，被其選擇的適體因而稱為″rRmY″適體。包含脫氧A和G與2′-OMe U和C的轉錄複合物被命名為″dRmY″複合物，相應的被選擇適體命名為″dRmY″適體。包含2′-OMe A，C，和U與2′-OH G的轉錄複合物被命名為″rGmH″複合物，相應的被選擇適體命名為″rGmH″適體。包含2′-OMeA，C，U和G與2′-OMe A，U和C以及2′-F G的轉錄複合物被命名為″備選混合物″，相應的被選擇適體命名為″備選混合物適體″。包含2′-OMe A，U，C，和G，其中10％以上的核苷酸是G′s，轉錄複合物被命名為″r/mGmH″複合物，相應的被選擇適體命名為″r/mGmH″適體。包含2′-OMe A，U，和C與2′-F G的轉錄複合物被命名為″fGmH″複合物，相應的被選擇適體命名為″fGmH″適體。包含2′-OMe A，U和C與脫氧G的轉錄複合物被命名為″dGmH″複合物，相應的被選擇適體命名為″dGmH″適體。包含脫氧A與2′-OMe C，G和U的轉錄複合物被命名為″dAmB″複合物，相應的被選擇適體命名為″dAmB″適體。只包含2′-OH核苷的轉錄複合物被命名為″m″複合物，相應的被選擇適體命名為″m″或″rRrY″適體。″mRmY″適體則是只包含2′-O-甲基核苷，通常從r/mGmH寡核苷由post-SELEXTM置換而獲得，也可以將2′-OH Gs用2′-OMe Gs取代來獲得。
優選的實施方案包括任何組合的2′-OH，2′-脫氧和2′-OMe核苷。較好優選實施方案包括任何組合2′-脫氧和2′-OMe核苷。更優選實施方案包括任何組合的2′-脫氧，和2′-OMe核苷，其中嘧啶2′-OMe如(dRmY，mRmY或dGmH)。
在篩選過程之前(如，pre-SELEXTM過程修飾)要完成修飾鹼基與發明中適體的結合。另外，在pre-SELEXTM修飾過程中與修飾鹼基相結合的本發明的適體還可以通過post-SELEXTM修飾過程進一步修飾(如pre-SELEXTM修飾之後post-SELEXTM過程修飾)。Pre-SELEXTM產生特異結合於SELEXTM靶點的經修飾過的核酸配體，並且改進了在體內的穩定性。Post-SELEXTM過程修飾(對先前鑑定的含有通過pre-SELEXTM過程修飾加入的的核苷的配體進行切斷，敲除，替換或添加核苷修飾)進一步改進了在體內的穩定性，而並不嚴重影響含有通過pre-SELEXTM過程修飾結合的核苷的核酸配體結合容量。
在聚合酶接受2′位修飾的NTPs的條件下，為了獲得2′位修飾(例如2′-OMe)的MA轉錄產物，優選聚合酶是Y693F/H784A突變體或Y693F突變體。另外一些聚合酶，尤其是能耐受2′位大量被取代的聚合酶也可用於本發明。通過檢測在此公開的轉錄條件下結合修飾核苷的能力可以獲得這些聚合酶的結合能力。
有許多因素被確定為對在此公開的方法使用的轉錄條件有重要作用。比如當前導序列與在DNA轉錄模板5′末端的固定序列結合後，觀察到經修飾的轉錄產量增加，合成的轉錄物至少前6個殘基都是嘌呤。
影響獲得結合修飾核苷轉錄物的另一個重要因素是2′-OH GT的存在或其濃度。轉錄可以分為兩個階段第一個階段是起始，在此階段，NTP加入到GTP的3′-羥氧基端(或另一個取代鳥苷)生成二核苷酸，之後延伸為10-12個核苷；第二階段是延長，在此階段，轉錄產物遠遠超過最開始加入的10-12個核苷。加入到含有過量2』-氧-甲基GTP的轉錄複合物中的少量的2』-氧-甲基GTP足可使聚合酶引發2′-OH GTP參與的轉錄，但當轉錄進入延長階段，由於2』-氧-甲基和2′-OH GTP的差別減弱，2』-氧-甲基GTP多於2′-OH GTP，使得轉錄結合的主要是2』-氧-甲基GTP。
影響2』-氧-甲基取代核苷滲入轉錄物的另一個重要因素是轉錄混合物中的二價鎂和錳。已有發現氯化鎂和氯化錳以不同的濃度組合影響2′-氧-甲基轉錄的產量，氯化鎂和錳的最適濃度取決於其在含有二價金屬離子以NTPs轉錄反應混合物的濃度。為了獲取2′取代的氧甲基化轉錄物的最大產量(即所有的A，C和U和大約90％G核苷)，當每種NTP的濃度是0.5mM時，優選的氯化鎂的濃度大約是5mM，而優選的氯化錳的濃度大約是1.5mM。當每種NTP的濃度是1..0mM時，優選的氯化鎂的濃度大約是6.5mM，而優選的氯化錳的濃度大約是2.0mM。當每種NTP的濃度是2.0mM時，優選的氯化鎂的濃度大約是9.6mM，而優選的氯化錳的濃度大約是2.9mM。在任何情況下，非二倍濃度的情況下仍然能顯著提高修飾轉錄產物的量。
GMP或鳥苷引發的轉錄也很重要。這種效應是由於聚合酶對起始核苷的特異性引起的。因而這種方式產生的任何轉錄的5′-末端核苷都可能是2′-OH G。GMP或鳥苷的優選濃度是0.5mM，甚至更優選濃度1mM。還發現在轉錄反應中，含有PEG最好是PEG-8000，有利於最大程度的結合修飾核苷。
為使2′-氧甲基ATP(100％)，UTP(100％)，CTP(100％)和GTP(～90％)(″r/mGmH″)最大程度結合到轉錄物中，下為優選條件HEPES緩衝液200mM，DTT 40mM，亞精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl25mM(6.5mM其中每種2′-OMe NTP的濃度是1.0mM)，MnCl2 1.5mM(2.0 mM其中每種2』-氧-甲基NTP的濃度是1.0mM)，2』-氧-甲基NTP(每種)500μM(更優選是1.0mM)，2′-OH GTP 30μM，2′-OH GMP 500μM，pH7.5，Y639F/H784A T7 MA聚合酶15units/mL，無機焦磷酸酶5units/mL，至少8個核苷長的全嘌呤引導序列。在此使用的一個單位的Y639F/H784A突變體T7 MA聚合酶(或在此特定任何其他T7 MA聚合酶)定義為1nmole2′-氧甲基NTPs結合如轉錄物中所需要的酶的量。在此使用的一單位的無機磷酸酶定義為在pH7.2和25℃條件下釋放每分鐘釋放1.0摩爾無機磷酸鹽所需要酶的量。
為了使2′-氧甲基ATP，UTP和CTP(″rGmH″)最大程度結合到轉錄物中，下為優選條件HEPES緩衝液200mM，DTT 40mM，亞精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，TritonX-1000.01％(w/v)，MgCl25mM(9.6mM當每種2』-氧-甲基NTP的濃度是2.0mM)，MnCl21.5mM(2.9mM當每種2′-OMeNTP的濃度是2.0mM)，2』-氧-甲基NTP(每種)500μM(更優選2.0mM)，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/ml，無機磷酸酶5units/mL，至少8個核苷長的全嘌呤引導序列。
為了使2′-氧甲基UTP和CTP(″rRmY″)最大程度結合入轉錄物種，下列為優選條件HEPES緩衝液200mM，DTT 40mM，亞精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-1000.01％(w/v)，MgCl25mM(9.6mM當每種2』-氧-甲基NTP的濃度是2.0mM)，MnCl21.5mM(2.9mM當每種2』-氧-甲基NTP的濃度是2.0mM)，2′-OMe NTP(每種)500μM(2.0mM更佳)，pH7.5，Y639F/H784A T7 MA聚合酶15units/mL，無機磷酸酶5units/mL，至少8個核苷長的全嘌呤引導序列。
為了使脫氧ATP和GTP和2′-氧甲基UTP和CTP(″dRmY″)100％最大結合到轉錄物中，優選以下條件HEPES緩衝液200mM，DTT 40mM，精胺2mM，亞精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl29.6mM，MnCl22.9mM，2』-氧-甲基NTP(每種)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/mL，無機磷酸酶5units/mL，至少8個核苷長的全嘌呤引導序列。
為了使脫氧2′-氧甲基ATP，UTP和CTP和2′-FGTP(″fGmH″)100％最大結合到轉錄物中，優選以下條件HEPES緩衝液200mM，DTT 40mM，亞精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl29.6mM，MnCl2 2.9mM，2′-OMe NTP(每種)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/mL，無機磷酸酶5units/mL，至少8個核苷長的全嘌呤引導序列。
為了使脫氧脫氧ATP，2′-氧甲基UTP和GTP和CTP(″dAmB″)100％最大結合到轉錄物中，優選以下條件HEPES緩衝液200mM，DTT 40mM，亞精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl29.6mM，MnCl2 2.9mM，2』-氧-甲基NTP(每種)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/mL，無機磷酸酶5units/mL，至少含有8個核苷的全嘌呤引導序列。
對於上述每種情況(a)轉錄優選在20℃到50℃，優選於30℃到45℃，更優選37℃進行至少兩個小時(b)50-300nM的雙鏈DNA轉錄模板被使用(在第一輪反應中使用200nM模板用以增加多樣性(300nM的模板用於dRmY轉錄))，在隨後幾輪反應中大約50nM，以1/10的比例稀釋用來優化PCR反應，使用在此所述的條件。優選DNA轉錄模板如下(其中ARC254和ARC256在全2′-氧甲基的條件下轉錄而ARC255在rRmY的條件下轉錄)。
SEQ ID NO 1 ARC2545』-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3』SEQ ID NO 2 ARC2555』-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3』SEQ ID NO 3 ARC2565』-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3』
在本發明m轉錄條件下，轉錄反應混合物由2′-OH腺苷三磷酸(ATP)，2′-0H鳥苷三磷酸(GTP)，2′-OH胞苷三磷酸(CTP)和2′-OH尿苷三磷酸(UTP)組成。使用本發明中m轉錄混合物產生的修飾寡核苷酸完全由2′-OH腺苷，2′-OH鳥苷，2′-OH胞啶，2′-OH尿苷組成。在m轉錄優選實施方案中，本發明產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，至少80％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少80％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少80％的胞苷是是2′-OH胞苷，至少80％的尿苷是是2′-OH尿苷。m轉錄更優選實施方案中，本發明產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，至少90％的腺苷是2′-OH腺苷，至少90％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少90％的胞苷是是2′-OH胞苷，至少90％的尿苷是是2′-OH尿苷。在m轉錄的更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少100％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少100％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少100％的胞苷是是2′-OH胞苷，至少100％的尿苷是是2′-OH尿苷。
本發明rRmY轉錄條件下，轉錄反應混合物由2′-OH腺苷三磷酸(ATP)，2′-OH鳥苷三磷酸(GTP)，2′-氧-甲基胞苷三磷酸(CTP)和2′-氧-甲基尿苷三磷酸(UTP)組成。由本發明中由rRmY轉錄混合物中產生的修飾寡核苷酸完全由2′-OH腺苷，2′-OH鳥苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基尿苷組成。優選實施方案產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少80％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少80％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少80％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，至少90％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少90％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少90％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。m轉錄的更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，至少100％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少100％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少100％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的尿苷是是2′-氧-甲基尿苷。
本發明dRmY轉錄條件下，轉錄反應混合物由2′-脫氧腺苷三磷酸(ATP)，2′-脫氧鳥苷三磷酸(GTP)，2′-氧-甲基胞苷三磷酸(CTP)和2′-氧-甲基尿苷三磷酸(UTP)組成。由本發明中使用dRmY轉錄混合物中產生的修飾寡核苷酸完全由2′-脫氧腺苷，2′-脫氧鳥苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基尿苷組成。優選實施方案中產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，至少80％的腺苷是是2′-脫氧腺苷，至少80％的鳥苷是2′-脫氧鳥苷，至少80％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少90％的腺苷是是2′-脫氧腺苷，至少90％的鳥苷是2′-脫氧鳥苷，至少90％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。最優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少100％的腺苷是是2′-脫氧腺苷，至少100％的鳥苷是2′-脫氧鳥苷，至少100％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的尿苷是是2′-氧-甲基尿苷。
本發明rGmH轉錄條件下，轉錄反應混合物由2′-OH鳥苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸，2′-氧-甲基尿苷三磷酸和2′-氧-甲基腺苷三磷酸組成。由本發明中使用rGmH轉錄混合物中產生的修飾寡核苷酸完全由2′-OH鳥苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基尿苷和2′-氧-甲基腺苷組成。優選實施方案中產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少80％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少80％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷，至少80％的腺苷是是2′-氧-甲基腺苷。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少90％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少90％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷，至少90％的腺苷是是2′-氧-甲基腺苷。最優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少100％的鳥苷是2′-OH鳥苷，至少1 00％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的尿苷是2′--氧-甲基尿苷，至少100％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷。
本發明r/mGmH轉錄條件下，轉錄反應混合物由2′-氧-甲基腺苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸，2′-氧-甲基鳥苷三磷酸和2′-氧-甲基尿苷三磷酸組成。由本發明中使用r/mGmH轉錄混合物中產生的修飾寡核苷酸完全由2′-氧-甲基腺苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基鳥苷和2′-氧-甲基尿苷組成，其中鳥苷三磷酸中2′-OH鳥苷的最大含量是10％。優選實施方案中產生的r/mGmH修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少80％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少80％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的鳥苷是2′--氧-甲基鳥苷，至少80％的尿苷是2′-氧-甲基尿苷，所有腺苷酸中2′-OH腺苷不超過10％。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少90％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少90％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的鳥苷是2′--氧-甲基鳥苷，至少90％的尿苷是是2′-氧-甲基尿苷，所有鳥苷酸中2′-OH鳥苷不超過10％。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少100％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少100％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的鳥苷是2′--氧-甲基鳥苷，至少100％的尿苷是2′-氧-甲基尿苷，所有鳥苷酸中2′-OH鳥苷不超過10％。
本發明fGmH轉錄條件下，轉錄反應混合物由2′-氧-甲基腺苷三磷酸，2′-氧-甲基尿苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸和2′-F鳥苷三磷酸組成。由本發明中使用fGmH轉錄混合物中產生的修飾寡核苷酸完全由2′-氧-甲基腺苷，2′-氧-甲基尿苷，2′-氧-甲基胞苷和2′-F鳥苷組成。優選實施方案產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少80％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的鳥苷是2′-F尿苷。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少90％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少90％的胞苷是2′--氧-甲基尿苷，至少90％的鳥苷是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是2′-F鳥苷。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少100％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少100％的胞苷是2′--氧-甲基尿苷，至少100％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的鳥苷是2′-F鳥苷。
本發明dAmB轉錄條件下，轉錄反應混合物由2′-脫氧腺苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸，2′-氧-甲基鳥苷三磷酸和2′-氧-甲基尿苷三磷酸組成。由本發明中使用dAmB復轉錄混合物產生的修飾寡核苷酸完全由2′-脫氧腺苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基鳥苷和2′-氧-甲基尿苷組成。優選實施方案的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少80％的腺苷是2′-脫氧腺苷，至少80％的胞苷是2′-氧-甲基尿苷，至少80％的鳥苷是是2′-氧-甲基鳥苷，至少80％的尿苷是2′--氧-甲基胞苷。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列組成，該序列至少90％的腺苷是2′-脫氧腺苷，至少90％的胞苷是2′-氧-甲基尿苷，至少90％的鳥苷是2′-氧-甲基鳥苷，至少90％的尿苷是2′--氧-甲基胞苷。更優選實施方案中，產生的修飾寡核苷酸組成一個序列，該序列至少100％的腺苷是2′-脫氧腺苷，至少100％的胞苷是2′-氧-甲基尿苷，至少100％的鳥苷是2′-氧-甲基鳥苷，至少100％的尿苷是2′--氧-甲基胞苷。
在每種情形下，轉錄產物用於SELEXTM過程的混合物以鑑定出能與給定靶點特異結合的適體和/或確定與給定靶點特異結合的保守基序序列。產生的序列已被部分穩定化處理，從過程中除去這一步從而得到一種修飾的適體序列和一種更穩定的適體。2』-氧-甲基SELEXTM過程的另一個優點是產生的序列中可能有更少的序列所必需的2′-OH核苷，甚至可能沒有。2′OH核苷仍存在的程度時，可通過post-SELEXTM修飾除去。
如下所述，在非上述的優化條件的其他條件下，可以獲得完全結合了2′取代的核苷少量有用的複製產物。上述轉錄條件的改變包括
HEPES緩衝液的濃度範圍為0到1M。本發明也考慮使用其他pKa值介於5-10的緩衝液試劑。例如，Tris-羥甲基-氨基甲烷。
DTT濃度範圍介於0-400mM。本發明的方法也提供了其他還原試劑的使用方法，包括，巰基乙醇。
亞精胺和/或精胺濃度範圍為0-20mM。
PEG-8000濃度範圍為0到50％(w/v)。本發明的方法也提供了親水聚合體使用方法，包括其他分子量的PEG或其他親水的聚乙二醇。
Triton X-100濃度範圍為0到0.1％(w/v)。本發明的方法也提供了非離子去垢劑的使用，包括其他去垢劑和其他Triton-X去垢劑。
MgCl2的濃度範圍為0.5mM到50mM。MnCl2的濃度範圍為0.15mM到15mM。MgCl2和MnCl2必須在此所述的範圍內，在優選實施方案中MgCl2∶MnCl2的比例在大約10到3左右，優選的，MgCl2∶MnCl2的比例是大約3-5∶1，更優選MgCl2∶MnCl2的比例是大約3-4∶1。
2』-氧-甲基NTP濃度(每種NTP)範圍為5μM-5mM。
2′-OH GTP濃度範圍為0μM-300μM。
2′-OH GMP濃度範圍為0-5mM。
pH範圍為pH6到pH9。本發明的方法在大多數聚合酶保持能結合修飾核苷活性的pH範圍內操作，而且，本發明的方法也提供了在轉錄反應條件螯合試劑的任選使用方法，比如EDTA，EGTA，和DTT。
適體醫藥化學
適體醫藥化學是一種適體改進技術，通過化學方法合成多組變異適體。這些變異體由於引入了單一取代基而不同於母適體，由於取代基的位置不同彼此也不相同。比較這些適體變異體之間的差異，以及與母適體的差異。性能上可能有了很大的改進，以至於達到某一特定的治療標準是很有必要將單個取代基包含入內。
另外，從單取代變異適體獲得的信息可進一步通過同時引入一個以上的取代基來設計其他組的變異適體。其中一種設計方案是將所有的單取代的適體變異體分類，選出前四個，並將這四個適體變異體儘可能以雙倍(6)，三倍(4)和四倍(1)的形式組合，合成組合物並檢測。在第二個設計策略中，最好的單取代適體變異體做為母體，合成並檢測所有可能的雙取代適體變異體，包括最高級單取代適體變異體。也可以使用其他策略，這些策略可能重複被使用，隨著不斷對進一步的改進適體變異體的鑑定，取代的數目逐漸增加。
適體的醫藥化學尤其用於探究在局部而非全部引入取代基團。因為適體是在轉錄產生的的序列庫中發現的，任何SELEXTM過程引入的取代基必定是整體引入。比如，想要在核苷之間引入硫代磷酸酯聯接，那麼只能在每個A(或者每個G，C，T，U等)引入(整體取代)。如果適體需要在某些A(或每個G，C，T，U等)(局部取代)中引入硫代磷酸酯聯接，但又不允許其他的A之間引入，那麼就不能通過該過程實現。
適體的醫藥化學過程中所用的取代種類僅受到其做為固定相合成試劑產生取代的能力和將其引入低聚物合成方案能力的限制。該過程不僅限於核苷。適體的醫藥化學方案包括引入空間排阻，憎水性，親水性，疏水性，疏油性，正電荷，負電荷，中性電荷，兼性離子，極化性，抗核酸酶性，構象剛性，構象靈活性，蛋白結合特性，聚集等集團。適體醫藥化學方案可能包括鹼基修飾，糖修飾或磷酸連接修飾。
在治療學適體中考慮有用的取代基種類，引入下面一種或多種取代基都可取得理想的效果。
在體內已經出現了取代基團，比如2′-脫氧，2′-核糖，2′-氧甲基嘌呤或嘧啶或5-氧-甲基胞嘧啶。
取代基團已經成為被批准的治療劑的一部分，比如與硫代磷酸連接的寡核苷酸。
能水解或降解成上述兩種類型之一的取代基團，例如與甲硫代磷酸連接的寡核苷酸。
本發明的抗-IgE適體包括在此敘述的通過適體醫藥化學形成的適體與IgE特異結合的適體
本發明的材料包括一系列20-50核苷長的核酸適體，能特異結合IgE，並且在一些實施方案中有效的調節，如阻斷，IgE在體內的活性和/或其在功能檢測，如基於細胞的檢測中的活性。
這裡描述了能特異結合併調節IgE的適體。這些適體提供了一種低毒性，安全有效的形式來治療和/或預防過敏疾病或不適，已知所述過敏性疾病或不適是由IgE引起或與其有關，例如過敏性鼻炎(花粉症)，過敏性皮炎，哮喘，急性風疹(水泡-和-皮膚紅腫發炎)，食物過敏和系統性過敏反應。
提供了用於治療和/或診斷的特異性結合IgE的適體的例子，包括如下序列序列號11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292至295和296；尤其是從如下組中選出的序列序列號29，33，41至44，46，50，98至102，157至176，178至190，194至201，206至219，293至295和296；更尤其是從如下組中選出的序列序列號101，157，181，216，293至295和296。
其他與IgE結合的適體如實施例1-4例中敘述。
這些適體包括在此所述的修飾，包括與親脂性複合物或PEG高分子量複合物相連接，加入CpG基序，加入封端結構，與修飾核苷結合，磷酸骨架中的取代。
在本發明的實施方案中提供了能與IgE結合的分離出的非自然產生的適體。在一些實施方案中，這種分離出非自然發生的適體對少於100μM，少於1μM，少於500μM，少於50nM，少於1nM，少於500pM，少於100pM，少於50pM或少於1pM的IgE有一個解離常數(″KD″)。在發明的一些實施方案中，這個解離常數取決於在實施例1所述條件下使用人IgE滴定的斑點雜交試驗。在特別實施方案中，這個解離常數取決於標準斑點雜交試驗，在室溫下，在Dulbecco′s PBS(含有Mg++和Ca++)和0.1mg/mL BSA中滴定人IgE 30分鐘。
在另一個實施方案中，本發明的適體調節IgE的功能。另一個實施方案中，本發明的適體阻礙IgE發揮功能。還有其他發明實施方案中，適體結合和/或調節IgE衍生物的功能。這裡所用的IgE衍生物包括和與IgE功能完全相同的衍生物，尤其包括那些結構基本相同的衍生物，在一些優選實施方案中包括至少70％的胺基酸序列與IgE胺基酸序列一致的衍生物，更優選實施方案中80％序列一致，更優選是90％的序列一致，甚至更優選實施方案至少95％的胺基酸序列與IgE胺基酸一致。本發明的一些實施方案中，通過下述的BLAST法確定靶點衍生物序列的一致性。
文章裡出現的關於核苷酸或蛋白質序列的術語″序列一致性″或″一致性％″指的是在使用下面一種序列對比運算方法或靠視覺觀測來比較或比對最大吻合度時，兩個或多個序列或子序列其胺基酸殘基序列或核苷酸序列相同，或有一定比例的序列相同。序列對比時，通常，其中一個序列作為參照序列，其他序列與之進行對比。當用到一種數列對比運算方法時，參照序列和檢測序列輸入計算機，如有必要還可設定子序列對等物，還可設定序列運算法則程序中的參數。序列對比運算法則然後計算出檢測序列相對於參照序列的的相同序列百分比。可對要比較序列做最佳比對，如通過Smith Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)中的局部同源比對，通過NeedIeman Wunsch，J MoI.Biol.48443(1970)中同源比對運算法則，通過Pearson Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似方法研究和這些運算法則的計算機化(Wisconsm GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)或通過視覺觀測(參見Ausubel等人的文獻，同上)。
適合於確定序列同源百分比的其中一種運算法則，應用於基本局部比對工具(後引用為″BLAST″)，參見Altschul等人的文獻J MoI.Biol.215403-410(1990)和Altschul等人的文獻Nucleic Acids Res.，153389-3402(1997)。BLAST分析所用的軟體可從國家生物技術信息中心獲取(後文中引用為″NCBI″)。從NCBI中獲得的軟體在確定序列同源時使用默認參數。例如，BLASTN(對於核苷酸)和BLASTP(對於胺基酸序列)都在McGmnis等人的文獻Nucleic Acids Res.，32W20-W25(2004)中有所描述。
發明中的另一個實施方案中，適體與IgE結合的能力與任何一種依照序列號11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292-295和296的適體的結合能力相同。在發明的另一個實施方案中，適體的結構，和/或與IgE結合的能力與包括任何一種序列號11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292至295和296的適體相同。在特定的實施方案中，提供依照任何一種序列號11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292至295和296的適體。在一些特殊實施方案中，提供了依照任一種序列號101，157，181，216，293至295和296的序列。在另一個實施方案中，發明中的適體用做藥物成分中的活性劑。在另一個實施方案中，組成本發明適體的適體或組合物用於治療遺傳性過敏性疾病或功能不適，如過敏性鼻炎(花粉症)，遺傳性過敏性皮炎，哮喘，急性風疹，食物過敏，花生過敏，系統性過敏反應，過敏性結膜炎，春天角膜結膜炎，遺傳性過敏性結膜炎，巨大乳頭結膜炎和嗜曙紅細胞腸胃炎。
在一些實施方案中，本發明的適體治療劑與靶點有很強的親和力和特異性，同時適體治療劑能在病人或研究主體體內分解，則會降低非自然作用取代的核苷毒副作用。在一些實施方案中，包含本發明適體治療劑的治療性組合物沒有氟化核苷，或有少量的氟化核苷。
本發明的適體可通過使用任何寡核苷酸合成技術合成，技術包括工藝上已廣為人知固相寡核苷酸合成技術(參見Froehler等人的文獻Nucl.Acid Res.145399-5467(1986)和Froehler等人的文獻Tet.Lett.275575-5578(1986))和的裡斯雅特合成方法的液相合成法(參見Sood等人的文獻Nucl.Acid Res.42557(1977)和Hirose等人的文獻Tet.Lett.，282449(1978))。
含有免疫基序的適體
本發明提供了與IgE結合併調節其生物學功能的適體。本發明尤其提供了能干擾IgE與IgE受體，FcεRI結合的適體，因而阻礙了IgE介導的過敏反應。這類適體的治療效果可通過篩選與IgE結合併含有免疫應答或免疫調節基序的適體而進一步加強，也可以通過處理結合到IgE上的適體進一步得到加強，與適體相連的IgE與靶點上的免疫應答和/或免疫調節序列相結合。
脊椎動物免疫系統對細菌性DNA的識別是基於對特定序列背景下未甲基化CG二核苷酸的識別(″CpG基序″)。識別這種基序的一個受體是Toll樣受體9(″TLR9″)，是Toll樣受體家族的成員(大約10個成員)內之一。Toll樣受體通過識別特異細菌性成分參與先天免疫應答。TLR9與未甲基化寡核苷酸(″ODN″)CpG序列以一種序列特異方式結合。CpG基序的識別觸發了引起先天免疫反應防禦機制，最終獲得了免疫應答。例如，激活小鼠體內TLR9將引發抗原呈現細胞的激活，I和II類MHC分子的上調以及重要共調節分子和細胞激酶包括IL-12和IL-23等的表達。這種激活都直接或介接加強了B和T細胞應答，包括TH1細胞激酶IFN-γ的有力上調。全體的，對CpG序列的應答引起抵禦感染疾病，改進對疫苗的免疫反應，對哮喘有效應答，改進抗體依賴細胞介導的細胞激酶。因此CpG ODNs可抵抗感染性疾病，起到免疫輔助作用或癌症治療作用(單獨療法或與或其他藥物聯合療法)，並能減少哮喘和過敏反應。
本發明的適體包括一個或更多個CpG或其它免疫觸發序列，使用在此敘述的SELEXTM過程可通過多種策略鑑定或生成。通常，這些策略可分為兩組。對第一組而言，策略是針對鑑定或生成含有CpG基序或其他免疫觸發序列以及與靶點相結合的位點的適體。該靶點(之後用做″非CpG靶點″)不是已知的識別CpG基序或其他免疫觸發序列的並一旦結合了CpG基序就激發免疫反應的靶點。一些發明的實施方案中，非CpG靶點是IgE。本組的第一種策略包括進行SELEXTM獲得對特定的非CpG靶點，優選例如IgE靶點的適體，其中免疫反應與疾病的發展有關，使用的是CpG基序已經被加入到其每一個成員中，作為或者部分作為固定區域的寡核苷酸庫，例如在某些實施例中，寡核苷酸庫成員的隨機區域包括已加入了CpG基序的固定區域，以及識別包括了CpG基序的適體。本組的第二種策略包括進行SELEXTM以獲得對特定的非Cp靶點，優選例如IgE靶點的適體，這裡免疫應答與疾病發展相關，隨後將CpG基序選擇增加到5′和/或3′封端或將CpG基序通過工程學方法添加到適體的一個區域，優選非必需區域。本組的第三種策略包括進行SELEXTM以獲得對特定的非CpG靶點，優選IgE靶點的適體，在這裡免疫應答與疾病發展相關，其中在合成文庫的過程中，不同核苷酸的摩爾比偏向於一種或更多種核苷酸加入步驟，因此庫中每一成員隨機化區域富集CpG基序，以及識別包括了CpG基序的適體。本組的第四種策略包括進行SELEXTM以獲得對特定的非CpG靶點，優選IgE靶點的適體，在這裡免疫應答與疾病發展相關，以及識別包括了CpG基序的適體。本組的第五種策略包括進行SELEXTM獲得對特定的非CpG靶點，優選IgE靶點的適體，在這裡免疫應答與疾病發展相關，以及識別不包括CpG基序，但在結合後，能夠刺激免疫反應的適體。
第二組中，策略是針對鑑定或生成包括CpG基序和/或其他被CpG基序的受體(如，TLR9或其他toll形受體)結合的並觸發免疫應答的序列的適體。本組的第一種策略包括進行SELEXTM獲得對已知能與CpG基序或其他免疫觸發序列相結合併刺激免疫應答發生的靶標的適體，使用CpG基序已經被加入到每一個成員中作為或者部分作為其固定區域的寡核苷酸庫，例如在某些實施例中，寡核苷酸庫成員的隨機區域包括加入了CpG基序的固定區域，以及識別包括了CpG基序的適體。本組的第二種策略包括進行SELEXTM獲得對已知可與CpG基序或其他免疫觸發序列相結合的靶標的適體，這種結合一旦發生能夠刺激免疫反應，然後將CpG基序添加到適體5′和/或3′末端或將其工程構造到適體的一種區域，優選非必需區域中。本組的第三種策略包括進行SELEXTM獲得對已知與CpG基序或其他免疫觸發序列相結合的靶標的適體，這種結合一旦發生能夠刺激免疫反應，其中，在寡核苷酸庫的合成過程中，不同核苷酸的摩爾比偏向一種或多種核苷酸添加步驟，使庫中每一成員的隨機化區域富集CpG基序，以及識別包括了CpG基序的適體。本組的第四種策略包括進行SELEXTM獲得對已知與CpG基序或其他免疫觸發序列相結合的靶標的適體，這種結合一旦發生能夠刺激免疫反應，以及識別包括了CpG的適體。本該組的第五種策略包括進行SELEXTM以獲得對已知與CpG基序結合或與其他免疫觸發序列結合的靶標的適體，以及識別適體，該適體雖不包括CpG基序，但是，一旦結合就刺激免疫應答。
已經被鑑定出許多不同類的CpG基序，每個只要被識別出來就會觸發多種不同的反應，細胞因子和其他分子的釋放，某種細胞類型的激活。參見文獻CpG Motifs m Bacterial DNA and Their Immune Effects，Annu.Rev.Immunol.2002，20709-760，該文獻通過在這裡引證全部併入本文。隨後的美國專利還揭示了其他的免疫觸發基序，每個文獻都通過在此引證全部併入本文美國專利第6,207,646號；美國專利第6,239,116號；美國專利第6,429,199號；美國專利第6,214,806號；美國專利第6,653,292號；美國專利第6,426,434號；美國專利第6,514,948號和美國專利第6,498,148號。任何這些CpG基序和其他免疫觸發基序都可結合到適體中。適體的選擇由治療的疾病或功能紊亂來決定。優選的免疫觸發基序如下(從左到右是5′至3′)，其中″r″指的是嘌呤，″y″指的是嘧啶，″X″指任意的核苷AACGTTCGAG(序列號4)；AACGTT；ACGT，rCGy；rrCGyy，XCGX，XXCGXX，和X1X2CGY1Y2，其中X1是G或A，X2不是C，Y1不是G和Y2優選T。
在CpG基序與適體結合的實施例中，適體結合到特異的靶點上而不是已知的與CpG基序結合的靶點(非CpG靶點)，這種引發免疫應答，CpG優選位於適體的非必需區域。適體的非必需區域可通過定點突變，刪除分析和/或取代分析來確定。然而，任何不明顯的影響適體與非CpG靶點結合能力的定位方法都可使用。CpG基序除了位於適體內部序列也可是增加到5′和3′或附著於適體上。只要適體結合到非CpG靶點的能力沒有受到顯著的改變，可以以任何方式定位附著。
在此使用的，「免疫應答的刺激」的意思可以是(1)特異應答的誘導(例如ThI應答的誘導)或者是某個分子產生的誘導；或(2)特定反應(阻止或抑制Th2應答)或某些分子的阻止或抑制。
藥物組合物 發明也包括含有能與IgE結合的適體分子的藥物組合物。在一些實施方案中，這些組合物更適於內用，包括有效劑量的本發明的有藥物活性的化合物，單獨或同一個或多個藥學可接受載體組合使用。尤其是由於化合物的低毒性使得其非常有用。
本發明的組合物可用於治療，預防和/或改進病理，比如疾病或功能紊亂，也可以減輕這些疾病患者的症狀。比如本發明的組合物可用於治療，預防和/或改進與遺傳性過敏性疾病相關的疾病或功能紊亂，如由IgE引起或者與其相關的疾病過敏性鼻炎(花粉熱)，遺傳性過敏性過敏性皮炎，哮喘，急性風疹，食物過敏，花生過敏，系統性過敏反應。
發明的組合物可以用於對患有(或傾向於)某種疾病或功能紊亂的患者給藥，這種疾病或功能紊亂和特異結合了發明適體的靶點有關或是有其引起的。發明的組合物作為治療有病變的病人或主體的一種方法，方法涉及到給予病人或主體一個與IgE結合的適體或含有適體的組合物，適體結合了IgE改變了靶點的生物學功能從而治療了病變。
有病變的患者或主體，即，發明方法處理的病人或主體可以是脊椎動物，尤其是哺乳動物，尤其是人。
實際上，適體或其藥物容受鹽都是在其足可以發揮生物學活性的劑量下給藥，即抑制IgE適體與受體IgE結合。
發明的一方面包括了和其他治療IgE介導的功能紊亂的療法一起使用的本發明適體組合物。適體成分可能包括一種以上的適體。在一些實施例中，包含本發明一種以上適體的組合物與另一種組合物一起給藥，比如抗炎試劑，免疫抑制劑，抗濾過性病原體試劑或類似的試劑。總之，當前已知治療試劑的可用的劑量形是合適的。
「聯合治療」(或「共療法」)包括本發明適體化合物的給藥和至少另一種試劑的給藥。這種試劑作為特異治療方案的一個部分，目的在於提供這些藥物試劑共同作用的有益作用。聯合治療的有益作用包括但不是只限於由於藥物試劑聯合使用而引起的藥代學或藥效。這些藥物試劑聯合給藥都在規定的期限內執行的(通常是依據所選定的組合確定的分鐘，小時，日或周)。
「聯合療法」一般不是但是傾向於將兩種或以上這些治療試劑作為單獨療法方案的一部分，從而導致了本發明的聯合治療。聯合治療包括這些治療試劑按次序給藥，即，每種治療試劑在不同的時間給藥，或這些試劑，至少兩種試劑同時給藥。同時給藥是可以一個實現的，如給研究主體一個每種治療試劑都是按照固定比率配好的膠囊，或給多個膠囊，每個膠囊含有一種治療試劑。
每種治療試劑連續的充分的給藥受到任何合適途徑的影響，包括但不限於局部給予，口服，靜脈給予，肌肉給予和通過黏膜組織的直接的吸收。治療劑量可通過相同的途徑或不同的途徑給藥。比如，所選組合的第一種治療試劑可可通過注射方式給藥，而組合的其他治療試劑可通過局部給藥。
另外，所有的治療試劑都可能局部給予或者通過注射給予。治療試劑的給藥順序並不是非常嚴格除非有特別注釋。「聯合治療」也包括上述治療試劑的給藥和與其他生物學活性成分的聯合給予。當聯合治療還包括非藥物治療時，非藥物治療可以在任何合適的時間實施，只要非藥物治療聯合治療試劑共作用可以產生有益作用。比如，在一些實施例中，當非藥物治療暫時從治療治療試劑中去掉之後仍然有效，可能持續幾天甚至幾周。
本發明的治療成分或藥理成分一般包括有效劑量治療的活性成分，溶於或分散於藥理可容受的介質中。藥理可容受的介質或載體還包括任何的或所有的溶劑，分散介質，衣層，抗細菌或真菌試劑，等張試劑或吸收延長試劑，或一類。人們很了解適合於這種藥理活性物質的介質或試劑的使用工藝。增加的活性成分也可以加入到本發明的治療成分中。
鑑於這裡的披露，本領域技術人員非常清楚製藥學或藥理學組合物的製備。典型的，這些組合物可以製備成血管注射劑，或者液體溶液或者懸浮液；適合注射前能溶解或懸浮於液體的固體試劑；口服的片劑或其他固體試劑；緩釋膠囊；或當前使用的其他形式，包括滴眼液，乳液，洗液，藥膏，吸入劑或類似的。外科大夫，內科大夫或衛生健康工作者消毒方法的使用，比如鹽洗的，處理特定的手術區可能尤為重要。組合物也可以通過微型裝置，微粒或紗布來給藥。
治療試劑將按照與處方劑量相一致的方式，在能起到藥理學作用的劑量下給藥。方案可以很容易地以多種不同劑型的實施，如上述可注射溶液類型，但也可以使用藥物緩釋膠囊或類似類型。
在這種背景下，活性成分的量和給予的組合物的體積取決於要處理的宿主動物。給藥所需活性化合物需要的精確的量取決於執行者所做的判斷並因個體不同而有差異。
通常使用分散活性化合物所需要的最小的體積的組合物。雖然適宜的給藥方案也不同，但典型的給藥方案是先執行化合物給藥並監測結果然後再按一定的時間間隔上進一步控制藥物劑量。
例如，對片劑或膠囊(例如明膠膠囊)形式的口服給藥，活性藥物成分可以與乙醇，甘油，水或這類能口服的非毒性藥理學可容受的內載體一起給藥。而且，根據需要還可在混合物中添加合適的連接物，潤滑劑，崩解劑和著色劑。合適的連接物包括澱粉，矽酸錳鋁，澱粉糊，明膠，甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，例如葡萄糖和beta-乳糖的天然糖，玉米甜料，天然或合成樹脂，如阿拉伯膠，黃芪膠或藻酸鈉，聚乙烯乙二醇，蠟或此類。在這些劑型中所使用的潤滑劑包括油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，安息香酸鈉，醋酸鈉，氯化鈉，無水矽石，滑石，硬脂酸及其鎂或鈣鹽和/或聚乙二醇，和此類。崩解劑包括，但不止限於，澱粉，甲基纖維素，瓊脂，黏土，黃原膠樹脂澱粉，藻酸及其鈉鹽，或生泡混合物，和此類。稀釋劑包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露糖，山犁糖，纖維素和/或氨基乙酸。
發明的組合物可以是口服劑型給藥，如定時釋放和持續釋放片劑或膠囊，藥丸，藥粉，顆粒，酊劑，懸浮液，糖漿和乳劑。栓劑可從脂肪乳劑或懸浮液中製備。
有藥理活性的組合物可是已滅菌的和/或包含輔劑，如防腐劑，穩定劑，溼劑或乳化劑，促溶劑，調節滲透壓的鹽和/或緩衝液。另外，藥物成分也包含其他有藥理學作用的物質。藥物組合物按傳統方法混合，粒化，包衣進行製備，活性成分典型的是佔0.1％至75％，優選是佔0.1％至75％。
液體，尤其是可注射組合物可通過例如溶解，分散等來製備。活性組合物溶解於或混合於製藥學上的純溶劑，如，水，鹽溶液，葡萄糖液，甘油，乙醇等，從而形成可注射溶液或懸浮液。另外，還可製成適合在注射前溶解於液體中的固體。
本發明的組合物可在靜脈內(大丸藥和灌輸)，腹腔內，皮下或肌肉內注射的形式給藥。這幾種形式都是藥學上為人熟知的普通技術。血管注射劑可按照傳統的方式，以液體溶液的方式或懸浮液的形式來進行製備。
非腸胃給藥通常用於皮下注射，肌肉注射或靜脈注射和灌輸。另外，非腸胃給藥的一種方法使用了緩慢釋放或持續釋放系統的灌輸，保證了藥物維持在一個恆定的濃度，依據美國專利第3,710,795號所述，在這裡該專利通過引證併入全文。
此外，本發明的優選組合物可以使用本領域普通技術人員已知的方式通過適當的鼻用工具，吸入器鼻部局部給藥，或通過透皮貼劑形式由真皮途徑鼻內給藥。皮膚貼劑通過透皮途徑給藥，在該領域裡都是為人熟知的技藝。使用真皮運輸系統的形式給藥，整個劑量方案中劑量給藥應該是連續的而不是間斷。另一些優選的局部製劑包括乳劑，藥膏，洗劑，氣霧劑和凝膠體，其中活性成分典型的濃度在0.01％至15％，w/w或w/v範圍內。
對於固體組合物，賦形劑包括甘露糖，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖化鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂和其他。上文所定義的活性組合物可以使用栓劑作為栽體，聚二醇就使用栓劑作為載體，例如丙二醇。在一些實施方案中，栓劑很容易從脂肪酸乳劑和懸浮液中製備。
本發明組合物也可以通過脂質體傳遞系統給藥，比如小單囊泡，大單囊泡，多囊泡。脂質體可通過多種磷脂形成，包括膽固醇，硬脂醇或卵磷脂。在一些實施方案中，脂質組合物薄膜與藥物的水溶液結合形成脂質層包裹藥物，在美國專利第5,262,564中有此描述。比如，在此描述的適體分子可與通過使用為人熟知的方法構造的親脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物相連形成複合物。在美國專利第6,011,020中提供了一個核酸相關複合物的例子。
本發明的組合物也可作為靶向性藥物載體與可溶性聚合物相連。這樣的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羥丙氨-甲基丙烯醯胺-苯酚，多羥基乙氨基苯酚殘基取代的聚乙烯賴氨酸。此外，本發明的組合物可連接到一類能生物降解的聚合物上，有利於實現藥物的控制釋放，比如，聚乳酸，聚ε-己內酯，多羥基酪酸，聚原酸酯，聚縮醛(樹脂)，聚二羥基吡喃，聚丙烯酸脂和交聯的或兩性的凝膠共聚物。
所給的藥物組合物也可以包括小量的無毒副作用物質，如溼劑，乳化劑，pH緩衝試劑，和其他的例如醋酸鈉和三羥乙基胺油酸鹽的底物。
所使用適體的配藥方案是依據一系列因素來選擇的，包括類型，種類，年齡，重量，性別和病人的體檢狀況；需要治療的嚴重程度；給藥途徑；病人的肝功和腎功；使用的特定適體和鹽。一位普通的技術熟練的醫師或獸醫可以很容易確定並指出治療，預防，預測或拖延病情需要藥物的有效劑量。
本發明的口服劑量如果用於表明藥物作用則在每天口服0.05-7500mg的範圍內。組合物優選地以標記片劑的形式提供，其中含有0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100.0，250.0，500.0和1000.0mg的活性成分。灌輸用量，鼻內用量和真皮吸收用量在0.05-7500mg/day範圍內。皮下，靜脈和腹腔膜的用量則在0.05-3800mg/day範圍內。
本發明化合物的有效血漿水平在0.002mg/mL至50mg/mL範圍內。
本發明的化合物以每日一次的劑量形式給藥，或將每日總劑量分為兩次，三次或四次給藥。
適體治療試劑的藥代動力學和生物分布調節
很重要的一點是，對於所有基於包括適體在內的寡核苷酸的治療，其藥代動力學特性應與期望的藥物應用相匹配。針對細胞外靶點的適體不涉及細胞內運輸相關的困難(抗過敏和基於MAi的治療就是例子)，這類適體仍然能分散於靶器官或組織，或在一端時期內留在體內(未經修飾)，與理想的定量給藥方案一致。
本發明提供了影響適體成分藥代動力學的物質和方法，特別是提供了調節適體藥代動力學的能力。適體藥代動力學的調節能力(即，調整能力)可通過將修飾基團(如PEG共聚體)結合到適體和/或結合修飾核苷(如2』-氟或2』-氧-甲基)以改變核苷酸的化學成分來獲得。調節適體藥代動力學的能力用於改進現有藥物應用，或者新藥物應用的發展。例如，在一些藥物的實際應用中，如在需要快速清除藥物的抗新生或緊急護理處置中，減少適體在循環中的滯留時間是非常需要的。另外，在一些藥物的實際應用中，如，需要藥物系統循環的維持療法，增加適體在循環中的維持時間很有必要。
此外，適體藥代動力學的調節能力也用於調節適體藥物在研究主體體內的生物分布。例如，在一些藥物的應用中，需要改變適體藥物在體內的生物分布以靶向於特定的組織或器官(或一組器官)。在這些應用中，適體藥物在特定組織或器官積聚。在另一些藥物的應用中，需要靶向於呈現出細胞標記物或與疾病相關症狀的靶組織，有細胞損傷或其他病變的靶組織，這樣有利於適體藥物在受到影響的組織中聚積。如在2004年3月5日提出的美國臨時申請第60/550790號命名為「適體治療劑藥代動力學和生物分布的控制調節」和2005年3月7日提出的美國非臨時申請號10/---，---名為「適體治療劑藥代動力學和生物分布的控制調節」中描述適體藥物的PEG化產物(如，連接一個20kDa PEG聚合體的PEG化產物)用於靶向於炎性組織，從而有利於PEG化的適體藥物在炎性組織中的聚積。
為確定適體藥物(如適體連接體或含有發生化學修飾的適體，如修飾核苷)的藥代動力學和生物分布圖象，監測了各種參數。這些參數包括，例如，適體治療劑的半衰期(t1/2)，血漿清除率(Cl)，分布體積(Vss)，濃度-時間曲線下面積(AUC)，最大血清濃度或血漿濃度(Cmax)，和平均滯留時間(MRT)。其中″AUC″指的是適體藥物血漿濃度-適體給藥後時間圖象下面積。AUC值用於估計生物利用度(即，適體藥物給藥後適體藥物在循環中的百分比)和所給適體藥物的總清除率(Cl)(即，適體藥物從循環中清除的比率)。分布體積將適體藥物血漿濃度與體內適體總量聯繫起來。Vss越大，越容易在血漿中找到適體。
本發明提供了以控制方式調節體內經穩定化處理過的適體組合物的藥代動力學和生物利用度的材料和方法，通過將適體連接到調節基團上，如小分子物質，肽，或聚合物末端基團，或填加修飾核苷到適體中。在此所說到的連接修飾基團和/或改變核苷化學成分從根本方面改變了適體在循環中的滯留時間和在組織中。
寡苷核酸藥物除了被核酸酶修飾清除也通過腎臟過濾來清除。因此抗核酸酶的寡苷核酸的給藥通常是靜脈注射，如果過濾不受到阻礙，其顯示的體內半衰期小於10分鐘。可以通過促進血流快速分布入組織或增加寡苷核酸分子表面積使其超過腎小球有效截面來實現阻礙過濾。下述的將小分子藥物連接到PEG聚合物上(PEG化產物)可以顯著的延長適體在循環中的滯留時間，因而減少了給藥次數並加強對血管靶點的效力。
適體可以連接多種修飾基團-高分子量聚合物，如，PEG，肽，例如破傷風抗毒素(HIV破傷風抗毒素蛋白的13個胺基酸片段(Vives，等人(1997)，J.Biol.Chem.272(25)16010-7))，Ant(來自果蠅觸角基因同源蛋白第三個螺旋一個16個胺基酸序列(Pietersz，等人(2001)，Vaccme 19(11-12)1397-405))，疫苗19(11-12)1397-405))和精氨酸7(一個短的帶陽性電荷的可滲透入細胞的肽，由聚精氨酸(Arg7)組成)(Rothbard，等人(2000)，Nat.Med.6(11)1253-7；Rothbard，J等人(2002)，J.Med.Chem.45(17)3612-8))，和小分子，如親脂混合物膽固醇。上述這些多種連接物，由於PEG基團的複合作用使得適體在體內的特性都發生了很大的變化。例如，2′F和2』-氧-甲基修飾的與20kDa PEG聚合物連接的適體阻礙了腎臟的濾過，促進了健康組織和炎性組織的分布。而且20kDa PEG聚合物-適體連接體與40kDa PEG聚合物-適體連接體在經過腎臟被濾出時所起到的阻止作用幾乎是一樣的。儘管PEG化產物的一個作用在於對適體的清除上，但由於20kDa基團的出現延長了適體在系統中的滯留時間，從而促進了適體在組織中的分布，尤其是高灌注器官和炎性部位。20kDa PEG聚合物連接體將適體定向運輸到炎性部位，PEG化的適體就很容易在炎性組織中積聚。在一些例子中，20kDa PEG化的適體連接體能到達細胞內部，如腎臟細胞內部。
修飾核苷可用於調節適體的血漿清除率。如，與未經修飾的適體相比，結合了2′-F和2′-OMe穩定化學物質的而未連接的適體(由於在體內和體外都顯示了很高的核酸酶穩定性，是目前該代適體的典型代表)顯示能快速從血漿清除(即，快速血漿清除率)並快速分布入組織，尤其是腎組織。
PEG衍生的核酸
如上述，帶有高分子量的非免疫原聚合物的核酸衍生物有改變核酸的藥代動力學和藥效特性的潛力，使其成為有效的治療劑。活性上有益的變化包括增加增加了抵抗核酸酶降解的能力，減少了腎臟的濾過作用，減少了在免疫系統中的出現，改變了藥物在體內的生物分布。
發明的適體組合物可從聚醚類(″PAG″)衍生而來。PAG衍生核酸的例子可在2003年11月21日提出的專利申請第10/718,833號中找到，該申請在這裡通過引證全文併入本文。發明中使用代表性聚合物包括聚乙二醇(″PEG″)，也被認為是聚乙烯氧化物(″PEO″)，和聚丙烯乙二醇(包括聚異丙基乙二醇)。另外，在多種應用中，可隨機或阻斷不同烴基氧化物(如乙烯氧化物和丙烯氧化物)的共聚物。最常見的形式，聚二醇(如聚乙二醇)是一個線形聚合物，每個末端終止於烴基HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。這個聚合物α-，Ω-二羥聚乙二醇，可用HO-PEG-OH代表，其中PEG-形式代表下列結構單位-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中n的取值範圍是4到10,000。
PEG分子是雙功能的，有時被稱為PEG二醇。PEG分子末端部分相對的非反應羥基基團(-OH)，可被基活或轉化為功能基團，便於PEG或其他組合物在複合物中的反應位點連接。這種激活的PEG二醇在此稱為雙激活PEGs。例如，通過使用N-羥基琥珀醯亞胺中琥珀醯亞胺活性酯基團取代相對的非反應羥基基團(-OH)，PEG二醇的末端基團被激活，起到與胺基酸基團選擇反應活性碳酸酯的作用。
在很多應用中，需要在PEG分子必需非反應基團端加帽使的PEG分子成為單功能(或單激活)。蛋白質藥物對激活的PEGs通常顯示多個反應位點，雙功能激活的PEGs導致廣泛的交叉連接，產生很少的功能基團。為生成單激活PEGs，PEG二醇分子末端的羥基由非反應甲基端基團-OCH3取代。PEG分子的未加帽端轉化為反應端，可被激活以便於蛋白質分子在表面的反應位點連接。
PAGs是在水溶液和有機溶液中有良好溶解性，無毒性，無免疫原性的聚合物。PAGs可將聚合體共價連接到不溶性分子上使PAG-分子連接體變成可溶的。例如，水溶性藥物紫杉醇連接到PEG上就變成水溶性的。Greenwald等人，J.Org.Chem.60331-336(1995)。PAG連接體不僅用於增加溶解性和穩定性也用於延長分子在血液循環中的半衰期。
本發明的聚烷基化合物代表性的大小在5-80kDa之間，儘管可以使用任意大小，但是還是要根據適體和應用來確定。發明的另一些PAG複合物大小在10-80kDa之間。還有其他發明的PAG複合物大小在10-60kDa之間。例如，一個PAG聚合體大小可能至少是10，20，30，40，50，60，或80kDa。這種聚合體可以是線形化的或分支的。在一些實施方案中，聚合體是PEG。在一些實施方案中，聚合體是分支PEG。在另一些實施方案中，如圖3所述，聚合物是40kDa的支鏈PEG。在一些實施方案中，如圖4所述，40kDa的支鏈PEG連接到適體的5′端。
與生物蛋白藥物相比，核酸藥物典型的是從激活的單核苷化學合成的。PEG-核酸連接體可通過使用反覆單體合成方法結合PEG來製備。例如，通過轉化成脫氧核苷亞磷醯胺形式激活PEGs，然後加入到固相寡核苷酸合成中。或者，寡核苷酸合成是通過在特異位點加入反應PEG結合位點。最常見的是通過在5′-末端加入主要的自由胺基酸(在固相合成最後連接步驟中使用修飾脫氧核苷亞磷醯胺而加入)。通過這種方式，反應PEG(激活後將與胺基酸反應形成連接鍵)連接到純化的寡核苷酸上，連接反應在溶液中進行。
PEG連接體改變藥物生物分布的能力與很多因素有關，包括連接體的表面大小(用術語水力半徑來測量)。大的連接體(＞10kDa)已知能有效阻止腎臟濾過，從而增加小的高分子血漿半衰期(即肽，抗過敏寡核苷酸)。PEG連接體阻止濾過的能力被證實隨著PEG大小增加到50kDa左右而增加(進一步的增加只有很少的有益作用，半衰期變成由巨噬細胞介導的新陳代謝決定而不是腎臟的清除決定)。
高分子量PEGs(＞10kDa)的生成是困難的，效率低下，且價格昂貴。作為合成高分子量PEG核酸連接體的一條途徑，先前的工作目的集中於生成更高的分子量激活的PEGs。生成這種分子的一種方法包括形成激活的分支PEG，其中兩個或多個PEGs連接到帶有激活基團的中心核。這些高分子量PEG分子的末端部分，如相對的非反應羥基(-OH)，可以激活或轉化為功能基團，以便於一個或多個PEGs連接到其他組合物的反應位點上。分支的活化的PEGs可以多於兩個作用位點。當兩個或多個末端被激活，這種激活的高分子量PEG分子在此稱為多激活PEGs。在一些情況中，分支的PEGs分子中並不是所有的作用位點都被激活。在任意兩個位點都被激活的情況下的PEG分子被稱為雙激活PEGs。在只有一個位點激活的情況下，這種PEG分子被稱為單激活PEGs。這種途徑的一個例子是，通過連接單甲氧基PEGs到賴氨酸中心來製備激活PEG，該中心被激活以利於隨後的反應(Harris等人，Nature，vol.2214-221，2003)。
本發明提供了另一種合成高分子量PEG-核酸連接體(優選，適體)的經濟有效的路線，包括多PEG化核酸。本發明也包括PEG-連接的萬用寡核苷酸，如二聚化適體。本發明與高分子量組合物相關，該組合物中PEG經穩定化處理的基團作為接頭將適體按照不同比例分開。如PEG連接在一個適體序列內，高分子量適體組合物的線形組合是核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n，其中n大於等於1。
發明的高分子量組合物包括分子量至少10kDa的組合物。代表性的組合物分子量大小在10到80kDa之間。發明的高分子量組合物至少是10，20，30，40，50，60，或80kDa大小。
穩定化處理的基團是一個分子或分子的一部分，改進了本發明高分子量適體的藥代動力學和藥效學特性。在一些情況中，穩定化處理的基團是一個分子或分子的一部分，能將兩或多個適體或適體區域相互接近，或減少發明高分子量適體組合物的總轉動自由度。一個穩定化處理的基團可以是聚烴基乙二醇，例如聚乙二醇，這種聚乙二醇可以是線形的或分支的，均聚物或雜聚物。另一些穩定化處理的基團包括肽例如肽核酸(PNA)。寡核苷酸可以是穩定化處理的基團；這種寡核苷酸可包括修飾核苷，和/或硫代磷酸脂類的修飾聯接。一個穩定化處理的結構可以是一個適體組合物的完整的一部分，即共價連接到適體上。
發明的組合物包括高分子量適體組合物，其中兩或多個核酸基團共價連接到至少一個聚烴基乙二醇基團上。聚烴基乙二醇基團起到穩定基團的作用。在組合物中聚烴基乙二醇基團任意一端共價連接到適體，這樣聚烴基乙二醇基團將核酸在一個分子中連接起來。有人說聚烴基乙二醇基團是一個連接基團。在這樣的組合物中，共價分子的基本結構包括線形排列的核酸-PAG-核酸。包含基本結構核酸-PAG-核酸的組合物就是一個例子。另一個例子是線形排列的核酸-PEG一核酸-PEG-核酸。
為了生成核酸-PEG-核酸連接體，先合成核酸，這樣就提供了一個反應位點(即單激活)。在優選實施方案中，該反應位點是5′末端的一個胺基酸基團，它是通過在寡核苷酸固相合成最後一步填加修飾脫氧核苷亞磷醯胺而引入的。脫保護和純化修飾寡核苷酸後，在高濃度的能減少激活的PEG自發水解的溶液中再生成。在優選實施方案中，寡核苷酸濃度是1mM，再生溶液濃度包含200mM緩衝液和NaHCO3緩衝液，pH8.3.連接體的合成通過緩慢的加入高度純化的雙激活PEG引發。在優選實施方案中，PEG二醇通過在兩端琥珀醯亞胺丙酸鹽的衍生而激活。反應後，PEG核酸連接體通過凝膠電泳或液相色譜純化分離出完全連接體，部分連接體和非連接體。多PAG分子(隨機或阻斷共聚體)或小PAG鏈可被連接以獲取不同的長度(或分子量)。非PAG接頭可用於不同長度的PAG鏈之間。
2′-O-甲基，2′-氟和其他經修飾的核苷修飾物穩定了適體抵抗核酸酶降解的能力，延長了體內半衰期。3′-3′-dT帽也增加了核酸外切酶的抵抗力。參見美國專利第5,674,685號；第5，668,264號；第6,207,816號和第6,229,002號，其中每個都被在此引證而全文合併於本文。
反應性核酸的PAG衍生物
高分子量PAG-核酸-PAG連接體可通過單功能激活的PEG與含有多個反應位點核酸的反應來製備。在實施方案中，核酸是雙反應的或雙激活的含有多個反應位點通過傳統的脫氧核苷亞磷醯胺合成方法引入到寡核苷酸上的一個5′-胺基酸基團和一個3′-胺基酸基團，例如在圖5所示的3′，5′二PEG化產物。在另一些實施方案中，可在內部引入反應位點，如在嘧啶的第5位，嘌呤的第8位，或核糖的2′位點引入主要胺基酸的結合位點。在這些實施方案中，核酸可有幾個激活的或反應位點，有人說可被多激活。合成和純化後，在促進與寡核苷酸反應選擇性反應同時也減少了自發水解的條件下，修飾寡核苷酸與單位點激活的PEG連接。在優選實施方案中，單甲氧化PEG由羥基琥珀醯亞胺丙酸鹽激活，連接反應在pH8.3進行。為了促進雙取代PEG的合成，提供了相對於寡核苷酸計量過量的PEG。反應之後，PEG-核酸連接體經凝膠電泳或液相色譜分離出完全，部分和非連接樣本。
在這裡供連接的連接區域可有一個或一個以上聚二醇基團。這種PAGs可有不同的長度，也可用於合適的連接體中以獲得理想的不同分子大小的組合物。
特定接頭的效應可受到其化學成分和長度的影響。一個很長，很短的或與IgE形成不宜的空間結構和/或離子鍵的接頭是適體與IgE形成複合體的前提。接頭如果長於核苷酸之間的距離可通過減少配體的有效濃度而降低連接的穩定性。因此，常有必要優化接頭成分和長度以使適體最大程度的連接到靶點上。
所有在此引用的專利和刊物都被在此引證而全部合併與本文，就如同每個專利文件和刊物都被分別明確逐個的引證而合併於本文。引用刊物和專利文件並不表明其是現有技術文獻，也不表明對其內容或日期的認可。本發明已通過書面描述的方式進行描述，本領域技術人員將意識到本發明可在多種不同實施方案中實踐。前面的描述和下面的實施例都是用以闡述的而不是對所附權利要求的限制。
實施例實施例1適體篩選和測序實施例1A″rRfY″IgE適體的h-IgE篩選
從人骨髓瘤血漿中純化而來的人IgE(此後為″h-IgE″)，是從雅典技術研究中心(雅典，GA)購買的。表達並純化T7MA聚合酶(Y639F)。2′-F嘧啶核苷和2′-OMe嘌呤嘧啶寡核苷均購自TriLmk BioTechnologies(San Diego，CA)。其他普通反應試劑是商業購買的。使用2′-OH嘌呤和2′-F嘧啶寡核苷酸(rRfY)庫中從中篩選出並鑑定與h-IgE結合的適體。進行針對h-IgE的篩選並生成h-IgE的高親和力適體。
序列庫製備使用ABI EXPEDITETMDNA合成儀合成序列5′-GGGAAAAGCGAATCATACACAAGAN4OGCTCCGCCAGAGACCAACCGAGAA-S′(序列號5)，採用標準方法去保護。模板採用引物5′TAATACGACTCACTATAGGGAAAAGCGAATCATACACAAGA 3′(序列號6)和5′TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC 3′(序列號7)進行擴增，擴增產物作為模板(Y639F)使用T7 MA聚合酶進行體外轉錄。轉錄條件為40mM Tris，40mM DTT，1mM亞精胺，0.002％TritonX-100，4％PEG-8000，12mM MgCl2，3mM 2′-F-CTP，3mM 2′-F-UTP，3mM GTP，3mMATP，0.01units/mL無機核苷酸焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)，和0.5μM左右的模板DNA。
篩選。篩選開始室溫下將2×1014分子的2′-F嘌呤修飾的ARC212序列庫(5′GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA-N40-GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA 3′)(序列號8)和100 pmoles的h-IgE蛋白質在終體積100μL篩選緩衝液中(1X SHMCK20mM Hepes，120mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，pH7.4)培育一小時。MA-蛋白質複合物與未結合MA的分子使用0.45微型硝化纖維旋轉柱(SchleicherSchuell，Keene，NH)來分離開。柱子要提前用1mL IXSHMCK的緩衝液洗滌，然後向柱子中加入含有混合物IgE複合物的溶液洗滌並1500×g離心2分鐘。濾過器用400μL IXSCHMK洗滌兩次以除去非特異結合物(輪，2×400μL IX SHMCK；後面幾輪中，2×500μL IX SCHMK)。加入2×200μL洗滌緩衝液(7M脲，100mM醋酸鈉，3mMEDTA，預熱到95℃)洗滌MA。後面幾輪中，MA用2×100μL洗滌緩衝液洗滌。
洗滌的蛋白質從MA混合物中用苯酚氯仿萃取，沉澱MA庫(2μL肝糖，1體積異丙醇)。使用序列號7的3′引物按照使用說明使用ThermoScript RT-PCRTM(Mvitrogen，Carlsbad，CA)進行MA反轉錄。使用PCR(20mM Tris pH8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM 5′引物(序列號6)，0.5μM 3′引物(序列號7)，0.5mM每種dNTP，0.05units/μL Taq聚合酶(New Engl和Biolabs，Beverly，MA))擴增cDNA。PCR產物使用QIAquick PCR純化儀器(Qiagen，Valencia，CA)進行純化。使用CX32P ATP大量標記在37℃下過夜，轉錄模板(4％PEG-8000，40mM Tris pH8.0，12mM MgCl2，1mM亞精胺，0.002％Triton x-100，3mM 2′OH嘌呤，3mM2′-F CTP和UTP，25mM DTT，無機核苷酸焦磷酸酶，T7MA聚合酶(Y639F)5μCi α32P ATP)。按照說明手冊使用Centrisep柱(Prmceton Separations，Adelphia，NJ)使反應物脫鹽，並用1.5mm的變性聚丙烯醯胺凝膠進行純化(8M尿素，10％丙烯醯胺；19∶1丙烯醯胺∶雙丙烯醯胺)。
隨後的幾輪按照第一輪的方法重複，但增加了在陰性篩選這一步。在培育蛋白質靶點前，MA庫經過0.45微米硝化纖維過濾柱除去與濾過器連接的序列，濾液進入陽性篩選步驟。
在互換輪時，MA庫經凝膠純化。加入50mM EDTA結束轉錄反應，乙醇沉澱，然後使用變性聚丙烯醯胺凝膠進行純化。MA庫經凝膠電泳在Elutrap(Schleicher和Schuell，Keene，NH)裝置中除去，電壓225V在IX TBE(90mM Tris，90mM硼酸0.2mM EDTA)一小時。洗滌的物質通過加入300mM醋酸鈉和2.5體積的乙醇沉澱。
整個篩選中MA濃度要保持高於h-IgE。在開始2輪中蛋白質濃度是1μM，在隨後的輪中降到更低的濃度(表1)。在第四輪中開始將濃度是0.1mg/niL競爭性tMA加入連接反應液中。當篩選進行了10輪後，混合物分成兩份。第11a輪同時進行陽性篩選，混合物與h-IgE的濃度比是10∶1。第11b和12b的MA和h-IgE濃度比是100∶1。這樣做用以增加嚴格性篩選出更高親和力的結合物。表1包含了篩選細節，包括MA混合物的濃度，蛋白質濃度，和每一輪的tMA濃度，所用到的陰性篩選以及在4％瓊脂糖凝膠獲得單一條帶所需要的PCR循環數(Mvitrogen，Carlsbad，CA)，該條帶強度和100bp DNA梯度(-48ng of DNA mass)對照物100bp的條帶強度相同，上樣時按照推薦的使用說明(New Engl和Biolabs，Catalog#N323 IL，Beverly，MA)。
篩選過程通過測定在陽性篩選步驟中從硝化纖維過濾中洗滌出MA混合物的百分比來監測。
表1篩選每一輪所使用(rRfY)的條件
h-IgE結合分析整個篩選中採用斑點雜交試驗來監測序列庫中蛋白質的親和力。微量32P標記的MA庫與h-IgE結合，並在室溫下，在終體積是25μL的1X SHMCK緩衝液和0.1mg/mL tMA中培育30mm。混合物應用於(自上而下)裝有硝化纖維，尼龍和凝膠斑點膜斑點吸印器(Schleicher和Schuell Mmifold-1 Dot Blot，Acrylic)。與蛋白質結合的MA可通過硝化纖維過濾獲得，而未與蛋白質結合的MA則在尼龍上過濾獲得。當觀察到有h-IgE存在時相對於無h-IgE存在時MA結合的陽性比率，依據使用說明使用TOPO TA克隆儀(Mvitrogen，Carlsbad，CA)克隆混合物。克隆和測序11a輪序列庫模板，在1-點斑點雜交(+/-20nM h-IgE)中檢測到8個特異克隆。克隆和測序12b混合物，在1-點斑點雜交(+/-20nM h-IgE)中檢測到與蛋白質結合的4個特異克隆。檢測的每個克隆與20nM h-IgE的結合百分比(背景信號)列於下表最右欄中。下表3列出了這12個克隆的序列。基於1-點斑點雜交，選出幾個克隆確定KD。克隆的轉錄產物5′端標記γ-32P ATP。連接反應是在上述檢測混合物親和力的條件下進行微量32P標記的克隆與h-IgE滴定相結合，並在室溫下終體積是25μL的IX SCHMCK緩衝液和0.1mg/mL tMA中培育30分鐘。使用斑點雜交試驗確定所有特異序列的KD值，這些特異序列在初始檢測中代入公式(amp1.1/(1+KD1/[h-IgE])+amp1.2/(1+KD2/[h-IgE]))+background+/-h-IgE結合比率大於2；其中amp1.1和amp1.2代表兩階段浸潤結構兩相的穩定水平值，KDI和KD2每種產生所得數據作用的解離常數，蛋白質結合特徵的結果製成表2。
表2克隆結合活性


N.T.＝未檢測N.B.＝未觀察到明顯的結合
下表3中給出已經鑑定的rRfY適體的核酸序列。每個適體的特異序列開始於核苷25，後面的序列是GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA(序列號9)一直到與3′固定核苷酸序列GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA(序列號10)。
除非有特別注釋，下面列出的每個序列代表的都是5′到3′方向並在rRfY SELEXTM條件下篩選，其中嘌呤(A和G)是2′-OH，嘧啶(U和C)是2』-氟。在一些實施方案中，發明包含下面表3描述的核酸序列。在另一些實施方案中，表3中描述的適體核酸序列另外還包括3′帽子(即，一個3′反向dT(3T))，和/或一個5′胺(NH2)修飾，以便於化學結合，和/或連接到高分子量非免疫原性組合物(即，PEG)。
表3rRfY適體的序列信息
h-IgE篩選(11a輪)SEQ ID NO 11GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUCGGGUUGAGGCGGAAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 12GGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUCGCGAUAGAUUGCUUGUGAAUGGUUUUGGUGGAAGCGGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 13GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUCGCUAGAUUGCUAGUGUAUGGUUUAUCUAAAGGCGGCCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 14GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGGUCUUACAGAUCCUGUGUAGUGGUUCGAUACAUGCGGGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 15GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUGAGCAUAUCAUUGAGUGUAGUGGUUCCGGAGUAAGUCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 16GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGCACCUUGACUGUGAUUCGCGGGUGUGAGUCGUGCGAAGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 17GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUGCAAGAAGUGCAUUGCUGUGUCUGGUUCUUGGCGAUGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 18GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUCCGAGGGUGGGCAAUAGGCUCACAAGGGUUUCGCGUGAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAAh-IgE 篩選(12b輪)SEQ ID NO 19GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUGCCGAGGCAUUGCUUGGUAUGGUUCCGGUCUUGUCGGGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 20GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUGGUGGUUCGGGUUGAGGCGGAAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 21GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCAGUAAGAUUGAGUGUAUGGUUCCUGGUGGACAAUAAUGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 22GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGAGUGGAGGAGGUAUGUAUGGUUUGUGCGUCUGGUGCGGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA實施例1BdRmY IgE適體的篩選
進行篩選以鑑定含有脫氧-A，G和2′O-甲基C，U殘基的IgE適體(dRmY組合物)。這是直接針對固定於矽化離心板上的h-IgE。這種篩選產生了大量富集於h-IgE粘合物的混合物(相對於未被選擇的混合物)。
序列庫製備使用ABI EXPEDITETMDNA合成儀合成序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN30CGCTGTCGATCGATCGATCGATG-S′(序列號23)，並採用標準方法對其去保護。模板使用5′引物5′GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(序列號24)和3′端引物5′-C ATCGATCGATCGATCGACAGC-S′(序列號25)擴增，並用做轉錄模板使用T7 MA聚合酶(Y639F)體外轉錄。轉錄使用200mM Hepes，40mM DTT，2mM亞精胺，0.01％TritonX-100，10％PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，30μM GTP，2mM mCTP，2mM mUTP，2mM dGTP，2mM dATP，2mM GMP，2mM亞精胺，0.01units/ul無機焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)。
篩選篩選的每一輪都是通過室溫下將20pmoles 100μL在1 XPBS中的h-IgE固定於Nunc Maxisorp(RoChester，NY)矽化離心板表面上一小時引發的。除去上清液並用120μL洗滌緩衝液衝洗五次(1 X PBS，0.1mg/mL tMA和0.1mg/mL ssDNA)。在第一輪中，100 pmoles MA混合物(6×10 unique molecules)在100μL的連接緩衝液(1 X PBS，0.1mg/mL tMA和0.1mg/mL ssDNA)中室溫下培育1小時，連接緩衝液置於含有固定化靶蛋白的孔中。除去上清用120μL洗滌緩衝液將孔洗滌五次。隨後的幾輪中都包含了陰性篩選步驟；MA混合物同樣在室溫下空孔中培育1小時，以在陽性篩選步驟之前從混合物中除去任何可結合的序列。從第3輪開始，要進行第二次陰性篩選以進一步篩選出非特異結合物；混合物於室溫下在之前用100μl封閉緩衝液(1 X PBS，0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL ssDNA和0.1mg/mL BSA)封閉的孔中培育1小時。第3輪以後，在進行陽性篩選前，靶-固定化孔在100μl封閉緩衝液(1 X PBS，0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL ssDNA和0.1mg/mL BSA)室溫下封閉1小時。每種情況下，與固定的h-IgE相結合的MA混合物在加入RT混合物(3′引物(序列號25)和Thermoscript RT，Mvitrogen)並在65℃下培育1小時後直接在篩選板上反轉錄。產生的cDNA用做PCR(Taq polymerase，New Engl和Biolabs)模板。″Hot start″PCR條件和68℃退火溫度用於儘量減少引物二聚體。PCR擴增需要進行的循環數(下表4最後一欄)，以4％瓊脂糖凝膠(Mvitrogen，Carlsbad，CA)獲得單一條帶。上樣時，依照推薦使用說明(New England Biolabs，編目號N3231L，Beverly，MA)，該條帶強度和100 bp DNA梯度(-48 ng of DNA mass)對照物100 bp的甬道的強度相同。依據推薦使用條件，使用Micro Bio-Spm column(Bio-Rad，Hercules，CA)對擴增的混合物模板DNA脫鹽，脫鹽後的模板用於篩選的下一輪MA混合物的轉錄。每一輪的轉錄混合物在10％聚丙烯醯胺上純化。下表4顯示了每一輪dRmY適體篩選所使用的條件表4使用dRmY組合物進行的每輪篩選使用的條件
h-IgE結合分析使用夾層濾過結合試驗來監測篩選進程。5′-32P-標記的MA混合物(微量濃度)與h-IgE，IX PBS加0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL ssDNA和0.1mg/mL BSA室溫下培育30分鐘，並應用於斑點印跡器(Schleicher和Schuell)中硝化纖維和尼龍濾過夾層。在第6和7輪後採用七點檢測法(0.25nM，0.5nM，1nM，4nM，16nM，64nM和128nM h-IgE，也有非靶點控制)後計算MA混合物連接到硝化纖維上的比例。使用上述的蛋白質滴定和斑點印跡器來測量混合物KD測量值。
篩選第6輪後，相對於自然序列庫，dRmY h-IgE富集以與h-IgE連接。在第6和7輪後，序列庫的KD接近於4nM。使用TOPO TA克隆儀(Mvitrogen)克隆第6輪混合物，產生了31個序列。31個序列中8和3是其中的兩個主要代表序列，和21單件。圖6顯示是顯示第6和7輪混合物相對於h-IgE濃度的結合比率圖。
克隆篩選。為了確定KD，23個特異序列的每個克隆轉錄產物都在5′端標記γ-32P ATP。在斑點雜交試驗中(0-300nM h-IgE，3倍連續稀釋)，使用八點檢測來確定KD值，緩衝液條件1X Dulbecco′s PBS；1.0mg/mL tMA；0.1mg/mL被修剪的蛙魚精DNA；和0.1mg/mL BSA。將數據代入公式MA結合比率＝amplitude/(1+KD/[h-IgE])+background估計解離常數(KDs)。在這些結合條件下，23個中有20個特異序列不顯示明顯的結合。與序列號43和序列號46序列一致的克隆顯示解離常數分別為87.7nM和109.7nM。
23個特異克隆隨後在不同的實驗條件下重新測定與h-IgE的結合力。使用標準化學合成方法和加強保護方法來綜合生成克隆。微量5′-32P-標記的適體與人7中濃度逐漸降低的IgE結合，以300nM(3倍稀釋)開始並且無蛋白質樣品在室溫下dPBS(含有Mg++和Ca++)和0.1mg/mL BSA中培養30分鐘。使用如前述的斑點雜交試驗來確定KD值。每個克隆重複三次檢測。對每種蛋白質濃度計算平均結合百分比，代入公式((A+P+K)-sqrt((A+P+K)^2-4*A*P))/2A+B中計算平衡解離常數，其中A代表總適體濃度，P代表總蛋白濃度，B代表背景信號。
在這些檢測條件下，與核酸序列序列號43和序列號46一致的克隆在和h-IgE結合力上顯示出很大的改進。其中23個特異序列中，另有6個克隆在低毫微摩爾範圍內顯示了和h-IgE的高親和力。蛋白質結合特性結果列在表5A中，生成的22個克隆的序列列在下面表5B中。
表5A在dPBS(含有Ca++和Mg++)的0.1mg/mL BSA中dRmY克隆結合活力
表5B中的每個適體的特異序列開始於核苷23，之後的序列為GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(序列號26)，一直到3』固定核酸序列CGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG(序列號27)。
除非有特別注釋，下列出的每個序列都代表5』到3』方向，並在dRmY SELEXTM條件下篩選，其中嘌呤(A和G)是脫氧的，嘧啶(U和C)是2』-氧-甲基化的。在一些實施方案中，發明包括含有下表5B中所描述核酸序列的適體。在另一些實施方案中，含有下表5B中所描述核酸序列的適體的核酸序列還包括了3』帽子(即，3』反向dT(3T))，和/或5』胺(NH2)修飾以便於化學結合，和/或連接到高分子量非免疫原組合物(即，PEG)。
表5B第6輪混合物的特異序列(所有的都是dRmY組合物)SEQ ID NO 28GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAUUAGCAGGGAGGGAGAGUGCGAAGAGGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 29GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACACUCUGGGGACCCGUGGGGGAGUGCAGCAACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 30GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGGUGAGGGUCUACAAUGGAGGGAUGGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 31GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCCGCAGCAUAGCCUGNGGACCCAUGNGGGGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 32GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUGGGGGGCGUGUUCAUUAGCAGCGUCGUGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 33GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCAGCGCAUCUGGGGACCCAAGAGGGGAUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 34GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGGAUGGGUAGUUGGAUGGAAAUGGGAACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 35GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGGUGUAGGGAUAGAGGGGUGUAGGUAACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 36GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGAGUGGAGCUACAGAGAGGGUUAGGGGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 37GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAUGUUGGGAGUGAUAGAAGGAAGGGGAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 38GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUUGGGGUGGAAGGAGUAAGGGAGGUGCUGAUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 39GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGUAUUAGGGGGGAAGGGGAGGAAUAGAUCACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 40GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGGAGAGAGUGUUGAGUGAAGAGGAGGAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 41GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUUGUGCUCCUGGGGCCCAGUGGGGAGCCACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG
SEQ ID NO 42GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGCAGCCCUGGGGCCCGGAGGGGGAUGGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 43GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAGUUCUGGGGACCCAUGGGGGAAGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 44GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCAACGGCAUCCUGGGCCCCACAGGGGAUGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 45GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGUGGAUAGGGAAGAAGGGGAGUAGUCACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 46GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCCGCAGCAUAGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 47GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGUCGCGUGUGGGGGACGGAUGGGUAUUGGUCGCUGUCNAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 48GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGGGUUACGUCGCACGAUACAUGCAUUCAUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 49GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUAGCGAGGAGGGGUUUUCUAUUUUUGCGAUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 50GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAGCAGUUCUGGGGACCCAUGGGGGAAGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG實例1CrRmY h-IgE適體的篩選
進行篩選的目的是鑑定出含有2′-ribo G和A和2』-氧-甲基C和U殘基(rRmY組合物)的h-IgE適體。這是針對固定於疏水板上的h-IgE的直接篩選。相對於天然未經篩選的序列庫，篩選得到了大量富集於h-IgE粘合物的序列庫。
序列庫製備採用ABI EXPEDITETMDNA合成儀合成序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN3OCGCTGTCGATCGATCGATCGATG-S′(序列號51)並用標準方法去保護。使用5′引物5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-S′(序列號52)和3′引物5′-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3′(序列號53)擴增模板，擴增產物用做模板並使用T7 MA聚合酶(Y639F)的體外轉錄。轉錄使用200mM Hepes，40mM DTT，2mM亞精按，.01％ TritonX-100，10％ PEG-8000，5mM MgCl2，1.5mM MnCl2，500μM rGTP，500μM rATP，500μM mCTP，500μM mUTP，500μM GMP，.01 units/μL無機焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)。
篩選。篩選每一輪的開始都是在室溫下於100μL 1X Dulbecco′s PBS中使20pmoles h-IgE固定於Nunc Maxisorp疏水板兩小時。然後除去上清，用120μL洗滌緩衝液(1 X DPBS，0.2％BSA5和.05％Tween-20)衝洗孔MA混合物加熱到90℃ 3分鐘然後冷卻到室溫下復性。在第一輪中要進行陽性篩選。簡言之，1×1014molecules(.2 nmoles)1MA混合物於室溫下在栽有100μL連接緩衝液(1 X DPBS和.05％Tween-20)和經固定化處理蛋白靶點的孔中培育1小時。然後除去上清並用120μL4 X的洗滌緩衝液衝洗。在隨後的每一輪篩選都包括陰性篩選。陽性篩選之前，MA混合物室溫下在空孔中孵化30分鐘以除去混合物中的可結合序列。第4輪之後另增加2個120μl洗滌(總計6×120μl洗滌)來增加嚴格度。在每種情況下，通過增加RT混合液(3′引物(序列號53)和Thermoscript RT，Mvitrogen))並在65℃孵化1小時，與經固定化的h-IgE結合的MA混合物直接在篩選板上進行反轉錄。產生的cDNA用做PCR模板(Taq聚合酶New Engl和Biolabs)。熱啟動PCR並在60℃退火以減少引物二聚體的形成。擴增的混合物模板DNA依照生產商推薦條件，使用Centrisep柱(Prmceton Separations)脫去鹽分並用於篩選下一輪以引導MA混合物的轉錄。每一輪中轉錄混合物在10％聚丙烯醯胺凝膠純化。
下表6顯示了每一輪rRmY篩選混合物用法
使用夾層過濾結合檢驗來監測篩選過程。5′-32P標記的MA混合物在90℃下復性3分鐘，並在室溫下冷卻10分鐘。下一步，MA混合物(微量濃度)室溫下在h-IgE的1×DPBS和0.1mg/mL tMA中培育30分鐘，然後在斑點印跡器中進行硝化纖維和尼龍過濾夾層(Schleicher和Schuell)。計算與硝化纖維結合的MA混合物的百分比並每隔三輪用單點檢測(+/-25OnMh-IgE)來監測。通過使用上述的蛋白滴定和斑點印跡器來測定混合物的KD。
第4輪之後篩選物富集於在天然序列庫上。篩選強度又增加了2次用120μl洗滌，篩選又多進行了兩輪。在第6輪序列庫KD接近於500nM。使用TOPO TA克隆儀(Mvitrogen)對序列庫克隆，並獲得單個克隆。第6輪序列庫包含一個優勢克隆。該克隆的核酸序列與序列號56一致，在測序的24個克隆中佔到71％。使用12點試驗(0-250nM h-IgE 2倍稀釋液)檢測該克隆和複製中出現過的三個克隆與h-IgE的結合情況。雖然這三個複製克隆顯示了比優勢克隆較高的結合力，但是，所有的KDs都接近於500nM。另外獲得了一組96個序列的家族和其他8個在第一序列組不明顯的序列家族，含有核酸序列與序列號56一致的優勢克隆佔這96個序列的40％。對另外特異序列(+/-200nM h-IgE)進行單點試驗。基於單點試驗，使用12點試驗(0-400nM h-IgE，2倍連續稀釋液)對另外24個KDs序列確定KDs。每個克隆的KDs都超過100nM，並且進一步終止這些克隆。表7顯示了篩選rRmy克隆的核苷序列。
每個適體的特異序列都開始於核苷22，後面的序列是GGGAGAGGAGAGAACGUUCUA(序列號54)直到3′固定的核酸序列CGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG(序列號55)為止。
除非另有特別說明，下面列出的每個序列代表的都是5′到3′方向，並在rRmY SELEXTM條件下篩選，其中嘌呤(A和G)和嘧啶(U和C)是2′-OMe。在一些實施方案中，發明包括了含有下表7中所描述核酸序列的適體。在另一些實施方案中表7中所描述適體的核酸序列還包括3′帽子(3′反向dT(3T))，和/或5′胺(NH2)修飾，修飾後便於化學連接，和/或連接到高分子量非免疫原化合物(例如，PEG)。
表7rRmY獨特克隆序列信息SEQ ID NO 56GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAUCUGGGCGAGCCAGUCUGACUGAGGAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 57GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCGGUCGGGUGUGUGGAGGAAGUAGUUCGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 58GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGACGUUAAUGCAGCGGCUAGGGAUGGGCAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 59GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGUGUUGGUAGGGUACGACGAGGCAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 60GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUGAGGGAUAAUACGGGUGGGAUUGUCUUCCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 61GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 62GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAGAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCG
SEQ ID NO 63GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 64GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 65GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGACAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 66GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACNAAAAAGUAUAUGAGAGAAAGGAUUAANAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 67GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAAGGAUUGAGAGAUGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 68GGGAGAGGAGAGCACGUUCUACGAAAAAGAUAUGGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 69GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 70GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAANAAGAUACAUAGUAGAAAGGAUUAAUAAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 71GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGUGUUGGUAGGGUACGACGAGGCAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 72GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCAAAAAUGUGAUGCGAGGUAAUGGAACGCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 73GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGACCUCAGCGAUAGGGGUUGAAACCGACACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 74GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUGGUCGGAUGCUGGGGAGUAGGCAAGGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 75GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGUAUCGGCGAGCGAAGCAUCCGGGAGCGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 76GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGUAUUGGCGCGCGAAGCAUCCGGGAGCGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 77GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUUAUACCUGACGGCCGGAGGCGCAUAGGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 78GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUGGUCGGAUGCUGGGGAGUAGGCAAGGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCG
SEQ ID NO 79GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACACGAGAGUACUGAGGCGCUUGGUACAGAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 80GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGAAGGUAGAAAAAGGAUAGCUGUGAGAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 81GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUGAGGGAUAAUACGGGUGGGAUUGUCUUCCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 82GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUUGAGCGUUGAAGUUGGGGAAGCUCCGAGGCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 83GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCGGAGAUAUACAGCGAGGUAAUGGAACGCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 84GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAGACAGCCCAAUAGCGGCACGGAACUUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 85GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCGGUUGAGGGCUCGCGUGGAAGGGCCAACACGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 86GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUAUCAAUAGACUCUUGACGUUUGGGUUUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 87GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGUGAAGGAAAAGUAAGUGAAGGUGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 88GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAUGAAAUGAGUGUCUGCGAUAGGUUAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 89GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAAGGAAAUGUGUGUCUGCGAUAGGUUAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCG實施例2適體修飾實施例2ArRfY IgE 克隆最小化
儘量使實施例1A中描述的IgE適體最小化，同時保持，優選改善適體的結合親和力。為了鑑定h-IgE結合所必需的核心結構元件，確定了其中幾個高親和力h-IgE粘合物的3′邊界。MA轉錄產物在5′末端以γ-32P ATP和T4多聚核苷酸激酶標記。放射性標記的配體部分鹼水解並在硝化纖維過濾分開之前選擇性的在溶液中連接到h-IgE 500nM。保留的寡核苷酸在8％的變性聚丙烯醯胺凝膠上被分解。最小的寡核苷酸連接到結合到h-IgE定義的3′封端。經過選擇的克隆的3′封端在表8中描述。在邊界實驗和預測摺疊視覺觀測的基礎上，製備部分結構並從整合DNA技術(Coralville，IA)上排序寡核苷酸片段。通過前述的夾層過濾結合試驗可以檢測到核酸序列與序列號11，序列號18和序列號21一致的母克隆的最小化產物顯示了明顯的蛋白質結合力。表8中顯示小型結合數據在，而表9中顯示了相應的序列。
表8小序列結合活性

*所有的測量都是在1X SHMCK和0.1mg/mL tRNA中操作
除非另有特別說明，下面列出的每個序列代表的都是5′到3′方向，並在rRmY SELEXTM條件下篩選，其中嘌呤(A和G)是2′-OH，嘧啶(U和C)是2』-氟。在一些實施方案中，發明包括了含有下表9中所描述核酸的適體。在另一些實施例中表7中所描述適體的核酸序列還包括3′帽子(例如，3′反向dT(3T))和/或5′胺(NH2)修飾，以便於化學連接，和/或連接到高分子量非免疫原組合物(即，PEG)。
表9rRfY最小化適體的序列SEQ ID NO 90GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUSEQ ID NO 91GGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUCCSEQ ID NO 92GGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUSEQ ID NO 93GGAGAUCCGAGGGUGGGCAAUAGGCUCACAAGGGUUUSEQ ID NO 94GGAUCCGAGGGUGGGCAAUAGGCUCACAAGGGUCCSEQ ID NO 95GGAAUCAUACACAAGACGUCAGUAAGAUUGAGUGUAUGGUUCCSEQ ID NO 96 GGAAUCAUACACAAGACGUCAGUAAGAUUGAGUGUAUGGUU實施例2BdRmY IgE克隆最小化
儘量將實施例1B中描述的dRmY IgE適體最小化，同時保持，優選改善適體的結合親和力。在檢測與核酸序列序列號43和序列號46一致的克隆的預測摺疊情況的基礎上，設計了一組最小化的序列。最高親和力的分子，ARC445(序列號101)是一個含有23個核苷並與22 nMKD的h-IgE結合。數據匯總在表10中。表11顯示了ARC441到ARC447(序列號97-103)的核酸序列，源於與核酸序列序列號43和序列號46一致的克隆的部分片段。
表10最小化dRmY h-IgE粘合物

KD測量是在含有0.1mg/mL，1mg/mL tMA和0.1mg/mL ssDNA BSA的IX PBS 25℃中進行30分鐘。
除非另有特別說明，下面列出的每個序列代表的都是5′到3′方向，並在rRmY SELEXTM條件下篩選，其中嘌呤(A和G)是脫氧的，嘧啶(U和C)是2』-氧-甲基嘧啶。在一些實施方案中，發明包括了含有下表11中所描述核酸序列的適體。在另一些實施方案中表7中所描述適體的核酸序列還包括3′帽子(3′反向dT(3T))，和/或5′氨基(NH2)修飾，便於化學連接，和/或連接到高分子量非免疫原組合物(例如，PEG)。
表11與核酸序列序列號43和序列號46一致的克隆部分片段。
SEQ ID NO 97(ARC441)UUCUGGGGACCCAUGGGGGAASEQ ID NO 98(ARC442)GUUCUGGGGACCCAUGGGGGAACSEQ ID NO 99(ARC443)AGUUCUGGGGACCCAUGGGGGAACUSEQ ID NO 100(ARC444)GCCUGGGGACCCAUGGGGGGCSEQ ID NO 101(ARC445)AGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCUSEQ ID NO 102(ARC446)UAGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCUASEQ ID NO 103(ARC447)GCCUGGGGAACCAUGGGGGGC實施例2C摻雜物再篩選ARC445
摻雜物再篩選是用來探究活性克隆或最小化物所必需的序列。摻雜物再篩選中，篩選是在已經合成的並退化的序列庫中進行，序列庫是基於單序列設計的。退化水平在野生型核苷70％到85％的範圍內。總體上，觀測到中性突變體，但在一些情況下序列的變化可引起親和力的改變。組合物序列的信息可用於鑑定最小的結合基序，對適體醫藥化學也有幫助。
基於最小化的h-IgE結合序列ARC445(序列號101)(實施例2B中描述)，使用摻雜物混合物進行篩選以鑑定更高親和力的粘合物。篩選是針對固定於疏水板表面上的h-IgE，並利用促進篩選更高親和力適體的技術，如若干更長洗滌物的混合物(例如，30分鐘，60分鐘，過夜)。
序列庫製備使用ABI EXPEDITETMDNA合成儀合成並用標準方法去保護序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGCCTGGGGACCCATGGGGGGCTGGTCGATCGATCGATCATCGATG-S′(序列號104)。粗體的核苷85％的可能是所指出的殘基，5％的可能是其他三個核苷的一個。模板使用5′引物5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(序列號52)和3′引物5′-CATCGATGATCGATCGATCGACC-3′(序列號105)來擴增，擴增產物作為模板使用T7 MA聚合酶(Y639F)在體外轉錄。轉錄中使用了200mM Hepes，40mM DTT，2mM亞精胺，0.01％TritonX-100，10％ PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，30μM GTP，2mM mCTP，2mM mUTP，2mM dGTP，2mM dATP，2mM GMP，2mM亞精胺，0.01urits/μl無機焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)。
篩選。篩選的每一輪都是室溫下於100μL 1X Dulbecco′s PBS中將20 pmoles h-IgE固定於Nunc Maxisorp疏水板表面上1小時而引發的。然後除去上清，用120μL 1 X DPBS洗滌緩衝液洗孔。加入100μL封閉緩衝液(1 X Dulbecco′s PBS，0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL蛙魚精DNA，和0.1mg/mL BSA)將孔封閉，室溫下培育1小時。然後除去上清，用120μL洗滌緩衝液衝洗孔。在第二輪開始，MA庫需要在在空孔中陰性結合培育1小時，在用BSA封閉的孔中陰性結合培育。通過在100μL的1 X Dulbecco′s PBS中將100 pmoles MA混合物加入到靶孔中進行陽性篩選。再加入0.1mg/mL tMA和0.1mg/mL蛙魚精DNA到陽性選擇中。室溫下培育一小時後除去上清，用表12列出的洗滌緩衝液(1 X DPBS)120μL洗滌孔五次。將第3和4輪篩選的混合物分開增加額外篩選。更長時間的洗滌可增加篩選嚴格度。
使用ThermoScript RT-PCRTM系統(Mvitrogen)，在100μl反應液65度下對MA進行反轉錄30分鐘，使用3』引物與序列號5一致，PCR擴增cDNA，PCR擴增條件20mM Tris pH8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM 5′引物(序列號52)，0.5μM 3′引物(序列號105)，0.5mM每種dNTP，0.05units/μL Taq聚合酶(New Engl和Biolabs)使用PCR循環數(表12最後一欄)需要能在4％瓊脂糖凝膠中獲得一條帶(Mvitrogen，Carlsbad，CA)，按照推薦(-48ng DNA)(New Engl和Biolabs，編目號N3231L，Beverly，MA)使用，上樣時其強度與100bp DNA梯度上100bp標記物相同。PCR產物使用Centrisep Spm柱(Prmceton Separations)進行脫鹽。模板在37度下轉錄過夜，使用200mM Hepes，40mM DTT，2mM亞精胺，0.01％ TritonX-100，10％ PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，30μM GTP，2mM mCTP，2mM mUTP，2mM dGTP，2mM dATP，2mM GMP，2mM亞精胺，0.01units/μl無機焦磷酸鹽，T7聚合酶(Y639F)。隨後幾輪中的MA 10％的聚丙烯醯胺上純化。下表12顯示ARC445(序列號101)摻雜物再篩選方案的總結。
表12.ARC445(序列號101)摻雜物再篩選方案常規條件

開始於第3輪的長洗滌(從第3輪模板中分開)

開始於第4輪的長洗滌(從第4輪模板中分開)
使用TOPO TA克隆儀(Mvitrogen，CarlsbadCA)克隆DNA，這些DNA是在篩選最後一輪不同條件下和在第2和3輪中非嚴格篩選中獲得的。合成篩選出7條序列並使用斑點雜交試驗和實施例1B中敘述的的條件檢測其與h-IgE的特異親和力。檢測的克隆都不顯示和h-IgE的明顯的結合。下表13顯示了來自ARC445摻雜物再篩選的克隆序列。
除非另有特別說明，下面列出的每個序列代表的都是5′到3′方向，並在dRmY SELEXTM條件下篩選，其中嘌呤(A和G)是脫氧嘌呤，所有的嘧啶(U和C)是2』-氧-甲基嘧啶。在一些實施方案中，發明包括了含有下表13中所描述核酸序列的適體。在另一些實施方案中，表13中所描述適體的核酸序列還包括3′帽子(即，3′反向dT(3T))，和/或5′氨基(NH2)修飾，便於化學連接，和/或連接到高分子量非免疫原化合物(如，PEG)。
表13. ARC445摻雜物篩選克隆的序列SEQ ID NO 106 ARC664AGCCUGGGGACCCAUGGGGGCUSEQ ID NO 107 ARC665CGCCUGGGGACCCAGGGGGGGCUSEQ ID NO 108 ARC666AGCCUGGUGGCCCAUGGGGUGCUSEQ ID NO 109 ARC667AGCCUGGGGACCCAUGGGGGGUGGUSEQ ID NO 110 ARC668AGUCUGGGGACAGAUGGAUGGCUSEQ ID NO 111 ARC669AGCUGUGGAGUCGUGUGGGGCUSEQ ID NO 112 ARC670AAGCCUGGGGACCCAUGGGGGGGCU實施例2DDNA IgE適體的摻雜物再篩選
基於h-IgE結合序列D17。45′-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3′(序列號113)(US 5,686,592在此整體併入參考文獻)使用摻雜物序列庫進行篩選以鑑定出更高親和力的粘合物。篩選是針對固定於疏水板表面的h-IgE，使用的技術是用以促進篩選更高親和力適體，如多種不同時間下洗滌的混合物(即30分鐘，60分鐘，過夜)。實驗產生了許多與h-IgE親和力增加的D17.4衍生物。
庫列庫製備含有序列5′gatcccttgttcagtccGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCttaagccacaggactccaaa-3′(序列號114)的DNA模板(ARC273)其中引物結合位點用小寫字母表示，粗體的核苷有85％的可能代表所指出的殘基，有5％的可能表示另外3個核苷中的其中一個。使用ABI EXPEDITETMDNA合成儀合成模板並用標準方法去保護。使用標準條件將混合物採用5』引物5′-GATCCCTTGTTCAGTCCG-3′(序列號115)和3′引物5′-GGAGTCCTGTGGCTTArA-3′(序列號116)(其中rA代表核糖腺苷，可使引物在PCR後分開，將模板和混合物條帶在凝膠上分離)進行擴增。產物進行鹼水解(200mMNaOH，90℃，15mm)並用異丙醇沉澱。在8％的聚丙烯醯胺凝膠分離雙鏈，ssDNA混合物有很低的遷移率，將其從凝膠上割開。
篩選的每一輪都是在室溫下於100μL篩選緩衝液(1 X SCHMK；參見實施例1A)中將20 pmoles h-IgE固定於Nunc Maxisorp疏水板表面上培育1小時而引發。然後除去上清，用120μL洗滌緩衝液(1 X SCHMK，0.2％ BSA和0.5％ Tween-20)衝洗孔四次。加入100μL封閉緩衝液(1 X SHMCK，1％ BSA，0.5％Tween-20)室溫下培育1小時將孔封閉。然後除去上清，用120μL洗滌緩衝液洗滌孔四次。在第一輪中將80pmoles混合物DNA(1.5×1013特異分子)在100μL篩選緩衝液於室溫下在空白孔內培育1小時，作為陰性篩選步驟以除去非特異粘合物。除去上清，在1 X SCHMK中加入12μL of 9.1mg/mL蛙魚精子DNA，混合物轉移到含有靶蛋白的孔內。培育1小時後室溫下除去上清，多次用120μL洗滌緩衝液洗滌孔。下表14顯示了摻雜物再篩選的篩選條件。
表14篩選嚴格度作為每一輪及洗滌的函數
在所有的情況下，連接到經固定化處理的h-IgE的混合物DNA用2×150μL熱洗提緩衝液洗滌(7M Urea，100mM NaOAc pH5，3mM EDTA)，加入異丙醇沉澱，然後PCR擴增。篩選第一輪後洗提的DNA按照上述方法進行擴增並純化。在標準條件下，使用5′和3′引物序列號115和序列號116，進行初始DNA摻雜物序列庫的擴增。第2到4輪，洗提的DNA用5′和3′引物序列號115 5′-(5-biotm-T)(5-biotm-T)(5-biotm-T)GGAGTCCTGTGGCTTAA-3′(序列號117)。PCR產物用苯酚萃取，乙醇沉澱。在5-10μl of IX SCHMK緩衝液中加入300 pmoles中性鏈親和素(Pierce，Rockford，IL)使DNA懸浮，室溫下培育30分鐘，然後加入10μl甲醯胺上載染液，在8％變性的聚丙烯醯胺上分離。整個變性過程中，生物素-中性鏈親和素複合物保持完整，抗過敏DNA鏈的移動性相對於過敏DNA鏈顯著降低。這樣鏈被分開，有比較高的遷移率的目的ssDNA混合物成員，從膠上切下來進入篩選的下一輪。
篩選第三到第五輪後，使用TOPO TA克隆儀(Mvitrogen)和5′和3′引物序列號115和5′-GGAGTCCTGTGGCTTAA-3′(序列號118)(完全未被修飾的DNA)對混合物模板進行在擴增t，生成了84個序列。每個製備克隆無引物結合序列，並使用建立的斑點雜交試驗和前面實施例1A中的條件檢測克隆與5和50nM h-IgE的結合。和初始監測中下列序列號核酸序列一致的克隆未顯示與h-IgE結合序列號125，序列號137和序列號138。使用滴定h-IgE(30pM至30nM，3倍稀釋)(表15)，確定KDs以鑑定在初始監測中最好的結合物。其中幾個克隆與母序列相比顯示了經改善的結合力D17.4(序列號113)。含有核酸序列序列號140的克隆相對於母序列D17.4(序列號113)在親和力方面顯示出最大程度的改善。有趣的是含有序列序列號140的克隆和克隆D17.4(序列號113)之間的差別很微弱。變化包括含有核酸序列序列號140的克隆在已提出的Watson/Crick骨架直接接近於D17.4適體(序列號113)的環形區。幾乎所有再篩選中(包括含有核酸序列與序列號140一致的克隆)獲得的特異克隆都在D17.4的G8-C30鹼基對上獲得了突變變成了A8-T30或C8-G30，有效的改變了螺旋鏈大溝中出現的功能基團，該功能基團位於鹼基對G8-C30的5′-鏈-羰基/3′-鏈-氨基和鹼基對A8-T30與C8-G30 5′-鏈-氨基/3′-鏈-羰基之間。親和力最大的克隆(除了與序列SEQ DD NO 140一致的克隆)根據其自身的環序列(殘基9-29)重新設計，並基於與核酸序列號140(殘基1-8和30-37)序列一致的克隆的骨架對其進行優化。在序列號140優化的骨架上將錯配的C4-C34轉化成G4-C34。下表15顯示了核苷長度和被選擇DNA適體的親和力。表16顯示了被選擇DNA適體的核苷序列。
Table 15被選擇DNA適體的長度和連接親和力
下面描述的DNA適體中，所有的核苷(A，T，C和G)都是脫氧的。除非有特殊注釋，每個序列代表的的都是5′到3′方向。在一些實施方案中，發明包括含有表16所描述的核酸序列的適體。在另一些實施方案中，表16中描述的適體的核酸序列還包括了增加了3′帽子(即，3′反向dT(3T))和5′端氨基修飾，便於化學連接和/或連接到一個高分子量非免疫原性的組合物上(如PEG)。
表16 DNA h-IgE摻雜物再選擇適體序列信息(列出的克隆序列不包含引物區域)SEQ ID NO 113 D17.4GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCSEQ ID NO 119GGGGCACATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGTTGTGCCCCSEQ ID NO 120 GGGGTACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 121 GGGGTACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTACCCCSEQ ID NO 122 GGGGCAAATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGTTTGCCCCSEQ ID NO 123 GGGGCATATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGTATGCCCCSEQ ID NO 124 GGGGCACATTTATCCGTTCCTCCTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 125GGGGTACATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 126GGGGCATGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 127 GGGGCAACTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGGTTGCCCSEQ ID NO 128GGGGCACATTCATCCGTCCCTCCTAGTGGTGTGCTCC
SEQ ID NO 129GGGGTACCTTGATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 130GGGGCATGTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 131GGGGCAGCTTTATCCGTTCTCCTAGTGGGCTGCCTCSEQ ID NO 132GGGGTACCTTTATCCGTTTCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 133 GGGGTATGTTGATCCGTCCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 134 GGGGCATGTTCATCCGTTCCTCCTAGTGGCGTGCCCCSEQ ID NO 135GGGACACATTTATCCGTTACTCTTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 136 GGGGCACATTTATCCGTTACTCTTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 137GGGGCACGTTTACAGTCCCTCCTATCGCCTCCCSEQ ID NO 138GGGGCACGTTTACAGTCCCTCCTTATCGCCTCCCSEQ ID NO 139 GGGCAACTTTATCCGTTCCTCTTAGTGGGTTGCCCCSEQ ID NO 140 GGGCTACTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 141GGCACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 142 GGGGCACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 143 GGGCACATTCATCCGTTCCTCCTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 144 GGCACCTTTATCCGTTCCTTCTAGTGGGGTGCCCSEQ ID NO 145 CGGCACCTTTATCCGTTACTCTTAGTGNGGTGCCCCSEQ ID NO 146 GGCACCTTGATCCGTTCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 147 GCGGGCAAATTCATCCGTCCCTCCTAGTGGTTTGCCCSEQ ID NO 148GGGCACTTTATCCGTTCCTTCTAGTGGGTGTCCCSEQ ID NO 149GGCGGCAGCTTTATCCGTACCTCCCAGTGGGCTGCTCCSEQ ID NO 150 ARC474GGGGCAGCTTTATCCGTACCTCCCAGTGGGCTGCCCCSEQ ID NO 151 ARC475 GGGGCTACTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 152 ARC476GGGGCTACTTTATCCGTACCTCCCAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 153 ARC477 GGGGCTACTTGATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 154 ARC478 GGGGCTACTTCATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCC
SEQ ID NO 155 ARC479 GGGGCTACTTTATCCGTTCCTCTTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 156 ARC480 GGGGCTACTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 157 ARC656GGGGCTACTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGGTAGCCCC-3T實施例2用以增加血漿中穩定性和體外親和力的ARC445適體醫藥化學
通過系統合成方法包括適體合成多相，純化和結合活力檢測而鑑定出ARC445(序列號101)的一個高度穩定和有效的變異體。修飾，比如用含有2』-O-甲基殘基置換含有2′-脫氧殘基的系統置換法是一種用於顯著增加血漿核酸酶抵抗力和總穩定性的基本方法。
在生成ARC445(序列號101)的克隆監測和最小化過程中，適體的相對結合能力(前面述的斑點雜交試驗得到)，ELISA，FACS，組氨酸釋放試驗(下實施例3描述)都非常一致。因此，大多數的實驗衍生物都檢測了和h-IgE結合的親和力，並用來表示相對結合能力。使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，5′末端標記的γ-P ATP，來純化化學合成的適體，以確定KD。並測試這些化學合成適體與人h-IgE的直接結合情況。8點蛋白滴度用於前述的斑點雜交結合試驗(即{100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，0pM}或{10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，10pM，0pM})在含有0.1mg/ml BSAD的Dulbecco′s PBS(含有Mg++和Ca++)中室溫下半小時。使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)通過代入公式y＝(max/(1+K/protem))+ymt來計算KD值。下面表17中列入合成的，純化的，檢測的與h-IgE結合的ARC445衍生物的序列以及蛋白結合特性。
用2′-O甲基殘基替換脫氧殘基過程的第一步是合成和檢測ARC 1250-ARC 1264(序列號158-172)的結合活力，其中每個都與增加了3′-反向-dT(3T)和用2′-O-甲基殘基替換了2′-脫氧殘基的ARC445結合活性相當。從表17中的結合數據可以看出，一些位置容易容受2′-O-甲基殘基替換脫氧殘基，而另一些位置則不是。有趣的是，在位點10(ARC1256)(序列號164)以2′-O-甲基殘基替換2′-脫氧殘基顯著改善親和力。
基於適體醫藥化學過程相1產生的結構活性關係結果，我們設計，合成，純化又一系列的適體，並檢測與h-IgE的結合。對這些分子和所有衍生分子，親和力(KD)＜1nM的分子或更好的分子用於進一步的適體設計策略中。在產生ARC1332-ARC1337(序列號173-178)的相2中，只使用2′-O-甲基替換法，相1中的數據用於設計更高級修飾的組合物分子。加入了含有聯接的穩定化處理的硫代磷酸酯的適體也被檢測。這些之中簡單親和力最佳的是ARC1335(序列號176)。
在適體醫藥化學過程的相3(ARC1382-ARC1384，序列號179-181)和相4(ARC1572-1573，序列號182-183)中，在ARC1335(序列號176)中進一步檢測硫代磷酸酯修飾作用。ARC1384(序列號181)是這有限適體中能打破了硫代磷酸酯的平均數目與最大親和力之間的平衡的一個分子(參見圖7)。
ARC445和其衍生物的合成過程中，在離子交換高效能液體色譜中觀察到的峰與ARC445多亞基聚合體一致。圖8是ARC445和幾個衍生物高效能液體色譜微量分析的實施例，由於適體的集合顯示多重峰。ARC445在位置6-9和16-21包含了2串鳥苷殘基。儘管不受任何理論的約束，這2串中的任何一個或兩者都可能引起適體集合。根據報導，以基本同樣的方式，結合了雙鏈MA和DNA溴化乙啶螢光性就增加了，結合了G-四連體(G-quartet)結構後N-甲基中卟啉IX(NMM)螢光性也增加。(Arthanari等人，Nucleic Acids Research，26(16)3724(1996)；Marathais等人，Nucleic Acids Research，28(9)1969(2000)；Joyce等人，Applied Spectroscopy，58(7)831(2004))。如圖9中顯示，我們使用NMM螢光性建立了理論ARC445實際上採用了G-quarte結構。根據文獻方案，使用SpectraMaX Gemmi XS螢光板閱讀器分析了含有大約1微摩爾NMM100微升反應物和含有鎂和鈣的Dulbecco′s PBS中大約2微摩爾的適體。收集550到750nm和405nm波長刺激下的螢光發散色譜。抗凝血酶DNA適體ARC183的G-quartet結構已經在文獻(Macaya等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，903745(1993))中建立起來，因此在本實驗中可作為陽性對照(圖10)。圖10顯示了與ARC445大小相似核苷成分相似適體並沒有被預測含有G-quartet結構，因此在本實驗中用做陰性對照(圖10)。從圖9和10可以看出，相對於NMM單獨作用相比，ARC183和ARC445的NMM螢光性明顯增加，而ARCl 346則沒有增加。
除了用dG類似物取代dG並監測在NMM螢光試驗中的″G-四連體″最小化之外，還用斑點雜交試驗在前敘述的結合反應條件(Dulbeccos PBS(含有Ca++″和Mg++)加0.1mg/mL BSA室溫下30分鐘)檢驗dG類似物是否改善了與h-IgE的親和力以及對h-IgE的作用。第一個測試的類似物是脫氧-7-脫氮G。在嘌呤基第七位的氮被碳取代，G-四連體中G∶G配對所需要的氫鍵受體被有效的除去。在相5.1(序列號184-201)中ARC445每個G都被7-脫氮G取代。從圖8和9中可以看出，HPLC和NMM螢光中觀測到，位置18-20(ARC909-911，序列號191-193)去掉G N-7之後則完全除去了通過HPLC中觀察到的適體集合。這些取代也完全除去了與h-IgE的結合，如圖11所顯示的結合曲線已經表明這點(參見表17中報導的KD值)。在HPLC中也觀察到ARC912(序列號194)適體集合也顯著減少，並保留了一定程度上與h-IgE的結合。基於ARC912(序列號194)的結合結果和其HPLC，位置3∶21的mC∶dG配對被另一個Watson/Crick配對鹼基所取代，以減少多亞基集合。該配對在位置21上沒有dG。在ARC1244-ARC1249(序列號195-200)中都進行了這樣的操作，但是沒有產生親和力和ARC445(序列號101)相當的任何適體。因此這種修飾作為ARC445修飾方式被放棄。
儘管並不希望受到理論上的限制，用7-脫氮-G取代dG的試驗提出了一種觀點16到21位較長的G-序列串可能是引起集合現象的原因，測試的許多殘基的N-7位是與h-IgE高親和力結合所必需的，通過直接的氫鍵相互作用或通過和適體中其他殘基的相互作用，促進適體的功能性摺疊。
在適體醫藥化學過程(序列號201-211)的相5.2中，在含有ARCl 335(序列號176)的適體下，dG被脫氧次黃嘌呤所取代。由於脫氧次黃嘌呤缺乏脫氧鳥苷裡發現的環外胺基酸，單個氨基和N7之間的氫鍵從每個dG被替換成dI的G-四聚體中去除掉。ARCs 1548，1552-1555和1562-1567(序列分別是相應的序列號201-211)的結合試驗揭示了dG被替換成dI的SAR關係，幾乎與dG替換成7-脫氮-G的關係相反。在dI系列中位置6-9上不能容受取代，而在位置16-21上則能不同程度的容受。
相5.2的結果導致了在ARC1384條件下對含有多個dG替換為dI取代的組合物分子的設計。5.3(序列號212-219)的結果產生了大量的適體，這些適體相對於ARC445(序列號101)和ARC1384(序列號181)明顯的改進了親和力。例如，圖12描述，通過NMM螢光試驗檢測到ARC1666(序列號216)明顯減少了G-四聚體的形成。
在一些實施方案中，發明包含了含有表17描述核酸序列的適體。在一些實施方案中，還包括含有表17描述適體的核酸序列的3′帽子，{如反向dT帽子(3T))，和/或5′氨基(NH2)修飾，而表17中沒有這些修飾，以便於化學結合或連接到高分子量非免疫原組合物(即，PEG)上。在另一些實施方案中，表17描述的核酸序列沒有所表示的3′帽子(即，3′反向dT帽子(3T))。小寫字母「f』，″m″，和″d″分別表示2』-氟，2-O-甲基和脫氧修飾，″s″表示一個核苷間硫代磷酸取代，″I″表示次黃嘌呤取代鳥苷。
表17ARC445被修飾的衍生物的序列和結合親和力




實施例2FARC656適體醫藥化學
通過系統合成方法，包括適體的多相合成，純化和結合活性分析，來識別高穩定性高潛力的ARC656變異體(序列號157)(如實施例2D所描述)。用含有殘基的2』-O-甲基置換含有殘基的2′-脫氧的系統置換法是一種用於顯著增加血漿核酸酶抵抗力和總穩定性的基本方法。
在生成ARC656(序列號157)的克隆監測和最小化過程中，適體的的相對結合能力(如前面描述的斑點雜交實驗測量)，ELISA，FACS，組氨酸釋放試驗(下實施例3描述)都非常一致。因此，使用斑點雜交結合試驗檢測實驗變異體與h-IgE的結合親和力的實驗用來表徵大多數合成適體的相對能力。化學合成適體使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳進行純化，5′末端標記的γ-32P ATP，測試其對全人h-IgE的直接結合力以確定KD。在前述的斑點雜交試驗在Dulbecco′s含有0.1mg/ml BSA的PBS(含有Mg++和Ca++)中使用到8點蛋白質滴度{30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，0pM}。使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)代入公式y＝(max/(1+K/protem))+ymt來計算KD值。下面表18列出了合成的，純化的，以及與h-IgE結合的ARC445衍生物序列，以及蛋白質結合特性結果。
用2』-O-甲基包含殘基替換脫氧包含殘基過程的第一步是合成和檢測ARC1265-ARC1306(序列號220-261)的結合活性，其中每個都與增加用2』-O-甲基殘基替換脫氧殘基的ARC656結合活性相當。從表18中的結合數據可以看出，一些位置容易容受2』-O-甲基殘基替換脫氧殘基，而另一些則不是。被提出的ARC656骨架區最能容受2』-O-甲基殘基替換脫氧殘基。另外，相一還包括在適體骨架區阻斷脫氧殘基被2』-O-甲基殘基取代。
基於適體醫藥化學設計的相1結構活性關係結果，設計，合成，純化又一系列的適體，並檢測與h-IgE結合情況。對添加了含有聯接(ARC1391(序列號266)和ARC1417(序列號292))的穩定硫代磷酸之後的適體也進行了檢測。這些之中在簡單親和力方面最好的是ARC1410(序列號285)。儘管許多測驗的許多構造物都保留了相對高的與h-IgE的親和力(這一點是非常清晰的)，但是幾乎沒有保留和母組合物ARC656(序列號157)相當的親和力。
在一些實施方案中，發明包括了含有下表18描述核酸序列的適體。在一些實施方案中，表18描述適體的核酸序列還包括3′帽子(3′反向的dT帽子(3T))，和/或5′氨基(NH2)修飾，以便於化學結合或連接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上，而表18描述的核酸序列則缺少這種修飾。在另一些實施方案，表18描述的核酸序列沒有所表示的3′帽子(即，3′反向dT帽子(3T))。核苷縮寫A，C，G，或T之前的小寫字母″f′，m″，和″d″分別表示2』-氟，2-O-甲基和脫氧修飾，″s″表示核苷間硫代磷酸取代。
表18修飾衍生物ACR656的序列和結合親和力




實施例2G適體-5′-PEG連接體的合成
在AKTA OligoPilot 100合成儀上(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，依照推薦使用程序使用標準的購買的2，-氧-甲基MA，脫氧次黃嘌呤和DNA亞磷醯胺(Glen Research，Sterlmg，VA)和反向脫氧胸腺嘧啶CPG支持合成寡核苷酸5′NH2 mA mG mC mC mU dG mG dG-s-dG mA mC mC mCmA mU-s-dI-s-mG dI-s-dG dI-s-dG mC mU-idT 3′(ARC 1666，序列號216)。末端氨基官能團與5′-氨基-修飾C6-TFA (Glen Research，Sterlmg，VA)連接。去保護之後，寡核苷酸經離子交換色譜Super Q 5PW(30)樹脂(Tosoh Biosciences)進行純化，並用乙醇沉澱。
合成之後將5′氨基修飾適體組分連接到不同的PEG基團上(如40kDa，60kDa PEG基團)。適體溶解於水/DMSO(1∶1)溶液中，濃度在1.5到3mM之間。加入碳酸鈉緩衝液，pH8.5，直到終濃度是100mM，只有少數分子與1.7-3倍於目的PEG試劑的分子發生反應(即，40 kDa Sunbright GL2-400NP p-硝基苯碳酸酯[NOF Corp，Japan]，40kDa或60kDa mPEG2-NHS酯[Nektar，Huntsville AL])，目的PEG試劑溶解於等體積的乙腈。產生的40kDa或60kDa PEG化產物在離子交換色譜Super Q 5PW(30)resm(Tosoh Biosciences)上純化，使用反相色譜Amberchrom CG300-S resm(Rohm和Haas)上脫鹽，並冷凍幹。
產生的PEG化適體序列列於下表19中。小寫字母「f」，″m″，和″d″分別表示2』-氟，2-O-甲基和脫氧修飾，″s″表示核苷間磷酸取代，″I″表示次黃嘌呤取代鳥苷，″NH″表示便於化學連接的氨基，″3T″表示3′反向dT。
表19抗IgE適體ARC1666的5′PEG連接體ARC1787(SEQ ID NO 293)40K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3TARC1788(SEQ ID NO 294)60K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T
5′PEG化產物對適體功能幾乎沒有作用，這是通過下面實施例3描述的基於細胞的檢測測量到的。
實施例2H適體-3′-5′-PEG連接體的合成
依照推薦使用程序採用標準購買的2』-氧-甲基MA，脫氧次黃嘌呤和DNA裡的磷酸(Glen Research，Sterlmg，VA)和3′-酞亞胺-氨基-修飾C6 CPG支持在AKTA OligoPilot100合成儀中(GE Healthcare Uppsala，Sweden)合成寡核苷酸5′NH2 mA mG mC mC mU dG mG dG-s-dG mA mC mC mC mA mU-s-dI-s-mG dI-s-dG dI-s-dG mC mU-NH23′(ARC1784，序列號297)。末端胺基酸官能團與5′-氨基-修飾基C6-TFA(Glen Research，Sterlmg，VA)相連接。去保護之後，寡核苷酸經離子交換色譜Super Q 5PW(30)resm(Tosoh Biosciences)和乙醇沉澱進而純化。
合成後將3′-5′-二氨基修飾適體組分連接到不同的PEG基團上(20kDa和30kDa PEG基團)。將1.5和3mM的適體溶解於水/DMSO(1∶1)的溶液中。加入碳酸鈉緩衝液，pH8.5，直到終濃度是100mM，只有少量與2.7-3.5倍於目的PEG試劑的分子(e.g.，20kDa or 30kDa Sunbright GL2-400NP p-硝基苯碳酸酯[NOF Corp，Japan])反應過夜，目的PEG試劑溶解於等體積的乙腈。產生的2×20kDa或2×30kDa PEG化的產物在Super Q 5PW(30)resm(Tosoh Biosciences)在離子交換色譜上純化，使用反相色譜Amberchrom CG300-S樹脂(Rohm和Haas)上除去鹽分，並冷凍幹。
產生的雙PEG化適體序列列於下表20中。小寫字母「f」，″m″，和″d″分別表示2』-氟，2-O-甲基和脫氧修飾，″s″表示核苷間硫代磷酸取代，″I″表示次黃嘌呤取代鳥苷，″NH″表示便於化學連接的氨基。
表20抗IgE適體ARC 1666的3′-5′-PEG連接體ARC 1785 (SEQ ID NO 295)PEG20K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmGmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-NH-PEG20KARC1790(SEQ ID NO 296)PEG30K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-NH-PEG30K
3′-5′PEG化對適體功能有很少的影響或沒有影響，下實施例3描述的基於細胞實驗的檢測到這一結果。
實施例3功能性細胞試驗實施例3A受體(FcεR1)結合抑制ELISA
採用ELISA試驗測試一組rRfY IgE適體(實施例IA所描述)抑制h-IgE和可溶的單節顯性的FcεR1α(室內純化)形成複合物的能力。IX PBS中的FcεR1(100μL，10μg/mL)在Nunc Maxisorb 96孔板中的孔中4℃培育過夜，以使其吸附於孔表面。除去上清，用120μl IX PBS溶液洗滌孔三次，並用300mL IX PBS和0.2％Tween-20在4℃下封閉孔兩小時。封閉之後用IX PBS洗滌孔三次。不同濃度的適體緊接著與0.5nM h-IgE在100μL PBS和0.05％Tween-20中室溫下培育30分鐘，然後將混合液加入到檢驗孔中並在室溫下培育一小時。用120μL IX PBS洗滌孔五次。通過加入HRP標記的抗h-IgE多克隆抗體(羊抗人IgE-HRP(074-1004)(KPL，Gaithersburg，MD))來檢測結合的h-IgE。每個孔中加入100μl Quantablue substrate(Pierce，Rockford，IL)並在室溫下培育15分鐘。再向每孔中加入100μl提供的終止溶液。板使用SpectraMax 96孔板閱讀器分別325nm和420nm的刺激/發散下閱讀。每個孔的相對螢光單位(RFU)用來計算IC50。下表21顯示計算出的IC50，表示rRfY篩選的不同適體對FcεRIα受體的抑制。
表21受體(FcεR1)結合抑制-rRfY適體

實施例3BFACS抑制受體(FcεR1)結合
檢測一組代表rRfY，dRmY和DNA組合物的適體抑制h-IgE結合FcεR1的能力，FcεR1在鼠嗜鹼性白血病(RBL)細胞表面表達。SX38細胞是RBL細胞系(Harvard University，Cambridge，MA)能穩定的表達h-IgE受體α，β和γ鏈，用於流式血細胞h-IgE結合試驗。細胞在含有16％胎兒牛血清(FBS)和1mg/mL G418(Mvitrogen)的低限量Eagle培養基(MEM)在37度5％CO2的條件下培養。SX38細胞在含有1％BSA(Sigma，St.Louis，MO)和0.03％NaAzide(FACs buffer)(VWR，WestChester，PA)的1 X DPBS中，一百萬個細胞被96孔板板上一個合適的孔數目整除，並在冰上培育30分鐘。每種濃度的適體和h-IgE(Athens Research和Technology，Athens，GA)的2X混合液在冰上孵化30分鐘。適體與h-IgE的混合物加入到SX38細胞中以獲得IX終濃度，並在冰上再培育30分鐘。在3μg/mLh-IgE(15nM)下檢測終濃度範圍在0-1μM中的適體。然後用FACs洗滌細胞3X以除去沒有與受體結合的h-IgE。為了檢測h-IgE結合，抗h-IgE-FITC抗體(QED Biosciences，San Diego，CA)加入到細胞，並在冰上培育30分鐘。培育後，細胞用FACs緩衝液洗滌3次以除去未結合的抗體。細胞在FACs緩衝液中懸浮並用FACSCAN(BD Biosciences，San Jose，CA)分析。h-IgE單獨和h-IgE自然混合物被分別包括入陰性對照和陽性對照。通過計算h-IgE與細胞結合的抑制百分比來測定h-IgE適體活性。平均螢光強度值用來計算抑制百分比。表22顯示了通過FACS試驗計算的被選擇的各種rRfY，dRmY和DNA克隆的IC50。
表22FACS試驗rRfY，dRmY，DNA克隆受體(FceR1)結合抑制

*idT相同序列3』端是含有反向dT殘基的le 3』-endN.D.未確定
使用上述FACS試驗和下列的修飾對ARC 445(序列號101)(在實施例2E中描述)和ARC 656(序列號157)(實施例2D中描述)的幾個修飾衍生物進行試驗檢測其h-IgE受體(FceR1)的結合抑制。對每種適體濃度，適體和h-IgE(Athens Research and Technology，Athens，GA)2X的混合物在冰上培育30分鐘；適體和h-IgE的混合物加入SX38細胞中，終濃度是IX，在冰上再培育2小時；在0.5μg/mL h-IgE(2.5nM)下檢測0-1μM之間的終適體濃度。計算的IC50值總結在表23中。
表23ARC445經修飾的衍生物；FACS試驗ARC656受體(FceR1)結合抑制
在實施例2G和2H中描述的與PEG連接的適體在下列條件下FACS試驗中都是有活性的。計算的IC50值概括在下表24中。從表24的數據可以看出，不同類型的PEG連接體對適體的功能幾乎不起作用。
表24

實施例3C適體與獼猴IgE的交叉反應
採用ELISA檢測來測試適體抑制獼猴IgE和FcεR1α-Fc聯合體形成的能力。1 X PBS中的FcεR1α-Fc(100mL，5μg/mL)在Nunc Maxisorb 96孔板中的孔中4℃培育過夜以吸附於表面。除去上清，用120μl 1 X PBS洗滌孔三次並用300mL 1X PBS和0.2％Tween-20度兩小時封閉孔。用120μL 1 X PBS洗滌孔。不同濃度的適體緊接著在含0.5ng h-IgE的100μL PBS(或獼猴血清(Sigma)同樣稀釋到10％)室溫下培育30分鐘，然後將混合液加入到檢驗孔中並在室溫下培育一小時。用120μL 1 X PBS洗滌孔五次。通過加入HRP標記的抗-h-IgE多克隆抗體(羊抗IgE-HRP(074-1004)(KPL，Gaithersburg，MD))來檢測結合的h-IgE。使用Quantablue底物(Pierce，Rockford，IL)來檢測過氧化物酶活性。每孔中加入100μl過氧化物酶底物並在室溫下培育15分鐘。在向每孔中加入100μl提供的終止溶液，分別在325nm和420nm刺激/發散下使用SpectraMax 96孔板閱讀器進行閱讀。每孔的相對螢光單位(RFU)用來計算IC50′s。
具有核酸序列為序列號149(含有3′反向脫氧胸腺嘧啶)和序列號151(3′-3′反向脫氧胸腺嘧啶)的DNA適體和與核酸序列為序列號90和序列號93的rRfY適體分別在250nM和1μM濃度下，並沒有抑制猴子結合到FcεR1-Fc上，而核酸序列ARC445(序列號101)和ARC1666(序列號216)的dRm 適體則很可能阻斷相互作用(ARC445，猴IC50＝161nM；人IC50＝63nM；ARC1666，猴IC50＝8nM；人IC50＝5nM)，表明該分子與獼猴IgE和人IgE發生交叉反應。另外的對照實驗顯示該檢測模式下ARC445並不抑制猴IgE的檢測。
圖13顯示了rRfY，dRmY和DNA最小化適體可能的二級結構。FACS試驗表明DNA最小化適體阻斷IgEFcεR1結合的可能最大。左序列號91(rRfY)，列出的殘基是2′-F；中間ARC445(序列號101)(dRmY)，下劃線的殘基是2′-脫氧，列出的殘基是2′-OMe；右ARC475(序列號151)(DNA)，下劃線殘基2′-脫氧。
實施例3D組氨酸釋放抑制
基於IgE適體細胞活性通過使用組氨酸釋放化驗SX38細胞(Dana Farber Cancer Mstitute，Boston，MA)來測驗。SX38細胞是能穩定表達人h-IgE受體α，β，和γ鏈的RBL細胞系。由於含有h-IgE和抗-h-IgE交叉連接抗體的SX38細胞上清液含有比適體受阻斷細胞更多的組氨酸，使用競爭性組氨酸ELISA(Immuno-Biological Laboratories，Mmneapolis，MN)來定量釋放入h-IgE和h-IgE交叉連接抗體+/-IgE適體處理過的SX38細胞上清液中的組氨酸。
實驗前一天在24孔板上每個含有MEM和16％FBS孔中都鋪入(200,000)SX38細胞。第二天，適宜濃度的適體(1μM開始2倍稀釋系溶液8點滴定)和3ug/mL h-IgE(AthensResearch and Technology，Athens，GA)在MEM和16％FBS中培育30分鐘。然後將混合液加入到SX38細胞中在37℃，5％CO2中培育30分鐘。每種濃度都檢測四分之一。使用MEM和16％FBS洗滌細胞三次，然後再在MEM加16％FBS中再培育5.5小時。h-IgE交叉連接抗體(QED Biosciences，San Diego，CA)加入到1ug/mL濃度的細胞培養基上再培育2小時。在組氨酸ELISA使用前收集上清在-20℃冷凍。組氨酸ELISA按照使用推薦用法。單獨h-IgE和h-IgE相對於天然混合物被分別作為陽性和陰性對照。通過測定組氨酸釋放入上清的抑制百分比來測定IgE適體活性，如圖14顯示(其中ARC445是序列號101，ARC656是序列號157，ARC714是非結合陰性對照)。
ARC445(序列號101)(實施例2E描述)和DNA適體，ARC656(序列號157)(實施例2D描述)中幾個修飾衍生物也被用來測驗其抑制上述SX38細胞組氨酸釋放的能力，測量得到ARC445衍生物的IC50概括在表25中。
表25ARC445修飾衍生物；ARC656SX38細胞中組氨酸釋放抑制

實施例4PK研究
實施例4中，所有基於質量的濃度數據只是指適體寡聚核苷酸部分的分子質量，與PEG連接體的質量無關。
實施例4A抗IgE適體血漿穩定性
檢測適體醫藥化學過程中鑑定的一組適體在人和鼠血漿中核酸酶穩定性。在下述變性聚丙烯醯胺凝膠電泳上來測定血漿核酸酶降解。簡單的說，使用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳來純化化學合成的適體，5′末端標記γ-32P ATP，然後凝膠純化，以測定血漿穩定性。微量的32-P標記適體在中含有100nM未標記適體95％人血漿(或95％鼠血漿)200微升連接反應中培育。時間零點的反應單獨分出來，用的是成分相同的PBS而不是血漿。這保證了實驗中凝膠上的量或放射能一致。除非另有特別說明，反應液在37℃熱循環儀中培育1，3，10，30和100個小時。在每個時間點上，除去20微升的反應液，與200微升甲醯胺上載染料一起在液氮中速凍並保存於-20℃。最後一點取完之後，取出凍結的樣品並從每個時間點上除去20微升。加入SDS到小量樣品中直到終濃度是0.1％。樣品然後在90℃培育10-15分鐘，並直接載入15％變性聚丙烯醯胺凝膠上在12W跑電泳35分鐘。使用Storm 860 phosphoroimager系統(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)來定量凝膠上的放射能。量化0小時時間點全長適體條帶並用甬道數目整除，從而確定每點上全長適體的百分比。每個時間點上的全長適體百分數然後規範化到0小時時間點全長適體百分比。適體全長百分數與每個時間上功能的關係符合公式ml*e^(-m2*m0)其中ml是適體全長最大％(ml＝100)；m2是降解率。
適體半衰期(T1/2)與(ln2)/m2相等。
圖15a和15b顯示了樣品數據，檢驗是的結果總結在表26中。與我們預期的一致，適體在人血漿中比在鼠血漿中穩定，糖磷酸鹽骨架中增加穩定化處理的修飾的數目與增加血漿穩定性有關。
表26ARC445和ARC656衍生物血漿穩定性

實施例4B鼠IV給藥10mg/kg後抗IgE適體相對於PEG化產物ARC1785，ARC1787，ARC1788，和ARC1790的藥代動力學
圖16顯示了對鼠科靜脈給藥ARC1785，ARC1787，ARC1788和ARC1790藥代動力學研究。簡單的說，本研究由三組組成(總計33個動物)。在每個樣品採集時間點上，處死三個動物，通過心臟的小孔採集到0.5mL全血收集血漿。用標準0.9％鹽將凍幹的粉末適體配製成終濃度是10mg/mL(寡核苷酸濃度)的注射試劑，並在給藥前滅菌過濾。給藥方案是單靜脈藥丸注射，劑量是10mg/kg。在指定的時間點上，t＝給藥前，0.08，0.5，1，2，4，8，16，24，32，48，和72小時獲得全血樣品並直接轉移到K2EDTA吸附的試管中，反向混合併放置在冰上。
將血-EDTA試管3500rpm離心5分鐘收集血漿。在分析之前血漿樣品轉移到新標記的1.5mL試管並儲存於-80°C。使用相同的方法分析血漿適體濃度，直接將能整除的血漿加入到含有直接購買的螢光核酸檢測試劑OligreenTM(Molecular Probes，Eugene，OR)的試驗孔中。室溫下簡單培育(5分)，避光，使用螢光平板閱讀器閱讀檢測板。每個孔的螢光信號與孔中適體濃度成正比，通過在螢光濃度標準曲線上添寫螢光值來計算樣品濃度(平均值來自雙重曲線)。每組三個動物在每個時間點獲取平均血漿濃度與時間後劑量繪成圖17。
血漿濃度和時間數據要使用工業標準藥代動力學模型軟體WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)進行非劃分分析(NCA)。可以估計出下面主要藥代動力學參數最大血漿濃度，Cmax；濃度-時間曲線下面積AUC；終末半衰期，t1/2；終末清楚率，Cl；穩定狀態分布體積，Vss。使用WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)。分析(NCA)非劃分分析數據，獲得了下圖20列出的主要藥代動力學參數的估計值。
實施例4C鼠SC給藥(10mg/kg)後抗-IgE適體相對於PEG化產物ARC1785，ARC1787，ARC1788和ARC1790的藥代動力學和生物利用度
圖18顯示了通過靜脈注射途徑給藥研究鼠類藥代動力學中的ARC1785，ARC1787，ARC1788，和ARC1790的生物利用度的設計。簡單的說，本研究由三組組成(33個動物)。在每個樣品採集時間點上，處死三個動物，通過心臟小孔採集0.5mL的全血以收集血漿。使用標準0.9％鹽將乾粉末適體配製成終濃度是10mg/mL(寡核苷酸濃度)的注射液，並在注射前消毒(0.2μm)。給藥路線是一個簡單的皮下注射藥物，劑量是10mg/kg。在指定的時間點上，t＝給藥前，0.08，0.5，1，2，4，8，16，24，32，48，和72小時，獲得全血樣品並直接轉移到K2EDTA吸附的試管中，倒轉混合放置在冰上。
將血-EDTA試管3500rpm離心5分鐘收集血漿。在分析之前血漿樣品轉移到新標記的1.5mL試管並儲存於-80°C。使用同樣的方法來分析不同血漿樣品中的適體濃度，直接將血漿加入到含有購買的螢光核酸檢測試劑OligreenTM(MolecularProbes，Eugene，OR)的孔中。室溫下培育(5mm)，避光，檢測板使用螢光平板閱讀器閱讀。每個孔的螢光信號與孔中適體濃度成正比，通過使用添寫螢光濃度標準曲線上的螢光值來計算樣品濃度(平均值來自雙重曲線)。在每組三個動物中每個時間點獲取平均血漿濃度並時間後劑量繪成圖19。
血漿濃度和時間數據要使用工業標準藥代動力學模型軟體WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)進行非劃分分析(NCA)。可以估計出下面主要藥代動力學參數最大血漿濃度，Cmax；濃度-時間曲線下面積AUC；終末半衰期，t1/2；終末清楚率，Cl；穩定狀態分布體積，Vss。整體使用WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)。分析(NCA)數據生成了圖20列出的主要藥代動力學參數的估計，所有的PEG連接適體被檢測的都顯示了皮下生物利用度。
本發明已經被用書面描述和實施例的形式描述了，本領域普通技術人員能認識到本發明可以在多種實施方案中應用，並且上面的描述和實施例都是為了說明而並不是所附權利要求的限制。
序列表110阿切埃米克斯有限公司120免疫球蛋白E的特異性核酸配體及其作為過敏性疾病治療的應用13023239-581-06115060/565,6011512004-04-2615060/574,1201512004-05-2415060/581,8651512004-06-2215060/660,2041512005-03-07160298170Patentln version 3.3210121193212DNA213人工合成的220
223合成模板220
221其他特徵222(25)..(54)223n是a，t，c，或g4001catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93210221192212DNA213人工合成的220
223合成模板220
221其他特徵
222(24)..(53)223n代表a，t，c，或g4002catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92210321192212DNA213人工合成的220
223合成模板220
221其他特徵222(24)..(53)223n代表a，t，c，或g4003catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92210421110212DNA213人工合成的220
223合成的免疫刺激基序4004aacgttcgag 10210521188212DNA213人工合成的220
223合成模板220
221其他特徵222(25)..(64)223n代表a，t，c，或g4005
gggaaaagcg aatcatacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnngctccg ccagagacca accgagaa 88210621141212DNA213人工合成的220
223合成引物4006taatacgact cactataggg aaaagcgaat catacacaag a 41210721124212DNA213人工合成的220
223合成引物4007ttctcggttg gtctctggcg gagc 24210821188212RNA213人工合成的220
223合成模板220
221其他特徵222(25)..(64)223n是a c，u，或g4008gggaaaagcg aaucauacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnngcuccg ccagagacca accgagaa 88210921124212RNA213人工合成的220
223合成的固定區域
4009gggaaaagcg aaucauacac aaga 242101021124212RNA213人工合成的220
223合成的固定區域40010gcuccgccag agaccaaccg agaa 242101121188212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-OH，所有的嘧′-羥啶(C和U)是2′-氟40011gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu gucgugguuc ggguugaggc 60ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 882101221187212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(87)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40012ggaaaagcga aucauacaca agagucgcga uagauugcuu gugaaugguu uugguggaag 60
cgggcuccgc cagagaccaa ccgagaa 872101321188212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40013gggaaaagcg aaucauacac aagagucgcu agauugcuag uguaugguuu aucuaaaggc 60ggccgcuccg ccagagacca accgagaa 882101421187212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(87)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40014gggaaaagcg aaucauacac aagaggucuu acagauccug uguagugguu cgauacaugc 60ggggcuccgc cagagaccaa ccgagaa 872101521188212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)..(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40015gggaaaagcg aaucauacac aagacgugag cauaucauug aguguagugg uuccggagua 60agucgcuccg ccagagacca accgagaa 882101621187212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(87)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40016gggaaaagcg aaucauacac aagagcaccu ugacugugau ucgcgggugu gagucgugcg 60aaggcuccgc cagagaccaa ccgagaa 872101721188212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40017gggaaaagcg aaucauacac aagagugcaa gaagugcauu gcugugucug guucuuggcg 60augugcuccg ccagagacca accgagaa 882101821188212RNA213人工合成的
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40018gggaaaagcg aaucauacac aagauccgag ggugggcaau aggcucacaa ggguuucgcg 60ugaugcuccg ccagagacca accgagaa 882101921188212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40019gggaaaagcg aaucauacac aagagugccg aggcauugcu ugguaugguu ccggucuugu 60cggggcuccg ccagagacca accgagaa 882102021188212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40020gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu guggugguuc ggguugaggc 60
ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 882102121190212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(90)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40021gggaaaagcg aaucauacac aagacgucag uaagauugag uguaugguuc cugguggaca 60auaauggcuc cgccagagac caaccgagaa902102221188212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(88)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40022gggaaaagcg aaucauacac aagagagugg aggagguaug uaugguuugu gcgucuggug 60cggugcuccg ccagagacca accgagaa 882102321175212DNA213人工合成的220
223合成模板220
221其他特徵
222(23)..(52)223n代表a，t，c，或g40023gggagaggag agaacgttct acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgctgtcg 60atcgatcgat cgatg 752102421122212DNA213人工合成的220
223合成引物40024gggagaggag agaacgttct ac 222102521122212DNA213人工合成的220
223合成引物40025catcgatcga tcgatcgaca gc222102621122212RNA213人工合成的220
223合成的固定區域40026gggagaggag agaacguucu ac222102721123212RNA213人工合成的220
223合成的固定區域40027cgcugucgau cgaucgaucg aug 23
2102821175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40028gggagaggag agaacguucu acgauuagca gggagggaga gugcgaagag gacgcugucg 60aucgaucgau cgaug752102921175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40029gggagaggag agaacguucu acacucuggg gacccguggg ggagugcagc aacgcugucg 60aucgaucgau cgaug752103021174212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(74)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
4003 0gggagaggag agaacguucu acgaggugag ggucuacaau ggagggaugg ucgcugucga 60ucgaucgauc gaug 742103121175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是a，c，u，或g220
221其他特徵222(48)..(48)223n是a，c，u，或g40031gggagaggag agaacguucu acccgcagca uagccugngg acccaugngg ggcgcugucg 60aucgaucgau cgaug752103221175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40032gggagaggag agaacguucu acuggggggc guguucauua gcagcgucgu gucgcugucg 60
aucgaucgau cgaug752103321175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40033gggagaggag agaacguucu acgcagcgca ucuggggacc caagagggga uucgcugucg 60aucgaucgau cgaug752103421173212DNA213人工合成的220
223合成適體220
220修飾鹼基222(1)..(73)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40034gggagaggag agaacguucu acgggauggg uaguuggaug gaaaugggaa cgcugucgau 60cgaucgaucg aug 732103521174212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(74)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40035gggagaggag agaacguucu acgaggugua gggauagagg gguguaggua acgcugucga 60ucgaucgauc gaug 742103621175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40036gggagaggag agaacguucu acaggagugg agcuacagag aggguuaggg gucgcugucg 60aucgaucgau cgaug752103721175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40037gggagaggag agaacguucu acggauguug ggagugauag aaggaagggg agcgcugucg 60aucgaucgau cgaug752103821176212DNA
213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(76)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40038gggagaggag agaacguucu acuuggggug gaaggaguaa gggaggugcu gaucgcuguc 60gaucgaucga ucgaug 762103921175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基4003 9gggagaggag agaacguucu acguauuagg ggggaagggg aggaauagau cacgcugucg 60aucgaucgau cgaug752104021176212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(76)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40040gggagaggag agaacguucu acagggagag aguguugagu gaagaggagg agucgcuguc 60
gaucgaucga ucgaug 762104121175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40041gggagaggag agaacguucu acauugugcu ccuggggccc aguggggagc cacgcugucg 60aucgaucgau cgaug752104221175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40042gggagaggag agaacguucu acgagcagcc cuggggcccg gagggggaug gucgcugucg 60aucgaucgau cgaug752104321175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40043gggagaggag agaacguucu acaggcaguu cuggggaccc augggggaag ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaug752104421175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40044gggagaggag agaacguucu accaacggca uccugggccc cacaggggau gucgcugucg 60aucgaucgau cgaug752104521174212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(74)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40045gggagaggag agaacguucu acgaguggau agggaagaag gggaguaguc acgcugucga 60ucgaucgauc gaug 742104621175212DNA
213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40046gggagaggag agaacguucu acccgcagca uagccugggg acccaugggg ggcgcugucg 60aucgaucgau cgaug752104721176212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(76)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(61)-(61)223n是a，c，u，或g40047gggagaggag agaacguucu acggucgcgu gugggggacg gauggguauu ggucgcuguc 60naucgaucga ucgaug 762104821175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)
223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40048gggagaggag agaacguucu acgggguuac gucgcacgau acaugcauuc aucgcugucg 60aucgaucgau cgaug752104921175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40049gggagaggag agaacguucu acuagcgagg agggguuuuc uauuuuugcg aucgcugucg 60aucgaucgau cgaug752105021175212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(75)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40050gggagaggag agaacguucu acaagcaguu cuggggaccc augggggaag ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaug752105121175212DNA213人工合成的
220
223合成模板220
221其他特徵222(23)..(52)223n代表a，t，c，或g40051gggagaggag agaacgttct acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgctgtcg 60atcgatcgat cgatg752105221122212DNA213人工合成的220
223合成引物40052gggagaggag agaacgttct ac 222105321122212DNA213人工合成的220
223合成引物40053catcgatcga tcgatcgaca gc 222105421121212RNA213人工合成的220
223合成的固定區域40054gggagaggag agaacguucu a212105521123212RNA213人工合成的
220
223合成的固定區域40055cgcugucgau cgaucgaucg aug 232105621182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-OH，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40056gggagaggag agaacguucu acgaucuggg cgagccaguc ugacugagga agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822105721182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40057gggagaggag agaacguucu acgcggucgg guguguggag gaaguaguuc gucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822105821182212RNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40058gggagaggag agaacguucu acgacguuaa ugcagcggcu agggaugggc agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822105921182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40059gggagaggag agaacguucu acaggcgugu ugguagggua cgacgaggca ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822106021182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40060gggagaggag agaacguucu acugagggau aauacgggug ggauugucuu cccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82
2106121182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40061gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822106221182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40062gggagaggag agaacguucu acgaagaaga uaugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822106321182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
40063gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg 822106421182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40064gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaga ggcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822106521182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40065gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga caugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822106621183212RNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(83)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(23)..(23)223n是a，c，u，或g220
221其他特徵222(50)..(50)223n是a，c，u，或g40066gggagaggag agaacguucu acnaaaaagu auaugagaga aaggauuaan agacgcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 832106721183212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(83)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40067gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aaggauugag agaugcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 832106821183212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)-(83)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2 ′-氧-甲基40068gggagaggag agcacguucu acgaaaaaga uauggagaga aaggauuaag agacgcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 832106921184212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(84)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40069gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaaa gagacgcugu 60cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 842107021185212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(85)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(26)..(26)223n是a，c，u，或g40070gggagaggag agaacguucu acgaanaaga uacauaguag aaaggauuaa uaagacgcug 60ucgaucgauc gaucgaugaa gggcg 85
2107121182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40071gggagaggag agaacguucu acaggcgugu ugguagggua cgacgaggca ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822107221182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40072gggagaggag agaacguucu acgcaaaaau gugaugcgag guaauggaac gccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822107321182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222 (1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40073gggagaggag agaacguucu acggaccuca gcgauagggg uugaaaccga cacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822107421182
212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40074gggagaggag agaacguucu acauggucgg augcugggga guaggcaagg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822107521182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40075gggagaggag agaacguucu acguaucggc gagcgaagca uccgggagcg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822107621182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40076gggagaggag agaacguucu acguauuggc gcgcgaagca uccgggagcg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822107721182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40077gggagaggag agaacguucu acuuauaccu gacggccgga ggcgcauagg ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822107821182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40078gggagaggag agaacguucu acauggucgg augcugggga guaggcaagg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82
2107921182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40079gggagaggag agaacguucu acacgagagu acugaggcgc uugguacaga gucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822108021182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40080gggagaggag agaacguucu acagaaggua gaaaaaggau agcugugaga agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822108121182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
40081gggagaggag agaacguucu acugagggau aauacgggug ggauugucuu cccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822108221184212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(84)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40082gggagaggag agaacguucu acauugagcg uugaaguugg ggaagcuccg aggccgcugu 60cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 842108321182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40083gggagaggag agaacguucu acgcggagau auacagcgag guaauggaac gccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822108421182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40084gggagaggag agaacguucu acgaagacag cccaauagcg gcacggaacu ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822108521184212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(84)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40085gggagaggag agaacguucu accgguugag ggcucgcgug gaagggccaa cacgcgcugu 60cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 842108621182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40086gggagaggag agaacguucu acauaucaau agacucuuga cguuuggguu ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82
2108721179212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(79)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40087gggagaggag agaacguucu acagugaagg aaaaguaagu gaaggugugc gcugucgauc 60gaucgaucga ugaagggcg792108821182212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(82)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40088gggagaggag agaacguucu acggaugaaa ugagugucug cgauagguua agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg822108921183212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(83)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
40089gggagaggag agaacguucu acggaaggaa augugugucu gcgauagguu aagcgcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 832109021149212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(49)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40090gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu gucgugguu 492109121143212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(43)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40091ggaaucauac acaagacguc gccagauuga gugucguggu ucc 432109221141212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(41)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40092ggaaucauac acaagacguc gccagauuga gugucguggu u 412109321137212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40093ggagauccga gggugggcaa uaggcucaca aggguuu372109421135212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(35)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40094ggauccgagg gugggcaaua ggcucacaag ggucc 352109521143212RNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(43)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40095ggaaucauac acaagacguc aguaagauug aguguauggu ucc432109621141212RNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(41)223所有的嘌呤(A和G)是2′-羥基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟40096ggaaucauac acaagacguc aguaagauug aguguauggu u 412109721121212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(21)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40097uucuggggac ccauggggga a 212109821123212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40098guucugggga cccauggggg aac 232109921125212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(25)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基40099aguucugggg acccaugggg gaacu 2521010021121212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(21)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400100gccuggggac ccaugggggg c 2121010121123212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400101agccugggga cccauggggg gcu 2321010221125212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(25)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400102uagccugggg acccaugggg ggcua 2521010321121212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(21)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400103gccuggggaa ccaugggggg c 2121010421168212DNA213人工合成的220
223合成模板400104gggagaggag agaacgttct acagcctggg gacccatggg gggctggtcg atcgatcgat 60catcgatg6821010521123212DNA213人工合成的220
223合成引物400105catcgatgat cgatcgatcg acc 2321010621122212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(22)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400106agccugggga cccauggggg cu2221010721123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400107cgccugggga cccagggggg gcu 23
21010821123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400108agccuggugg cccauggggu gcu2321010921125212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(25)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400109agccugggga cccauggggg guggu 2521011021123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400110
agucugggga cagauggaug gcu 2321011121122212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(22)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400111agcuguggag ucgugugggg cu 2221011221125212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(25)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400112aagccugggg acccaugggg gggcu2521011321137212DNA213人工合成的220
223合成適體400113ggggcacgtt tatccgtccc tcctagtggc gtgcccc 3721011421174212DNA
213人工合成的220
223合成模板400114gatcccttgt tcagtccggg gcacgtttat ccgtccctcc tagtggcgtg ccccttaagc 60cacaggactc caaa 7421011521118212DN213人工合成的220
223合成引物400115gatcccttgt tcagtccg 1821011621117212DNA213人工合成的220
223合成引物220
221修飾鹼基222(17)-(17)223第17位的腺嘌呤是2′-羥基400116ggagtcctgt ggcttaa 1721011721120212DN213人工合成的220
223合成引物220
221其他特徵222(1)..(3)2231到3位的n是5-生物素-胸腺嘧啶400117
nnnggagtcc tgtggcttaa 2021011821117212DNA213合成引物400118ggagtcctgt ggcttaa 1721011921137212DNA213人工合成的220
223合成適體400119ggggcacatt tatccgtccc tcctagtggt gtgcccc3721012021137212DNA213人工合成的220
223合成適體400120ggggtacctt tatccgtccc tcctagtggg gtgcccc3721012121137212DN213人工合成的220
223合成適體400121ggggtacctt tatccgtccc tcctagtggg gtacccc3721012221137212DN213人工合成的220
223合成適體
400122ggggcaaatt tatccgtccc tcctagtggt ttgcccc3721012321137212DNA213人工合成的220
223合成適體400123ggggcatatt tatccgtccc tcctagtggt atgcccc3721012421137212DN213人工合成的220
223合成適體400124ggggcacatt tatccgttcc tcctagtggt gtgcccc3721012521137212DN213人工合成的220
223合成適體400125ggggtacatt tatccgtccc tcctagtggc atgcccc3721012621137212DNA213人工合成的220
223合成適體400126ggggcatgtt tatccgtccc tcctagtggc atgcccc3721012721136212DNA213人工合成的
220
223合成適體400127ggggcaactt tatccgttcc tcctagtggg ttgccc3621012821137212DNA213人工合成的220
223合成適體400128ggggcacatt catccgtccc tcctagtggt gtgctcc 3721012921137212DN213人工合成的220
223合成適體400129ggggtacctt gatccgtccc tcctagtggg gtgcccc 3721013021137212DN213人工合成的220
223合成適體400130ggggcatgtt tatccgttcc tcctagtggc atgcccc 3721013121137212DNA213人工合成的220
223合成適體400131ggggcagctt tatccgttcc tcctagtggg ctgcctc 37
21013221137212DNA213人工合成的220
223合成適體400132ggggtacctt tatccgtttc tcctagtggg gtgcccc 3721013321137212DNA213人工合成的220
223合成適體400133ggggtatgtt gatccgtccc tcctagtggc atgcccc 3721013421137212DNA213人工合成的220
223合成適體400134ggggcatgtt catccgttcc tcctagtggc gtgcccc 3721013521137212DNA213人工合成的220
223合成適體400135gggacacatt tatccgttac tcttagtggt gtgcccc 3721013621137212DNA213人工合成的220
223合成適體
400136ggggcacatt tatccgttac tcttagtggt gtgcccc 3721013721134212DNA213人工合成的220
223合成適體400137ggggcacgtt tacagtccct ccttatcgcc tccc 3421013821134212DNA213人工合成的220
223合成適體400138ggggcacgtt tacagtccct ccttatcgcc tccc 3421013921136212DNA213人工合成的220
223合成適體400139gggcaacttt atccgttcct cttagtgggt tgcccc3621014021136212DNA213人工合成的220
223合成適體400140gggctacttt atccgtccct cctagtgggt agcccc3621014121135212DNA213人工合成的
220
223合成適體400141ggcaccttta tccgtccctc ctagtggggt gcccc 3521014221137212DNA213人工合成的220
223合成適體400142ggggcacctt tatccgtccc tcctagtggg gtgcccc 3721014321136212DNA213人工合成的220
223合成適體400143gggcacattc atccgttcct cctagtggtg tgcccc 3621014421134212DNA213人工合成的220
223合成適體400144ggcaccttta tccgttcctt ctagtggggt gccc 3421014521136212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221其他特徵222(28)..(28)
223第28位的n是a，t，c，或g400145cggcaccttt atccgttact cttagtgngg tgcccc3621014621135212DNA213人工合成的220
223合成適體400146ggcaccttga tccgttcctc ctagtggggt gcccc3521014721137212DNA213人工合成的220
223合成適體400147gcgggcaaat tcatccgtcc ctcctagtgg tttgccc 3721014821134212DNA213人工合成的220
223合成適體400148gggcacttta tccgttcctt ctagtgggtg tccc 3421014921138212DNA213人工合成的220
223合成適體400149ggcggcagct ttatccgtac ctcccagtgg gctgctcc 3821015021137
212DNA213人工合成的220
223合成適體400150ggggcagctt tatccgtacc tcccagtggg ctgcccc 3721015121137212DNA213人工合成的220
223合成適體400151ggggctactt tatccgtccc tcctagtggg tagcccc 3721015221137212DNA213人工合成的220
223合成適體400152ggggctactt tatccgtacc tcccagtggg tagcccc 3721015321137212DN213人工合成的220
223合成適體400153ggggctactt gatccgtccc tcctagtggg tagcccc 3721015421137212DNA213人工合成的220
223合成適體400154ggggctactt catccgtccc tcctagtggg tagcccc 37
21015521137212DNA213人工合成的220
223合成適體400155ggggctactt tatccgttcc tcttagtggg tagcccc3721015621137212DNA213人工合成的220
223合成適體400156ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccc3721015721138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221其他特徵222(38)..(38)223第38位的n是是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400157ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821015821124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)
223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(31-31連接)400158agccugggga cccauggggg gcun 2421015921124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400159agccugggga cccauggggg gcun 2421016021124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第6位的鳥嘌呤是是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400160agccugggga cccauggggg gcun 2421016121124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第7位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400161agccugggga cccauggggg gcun 2421016221124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第8位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400162agccugggga cccauggggg gcun 2421016321124212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第9位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400163agccugggga cccauggggg gcun 2421016421124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第10位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400164agccugggga cccauggggg gcun 2421016521124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)
223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400165agccugggga cccauggggg gcun 2421016621124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第16位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400166agccugggga cccauggggg gcun 2421016721124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400167agccugggga cccauggggg gcun 2421016821124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第18位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400168agccugggga cccauggggg gcun2421016921124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第19位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400169agccugggga cccauggggg gcun 2421017021124212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第20位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400170agccugggga cccauggggg gcun 2421017121124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400171agccugggga cccauggggg gcun 2421017221124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)
223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1位的腺嘌呤是2′-氧-甲基，和第2，20，和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400172agccugggga cccauggggg gcun 2421017321124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第10和14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400173agccugggga cccauggggg gcun 2421017421124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵
222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400174agccugggga cccauggggg gcun 2421017521124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第10和14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400175agccugggga cccauggggg gcun2421017621124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10和14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223第24位的n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400176agccugggga cccauggggg gcun 24
21017721128212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(27)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第3，8和20位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第11和15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(2)..(2)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)-(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(28)-(28)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400177angccugggg acccaungng gggngcun 2821017821130212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(29)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第3，8和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第12和16位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(2)(2)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(11)-(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(18)..(18)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(20)..(20)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)..(23)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)-(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(30)..(30)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400178angccugggg nacccaungn ggnggngcun3021017921127212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)-(28)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和18位是鳥嘌呤，第1，11和15位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(20)..(20)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)..(23)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(27)-(27)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400179agccugggng acccaugggn ggngcun 2721018021128212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(27)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和19位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11和15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)-(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(21)-(21)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400180agccugggng acccaunggg nggngcun 2821018121129212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(28)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和20位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11和15位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(25)..(25)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接
220
221其他特徵222(29)..(29)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400181agccugggng acccaungng gnggngcun2921018221132212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(31)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，8和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13和17位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(6)-(6)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)-(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)-(24)
223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(32)..(32)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400182agccunggng ngacccaung gngngngngc un3221018321135212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(34)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，9和23位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，14和18位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(6)..(6)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(8)..(8)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(10)..(10)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(12)..(12)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接
220
221其他特徵222(20)-(20)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(30)..(30)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(32)-(32)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(35)..(35)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400183agccungngn gngacccaun gngngngngn gncun3521018421123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2 ′-氧-甲基220
221其他特徵222(2)..(2)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400184anccugggga cccauggggg gcu 2321018521123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(6)..(6)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400185agccunggga cccauggggg gcu 2321018621123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(7)..(7)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤
400186agccugngga cccauggggg gcu2321018721123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(8)..(8)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400187agccuggnga cccauggggg gcu 2321018821123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223
所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400188agccugggna cccauggggg gcu 2321018921123212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(16)..(16)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400189agccugggga cccaungggg gcu 2321019021123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
220
221其他特徵222(17)..(17)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400190agccugggga cccaugnggg gcu 2321019121123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(18)..(18)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400191agccugggga cccauggngg gcu 2321019221123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(2 3)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
220
221其他特徵222(19)..(19)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400192agccugggga cccaugggng gcu2321019321123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′氧-甲基-220
221其他特徵222(20)..(20)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400193agccugggga cccauggggn gcu 2321019421123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(21)..(21)223n是脫氧的7-脫氮鳥嘌呤400194agccugggga cccauggggg ncu 2321019521123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)
223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400195aggcugggga cccauggggg ccu 2321019621123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第3位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶2′-氧-甲基400196aggcugggga cccauggggg ccu 2321019721123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400197agucugggga cccauggggg acu 2321019821123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第21位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶2′-氧-甲基400198agucugggga cccauggggg acu 23
21019921123212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基400199agacugggga cccauggggg ucu 2321020021123212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第3位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶2′-氧-甲基400200agacugggga cccauggggg ucu 2321020121124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第7和17位的鳥嘌呤2′-氧-甲基，第1，10和14位的腺嘌呤2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(2)..(2)223第2位的n是脫氧的次黃嘌呤
220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400201anccugggga cccauggggg gcun 2421020221124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(6)..(6)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400202agccunggga cccauggggg gcun 2421020321124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(7)..(7)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400203agccugngga cccauggggg gcun 2421020421124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，和7位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(8)..(8)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400204
agccuggnga cccauggggg gcun 2421020521124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第位的鳥嘌呤是2，7和17 2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400205agccugggna cccauggggg gcun2421020621124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基
222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(16)..(16)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400206agccugggga cccaungggg gcun 2421020721124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，和7位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(17)..(17)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400207agccugggga cccaugnggg gcun 2421020821124212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(18)..(18)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶400208agccugggga cccauggngg gcun 2421020921124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(19)..(19)223n是脫氧的次黃嘌呤
220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400209agccugggga cccaugggng gcun 2421021021124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(20)-(20)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)-(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400210agccugggga cccauggggn gcun2421021121124212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)..(23)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和17位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基221修飾鹼基222(1)..(23)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(21)..(21)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400211agccugggga cccauggggg ncun 2421021221129212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(28)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和20位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11，15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)-(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(25)-(25)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(29)-(29)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400212agccugggng acccaungng gngnngcun 2921021321129212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和20位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11，15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵
222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(18)..(18)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(19)-(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(25)..(25)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(29)..(29)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400213agccugggng acccaunnng gngnngcun2921021421132212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(31)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，8和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(31)
223所有的嘧啶(C和U)是2T-O-methyl220
221其他特徵222(6)..(6)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(11)-(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(27)..(27)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(32)..(32)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400214agccunggng ngacccaung gngngnnngc un32
21021521132212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(31)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，8和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(31)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(6)-(6)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(20)..(20)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接
220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(27)..(27)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(32)..(32)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400215agccunggng ngacccaunn gngngnnngc un3221021621129212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7和20位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11，15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(18)..(18)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(21)..(21)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(25)..(25)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(29)..(29)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400216agccugggng acccaunnng nngnngcun 2921021721129212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第位的鳥嘌呤是2，7和20 2′-氧-甲基，第位的腺嘌呤是1，11，15 are2′-氧-甲基220
221修飾鹼基
223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(21)..(21)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(25)..(25)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(29)..(29)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400217agccugggng acccaungng nngnngcun2921021821132212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(31)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，8和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(31)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(6)..(6)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)-(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)..(23)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(27)..(27)223n是脫氧的次黃嘌呤
220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(32)..(32)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400218agccunggng ngacccaung gnnngnnngc un3221021921132212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(31)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，8和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)-(31)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(6)..(6)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220其他特徵221
222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接
220
221其他特徵222(20)..(20)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)..(23)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..( 24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(27)..(27)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(32)..(32)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400219agccunggng ngacccaunn gnnngnnngc un 3221022021138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)
223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第1位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)-(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400220ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821022121138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第2位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3 ′-3′連接)400221ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821022221138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第3位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400222ggggctactt tatccgttcc tcctagtgggtagccccn 3821022321138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第4位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400223ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821022421138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第5位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400224ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821022521138212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第6位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400225ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821022621138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400226ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821022721138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)
223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第8位的胞嘧啶是2′氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400227ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821022821138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第9位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400228ggggctacut tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821022921138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第10位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵22238223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400229ggggctactu tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821023021138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第11位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400230ggggctactt uatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821023121138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第12位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400231ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821023221138212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第13位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400232ggggctactt tauccgttcc tcctagtggg tagccccn3821023321138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第14位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)-(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3，-3′連接)400233ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821023421138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)
223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第15位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)-(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400234ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821023521138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第16位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400235ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821023621138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第17位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400236ggggctactt tatccgutcc tcctagtggg tagccccn3821023721138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第18位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400237ggggctactt tatccgtucc tcctagtggg tagccccn3821023821138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第19位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400238ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821023921138212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第20位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400239ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821024021138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第21位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400240ggggctactt tatccgttcc ucctagtggg tagccccn3821024121138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)
223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第22位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400241ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821024221138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第23位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400242ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821024321138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第24位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400243ggggctactt tatccgttcctccuagtggg tagccccn 3821024421138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第25位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400244ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821024521138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第26位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400245ggggctactt tatccgttcc tcctagtgggtagccccn3821024621138212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第27位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400246ggggctactt tatccgttcc tcctaguggg tagccccn 3821024721138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第28位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特點222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400247ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821024821138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)
223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第29位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400248ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821024921138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第30位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400249ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821025021138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(1，(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第31位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400250ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg uagccccn 3821025121138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第32位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400251ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821025221138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第33位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400252ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821025321138212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第34位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400253ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821025421138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400254ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821025521138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)
223所有的嘌呤(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第36位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)-(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400255ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821025621138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第3 7位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400256ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821025721138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4，30和33位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第7和32位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的
220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400257ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821025821138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第5，8，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第6和31位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400258ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg uagccccn 3821025921138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，和4位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400259ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821026021138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和33位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第5，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400260ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn3821026121136212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(35)
223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，和32位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(35)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第4，33，34，和35位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(36)..(36)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400261gggctacttt atccgttcct cctagtgggt agcccn3621026221138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和33位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400262ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821026321138212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和33位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第5，8，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第6位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400263ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 3821026421138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和33位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第20，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第11，17，和18位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400264ggggctactt uatccguucc tcctagtggg tagccccn 38
21026521138212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和33位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(37)223所有的嘧啶(C和，T)是脫氧的，除了第5，8，20，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第6，11，17，和18位的尿嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400265ggggcuactt uatccguucc tcctagtggg tagccccn 3821026621139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400266ggggctacnt ttatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 3921026721139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(10)..(10)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400267ggggctactn ttatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 3921026821139212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400268ggggctactt ntatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 3921026921139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(12)..(12)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接
220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400269ggggctactt tnatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 3921027021139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(13)..(13)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400270ggggctactt tantccgttc ctcctagtgg gtagccccn 3921027121139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和31位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(14)-(14)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400271ggggctactt tatnccgttc ctcctagtgg gtagccccn 3921027221139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(15)..(15)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400272ggggctactt tatcncgttc ctcctagtgg gtagccccn 3921027321139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)-(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)-(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(16)-(16)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400273ggggctactt tatccngttc ctcctagtgg gtagccccn 3921027421139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基
220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400274ggggctactt tatccgnttc ctcctagtgg gtagccccn3921027521139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(18)..(18)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400275ggggctactt tatccgtntc ctcctagtgg gtagccccn 39
21027621139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是 2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400276ggggctactt tatccgttnc ctcctagtgg gtagccccn 3921027721139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)
223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(20)..(20)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400277ggggctactt tatccgttcn ctcctagtgg gtagccccn 3921027821139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第位的鳥嘌呤是1，2，3，4和34 2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是72′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(21)..(21)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)-(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400278ggggctactt tatccgttcc ntcctagtgg gtagccccn39
21027921139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶400279ggggctactt tatccgttcc tncctagtgg gtagccccn 3921028021139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(23)..(23)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間連接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400280ggggctactt tatccgttcc tcnctagtgg gtagccccn 3921028121139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第5，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400281ggggctactt tatccgttcc tccntagtgg gtagccccn 3921028221139212DNA213人工合成的220
223合成適體
220
221修飾鹼基222(1)-(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(25)..(25)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400282ggggctactt tatccgttcc tcctnagtgg gtagccccn 3921028321139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(26)-(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接
220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(31-31連接)400283ggggctactt tatccgttcc tcctangtgg gtagccccn3921028421139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)-(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(27)..(27)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400284ggggctactt tatccgttcc tcctagntgg gtagccccn3921028521139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基
222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(28)..(28)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400285ggggctactt tatccgttcc tcctagtngg gtagccccn3921028621139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(29)..(29)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)
400286ggggctactt tatccgttcc tcctagtgng gtagccccn 392102872113 9212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(30)..(30)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400287ggggctactt tatccgttcc tcctagtggn gtagccccn 3921028821139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基
220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(31)..(31)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400288ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg ntagccccn3921028921139212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和34位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(38)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(32)..(32)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(39)..(39)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400289ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tnagccccn 39
21029021146212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(45)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和41位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)-(45)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第42，43，44和45位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(10)-(10)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(14)..(14)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(30)..(30)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(34)..(34)
223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(46)..(46)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400290ggggctactn ttantcncgt tncctncctn agtngggnta gccccn4621029121146212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(45)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和41位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(45)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第5，8，42，43，44，和45位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(10)..(10)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(14)..(14)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)
223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(30)..(30)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(34)..(34)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(38)..(38)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(46)..(46)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400291ggggcuactn ttantcncgt tncctncctn agtngggnta gccccn 4621029221145212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(44)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第1，2，3，4和40位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(44)223所有的嘧啶(C和T)是脫氧的，除了第5，8，23，41，42，43和44位的胞嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(10)..(10)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接
220
221其他特徵222(14)..(14)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(25)..(25)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(29)..(29)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(33)..(33)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(37)..(37)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(45)-(45)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400292ggggcuactn tuantcncgu ucctncctna gtngggntag ccccn4521029321131212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221其他特徵222
223n是一個分支為40kDa大小的PEG220
221其他特徵222(2)..(2)223n代表一個氨基220
221修飾鹼基222(3)..(30)223所有的嘌呤是脫氧的，除了第4，9，和22位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(3)-(30)223所有的嘧啶2′-氧-甲基220
221其他特徵222(11)-(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)-(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(20)..(20)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(21)-(21)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)..(23)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)-(26)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(27)..(27)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(31)..(31)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400293nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu n 31
21029421131212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221其他特徵222(1)..(1)223n是一個分支為40kDa大小的PEG220
221其他特徵222(2)..(2)223n代表一個氨基220
221修飾鹼基222(3)..(30)223所有的嘌呤是脫氧的，除了第4，9，和22位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(3)..(30)223所有的嘧啶2′-氧-甲基220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(20)-(20)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(21)..(21)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)-(23)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(27)..(27)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(31)..(31)223n是一個反向脫氧的胸腺嘧啶(3′-3′連接)400294nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu n 3121029521132212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221其他特徵222(1)-(1)223n是20kDa的PEG220
221其他特徵222(2)..(2)223n是一個氨基220
221修飾鹼基222(3)..(30)223所有的嘌呤是脫氧的，除了第4，9，和22位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基
220
221修飾鹼基222(3)..(30)223所有的嘧啶2′-氧-甲基220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(20)..(20)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(21)..(21)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)..(23)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(27)..(27)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(31)..(31)223n是一個氨基220
221其他特徵222(32)..(32)223n是一個20kDa的PEG400295nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu nn 3221029621132212DNA213人工合成的
220
223合成適體220
221其他特徵222(1)(1)223n是一個30kDa的PEG220
221其他特徵222(2)..(2)223n是一個氨基220
221修飾鹼基222(3)..(30)223所有的嘌呤是脫氧的，除了第4，9，和22位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(3)(30)223所有的嘧啶2′-氧-甲基220
221其他特徵222(11)..(11)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(20)..(20)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(21)..(21)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(23)..(23)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(24)..(24)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(26)..(26)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(27)..(27)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(31)..(31)223n是一個氨基220
221其他特徵222(32)..(32)223n是的30kDa和PEG400296nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu nn 3221029721130212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221其他特徵222(1)..(1)223n是一個氨基220
221修飾鹼基222(2)..(29)223所有的嘌呤是脫氧的，除了第3，8和21位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，第2，12，和16位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(2)..(29)223所有的嘧啶是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(10)..(10)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(18)-(18)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(19)..(19)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(20)..(20)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(22)..(22)
223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(23)..(23)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(25)..(25)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(26)..(26)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(30)..(30)223n是一個氨基400297nagccugggn gacccaunnn gnngnngcun 3021029821128212DNA213人工合成的220
223合成適體220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘌呤(A和G)是脫氧的，除了第2，7，和20位的鳥嘌呤是2′-氧-甲基，和第1，11和15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基220
221修飾鹼基222(1)..(28)223所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基220
221其他特徵222(9)..(9)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(17)..(17)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(18)..(18)223n是一個脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵
222(19)..(19)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(21)..(21)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵222(22)..(22)223n是一個硫代硫酸鹽核苷間聯接220
221其他特徵222(24)..(24)223n是脫氧的次黃嘌呤220
221其他特徵
權利要求
1.與PEG基團連接的適體，包括下列序列mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU。
2.根據權利要求1所述的適體，其中PEG基團是從由60kDa，40kDa，30kDa和20kDa所組成的組中篩選出來的。
3.根據權利要求2所述的適體，其中PEG基團是分支的PEG。
4.根據權利要求3所述的適體，含有如下結構 其中， 表示一個接頭適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)其中mC，mG，mU和mA分別＝2』-OMe C，2′-OMeG，2′-OMe U和2』-OMe A，dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向脫氧胸腺嘧啶。
5.根據權利要求4所述的適體，其中的接頭是烷基接頭。
6.根據權利要求5所述的適體，其中的烷基接頭包括2至18個連續的CH2基團。
7.根據權利要求6所述的適體，其中的烷基接頭包括2至12個連續的CH2基團。
8.根據權利要求7所述的適體，其中的烷基接頭包括3至6個連續的CH2基團。
9.根據權利要求8中所述的適體，含有如下所述結構 適體＝mALmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)其中mC，mG，mU和mA分別＝2』-OMe C，2』-OMe G，2』-OMe U和2』-OMe A，dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向脫氧胸腺嘧啶。
10.根據權利要求3所述的適體，含有下面提出的結構 其中， 表示一個接頭適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)其中mC，mG，mU和mA分別＝2′-OMe C，2′-OMe G，2』-OMe U和2′-OMe A，dG＝脫氧烏嘌呤，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
11.根據權利要求1O所述的適體，其中的接頭是烷基接頭。
12.根據權利要求11所述的適體，其中烷基接頭包括2-18個連續的CH2基團。
13.根據權利要求12所述的適體，其中烷基接頭包括2-12個連續的CH2基團。
14.根據權利要求13所述的適體，其中烷基接頭包括3-6個連續的CH2基團。
15.根據權利要求14所述的適體，含有下面提出的結構 適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列號216)其中mC，mG，mU和mA分別＝2』-OMe C，2』-OMeG，2′-OMe U和2′-OMe A，dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
16.根據權利要求2所述的適體，含有下面提出的結構 其中， 表示一個接頭適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA分別＝2′-OMe C，2′-OMeG，2』-OMe U和2』-OMe A，dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
17.根據權利要求16所述的適體，其中的接頭是烷基接頭。
18.根據權利要求17所述的適體，其中的烷基接頭包括2-18個連續的CH2基團。
19.根據權利要求18所述的適體，其中的烷基接頭包括2-12個連續的CH2基團。
20.根據權利要求19所述的適體，其中的烷基接頭包括3-6個連續的CH2基團。
21.根據權利要求17所述的適體，含有下面提出的結構 適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA分別＝2』-OMe C，2』-OMeG，2′-OMe U和2』-OMe A，dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
22.根據權利要求2所述的適體有下面提出的結構 其中， 表示一個接頭其中，適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA分別＝2′-OMe C，2′-OMeG，2′-OMe U和2』-OMe A，dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
23.根據權利要求22所述的適體，其中的接頭是烷基接頭。
24.根據權利要求23所述的適體，其中的烷基接頭包括2-18個連續的CH2基團。
25.根據權利要求24所述的適體，其中的烷基接頭包括2-12個連續的CH2基團。
26.根據權利要求25所述的適體，其中的烷基接頭包括3-6個連續的CH2基團。
27.根據權利要求26所述的適體，含有下面提出的結構 適體＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列號298)其中mC，mG，mU和mA分別＝2』-OMe C，2』-OMeG，2』-OMe U和2』-OMe A，dG＝脫氧G，dI＝脫氧次黃嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
28.能特異結合IgE的適體，所述適體包括一種核酸序列，該序列與任何一個選自由序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，和98-102組成的組的序列有至少80％的同源性。
29.根據權利要求28所述的適體，其中的適體核酸序列與任意一個選自由序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102所組成的組的序列有至少90％的同源性。
30.能特異結合IgE的適體，所述適體包括一核酸序列，該核酸序列與選自序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-89中的任一序列的獨特序列區域有至少80％的同源性。
31.根據權利要求30所述的適體，其中的適體核酸序列至少與選自序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-89的任一序列的獨特序列區域有至少90％的同源性。
32.能與IgE結合的適體，包括30個相鄰的核苷，所述30個相鄰核苷與選自序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-96中的任一序列中的30個相鄰核苷序列相同。
33.根據權利要求32所述的適體，其中的適體包含有20個連續的核苷，所述連續的核苷序列與選自序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102中任一適體酸序列的獨特序列區域中的20相鄰核苷序列相同。
34.根據權利要求33所述的適體，其中的適體包含有8個連續的核苷，所述連續的核苷序列與選自序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102中任一序列中獨特區域的8個相鄰核苷序列相同，其中的適體特異結合IgE。
35.從由序列號11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102，119-124，126-136，139-157，158-176，178-190，194-201，206-243，247，249-259，261-267，269-290和292所組成的組中選出的適體。
36.依據權利要求35的適體，其中適體為單鏈核酸。
37.根據權利要求36所述的適體，其與一種高分子量非免疫原性化合物或親脂性化合物連接。
38.根據權利要求37所述的適體，其中高分子量，非免疫原性化合物是一種聚烴基乙二醇。
39.根據權利要求38所述的適體，其中的聚烴基乙二醇是聚乙二醇。
40.根據權利要求35所述的適體，該適體包括化學修飾，選自在糖位點上的化學取代；在磷酸鹽位點上的化學取代；在核酸鹼基位點上的化學取代；反向核苷3′封端；反向核苷5′封端。
全文摘要
該發明公開了能夠結合免疫球蛋白E(IgE)，用於治療和診斷過敏性疾病或者其它與IgE有關的疾病或不適的適體。該發明進一步涉及能夠結合IgE的適體的給藥材料和方法。
文檔編號C07H21/04GK101014609SQ200580021366
公開日2007年8月8日 申請日期2005年4月26日 優先權日2004年4月26日
發明者莎倫·克洛德, 約翰·L·戴納, 薩拉·切斯沃思·克內, 馬克斯·庫爾茲, H·A·丹尼爾·萊加斯, 哈羅德·尼古拉斯·馬莎, 波加·桑霍尼, 安東尼·多米尼克·克費, 波拉·伯梅斯特, 王春華 申請人:阿切埃米克斯有限公司