一種人源脂肪間充質幹細胞因子及其製備方法和用途與流程

2023-07-12 15:19:07

本發明屬於皮膚修復
技術領域：
，具體涉及一種人源脂肪間充質幹細胞因子及其製備方法和用途。
背景技術：
：近年來，間充質幹細胞分泌的因子已成為研究熱點，這些細胞因子可有效調控機體細胞信號傳導、活化人體幹細胞，進而生理性修復或替代機體損傷、病變及衰老的細胞。將細胞因子添加到美容化妝品，不僅具有一般化妝品的保溼美白功效，還能夠修復受損皮膚，消除皮膚皺紋，收縮毛孔，改善面色等，越來越受到人們的關注。然而市面上的細胞因子化妝品一般採用直接摻入或經凍幹後摻入化妝品基質的方式製造，細胞因子含量較低，且含有大量糖分等其它雜質，使用這些化妝品後反而會造成皮膚乾燥脫皮等不適感。公開號為CN105543313A的申請公開了一種分離人源間充質幹細胞因子的方法以及一種細胞因子化妝品或藥物，每100ml化妝品或藥物中包含權利要求6所述的間充質幹細胞因子凍乾粉0.5～1.5g，生物多糖膠0.1～1g，膠原蛋白1～5ml。但是其效果有待進一步改進。技術實現要素：為了解決上述問題，本發明提供了一種人源脂肪間充質幹細胞因子及其製備方法和用途。本發明人源脂肪間充質幹細胞因子的製備方法，它包括如下步驟：取人脂肪間充質幹細胞，置於高輔酶無血清培養基中，培養至細胞匯合度75～85％時，收集上清液，即可；其中，所述高輔酶無血清培養基是每1L添加有輔酶A10mg～28mg、輔羧酶5mg～15mg、黃素腺嘌呤二核苷酸4mg～12mg、尿苷酸磷酸0.5mg～2.5mg的間充質幹細胞無血清培養基。優選地，所述培養是在低氧條件下培養，其中，24h內細胞的氧濃度為21％，24h～26h氧濃度由21％均勻降到18％，第27h的氧濃度為18％，第28～36h氧濃度由18％均勻降到8％，第37h的氧濃度為8％，第38h～44h氧濃度由8％均勻降到2％，後持續於2％的氧濃度下培養；優選地，所述的細胞活率為97.3％。本發明還提供了一種人源脂肪間充質幹細胞因子濃縮液的製備方法，步驟如下：a、按照前述的方法培養，得培養液上清；b、過濾、濃縮。其中，所述過濾、濃縮方法是：先採用0.22μm濾膜過濾；然後通過40KD超濾膜，收集透析液，再將透析液通過100D超濾膜，收集截留液，得到細胞因子濃縮液,即可。本發明還提供了前述方法製備得到的人源脂肪間充質幹細胞因子濃縮液。本發明還提供了一種人源間充質幹細胞因子凍乾粉的製備步驟，如下：取前述細胞因子濃縮液，凍幹，得人源間充質幹細胞因子凍乾粉。其中，凍幹前，先加入凍幹保護劑；其中，所述凍幹保護劑每100ml中含有如下組分：生育酚0.5g、穀胱甘肽0.4g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘露醇4g、羥脯氨酸0.05g、精氨酸0.2g、組氨酸0.2g、蛋氨酸0.2g、酪氨酸0.2g、氨基乙酸2g、檸檬酸鈉0.26g。本發明還提供了前述方法製備得到的人源間充質幹細胞因子凍乾粉。本發明還提供了前述細胞因子濃縮液或前述細胞因子凍乾粉在製備化妝品或者修復皮膚損傷的藥物中的用途。本發明還提供了一種細胞因子化妝品或藥物，每10ml化妝品或藥物中包含前述間充質幹細胞因子凍乾粉0.005～0.05g，生物多糖膠0.1～0.145g，膠原蛋白溶液0.3ml，葉酸0.05g；優選地，每10ml中化妝品或藥物中包含前述的間充質幹細胞因子凍乾粉0.05g，生物多糖膠0.1g，膠原蛋白溶液0.3ml，葉酸0.05g。本發明分離純化人源脂肪間充質幹細胞因子的方法，通過特定的低氧培養體系和培養基培養得到高濃度細胞因子培養液，並且可有效去除間充質幹細胞培養液中的雜質，而且得到的細胞因子純度高，產量高，並且脂肪組織取材容易，不再依託臍帶組織來源，成本低廉。本發明的間充質幹細胞因子濃縮液能夠促進表皮細胞營養代謝；促進皮下膠原細胞功能，加速皮膚膠原細胞生長，增加膠原分泌，具有預防和修復皮膚損傷，延緩衰老，抗皺及美白等功效，而且使用時無皮膚乾燥等不適感。本發明的間充質幹細胞因子濃縮液與其他原料製備而成的化妝品或藥品，可以增強其皮膚修復、抗老化、祛皺美白等美容護膚功效，具有良好的市場前景。下面通過具體實施方式對本發明做進一步詳細說明，但是並不是對本發明的限制，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。附圖說明圖1為P5代ADSCADSC細胞表面標誌圖。圖2為燙傷後48h創面。圖3為燙傷後14d創面。圖4左圖為燙傷後18d創面。圖5左圖為燙傷後21d創面。圖2-圖5用藥說明：a為含本發明細胞因子的凝膠；b為生理鹽水；c為1％SD-Ag霜；d為成纖維細胞生長因子。具體實施方式下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照試劑盒說明書選擇。實驗試劑及儀器：試劑購買廠家CD45-FITCCD90-FITC美國Coulter公司HLA-DR-FITC美國Coulter公司CD105-PE美國Coulter公司DMEM/F12培養基美國GIBICO公司胰蛋白酶美國Sigma公司胎牛血清澳大利亞PAA無血清培養基美國GIBICO公司CoA(輔酶A)Solarbio公司TPP(輔羧酶)Solarbio公司FDA(黃素腺嘌呤二核苷酸)Solarbio公司UTP(尿苷酸磷酸)。Solarbio公司生物多糖膠Solabia公司膠原蛋白溶液(膠原蛋白濃度為10％)山東隆貝生物科技有限公司白蛋白成都蓉生藥業有限責任公司無血清培養基美國GIBICO公司；EGFELISA試劑盒美國RD公司FGF美國RD公司VEGF美國RD公司實施例1本發明脂肪間充質幹細胞因子的製備一、脂肪來源供者籤署脂肪捐贈知情者同意書，採集前檢查供者凝血功能、C型肝炎病毒抗體、愛滋病病毒Ⅰ/Ⅰ抗體、B型肝炎病毒抗原和梅毒螺旋體抗體。分離脂肪，保證所採脂肪無病毒汙染。二、製備方法脂肪改良培養基和本發明低氧培養組：1、人脂肪間充質幹細胞(AADSC)低氧培養上清液的獲取(1)細胞培養：將採集瓶中下層液體用吸管吸出，留下黃色脂肪組織，注意不要吸到黃色脂肪顆粒；加入30ml生理鹽水，振蕩採集瓶，清洗脂肪組織，然後靜置3分鐘，待分層後用吸管吸出下層液體。反覆重複此步驟，清洗3次；將採集瓶中清洗後的脂肪組織取出，每3ml放入一個100mm2培養皿中，用手術剪將脂肪組織剪成1mm3大小碎塊，均勻鋪在培養皿底部；每個培養皿加入10ml人脂肪幹細胞無血清培養基，然後將培養皿放置在37℃，5％CO2培養箱中培養；培養過程中，每3天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，並將培養上清液吸出，添加10ml新鮮培養基。用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，當觀察到培養皿中細胞生長出來且匯合度達40％時，將培養皿中上清液和脂肪組織吸出，注意不要吸到細胞。加入1ml0.25％胰酶-0.38g/LEDTA溶液消化細胞。在顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，即可加入5ml培養基終止消化。用移液器輕輕吹打瓶壁上剩餘的細胞，並輕輕吹打，將細胞吹散。將細胞轉移到15ml離心管中，1000rpm離心5min。棄上清，加入10ml培養基重懸細胞。此時獲得的細胞為P0代脂肪幹細胞。(2)製備種子庫細胞將收穫的細胞以3000個/cm2密度接種到T75培養瓶中，並採用無血清培養基培養。當細胞生長到匯合度75～85％時，收穫細胞，添加10％DMSO，用無血清培養基調整細胞量至1.0～10.0×106個/ml/管，用程控降溫儀降溫後保存在液氮罐中作為種子庫細胞(即P1代細胞)。對得到的P1代細胞進行活率測定，活率為98.3％。(3)製備人脂肪間充質幹細胞的上清液按需求量復甦種子庫細胞，進行擴大培養，復甦細胞活率為97.3％。將種子庫細胞以3000個/cm2密度接種到T75培養瓶中，並採用無血清培養體系培養。當細胞生長到匯合度75～85％時，對細胞(即P2代細胞)進行傳代，再以8000個/cm2密度接種到T225培養瓶中，在培養瓶中加入40ml高輔酶無血清培養基【培養基中加入了CoA(輔酶A)10mg～28mg/L、TPP(輔羧酶)5mg～15mg/L、FDA(黃素腺嘌呤二核苷酸)4mg～12mg/L、UTP(尿苷酸磷酸)0.5mg～2.5mg/L】，放入三氣培養箱，細胞按上述培養條件正常培養24h，24h後，氧氣濃度在24h～27h期間由21％均勻降到18％，並在18％維持1h，28h後調節氧濃度，使之在28h～37h期間由18％均勻降到8％，並持續在8％培養1h後調節氧濃度，使之在38h～44h期間由8％均勻降到2％，並持續在2％培養10h。當細胞生長到匯合度75～85％時，收集上清液並保存在-40℃低溫冰箱內，對細胞(即P3代細胞)進行傳代，如此重複操作直到收穫P5代細胞，按1.0～10.0×107個細胞/ml密度凍存(細胞凍存時加入10％DMSO)，並對最後收集的細胞上清液取樣，進行細胞活率、無菌、支原體、細菌內毒素檢測。(4)將收集的P2-P5代細胞的所有無血清培養液在37℃解凍後合併在一起，得到15L液體。脂肪常規培養實驗組：步驟(3)中培養基為常規的不添加高輔酶的無血清培養基，培養條件為正常氧狀態，其餘同脂肪改良培養基和本發明低氧培養組；脂肪改良培養基和現有低氧培養方法培養後的上清：步驟(3)中的低氧條件為：5％O2、5％CO2、90％N2，其餘同脂肪改良培養基和本發明低氧培養組；脂肪常規培養基和本發明低氧培養方法培養後的上清：步驟(3)中培養基為常規的不添加高輔酶的無血清培養基，其餘同脂肪改良培養基和本發明低氧培養組。2、過濾濃縮對收集的無血清上清液先採用0.22μm濾膜過濾，去除混在上清液中的細胞碎片；再採用分級無菌超濾分離機進行截留，此處所述分級超濾分離機，是由電磁供料泵、耐震壓力表、無菌原料罐、壓力表、無菌管道支架以及100D和40KD無菌有機濾膜等配件連接組成。培養上清液通過濾膜的順序為，先通過50KD有機濾膜，收集低於40KD的細胞因子液；然後將細胞因子液用電磁泵再次打入100d有機濾膜，收集到3L-5L細胞因子濃縮液，根據工藝需要，通過反覆濃縮可以將細胞因子體積濃縮為原培養上清液體積的1/3-1/10，即可。三、實驗結果1、人脂肪間充質幹細胞的形態取P5代細胞懸液進行流式檢測，檢測結果如表1，圖1所示。表1P5代ADSC細胞的免疫表型細胞免疫表型表達P5代ADSC細胞免疫表型CD90-FITC99.9CD105-PE99.9CD73-FITC99.7HLA-DR-PC51.0CD45-PC70.3CD14/34/79a-PE1.1FITC：代表異硫氰酸螢光素標記；PE：代表藻紅蛋白標記；PC5：藻紅蛋白－花青素5、P75：藻紅蛋白－花青素7。由表1，圖1可見，細胞高表達CD90、CD105、CD73，但不表達CD45、HLA-DR\CD14/34/79a，符合人脂肪間充質幹細胞的表面標誌特徵。2、細胞因子濃縮液中的細胞因子含量測定用ELISA試劑盒對表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)為代表的細胞因子進行檢測，試驗中對正常培養條件和常規無血清培養基培養所得的培養上清液、和改良後的培養基與低氧濃度培養所得培養上清液進行細胞因子含量測定。再對脂肪培養所得上清液採用100D與40KD聯合超濾後進行含量測定，以及回收率檢測。試驗均取5L細胞培養上清液，用0.22μm濾膜過濾後進行超濾，直至濃縮液為500mL為止，即濃縮10倍(而現有專利一般濃縮20倍以上)，取樣進行含定比較。檢測結果見表2。表2細胞因子含量對比由表2可見，與組1採用常規的培養方法(培養基為常規培養基，且氧濃度為正常氧濃度)相比，本發明改進的培養方式(組2)可以有效提高細胞因子表達水平，進而提高最終得到的產物中的生長因子含量；與現有低氧培養方法相比(組3)，本發明改進的低氧培養方式(組4)可以有效提高細胞因子的表達水平，進而提高最終得到的產物中的生長因子含量；與組1採用常規的培養方法(培養基為常規培養基，且氧濃度為正常氧濃度)相比，本發明同時改進培養基和採用低氧培養(組4)的方法，最終得到的產物中的生長因子含量高。實驗結果說明，本發明改良後的培養基與低氧濃度培養方式，均可以有效提高上清中生長因子的含量，獲得上清後用濾膜超濾法進一步純化，得到的細胞培養上清液的細胞因子含量均較高，回收率高。而且發明中採用脂肪得到細胞培養上清液，所得到的培養上清液中細胞因子量高且穩定，濃縮倍數少，節約時間，利於工業化，用於美容護膚，優勢明顯。實施例2本發明間充質幹細胞因子的製備1、取實施例1製備得到的細胞因子濃縮液，通過反覆超濾調整細胞因子濃縮液濃度，使濃縮液中EGF含量為6ug/ml。2、在細胞因子濃縮液中加入一定量凍幹保護劑，使EGF的含量為0.5ug/ml，並調節pH值為6.0。其中，凍幹保護劑每100ml中含有如下組分：生育酚0.5g、穀胱甘肽0.4g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘露醇4g、羥脯氨酸0.05g、精氨酸0.02g、組氨酸0.2g、蛋氨酸0.2g、酪氨酸0.2g、氨基乙酸2g、檸檬酸鈉0.26g。凍幹條件為：溫度在-25～-40℃，壓強維持在10-30pa，時間為18-28h，得到細胞因子凍乾粉。3、細胞因子凍乾粉的活性測定採用細胞增值法/MTT比色法測定凍幹前溶液的EGF和凍幹後的EGF，其EGF的活性保持率為97.1％。細胞因子凍乾粉水分經測定小於1.3％。本發明的凍幹保護劑可以有效保護細胞因子的活性，而且凍幹時間短，生產效率較高。實施例3本發明細胞因子化妝品或藥物的製備取實施例2製備的細胞因子凍乾粉，加入生物多糖膠、膠原蛋白、葉酸、無菌超純水製成組合物，該組合物可以加入到常規護膚品中，也可單獨作為護膚品使用。其中10ml水溶液中含細胞因子凍乾粉0.05g，生物多糖膠0.1g，膠原蛋白無菌溶液0.3ml、葉酸0.05g。實施例4本發明細胞因子化妝品或藥物的製備取實施例2製備的細胞因子凍乾粉，加入生物多糖膠、膠原蛋白、葉酸、無菌超純水製成組合物。其中10ml水溶液中含細胞因子凍乾粉0.025g，生物多糖膠0.125g，膠原蛋白無菌溶液0.3ml、葉酸0.05g。實施例5本發明細胞因子化妝品或藥物的製備取實施例2製備的細胞因子凍乾粉，加入生物多糖膠、膠原蛋白、葉酸、無菌超純水製成組合物。其中10ml水溶液中含細胞因子凍乾粉0.005g，低分子量生物多糖膠0.145g，膠原蛋白無菌溶液0.3ml、葉酸0.05g。以下通過試驗例具體說明本發明的有益效果。試驗例1本發明間充質幹細胞因子的凍幹保護劑篩選一、試驗方法1、取實施例1製備得到的細胞因子濃縮液，通過超濾調整濃度，使濃縮液中EGF含量為0.6ug/ml。2、在細胞因子濃縮液中加入一定量的凍幹保護劑，使EGF的含量為0.5ug/ml，並調節pH值為6.0。凍幹保護劑配方分別如下所示：配方1：100ml中含有如下組分：生育酚0.5g、穀胱甘肽0.4g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.5g、海藻糖1.5g，甘露醇4g、羥脯氨酸0.05g、精氨酸0.0.2g、組氨酸0.2、蛋氨酸0.2、絡氨酸0.2、氨基乙酸2g、檸檬酸鈉0.26g。配方2：100ml中含有如下組分：抗壞血酸(VC)1.0g，人白蛋白0.5ml,右旋糖苷3.8g、海藻糖3.0g，甘氨酸0.1、精氨酸0.17g、氨基乙酸4g、檸檬酸鈉0.26g。3、在壓強為10～30pa，-25～-40℃下進行凍幹。二、試驗結果見表3。表3兩種凍幹保護劑比較組分凍幹時間EGF活性凍乾粉所含水分(n＝3)配方130h97.1％1.2％配方235h94.2％1.7％由表3可見，使用本發明凍幹保護劑配方(配方1)可以顯著增加EGF活性，而且凍乾粉中水分含量低，使凍乾粉更易於保存。因此，本發明的凍幹保護劑用於凍幹時效果好，具有顯著優勢。試驗例2本發明細胞因子化妝品或藥物的配方篩選一、方法選取體重250g左右雄性Wistar大鼠30隻。經脫毛、局麻後，用3cm沸水加熱鐵棒緊貼背部皮膚，持續7s，每隻大鼠背部造成4個創面。燙傷後立即腹腔注射乳酸林格氏液5ml抗休克,創面經病理證實為深Ⅰ度。大鼠24隻隨機分為兩組：正常對照組(6隻)和實驗組(24隻)，實驗組分為4組，每組6隻，實驗組動物分別塗抹實施例3、4、5的藥物，每日一次。於燙傷後10d、14d、18d、21d測量創面癒合率。二、結果1、創面癒合率燙傷後10d、14d、18d、21d的創面癒合率如下表所示：表4各組創面癒合率比較(％,x±s，n＝6)*：與生理鹽水相比，P<0.05；#：與最佳組(實施例3)相比，P<0.05。由上表可以看出，本發明三個實驗組的癒合效果顯著優於對照組，說明三個組合的藥品/化妝品均可以有效促進創面癒合，其中，實施例3所示的組合方式的癒合效果最佳，顯著優於另外兩個實驗組。試驗例3本發明間充質幹細胞因子的應用一、方法選取體重250g左右雄性Wistar大鼠48隻。經脫毛、局麻後，用3cm沸水加熱鐵棒緊貼背部皮膚，持續7s，每隻大鼠背部造成4個創面。燙傷後立即腹腔注射乳酸林格氏液5ml抗休克,創面經病理證實為深Ⅰ度。大鼠4處創面分別給予含本發明細胞因子的凝膠、按照公開號為CN105543313A的申請的實施例4製備的藥物、成纖維細胞生長因子噴霧劑、1％SD-Ag霜和生理鹽水，每日一次。大鼠48隻隨機分為兩組：正常對照組(6隻)和實驗組(42隻)，實驗組分為7組，每組6隻，其中試驗組每組又隨機分為A、B二個小組，每小組3隻，A小組與B小組前後兩個創面用藥相交換，以排除部位不同的幹擾。7組大鼠分別於燙傷後4h、12h、24h、48h、7d、14d、21d處死，取創面全層皮膚測量創面癒合率和創面微血管密度。二、結果2.1創面癒合率燙傷後第10d，各組間創面癒合率沒有顯著差別，第14d、18d和21d時，含本發明細胞因子的凝膠組和成纖維細胞生長因子組創面癒合率顯著大於SD-Ag和生理鹽水組(P<0.05)，而含本發明細胞因子的凝膠組與成纖維細胞生長因子組、SD-Ag組與生理鹽水組間無顯著性差異。見表5、圖2～圖5。表5各組創面癒合率比較(％,x±s，n＝6)*：與生理鹽水相比，P<0.05；#：與1％SD-Ag霜相比，P<0.05。2.2創面微血管密度(MVD)燙傷後各組創面組織微血管密度逐漸增加，第21d達高峰。在燙傷後第7d，含本發明細胞因子的凝膠創面MVD顯著多於SD-Ag和生理鹽水組，燙傷後第14d和21d，含本發明細胞因子的凝膠組和成纖維細胞生長因子組與SD-Ag和生理鹽水組相比，創面MVD顯著增加(P<0.05)，含本發明細胞因子的凝膠組與成纖維細胞生長因子組間以及SD-Ag組與生理鹽水組間相比，差異無顯著性意義，見表6。表6創面微血管密度變化(條/mm2，x±s，n＝6)註：*：與生理鹽水相比，P<0.05；#：與1％SD-Ag霜相比，P<0.05。由表5、表6以及圖2～圖5可知，本發明藥物/化妝品促進創面癒合的能力優良，優於市售的藥物成纖維細胞生長因子噴霧劑和1％SD-Ag霜，同時也優於現有文獻報導的類似產品，修復效果良好，應用前景優良。綜上，本發明方法製備得到的濃縮液脂肪間充質幹細胞因子含量高，質量穩定，與其他材料在特定配比下組合物製備的產品，修復皮膚損傷的效果好；而且本發明方法簡單易行、適合大規模生產，具有良好的市場前景。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp