長效重組人促卵泡激素融合蛋白的製作方法

2023-07-12 13:40:26 1

長效重組人促卵泡激素融合蛋白的製作方法
【專利摘要】本發明公開了長效重組人促卵泡激素融合蛋白(Human?follicle-stimulating?hormone-Fc?fusion?protein，簡稱hFSH-Fc)及其製備方法，該hFSH-Fc蛋白為二聚化融合蛋白，其胺基酸序列從N端到C端依次包括hFSHβ亞基、CTP、hFSHα亞基、柔性肽接頭和人IgG?Fc變體，其體內半衰期比現有人促卵泡激素更長，副作用更小。本發明還涉及重組hFSH-Fc融合蛋白組合物在製備治療和/或預防不孕不育症的藥物中的用途。
【專利說明】長效重組人促卵泡激素融合蛋白
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學和醫藥領域。更具體地，本發明涉及長效重組人促卵泡激素融合蛋白、其製備方法及應用。該融合蛋白體內半衰期顯著延長，其療效優於現有的人促卵泡激素。
【背景技術】
[0002]目前，世界範圍內不孕症率高達15%，成為繼癌症和心腦血管疾病之外，嚴重影響人類健康的第三大疾病。我國不孕症人數佔生殖婦女人數10%以上，且其發病率呈明顯上升趨勢。人促卵泡素(Human follicle-stimulating hormone,簡稱hFSH)是目前市場常見的用於治療男女不孕症藥物的主要成份，我國目前市場包括人尿來源的FSH藥物和重組FSH。
[0003]尿源hFSH存在病毒汙染、原料來源有限、採集困難、含量低及純化過程複雜等問題，歐美等發達國家普遍不接受尿源產品上市和銷售。相比而言，重組hFSH在其純度、抗原性、安全性、無病毒感染等方面具有尿源hFSH無法比擬的優點。hFSH是一種糖基化蛋白，SDS-PAGE檢測其分子量為43KD。作為一種治療藥物，保證其生物活性，必要的條件是具有正確的三維結構和糖基化修飾。具有完善翻譯後修飾功能是哺乳動物細胞被選作大多數生物藥蛋白表達宿主的主因。其中，中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO)是用於真核生物外源基因表達最為成功的宿主細胞，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達，很多藥物已投放市場，如ΕΡ0、G-CSF等。與其它表達系統相比，該系統具有許多優點，如擁有完備的翻譯後加工過程，包括糖基化、羥基化，使表達的外源真核基因產物能夠保持其天然結構及活性，且使表達產物分泌到胞外，有利於外源蛋白的分離純化。
[0004]雖然目前已有利用CHO細胞生產的重組藥物hFSH上市，但仍然存在如下問題:首先，其半衰期短，臨床上為了達到有效的治療效果，需要頻繁給藥，給患者帶來極大痛苦。例如，當用於排卵時，患者必須每日1-2次肌肉內或皮下注射hFSH，通常需要注射8-12天甚至更長時間。這種治療方案常伴有不良的副作用，包括對神經、內分泌和免疫系統的刺激和毒副作用，並導致常見的併發症如卵巢過度刺激症候群，表現為卵巢增大、全身毛細血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重組hFSH表達量低，製備過程複雜和生產成本巨大。另外，hFSH是具有兩條單鏈(α鏈和β鏈)的糖基化蛋白，鏈間以非共價鍵連接，兩條鏈的正確摺疊才能保證hFSH的生物活性。如何在蛋白表達和純化過程中保持兩條鏈的正常結合是一個挑戰。針對現有重組hFSH及同類產品的缺陷，本發明利用優化的分子生物學技術、細胞生產和純化工藝開發新型的重組hFSH產品，以延長半衰期、保持其生物活性、提高重組hFSH蛋白表達水平，從而增加其藥效、降低副作用。

【發明內容】

[0005]本發明旨在提供重組人促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulatinghormone-Fc fusion protein,簡稱hFSH-Fc)、其製備方法及應用，以解決現有技術中重組hFSH表達量低、純化難、體內半衰期短的問題。
[0006]本發明的一個目的是提供重組hFSH-Fc融合蛋白，該融合蛋白為二聚化融合蛋白，其胺基酸序列從N端到C端依次包含hFSHii亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭(Linker,簡稱 L)和人 IgG Fe 變體(vIgG4Fc、vlgGlFc)，如 SEQ ID NO:2、4 所示(hFSH β -CTP-hFSH a -L_vIgG4Fc、hFSH β -CTP-hFSH a -L-vIgGlFc 胺基酸序列)，上述融合蛋白統稱為hFSH-Fc。
[0007]所述的hFSHP亞基的胺基酸序列去除了常規hFSHP亞基中的1_18位胺基酸殘基，如SEQ ID NO:7所示。
[0008]所述的CTP(carboxy_terminal peptide,羧基端肽)的胺基酸序列來自HCG β鏈羧基末端的28-34個胺基酸殘基，優選CTP為來自HCG β鏈羧基末端的33個胺基酸殘基序列，如SEQ ID NO:6所示。
[0009]所述的hFSHa亞基的胺基酸殘基序列去除了常規hFSH a亞基中的1_24位胺基酸殘基，如SEQ ID N0:5所示。
[0010]所述的肽接頭含有2-20個胺基酸殘基，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的胺基酸殘基，優選的肽接頭胺基酸序列為
[0011] GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
[0012]所述的人IgG Fe變體包括:(I)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2 和 CH3 區域；(2)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區、CH2和CH3區域。
[0013]以下具體介紹本發明的人IgG Fe變體、肽接頭和CTP功能:
[0014]IgG Fe 變體
[0015]IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質，它們的半衰期可高達21天，而Fe片段是IgG保持體內較長半衰期的主要原因，同時具有穩定蛋白的作用。
[0016]Fe來自免疫球蛋白的Fe區域，Fe在消滅病原體的免疫防禦中具有重要作用。IgG的效應子功能由Fe介導，通過兩種主要機制:(I)與細胞表面Fe受體(FcyRs)的結合，通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補體成分Cl的Clq部分的結合，引發依賴於補體的細胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型((IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)中，IgGl能有效的結合Fe Y Rs，IgG4與Fe Y Rs的結合親和力比IgGl低一個數量級。人IgGl還能有效地結合Clq，並激活補體級聯反應，而IgG4表現極端缺乏激活補體級聯的能力。對於醫療用途而言，重組二聚化蛋白的Fe區域必須不會介導效應子功能而裂解或除去這些細胞。因此，hFSH-Fc的Fe區域必須是非裂解性的，即在結合Fe y Rs和Clq而觸發效應子功能方面，Fe最好是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產生hFSH-L-Fc重組二聚化蛋白。為了得到非裂解性的Fe，必須使天然Fe區域中的一些胺基酸突變，以減少其效應子功能。
[0017]通過分析不同種屬的IgG同種型的胺基酸序列，發現CH2區域氨基末端附近的Fe部分顯示在IgG Fe與Fe Y Rs的結合中起作用，而與Clq結合至關重要的部分位於人IgG的CH2區域羧基端附近。為了減少Fe與Fe YRs和Clq的結合而引發的效應子功能，本發明使用下列人IgG Fe變體(如圖1):
[0018](l)IgG4Fc 變體(vIgG4Fc):含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變的人 IgG4 絞鏈區、CH2和CH3區域；
[0019](2) IgGlFc 變體(vlgGlFc):含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro33ISer 突變的人IgGl絞鏈區、CH2和CH3區域。
[0020]上述Fe變體比天然IgG4Fc和IgGlFc表現出低得多的效應子功能，更適於製備重組hFSH-Fc融合蛋白。
[0021]肽接頭
[0022]連接肽的長度對重組二聚化蛋白的活性非常重要。已有人報導了促紅細胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，與EPO單體相比，含有2個完整的EPO區域(相隔3到7個胺基酸肽接頭)的重組二聚化蛋白表現出減弱的活性(參見Qiu H等，J Biol Chem,273:11173-11176，1998)。然而，當這兩個EPO區域間的肽接頭的長度為17個胺基酸時，二聚體EPO分子的體外和體內生物活性明顯提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem, 274:24773-24778，1999 ;美國專利N0.6，187，564)。這可能解釋為重組二聚化蛋白兩部分間增加的連接肽，使該分子的兩部分能分別行使其功能(參見Ashkenazi A等，Curr Opin inImmunol,9: 195-200,1997)。
[0023]本發明人經過長期而深入的研究，首次設計了一種獨特的絞鏈區肽接頭來降低空間位阻效應，可以製得hFSH α鏈的C端與Fe變體偶聯的重組二聚化蛋白，中間有柔軟的肽接頭。此重組二聚化蛋白不僅不會導致hFSH的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高hFSH-Fc重組二聚化蛋白的生物活性。優選肽接頭的胺基酸殘基序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
[0024]CTP
[0025]糖基化對於蛋白的活性和半衰期有重要作用，蛋白上的糖基化位點有兩類，包括O-糖肽鏈和N-糖肽鏈。CTP是一段來自HCG β鍵羧基末端的28-34個胺基酸殘基，有文獻報導HCG較hFSH相對長的半衰期，主要來源於此CTP肽段。它含有4個O-連接的糖基化位點，可以增加蛋白的糖基化水平，提高蛋白的活性和延長蛋白在體內的半衰期。
[0026]本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白具有以下特徵:該重組融合蛋白為二聚化融合蛋白，其胺基酸序列從N端到C端依次包含hFSHii亞基、CTP、hFSHa亞基、肽接頭和人IgGFe變體。人IgG Fe變體具有延長體內半衰期和穩定蛋白的作用，Fe變體是非裂解性的，可減少與Fe Y Rs和Clq結合而觸發的效應子功能。CTP可提高蛋白活性及延長體內半衰期，其無免疫原性，通過CTP連接hFSH的α鏈和β鏈，不僅無副作用，且可以使兩條鏈之間有一定的位阻，有利於其正確摺疊而不影響功能。通過柔軟的肽接頭進行hFSH α鏈的C端與Fe變體的偶聯，能夠維持、甚至提高重組hFSH-Fc融合蛋白的生物活性。
[0027]本發明首次將CTP、肽接頭和人IgG Fe變體有序地連接到FSH中而形成新型的重組hFSH-Fc融合蛋白，該融合蛋白中人IgGFc變體、CTP和肽接頭的位置排列能維持FSH正確的空間構型，而不影響其生物活性，並可顯著延長半衰期，臨床應用時可減少注射頻率，降低現有治療方案中產生的毒副作用。
[0028]本發明另一個目的是提供重組hFSH-Fc融合蛋白的製備方法，該製備方法包括:
[0029](1)構建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達載體；
[0030](2)重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達；
[0031 ] (3)高密度細胞培養重組hFSH-Fc融合蛋白；[0032](4)重組hFSH-Fc融合蛋白的純化製備。
[0033]具體來說，構建編碼重組hFSH-Fc蛋白的基因表達載體步驟為:採用人工合成方法獲得編碼重組hFSH-Fc融合蛋白基因進行了密碼子優化的核苷酸序列(如SEQ ID NO=U3所示)，插入到哺乳動物細胞表達載體(如P⑶NA3)，獲得含有hFSH-Fc目的基因表達質粒pCDNA3-hFSH-Fc (圖5)。基因的核苷酸序列優化是基於哺乳動物宿主細胞偏愛的密碼子來選擇設計。
[0034]所述的哺乳動物細胞表達載體可採用市售的但不限於，如:p⑶NA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用於真核細胞系統表達的載體，優選，pCDNA3。
[0035]重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達步驟為:將含有hFSH-Fc蛋白的表達質粒轉染到合適的哺乳動物宿主細胞，篩選獲得穩定高表達目的蛋白的細胞株。
[0036]所述的哺乳動物宿主細胞包括CH0、HEK293、C0S、BHK、NS0和Sp2/0細胞。優選，CHO細胞；更優選，已馴化適應無血清培養基中懸浮生長的DHFR(Dihydrofolate Reductase,二氫葉酸還原酶)缺陷型CHO細胞(簡稱CH0-DHFR_)。
[0037]所述的轉染方法包括磷酸鈣法、電穿孔轉染法、脂質體轉染，優選的轉染方法是電穿孔轉染法。
[0038]所述的篩選方法是先利用篩選標記進行篩選，然後用擴增選擇性標記可提高表達量並獲得穩定高表達細胞株 。篩選標記是本領域內已知的任何一個合適的選擇性抗性標記，如ZEO (Zeocin,博來黴素)、G418 (氨基糖苷類抗生素)、PUR(puromycin,嘌呤黴素)、HYP(Hygromycin,潮黴素)，優選的抗性基因為ZEO ;篩選標記也可為本領域內已知的任何一個突光標記基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein,綠色突光蛋白)、RFP (RedFluorescent Protein,紅色突光蛋白)，優選的突光標記基因為GFP。擴增選擇性標記是本領域內已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase,穀氨醯胺合成酶)序列，優選的擴增選擇性基因是DHFR。由於CHO-DHFR-細胞自身缺失二氫葉酸還原酶(DHFR)，無法自身合成四氫葉酸,所以必須在添加了次黃嘌呤(hypoxanthine)、胸腺喃唳(Thymidine)和甘氨酸的培養液中才能得以存活。而通過目的基因與DHFR基因共轉染，不僅得到在不含上述添加劑的培養基上也能生長的細胞克隆，更為重要的是由於DHFR可被葉酸類似物MTX (Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，DHFR基因必須擴增到很多的拷貝數才能生存，從而得到抗MTX細胞系；又由於與DHFR基因共轉染的目的基因傾向於同它一起整合到細胞染色體上的同一區域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴增而擴增，可得到大量表達外源蛋白的細胞克隆。
[0039]高密度細胞培養重組hFSH-Fc融合蛋白的步驟為:將上述篩選到的穩定細胞株轉入搖瓶或生物反應罐進行大規模培養，特別是，本發明通過對細胞培養條件的優化，獲得高表達重組hFSH-Fc融合蛋白的細胞培養液。本發明的細胞培養方法可實現高密度細胞培養、重組蛋白質量和產量提升、重組蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。
[0040]所述的細胞培養條件的優化包括降溫培養法，具體來說，當細胞密度達到I X IO7個/mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養直至表達產量不再增加。該方法可以提高表達蛋白的活力水平及重組蛋白的累積產量。
[0041]所述的細胞培養條件的優化方法還包括在培養基中加入特殊的添加劑，優選，在基礎培養基加入100 μ M Cu2+，feeding培養基加入2mM ManNAc (N-乙醯基-D-氨基甘露糖)。該方法可使重組hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20 %。
[0042]重組hFSH-Fc融合蛋白的純化製備步驟為:
[0043]DProtein A親和層析:離心，收集上清，根據本發明蛋白偶聯Fe片段的特性，利用親和Protein A柱層析。
[0044]2)疏水層析柱純化:採用疏水層析柱，根據重組hFSH-Fc融合蛋白的疏水性不同，進一步去除上述ProteinA純化後目標蛋白中的雜質。
[0045]所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。優選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
[0046]本發明所公開的重組hFSH-Fc融合蛋白的製備方法，表達產量高且因與IgG Fe變體的偶聯，所形成的重組蛋白可以通過ProteinA親和層析得到高效便捷的純化。經疏水層析進一步純化後得到的融合蛋白純度達到98%以上。此外，本發明所公布的重組hFSH-Fc融合蛋白中α鏈和β鏈可正確摺疊在一起，避免了 α-α 二聚體、β-β 二聚體的出現，大大簡化了純化步驟，降低了生產成本。
[0047]本發明的還一個目的是提供了含有重組hFSH-Fc融合蛋白的藥物組合物，其特徵在於，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發明所述的重組hFSH-Fc融合蛋白。
[0048]具體來說，所述的藥物組合物含有有效量(如0.000001-90wt % ;較佳的
0.l-50wt% ;更佳的，5-40wt% )的本發明的重組長效hFSH-Fc融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將有效量的本發明融合蛋白配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。
[0049]所述的藥學上可接受的載體包括(但並不限於):蔗糖、甘露醇、吐溫20 (Tween20)、蛋氨酸、鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、及其組合物。通常藥物製劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物製劑還可製成緩釋製劑。
[0050]本發明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於:所述的融合蛋白的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。
[0051]本發明的再一個目的是重組hFSH-Fc融合蛋白在治療和/或預防人不孕不育症中的應用。
[0052]本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白體內半衰期顯著延長，從而改善了藥物動力學和藥效，與現有FSH比較，在臨床應用上可減少患者注射次數，降低副作用，減輕患者痛苦和經濟負擔。
[0053]本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白及其製備方法的優點概括如下:
[0054]1、本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白是由CTP、肽接頭和人IgGFc變體(vIgG4Fc或vlgGlFc)與hFSH有序偶聯形成的新型融合蛋白，維持了 FSH的正確空間構型，可顯著延長蛋白的體內半衰期，大大提高hFSH在CHO細胞中的表達量，且其體外和體內活性與現有天然hFSH類似。
[0055]2、二聚化單鏈hFSH-Fc融合蛋白的α鏈與β鏈以共價鍵正確摺疊，避免形成α-α 二聚體和β-β 二聚體，大大簡化了純化工藝，降低生產成本。
[0056]3、本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白體內半衰期顯著延長，其半衰期是現有重組hFSH的3倍以上，在臨床應用上可減少患者注射次數，降低現有治療方案產生的副作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]圖1.顯示了人IgGl、IgG4和它們變體的絞鏈區和CH2區域的胺基酸序列的比對。比較這三部分胺基酸序列:胺基酸區域228、234-237和330-331。這些變體的胺基酸突變以粗斜體顯示。胺基酸殘基編號是根據EU編號體系標定。
[0058]圖2.顯示了重組hFSH-Fc單鏈及二聚化結構示意圖。a)單鏈hFSH-Fc ；b) 二聚化的 hFSH-Fc。
[0059]圖3.顯示了在 pCDNA3 表達載體內 HindII1-EcoRI 片段的 hFSH-Fc (hFSH β-CTP-hFSHa-L-vIgG4Fc)的核苷酸序列及推導的胺基酸序列。hFSH-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導肽(l-18)、hFSHi3鏈、CTP、成熟hFSHa鏈、肽接頭、IgG4Fc變體(vIgG4Fc)。成熟的重組 hFSH-Fc 融合蛋白含有成熟 hFSH β 鏈(19-129)、CTP (130-162)、成熟 α 鏈(163-254)、肽接頭(255-270)和 IgG4Fc 變體(vIgG4Fc) (271-499)。
[0060]圖4.顯示了在 pCDNA3 表達載體內 HindII1-EcoRI 片段的 hFSH-Fc (hFSH β-CTP-hFSHa-L-vIgGlFc)的核苷酸序列及推導的胺基酸序列。hFSH-Fc的核苷酸序列包括編碼含前導肽(1-18),hFSH β鏈、CTP、成熟hFSH α鏈、肽接頭、IgGlFc變體(vlgGlFc)。成熟的重組 hFSH-Fc 融合蛋白含有成熟 hFSH β 鏈(19-129)、CTP (130-162)、成熟 α 鏈(163-254)、肽接頭(255-270)和 IgGlFc 變體(vlgGlFc) (271-497)。
[0061]圖5.顯示了所構建編碼hFSH-Fc融合蛋白的真核表達質粒圖譜。該表達質粒全長9063bp，含有10個主要基因片斷，包括1.CMV啟動子；2.目標基因hFSH-Fc ;3.1RES ;
4.Zeocin抗性篩選基因；5.BGH終止子；6.SV40啟動子；7.DHFR擴增基因；8.SV40終止子；
9.氨節青黴素抗性基因(Ampicillin) ; 10.ColEl複製起點(Ori)。
[0062]圖6.顯示了在7L生物反應器中重組hFSH-Fc細胞株表達分泌hFSH-Fc蛋白的累積趨勢曲線圖。
[0063]圖7.Western bloting結果顯示了重組hFSH-Fc融合蛋白在CHO細胞中的成功表達。非還原膠，Lanel:尿來源的hFSH(約43kDa) ;Lane2:本發明的重組hFSH-vIgGlFc融合蛋白(約140kDa) ；Lane3:本發明的重組hFSH_vIgG4Fc融合蛋白(約140kDa)。
[0064]圖8.顯示了單鏈和二聚化hFSH-Fc在還原條件和非還原條件下的10% SDS-PAGE電泳圖譜。Lanel:非還原膠，重組二聚化hFSH-vIgGlFc融合蛋白(約140kDa) ；Lane2:非還原膠，重組二聚化hFSH-vIgG4Fc融合蛋白(約140kDa) ；Lane3:還原膠，重組單鏈hFSH-vIgGIFc融合蛋白(約70kDa) ；Lane4:還原膠,重組單鏈hFSH_vIgG4Fc融合蛋白(約70kDa)。
[0065]圖9.顯示了本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白、重組hFSH和人尿hFSH在大鼠體內的代謝曲線。
【具體實施方式】[0066]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規條件如Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(NewYork: Co Id Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0067]實施例1.構建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達載體
[0068]基因序列設計是基於CHO細胞偏愛密碼子進行優化，採用人工合成的方法合成經過優化的含有編碼hFSH蛋白β鏈的信號肽及其成熟肽段、CTP和hFSHa鏈成熟肽段的融合基因，將所合成的756bp DNA片段插入轉移載體如PUC57中的EcoRV限制性酶切位點間，獲得了 hFSH質粒(phFSH)，使用DNA測序方法驗證插入序列的正確性。
[0069]分別人工合成含有BamHI (5』端)和EcoRI (3』端)酶切位點的編碼柔性肽接頭(Linker,簡稱「L」)和人IgGFc變體(vIgG4Fc和vlgGlFc)片段的融合基因L_vIgG4Fc和L-vIgGlFc。將獲得的融合基因片段分別插入到轉移載體如TOC19的BamHI和EcoRI位點間，得到含兩種變體的質粒，分別為pL-vIgG4Fc和pL-vIgGlFc。通過DNA測序驗證L-vIgG4Fc和L-vIgGlFc的基因序列。為製備兩種hFSH-L-Fc融合基因，用限制性內切酶SpeI和BamHI雙酶切phFSH質粒，凝膠電泳後膠回收編碼hFSH蛋白β鏈的信號肽及其成熟肽段、CTP和hFSHa鏈成熟肽段的融合基因片段，經純化的上述基因片段分別插入到PL-vIgG4Fc和pL-vIgGIFc質粒中肽接頭的5'-端，T4連接酶連接構成phFSH_L-VIgG4Fc和phFSH-L-vIgGIFc質粒。所構建的融合基因由hFSHβ、CTP、hFSHa、肽接頭和Fe變體基因組成，其單鏈結構如圖2a所示，二聚化結構如圖2b所示。
[0070]限制性內切酶Spel/EcoRI 分別雙酶切 phFSH-L_vIgG4Fc 和 phFSH-L-vIgGlFc質粒，DNA凝膠純化得到hFSH-L-vIgG4Fc和hFSH-L-vIgGlFc片段。將純化好的三種hFSH-L-Fc片段插入到哺乳動物細胞表達質粒如P⑶NA3 (Invitrogen)的相應酶切位點間，最終獲得含融合基因表達質粒pCDNA3-hFSH-L-vIgGlFc和pCDNA3-hFSH-L_vIgG4Fc，統稱為pCDNA3-hFSH-Fc質粒，如圖5所示。該質粒含哺乳動物細胞高效表達外源基因蛋白所需的啟動子CMV ;該質粒還含有兩種選擇性標記基因，從而在細菌中可以具有氨苄青黴素抗性，在哺乳動物細胞中可以具有博來黴素(zeocin)抗性。此外，當宿主細胞是DHFR基因表達缺陷型時，PCDNA3表達載體所含有的小鼠的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在時，能共擴增pFSH-Fc融合基因和DHFR基因。
[0071]用CTP肽段連接hFSH的α鏈和β鏈，可便於兩條鏈正確摺疊。通過肽接頭(較佳地為柔性接頭)進行hFSH和Fe片段的偶聯可提高蛋白的生物活性，對本發明而言，優選的是長度為約20個或更少(但不能少於2個)胺基酸的肽接頭，當然由I個胺基酸構成的肽接頭也在本發明的保護範圍內，宜使用含有或由2個或更多選自以下胺基酸構成的肽接頭:甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。本發明實施例的肽接頭含有Gly-Ser肽構件，其胺基酸序列為 GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
[0072]實施例2.重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物細胞中的穩定表達
[0073]將實施例1構建的表達質粒pCDNA3-hFSH-L-Fc轉染入DHFR酶缺陷型CHO宿主細胞(CHO-DHFR_)，圖2b顯示了重組二聚化hFSH-Fc融合蛋白的示意圖。採用電轉法進行轉染，使用 960 μ Fd 電容的Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA)，將其電場設置為250V，在比色杯內的2~5 X IO7個細胞中加入10 μ g用PvuI線性化的質粒DNA。在轉染兩天後，將培養基改成含100 μ g/mL Zeocin抗性標記基因的生長培養基，獲得經抗性初篩的轉染子。採用westernblotting的方法,用抗hFSH抗體檢測hFSH-Fc的表達。利用DHFR擴增選擇性標記基因提高重組二聚化蛋白的表達水平，為此在含有遞增濃度MTX的生長培養基中，用DHFR基因共擴增轉染的重組二聚化蛋白基因。用極限稀釋法亞克隆能在高達ΙΟμΜ/mL MTX培養基中生長的轉染子。對亞克隆細胞系的分泌率作進一步分析。篩選分泌水平超過約5 (較佳地約20) μ g/106(即百萬)個細胞/24小時的細胞株，獲得穩定高表達重組hFSH-Fc融合蛋白的細胞株。
[0074]實施例3.重組hFSH-Fc融合蛋白的生產和純化 [0075]將實施例2得到的高產量細胞株，首先在培養皿中進行無血清馴化培養，然後轉移到搖瓶中進行懸浮馴化培養，馴化過程中同時進行培養基的篩選，加入不同的成分觀察細胞的生長狀態、生長趨勢，以及表達產物的活性和唾液酸等生化指標，優選的細胞培養條件為:基礎培養基加入100 μ M Cu2+，feeding培養基加入2mM ManNAc (N-乙醯基-D-氨基甘露糖)，該方法可使重組hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高約20%。馴化成功後，進行細胞擴增，擴增到足夠量，進行7L生物反應器監測培養，在細胞密度超過IX IO7個/mL時開始降溫至33°C培養，批次生長周期為20天。用Iml ProteinA柱層析對重組蛋白進行初步純化，測定兩種重組hFSH-Fc融合蛋白的表達量，結果顯示，重組hFSH-L-vIgG4Fc和重組hFSH-L-vIgGlFc細胞株表達的累積產量分別為0.82g/L、0.73g/L (圖 6)。
[0076]重組hFSH融合蛋白的純化包括以下步驟:
[0077]DProtein A親和層析:離心，收集上清，根據本發明蛋白偶聯Fe片段的特性，利用親和層析方法，將上清液加樣到磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)平衡的Protein A柱；待重組融合蛋白結合於ProteinA後，用PBS洗滌該柱，直至0D280值低於0.01，再用20mM pH為4.0的醋酸鈉緩衝液洗脫結合的重組FSH-Fc融合蛋白，最後用ρΗΙΟ.0的IM Tris-HCl緩衝液中和活性收集液。純化的hFSH-Fc蛋白純度可達到95%以上。
[0078]2)疏水柱層析:用超濾方法將上述protein A活性收集液更換為20mMTris-HCl-L5M NaCl (pH8.0)緩衝液，將該樣品加樣到用 2OmM Tris-HCl-1.5MNaCl (pH8.0)平衡過的phenyl_6Fast Flow柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mMTris-HCl-L 35M NaCl (ρΗ8.0)淋洗，最後用 20mM Tris-HCl-0.5M NaCl (ρΗ8.0)緩衝液洗脫。
[0079]Western bloting結果顯示了本發明兩種重組hFSH-Fc融合蛋白在CHO細胞中的成功表達，如圖7所示，在非還原條件下SDS-PAGE膠電泳圖譜，人尿來源的hFSH(商業產品)和本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白分別在43kDa和140kDa顯示相對應的目標蛋白雜交條帶，驗證了本發明得到的重組hFSH融合蛋白中含有hFSH蛋白。圖8是純化的兩種hFSH-Fc融合蛋白在還原和非還原條件下的SDS-PAGE膠電泳圖譜。結果顯示，本發明純化的hFSH-Fc蛋白純度可達到98%以上，hFSH-Fc在還原條件下的分子量為非還原條件下分子量的50%。[0080]實施例4.重組hFSH-Fc融合蛋白的體內外活性測定
[0081]本發明的重組hFSH-Fc融合蛋白的體外活性(免疫原活性)採用B10CHECK (美國)公司生產的FSH酶免疫定量檢測試劑盒檢測，方法參考試劑盒說明書。體內活性採用2010版《英國藥典》中的卵巢增重法進行檢測。蛋白質含量測定使用LOWRY定量法。取HCG製劑，加0.1%白蛋白磷酸鹽緩衝液(pH7.2±0.2)溶液，製成含有70IU/mlHCG的供試品稀釋液。根據標準品標示量、重組hFSH、人尿hFSH和重組hFSH-Fc融合蛋白估計效價，用供試品稀釋液(PH7.2±0.2)將標準品、重組hFSH、人尿hFSH、重組hFSH-L-vIgG4Fc和重組hFSH-L-vIgGlFc配製成含FSH1.67IU/ml劑量的溶液。選用19~28日齡，年齡相差不得超過3日，體重相差不得超過10克的Wistar雌鼠，分為標準品、重組hFSH組、人尿hFSH組、重組hFSH-L-vIgG4Fc和重組hFSH-L-vIgGlFc組，每組6隻動物。大鼠頸後皮下注射，每天注射兩次,每次注射體積為0.2ml，連續注射三天，每天在相同時間給藥。最後一次注射給藥24小時後，按照給藥順序採用脫白法處死動物，取卵巢，剝離吸乾表面水分後稱重，記錄器官重量。根據標準品卵巢增重採用量反應平行線法計算重組hFSH、人尿hFSH和重組hFSH-Fc 的活性。測得重組 hFSH-L-vIgG4Fc、重組 hFSH-L-vIgGlFc、重組 hFSH 和人尿 hFSH的體外活性分別為10005、10020、9928和9321幾/1111，其體內活性分別為10120、10012、8190和9051U/ml，結果表明，本發明的兩種重組hFSH-Fc融合蛋白具有體內外生物學活性。
[0082]實施例5.重組hFSH-Fc融合蛋白的藥代動力學測定
[0083]分為重組hFSH-Fc (包括重組 hFSH_vIgG4Fc 和重組 hFSH-vIgGIFc)、人尿 hFSH 和重組hFSH給藥組，每組選用體重200-250g的雄性wi star大鼠5隻，分別按15IU/kg給予皮下注射。重組hFSH組和人尿hFSH組在給藥後1、2、3、4、6、8、12、36、56h取血，重組hFSH-Fc組分別在給藥後 1、2、4、8、12、24、56、120、176、200、264、34011取血，3000印111離心51^11後，吸取血清，-20°C保存。採用ELISA試劑盒(B10CHECK，美國)測定各時間點血漿中FSH免疫活性。使用PKSolverf.0軟體，通過統計矩法計算各組主要藥代動力學參數。各組藥代動力學曲線如圖9所示，半衰期結果如表1。結果顯示，重組hFSH和人尿hFSH在大鼠體內的消除半衰期分別約為11.35±1.0h和12.7±2.8h，而等劑量本發明重組hFSH-Fc融合蛋白的消除半衰期大大延長，重組hFSH-vIgG4Fc、重組hFSH-vIgGIFc融合蛋白的消除半衰期分別為40.64± 10.28h和38.34± 12.35h，是重組hFSH和人尿FSH的3倍以上。
[0084]表1本發明重組hFSH-Fc的半衰期
[0085]
【權利要求】
1.重組hFSH-Fc融合蛋白，其特徵在於，所述的融合蛋白為二聚化融合蛋白，其胺基酸序列從N端到C端依次包含hFSH β亞基、CTP、hFSH α亞基、肽接頭和人IgG Fe變體。
2.根據權利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的hFSHβ亞基的胺基酸序列是去除了常規hFSHii亞基中的1-18位胺基酸殘基之後的hFSHβ SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列；其中所述的CTP的胺基酸序列是來自HCG β鏈羧基末端的28-34個胺基酸殘基，優選CTP為來自HCG β鏈羧基末端的33個胺基酸殘基序列，如SEQ ID NO:6所示；其中所述的hFSHa亞基的胺基酸殘基序列是去除了常規hFSH a亞基中的1_24位胺基酸殘基之後的hFSHa SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列；其中所述的肽接頭含有2_20個胺基酸，所述肽接頭存在於hFSHa亞基和人IgG Fe變體之間，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的胺基酸，優選序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0
3.根據權利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的人IgGFc變體選自下組: (i)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2和CH3區域； (ii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro33ISer 突變的人 IgGl 絞鏈區、CH2 和 CH3 區域。
4.根據權利要求1所述的重組hFSH-Fc融合蛋白，其特徵在於，所述融合蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO:2和4所示。
5.編碼根據權利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特徵在於其序列如SEQID NO:1和3所示。
6.—種權利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白的製備方法，其步驟包括: 1)構建編碼重組hFSH-Fc融合蛋白的基因表達載體: 採用人工合成方法獲得編碼hFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳動物細胞表達載體，獲得含有hFSH-Fc融合蛋白基因的表達質粒； 2)重組hFSH-Fc融合蛋白在哺乳動物宿主細胞中的穩定表達: 將含有hFSH-Fc融合蛋白的表達載體轉染到哺乳動物宿主細胞，篩選穩定表達hFSH-Fc融合蛋白的細胞株； 3)高密度細胞培養重組hFSH-Fc融合蛋白: 將上述篩選到的穩定細胞株轉入搖瓶或細胞反應罐進行大規模培養，當細胞密度達到I X IO7個/mL時，將溫度由37°C降至33°C，在該溫度下培養直至表達產量不再增加； 4)重組hFSH-Fc融合蛋白的純化製備: a)ProteinA親和層析:離心，收集上清，根據本發明蛋白偶聯Fe片段的特性，利用親和Protein A柱層析； b)疏水層析柱純化:經疏水層析純化進一步去除上述ProteinA純化後目標蛋白中的雜質； 所述的疏水柱包括 Butyl Sepharose4Fast Flow, Octyl Sepharose4Fast Flow,Phenyl Sepharose6Fast Flow,Butyl-S Sepharose6Fast Flow,Butyl Sepharose4B,OctylSepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。優選，Phenyl Sepharose6Fast Flow。
7.根據權利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的製備方法，其中步驟I)中所述的基因表達載體為 pCDNA3、pCMV/ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT 或 pCMV-DHFR，優選，pCDNA3 ;其中步驟2)中所述的細胞轉染方法包括電穿孔轉染方法、磷酸鈣轉染、脂質體轉染和原生質融合，優選，電穿孔轉染方法；所述的哺乳動物宿主細胞包括CH0，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0細胞，優選，CHO細胞，更優選，DHFR酶缺陷型CHO懸浮細胞(CHO DHFR-)。
8.根據權利要求6所述的重組hFSH-Fc融合蛋白的製備方法，其中步驟3)中還包括在培養基中加入添加劑，優選，在基礎培養基加入100 μ M Cu2+，feeding培養基加入2mMManNAc (N-乙醯基-D-氨基甘露糖)。
9.藥物組合物，其特徵在於，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權利要求1-8任意一項權利要求所述的重組hFSH-Fc融合蛋白。
10.權利要求1的重組hFSH-Fc融合蛋白在製備治療不孕不育症藥物中的應用。
【文檔編號】C07K1/20GK103539861SQ201310529897
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月1日 優先權日:2013年11月1日
【發明者】侯永敏, 雷瑤, 鄧衡露 申請人:廣州諾新生物技術有限公司