一種發酵生產1,3‑丙二醇的微生物混合菌群及發酵方法與流程

2023-08-10 21:02:51 2

本發明屬於生物工程技術領域，特別涉及一種以粗甘油為底物經厭氧微生物菌群發酵生產1,3-丙二醇的方法。

背景技術：

1,3-丙二醇是一種重要的化工平臺化合物，廣泛應用於醫藥、食品及化妝品等多個行業，同時也是合成聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)及聚呋喃二甲酸丙二酯(PTF)的單體。PTT作為新型的聚酯纖維，具有優良的柔軟性、回彈性及染色性，在紡織行業具有良好的發展前景。PTF是一種100％可再生的新型聚酯，是代替塑料製品的理想原料，在包裝行業具有巨大的應用潛力。因此，1,3-丙二醇具有巨大的市場需求空間。

1,3-丙二醇的主要生產方式有化學法和生物法。化學法包括丙烯醛水合加氫法和環氧乙烷羰基化法，以丙烯或乙烯為起始原料，經多步高溫高壓催化反應合成1,3-丙二醇；生物法則利用某些天然細菌或基因工程菌株，以甘油或葡萄糖為底物常溫發酵生產1,3-丙二醇。相比於化學法，微生物發酵生產1,3-丙二醇具有原料可再生、生產過程綠色環保以及操作簡易安全等優勢，但由於生產成本較高和研發時間較短等因素，致使發酵法的大規模工業化應用相對遲緩。生物柴油生產過程中副產的廉價粗甘油是降低1,3-丙二醇生產成本的理想原料，而粗甘油中含有的複雜成分(甲醇、鹽、游離脂肪酸等)對菌體生長代謝有一定抑制作用，這就需要開發新的技術和方法解決此問題。

自然界中能將甘油轉化為1,3-丙二醇的高效菌株主要分為兩大類：一類是以肺炎克雷伯氏桿菌(Klesiella penumoniae)為代表的兼性厭氧菌，另一類是以丁酸梭菌(Clostridium butyricum)為代表的嚴格厭氧菌。其中，肺炎克雷伯氏桿菌與丁酸梭菌以其較高的甘油耐受力和1,3-丙二醇生產能力而受到人們的關注，已有大量研發和應用報導。肺炎克雷伯氏桿菌為兼性厭氧菌，生長迅速，生產強度高，且易於基因改造，但其條件致病菌屬性限制了工業化應用。此外，該菌的代謝產物除了1,3-丙二醇外，還有2,3-丁二醇、乙酸、乳酸、琥珀酸等副產物，其中2,3-丁二醇的沸點與目標產物相近，導致後續產物分離困難。丁酸梭菌是嚴格厭氧菌，屬於益生的安全菌，並且其代謝副產物主要為乙酸及丁酸，無2,3-丁二醇。相比於肺炎克雷伯氏桿菌，丁酸梭菌發酵生產1,3-丙二醇最大局限是該菌株生長相對緩慢，導致產物生產強度低。以純甘油為底物時，典型的丁酸梭菌DSM 5431在間歇發酵中可耐受底物濃度為110g/L，生產56g/L 1,3-丙二醇，生產強度為1.93g/(L·h)(Appl Microbiol Biotechnol,1992,36:592-597)。以粗甘油為底物時，丁酸梭菌VPI 1718在間歇發酵中可耐受底物濃度為80.1g/L，生產41.9g/L 1,3-丙二醇，發酵時間為52h，生產強度為0.81g/(L·h)；在批式流加發酵中，該菌株可生產67.9g/L 1,3-丙二醇，生產強度僅為0.78g/(L·h)(Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:101-112)。CN 102965323B公開了一種用丁酸梭菌轉化粗甘油生產1,3-丙二醇的方法，1,3-丙二醇最終濃度為78.5g/L，生產強度僅為1.49g/(L·h)，因此開發一種生物安全性高、生產強度高、成本較低的1,3-丙二醇發酵方法對其工業化生產具有重要的現實意義。

近年來，微生物菌群發酵逐漸引起國內外學者的關注。例如CN 104774879公開了一種微生物混菌發酵生產1,3-丙二醇的方法，混菌可耐受初始甘油濃度高達200g/L(單菌只能耐受100g/L)，1,3-丙二醇產量達到81.40g/L，副產物不含2,3-丁二醇，但該發明是以肺炎克雷伯氏桿菌為主的混菌，且用純甘油作底物，工業應用具有較大局限。也有學者利用從沼氣池汙泥中篩選得到的混菌發酵粗甘油生產1,3-丙二醇(Bioprocess Biosyst Eng,2014,37:225-233)，1,3-丙二醇最終濃度可達70g/L，同時生產強度為2.60g/(L·h)，明顯高於單菌發酵。但當底物粗甘油濃度達到70g/L時菌體生長代謝會受到明顯抑制，同時菌種組成未知，生物安全性有待考證。因此開發一種菌種穩定性強、生物安全性好、耐受粗甘油能力強、1,3-丙二醇生產強度高的微生物混合菌群，高效轉化粗甘油生產1,3-丙二醇成為一條工業化發展的新思路。

技術實現要素：

鑑於上述的現有技術中存在的問題，本發明的目的在於提供一種生物安全性高的可高效轉化粗甘油為1,3-丙二醇的微生物菌群以及利用該微生物菌群製備1,3-丙二醇的方法。本發明的微生物菌群以丁酸梭菌為主的混菌，其穩定性高，在厭氧條件下高效轉化粗甘油為1,3-丙二醇，克服丁酸梭菌純菌發酵粗甘油耐受性低、生產強度低等局限。

本發明的技術方案如下：

一種用於以甘油為底物發酵製備1,3-丙二醇的微生物混合菌群，所述的微生物混合菌群以丁酸梭菌為優勢菌，所述丁酸梭菌的有效活菌數佔微生物混合菌群中有效活菌數的95％以上。

進一步地，所述的微生物混合菌群還含有與丁酸梭菌共生的混合共生菌，所述混合共生菌的有效活菌數佔所述的微生物混合菌群中有效活菌數的5％以下，所述混合共生菌由梭菌屬菌株和乳桿菌屬菌株組成，二者的有效活菌數比例為1.50～4.99：0.01～0.05，所述梭菌屬菌株不包括丁酸梭菌。

進一步地，所述梭菌屬菌株為雙酶梭菌和拜氏梭菌中的一種或兩種；所述乳桿菌屬菌株為乳桿菌Lactobacillus farraginis與乳桿菌Lactobacillus equicursoris中的一種或兩種。

進一步地，在上述技術方案中，所述的甘油為粗甘油，更優選地，所述的粗甘油為甘油含量為75～95％的生物柴油副產物或油脂水解產物。

本發明還提供一種1,3-丙二醇的發酵方法，該方法包括將上述的微生物混合菌接入至以甘油為底物的發酵培養基中進行發酵的步驟。

進一步地，在上述的技術方案中，將所述的微生物混合菌接入以甘油為底物的發酵培養基中進行發酵。所述發酵過程可以採用間歇發酵，也可以採用批式流加發酵：採用間歇發酵方式發酵時發酵起始甘油濃度為40～120g/L，優選為100g/L；採用批式流加發酵方式發酵時可以採取兩種底物流加策略：連續補料與間歇補料。兩種流加策略的發酵起始甘油濃度為40～120g/L，優選80g/L，在連續補料的批式流加發酵過程中甘油濃度維持在10～35g/L，優選維持在10～25g/L，在間歇補料的批式流加發酵過程中，當甘油濃度低於20g/L時，間歇補料至甘油濃度為40～120g/L，優選80g/L。

進一步地，在上述的技術方案中，所述的甘油為純甘油或粗甘油，所述的粗甘油為甘油含量為75～95％的生物柴油副產物或油脂水解產物。

進一步地，在上述的技術方案中，所述的發酵培養基以g/L為劑量單位含有如下組分：粗甘油40～120，KH2PO4 1.36，(NH4)2SO4 6.61，MgCl2·6H2O 0.26，CaCl2 0.29，檸檬酸0.42，酵母粉2.0，每升發酵培養基中另加入5mL微量元素B溶液，其中微量元素B溶液的組成為：ZnCl2 0.68g/L，MnCl2·4H2O 0.17g/L，H3BO3 60mg/L，CuCl2·2H2O 0.47g/L，Na2MoO4·2H2O 5mg/L，FeCl2·4H2O 3.97g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，飽和鹽酸10mL/L。

本發明所述的微生物混合菌可利用粗甘油發酵生產1,3-丙二醇。該混合菌可在初始甘油濃度40～120g/L條件下發酵生產1,3-丙二醇，最終1,3-丙二醇濃度在20～90g/L，副產物為丁酸和乙酸，生產強度在1.5～4.0g/(L·h)。

本發明相對於現有技術具有以下有益效果：

(1)本發明公開了一種用於甘油發酵製備1,3-丙二醇的微生物混合菌，該混合菌以丁酸梭菌為絕對優勢菌，並含有少量梭菌屬(非丁酸梭菌)與乳桿菌屬菌株，菌群穩定性好，生物安全性高。與傳統的丁酸梭菌純種發酵相比，對複雜底物耐受性強，生產強度高。

(2)本發明微生物混合菌利用廉價非糧原料粗甘油為底物發酵製備1,3-丙二醇，降低生產成本。

(3)利用本發明的微生物混合菌進行發酵，底物流加可採取間歇補料的策略，補料過程操作簡便，降低1,3-丙二醇生產人工成本。

(4)利用本發明的微生物混合菌進行發酵，發酵培養基無需滅菌，進一步降低1,3-丙二醇生產成本。

附圖說明：

圖1為微生物菌群C2-2M傳代過程中細胞生長情況；

圖2為微生物菌群C2-2M傳代過程中代謝產物的變化情況；

圖3為微生物菌群C2-2M在不同起始粗甘油濃度下的甘油消耗情況；

圖4為微生物菌群C2-2M以底物濃度為100g/L粗甘油的間歇發酵結果；

圖5為單菌S1以底物濃度為80g/L粗甘油的間歇發酵結果；

圖6為微生物菌群D6以底物濃度為100g/L粗甘油的間歇發酵結果；

圖7為微生物菌群C2-2M以純甘油為底物的連續補料的批式流加發酵結果；

圖8為微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的連續補料的批式流加發酵結果；

圖9為微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的間歇補料的批式流加發酵結果；

圖10為微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物不滅菌條件下的批式流加發酵結果。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用試劑等均可從化學或生物試劑公司購買。

以下結合技術方案詳細敘述本發明的具體實施方式。

1.下述實施例使用的培養基：

種子培養基(g/L)：甘油22.0，KH2PO4 1.3，K2HPO4·7H2O 4.5，(NH4)2SO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCO3 2.0，CaCl2 0.02，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，酵母粉1.0。此外，每升培養基中加入2.0mL微量元素A溶液(飽和鹽酸0.9mL/L，CuCl2·2H2O 20mg/L，ZnCl2 70mg/L，MnCl2·4H2O 100mg/L，H3BO3 60mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，NiCl2·6H2O 25mg/L，Na2MoO4·2H2O 35mg/L)和1.0mL Fe2+溶液(飽和鹽酸4mL/L，FeSO4·7H2O 5g/L)。

固體培養基(1L)：種子培養基中加入瓊脂粉15g。

發酵培養基(g/L)：甘油40～120，KH2PO4 1.36，(NH4)2SO4 6.61，MgCl2·6H2O 0.26，CaCl2 0.29，檸檬酸0.42，酵母粉2.0，每升培養基中另加入5mL微量元素B溶液(ZnCl20.68g/L，MnCl2·4H2O 0.17g/L，H3BO3 60mg/L，CuCl2·2H2O 0.47g/L，Na2MoO4·2H2O 5mg/L，FeCl2·4H2O 3.97g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，飽和鹽酸10mL/L)。

2.種子培養條件：厭氧培養。採用250mL西林瓶，裝液量為100mL。待裝入培養基後每瓶持續通3min高純氮氣除氧，之後用丁基膠塞封頂。實驗過程中用一次性無菌針管接種及取樣，接種量2-10％(v/v)，培養溫度37℃，搖床轉速200r/min，培養時間15～24h。

3.發酵培養條件：採用5L全自動發酵罐，裝液量2L，接種量10％(v/v)，發酵罐溫度37℃，轉速250r/min，發酵過程用5M NaOH控制pH為7.0。接種前後1h內通入0.15vvm高純氮營造罐內厭氧環境。

粗甘油：是油脂水解的產物，組成為(w/w)：78％甘油、15～17％水、0.87％灰分、<0.1％游離脂肪酸，pH 6.91。

實施例1 從厭氧活性汙泥中篩選馴化產1,3-丙二醇的微生物菌群

取2.0g厭氧活性汙泥，接入含22g/L粗甘油的種子培養基中在37℃，200r/min條件下厭氧培養，待培養基甘油消耗殆盡後逐漸減小接種量進行傳代培養，經20次傳代後菌群生物量與代謝基本達到穩定。自然富集馴化過程如圖1和2所示，總體可分為三階段：初期(2代至4代)、波動期(5代至12代)及穩定期(12代之後)。篩選初期是菌群結構適應培養環境的階段，可富集到能利用甘油、生長迅速的菌株，淘汰掉不能利用底物、生長緩慢的菌株。隨著傳代次數的增加，培養時間逐漸由96h下降為24h，OD值由1.7增加至3.5，1,3-丙二醇濃度達到11.5g/L左右。波動期是菌群生長代謝不穩定的階段，表現為培養時間(延長至36h)、殘餘甘油量(0.64～3.87g/L)、1,3-丙二醇產量(7.33～11.96g/L)、副產物(乙酸、乳酸、丁酸)產量等均有波動。穩定期是菌群生長代謝趨於穩定的階段，培養時間重新穩定至24h，殘餘甘油進一步降低，OD值穩定至3.6上下，1,3-丙二醇產量穩定至12g/L以上，副產物乳酸消失，只剩下少量乙酸和丁酸。第20代菌群被命名為C2-2M。經不斷傳代C2-2M在種子培養基中可保持穩定生長，發酵時間為24h，OD值穩定至3.6左右，長時間在同一條件下自然富集馴化使微生物菌群組成趨於穩定。在產物分布中，C2-2M以1,3-丙二醇為主要代謝產物，濃度達到12.62g/L，摩爾轉化率為0.71mol/mol，已接近理論轉化率；副產物種類少，僅為乙酸和丁酸，含量分別為1.15g/L和1.21g/L。

菌群C2-2M 16S rRNA基因經測序及多樣性分析，其組成為如下：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)97.34％、梭菌屬(Clostridium)(非丁酸梭菌)2.64％、乳桿菌屬(Lactobacillus)0.02％，其中百分比(％)表示各菌的有效活菌數佔微生物菌群C2-2M中總有效活菌數的百分比。所述梭菌屬菌株為雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)與拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的混合菌，其活菌數比例為0.81：1.83，乳桿菌屬菌株為乳桿菌Lactobacillus farraginis與乳桿菌Lactobacillus equicursoris的混合菌，其活菌數比例為0.01:0.01。該混合菌群16S rRNA基因測序得到的原始數據已提交至美國國立生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，簡稱NCBI)的Sequence Read Archive(SRA)資料庫中，登錄號為SRP071045。

經厭氧塗平板從菌群C2-2M中分離得到單菌落S1和S2，經染色鏡檢，均為革蘭氏陽性杆狀細菌，單菌落S1和S2的16S rDNA相同，序列經克隆測序及比對後，確定為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，其16S rDNA序列見序列表。

以菌群C2-2M為原液，在厭氧環境中用無菌生理鹽水進行梯度稀釋(10-2～10-7)，在稀釋至10-6時得到可消耗甘油的含最少菌種種類的微生物菌群D6。經種子培養基培養後進行16S rRNA基因測序及分析，微生物菌群D6由94.92％丁酸梭菌(Clostridium butyricum)及5.08％雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)組成。

實施例2 厭氧微生物菌群C2-2M對粗甘油的耐受性

將實施例1中獲得的混合菌群C2-2M經種子培養基培養後，按10％體積比接種至裝有2L發酵培養基的5L發酵罐中培養，每批次發酵的初始甘油濃度由40g/L逐漸提升至140g/L(加入適量粗甘油，配置得到初始甘油濃度為40～140g/L的發酵培養基)，如圖3所示。發酵結果表明，微生物菌群C2-2M對粗甘油有較強的耐受能力，可在甘油含量為120g/L的粗甘油中生長代謝，1,3-丙二醇濃度達到60.61g/L，摩爾轉化率為0.63mol/mol，生產強度為3.79g/(L·h)。相對而言，初始甘油濃度為100g/L時間歇發酵效率較高(如圖4所示)，此時1,3-丙二醇濃度為51.28g/L，摩爾轉化率為0.64mol/mol，生產強度為4.10g/(L·h)。

實施例3 厭氧菌S1以粗甘油為底物的間歇發酵

單菌S1以80g/L粗甘油為底物的發酵結果如圖5所示，1,3-丙二醇濃度為44.34g/L，摩爾轉化率為0.67mol/mol，生產強度為0.92g/(L·h)。雖然單菌S1發酵粗甘油得到1,3-丙二醇濃度及摩爾轉化率與微生物菌群C2-2M發酵水平相近，但發酵時間分別較微生物菌群發酵延長了38h，生產強度僅為微生物菌群發酵的22.4％。這表明微生物菌群C2-2M較單菌具有優良的發酵性能，能耐受較高的甘油濃度，並且發酵時間較短。

實施例4 微生物菌群D6以粗甘油為底物的間歇發酵

將實施例1中所得的厭氧微生物菌群C2-2M在厭氧環境中梯度稀釋，稀釋至10-6時得到含94.92％丁酸梭菌及5.08％雙酶梭菌的微生物菌群D6。經種子培養基培養後，按10％體積比接入至發酵罐中，發酵罐初始粗甘油濃度為100g/L，發酵結果如圖6所示。1,3-丙二醇濃度為49.38g/L，摩爾轉化率為0.67mol/mol。該水平雖然與初始菌群C2-2M能力相當，但發酵時間較初始菌群C2-2M延長至28h，生產強度降低至1.76g/(L·h)。與原始微生物菌群C2-2M相比，微生物菌群D6發酵粗甘油生產1,3-丙二醇效率明顯降低。這表明含有梭菌屬(非丁酸梭菌)及乳桿菌屬的混合菌A可以提高微生物菌群C2-2M對粗甘油的耐受能力，縮短發酵時間，提高1,3-丙二醇生產強度。

實施例5 厭氧微生物菌群C2-2M以純甘油為底物的批式流加發酵

將實施例1中獲得的混合菌群C2-2M經種子培養基培養後，以10％接種量接入發酵罐中培養，初始純甘油濃度為80g/L，發酵過程中不斷補加純甘油維持底物濃度為10～25g/L，發酵時間為24h，結果如圖7所示。最終1,3-丙二醇濃度為83.71g/L，摩爾轉化率為0.65mol/mol，生產強度為3.49g/(L·h)。

實施例6 厭氧微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的連續補料的批式流加發酵

將實施例1中獲得的混合菌群C2-2M的種子培養液以10％接種量接入發酵罐中，發酵培養基初始粗甘油濃度為80g/L，發酵過程中不斷補加粗甘油維持底物濃度為10～25g/L，發酵時間為24h，發酵結果如圖8所示。最終1,3-丙二醇濃度為77.39g/L，摩爾轉化率為0.65mol/mol，生產強度為3.22g/(L·h)。這表明微生物菌群C2-2M具有較強的轉化粗甘油為1,3-丙二醇的能力。

實施例7 厭氧微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的間歇補料的批式流加發酵

將實施例1中獲得的混合菌群C2-2M的種子培養液以10％接種量接入發酵罐中，發酵培養基初始粗甘油濃度為80g/L，發酵過程中當甘油濃度低於15g/L時補充甘油至濃度為80g/L，待甘油濃度再次消耗至20g/L以下時，補充甘油至濃度為40g/L，發酵時間為24h，發酵結果如圖9所示。最終1,3-丙二醇濃度為79.78g/L，摩爾轉化率為0.65mol/mol，生產強度為3.32g/(L·h)。這表明微生物菌群C2-2M對粗甘油有良好的適應性，其1,3-丙二醇的生產能力不受發酵過程底物濃度劇烈變化影響。

實施例8 厭氧微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物在培養基不滅菌條件下批式流加發酵

將實施例1中獲得的混合菌群C2-2M種子培養液以10％接種量接入發酵罐中，發酵罐培養基無需滅菌，初始粗甘油濃度為80g/L，發酵過程中不斷補入粗甘油維持底物濃度為10～25g/L，發酵時間為24h，發酵結果如圖10所示。最終1,3-丙二醇濃度為76.63g/L，摩爾轉化率為0.64mol/mol，生產強度為3.19g/(L·h)。這表明不滅菌條件可達到與滅菌條件相同的發酵水平，該過程可節省生產成本。

SEQUENCE LISTING

大連理工大學

一種發酵生產1,3-丙二醇的微生物混合菌群及發酵方法

2011

1

PatentIn version 3.3

1

1336

DNA

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）

1

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