生產疏水多肽、蛋白質或肽的方法

2023-07-20 10:25:01

專利名稱：生產疏水多肽、蛋白質或肽的方法
本申請是申請日為1994年7月4日，申請號為94108110.9中國專利申請的分案申請。
以基因技術製備雜合基因的可能性為組構重組體蛋白質打開了新的途徑。將編碼所需蛋白質的基因序列與對配基有高親和性之蛋白質片段的基因編碼序列相連接，有可能使用親和肽以一個步驟純化融合蛋白質形式的所需重組體蛋白質。藉助位點特異性誘變，也有可能在親和肽和所需重組體蛋白質的連接點上引入特異性化學或酶切位點，這樣在藉助適當的親和樹脂純化融合蛋白質後即可經化學或酶促裂解來回收所需的重組體蛋白質。
然而，當所需的重組體蛋白質在其胺基酸序列中也含有這樣的化學或酶促裂解位點時，則對所需重組體蛋白質的回收就將是極其困難的。在這種情況下，所需的重組體蛋白質很容易被迅速降解。
為了抑制這種降解，本發明提供了融合蛋白質和可以在不影響所需重組體蛋白質的情況下在特定的化學或酶促裂解位點上進行選擇性裂解的方法。本發明的方法可特異地應用於生產疏水多肽、蛋白質或肽。
更具體地說，本發明涉及有下列通式的融合蛋白質A-B-C其中A是大體積親水肽，B是選擇性裂解位點，C是所需的疏水多肽、蛋白質或肽。
與根據本發明的融合蛋白質結合使用的術語「大體積親水肽」涉及以其大小和產生良好結構區域之親水胺基酸含量為特徵的親水肽。
根據本發明的融合蛋白質的大體積親水肽A具有雙重功能a)有利於融合蛋白質的高表達和b)使裂解位點C暴露於疏水基質柱上的流動相。根據本發明的融合蛋白質的優選大體積親水肽是具有下式肽序列的親水肽(NANP)x其中X是10-40，且最好是19。
選擇性裂解位點可以是化學或酶促裂解位點。適當的選擇性酶促裂解位點可以是胺基酸序列-(Asp)n-Lys-，其中n代表2,3或4，或可分別被蛋白酶腸激酶和凝血因子Xa特異性識別的-Ile-Glu-Gly-Arg-，被胰蛋白酶裂解的精氨酸殘基或賴氨酸殘基、被賴氨醯肽鏈內切酶裂解的賴氨酸殘基或被V8蛋白酶裂解的穀氨醯胺殘基。作為適當的選擇性化學裂解位點，可考慮有被3-溴-3-甲基-2-(2-硝基苯基巰基)-3H-吲哚裂解的色氨酸殘基、被2-亞硝基-5-硫氰基苯甲酸裂解的半胱氨酸、可分別被酸和羥胺裂解的胺基酸二肽Asp-Pro或Asn-Gly，以及較好可被溴化氰(CNBr)特異地裂解的蛋氨酸殘基。
與根據本發明的融合蛋白質結合使用的術語「疏水多肽、蛋白質或肽」是指以濃度為30-60％，較好約40％的加在含水緩衝液中的有機溶劑，如加在含水緩衝液中的濃度高於40％的乙醇，從反相HPLC柱上洗脫的疏水多肽、蛋白質或肽。
作為疏水多肽、蛋白質或肽，例如考慮有表面抗原、淋巴激活素受體、HIV-1和HIV-2被膜和結構蛋白質、C型肝炎被膜和結構蛋白質或有膜錨地序列的任何蛋白質。優選的疏水多肽、蛋白質或肽是具有下示序列的b-澱粉狀蛋白肽(bA4-澱粉狀蛋白)1 42DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(Seq IDNo:1)在35位上有亮氨酸(Seq ID No:3)、絲氨酸(Seq IDNo:4)、穀氨醯胺(Seq ID No:5)或穀氨酸(Seq ID No:6)殘基代替蛋氨酸或蛋氨酸亞碸殘基的bA4-肽點突變，以及有下示序列的HIV-1被膜肽1 35RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS(Seq ID No:11)可將根據本發明的融合蛋白質的大體積親水肽和選擇性裂解位點連接到疏水多肽、蛋白質或肽的氨基末端胺基酸或羧基末端胺基酸上。
本發明的融合蛋白質可以含有優先結合於親和載體材料上的特異性序列。這樣的序列例如可以是含有至少兩個相鄰組氨酸殘基的序列(可參見歐洲專利申請No.282 042)。這些序列可特異地結合到次氨基三乙酸鎳絡合樹脂上(Hochuli and Dobeli,Biol.Chem.Hoppe-Seyler368,748(1987)；歐洲專利No.253 303)。因此可以從保留的多肽中選擇性地分離出含有這種特異序列的本發明的融合蛋白質。可以將此特異性序列連接到大體積親水肽的胺基酸序列上或者親水多肽、蛋白質或肽的胺基酸序列上。
本發明還涉及編碼這些融合蛋白質的基因、含有這些基因的表達載體、用這些表達載體轉化的微生物以及製備所說的基因、表達載體和被轉化微生物的方法。
按照文獻中描述的重組DNA技術的方法製備本發明的融合蛋白質。較好首先合成編碼所需疏水多肽、蛋白質或肽的核苷酸序列，然後再將此序列與編碼大體積親水肽和選擇性裂解位點的核苷酸序列連接。
也可按照已知的方式將如此得到的雜合基因摻入到表達載體中。例如可參考Maniatis等人(「Molecular Cloning」,ColdSpring Harbor Laboratory,1982)的教科書和Sambrook等人(「Molecular Cloning-A Laboratory Manual」,2nd.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,1989)的教科書。
表達本發明融合蛋白質的方法也是已知的，並在上述教科書中有詳細的描述。它們包括下述步驟a)用其中上述雜合基因已可操縱地結合到表達控制序列上的表達載體轉化適當的宿主生物體，特別是大腸桿菌；b)在適當的生長條件下培養如此得到的宿主生物體；c)從宿主生物體中提取並分離所需的融合蛋白質。
作為宿主生物體，可以是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如大腸桿菌和枯草芽胞桿菌菌株。大腸桿菌菌株M15是本發明的特別優選的宿主生物體。但也可以使用與上述大腸桿菌菌株不同的、一般可以得到的大腸桿菌菌株，例如大腸桿菌294(ATCC No.3144)、大腸桿菌RR1(ATCCNo.31343)和大腸桿菌W3110(ATCC No.27325)。
本發明融合蛋白質允許在不影響所需疏水多肽、蛋白質或肽的情況下在特定化學或酶促裂解位點上進行選擇性裂解。所需的疏水多肽、蛋白質或肽擴散到疏水基質柱的固相中，便能夠定位本發明的融合蛋白質，以便隱藏所需的疏水多肽、蛋白質或肽。另一方面，大體積親水肽將選擇性裂解位點暴露於含水流動相。這樣就允許經選擇性裂解除去大體積親水肽而只留下結合到柱上的所需的疏水多肽、蛋白質或肽。然後可經加入有機溶劑而洗脫掉所需的疏水多肽、蛋白質或肽。
因此，本發明還提供了允許生產和純化所需疏水多肽、蛋白質或肽的方法，該方法包括下列步驟a)使含有本發明融合蛋白質的水溶液通過疏水基質柱，b)用含有裂解試劑或酶的溶液衝洗該柱，以及c)用與水混溶的溶劑除去由此得到的所需疏水多肽、蛋白質或肽。
作為疏水基質柱，可以是結合到矽膠基質柱上的氰基丙基、環己基、苯基、辛基或十八基基團。在本發明的實踐中，較好使用在反相高效液相層析(HPLC)條件下的RP-18(十八基結合的矽膠微顆粒柱)。
在用根據本發明的融合蛋白質裝柱之前，用緩衝液常規平衡疏水基質柱。平衡緩衝液可含有變性劑或高離液序列劑(Chaotropicagent)如鹽酸胍、尿素，或去汙劑如Triton。加入這樣的變性劑、高離液序列劑或去汙劑，既使用根據本發明的極難於溶解於水溶液的融合蛋白質，也不會有操作上的問題。
將本發明的融合蛋白質加到也可含有變性劑或去汙劑例如鹽酸胍、尿素或Triton的緩衝液中，然後上疏水基質柱。
用含有裂解劑或酶的緩衝液洗柱以完成裂解。最適宜緩衝液組成取決於所使用的裂解劑或酶，並基於不同情況來常規確定之。
可使用水混溶性溶劑的梯度洗脫所需的疏水多肽、蛋白質或肽。用於這一目的的水混溶性溶劑包括鏈烷醇如正丙醇、2-丙醇、乙醇、甲醇、叔丁醇或環醚如二噁烷。最適宜洗脫案件取決於待純化的所需疏水多肽、蛋白質或肽、疏水基質，柱大小等因素，並可基於不同情況常規確定之。
也可以間斷地進行上述生產和純化所需疏水多肽、蛋白質或肽的方法。然後將根據本發明的融合蛋白質吸附到加在緩衝液中的疏水基質上。將疏水基質與含有裂解劑或酶的緩衝液一起保溫以完成裂解。可在除去裂解劑或酶和大體積親水肽後，將疏水基質和水混溶性溶劑一起保溫而得到所需的疏水多肽。
在本發明的優選特定實施方案中，也利用允許生產和純化所需疏水多肽、蛋白質或肽的新方法將單體形式的b-澱粉狀蛋白純化到均一態。
用於生產作為均質肽之單體b-澱粉狀蛋白的特定方法包括下列步驟a)使含有本發明融合蛋白質的水溶液(其中所需的疏水肽是b-澱粉狀蛋白肽)通過疏水基質柱，b)用含有裂解劑或酶的溶液洗柱，c)用水混溶性溶劑洗脫，得到單體b-澱粉狀蛋白肽，d)用蒸餾水洗脫單體b-澱粉狀蛋白肽，然而凍幹，並且e)在必要時於凍幹後將此單體b-澱粉狀蛋白純化達到最大均質性在實施生產作為均質肽的單體b-澱粉狀蛋白肽的特定方法中，使含有融合蛋白質的溶液-其中所需疏水肽是b-澱粉狀蛋白肽，該肽較好是在含有變性劑如鹽酸胍或尿素的緩衝液中-通過疏水基質柱。實踐中，較好使用反相高效液相層析(HPLC)條件下的RP-18(十八基結合的矽膠微顆粒柱)。為此目的而使用的其他適宜的柱包括氰基丙基、環己基、苯基或辛基結合的柱(珠大小=5-30mm)。這些柱可作為商標為Vydac』或Nucleosil的商品得自Vydac或Macherey-Nagel。用含有裂解劑或酶的緩衝液衝洗該柱以完成裂解。在實踐中，較好使用加在緩衝水混溶性溶劑中的溴化氰衝洗該柱以完成裂解。使用水混溶性溶劑梯度，較好是乙醇梯度洗脫單體b-澱粉狀蛋白肽。直接用蒸餾水稀釋單體b-澱粉狀蛋白肽，例如將洗脫物滴加到含水容器內，然後凍幹。必要時可在凍幹後用已知方法如製備性凝膠電泳法或排阻層析法純化單體b-澱粉狀蛋白肽以使之達到最大均質性。在實踐中，較好應用製備非變性凝膠電泳法(分離大量的單體b-澱粉狀蛋白肽)和在HPLC條件下的凝膠過濾法(分離小量的單體b-澱粉狀蛋白肽)。
本發明還涉及用該新方法製得的純的和均一的、毒性單體b-澱粉狀蛋白肽。
根據本發明的b-澱粉狀蛋白肽可用於篩選早老性痴呆藥物。
也可使用如用於純化單體b-澱粉狀蛋白然的相類條件，利用生產和純化所需疏水多肽、蛋白質或肽的新方法將HIV-1被膜肽Seq ID No:11純化到均質狀態(實施例7)。
按該新方法製得的HIV-1被膜肽Seq ID No:11可用於診斷HIV感染。
在對本發明進行了如上的一般性描述之後，將藉助下列實施例詳細舉例說明本發明，但這些實施例並不以任何方式限制本發明。
結合附圖閱讀可以更好地了解這些實施例。附圖中出現有下列符號「N250PSN250P29」代表可調節的啟動子/操縱基因元件N250PSN250P29；「RBSⅡ」代表合成的核糖體結合位點RBSⅡ；「[His]6」、「[NANP]19」和「amy」代表編碼本發明6xHis-NANP-澱粉狀蛋白融合蛋白質的基因；「bla」、「cat」、「LacⅠ」和「neo」分別代表編碼β-內醯胺酶、氯黴素乙醯轉移酶、lac阻遏子和新黴索磷酸轉移酶的基因；「to」、「TE」和「T1」分別代表噬菌體的轉錄終止子to、T7噬菌體的T E和大腸桿菌rrnB操縱子的T1；「repl.」代表質粒pBR322和pREP4的複製區域。


圖1是質粒pREP4的示意圖。
圖2是質粒p6xHis-NANP-Met-Amy的示意圖。
圖3顯示質粒p6xHis-NANP-Met-Amy(Seq ID No:7)的核苷酸序列的一部分，該質粒編碼融合蛋白質6xHis-NANP-Met-Amy(Seq ID No:8)。在該序列中，標出了圖2中所示某些限制酶的識別序列。所示的胺基酸序列以三字母代碼表示融合蛋白質6xHis-NANP-Met-Amy的序列，其中標出了相當於bA4-肽的胺基酸的編號。
圖4是質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy的示意圖。
圖5顯示質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy的核苷酸序列的一部分(Seq IN No:9)，該質粒編碼融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy(Seq ID No:10)。該序列中標出了圖4所示一些限制酶的識別序列。所示胺基酸序列以三字母代碼表示融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy的序列，其中給出了相當於bA4肽之胺基酸的編號。圖中底下部分顯示了與質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy不同的核苷酸序列和所編碼的胺基酸，它們分別屬於編碼融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]的質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]，編碼融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]的質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、編碼融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]的質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]，和編碼融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]的質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]。
圖6給出用非變性瓊脂糖凝膠電泳法分析bA4的結合。用得自Beckman的「血清蛋白質電泳(SPE )系統Paragon」，按照供應者推薦的方法進行該分析。上樣的每種肽均為8μg(在2μl水中)。用考馬斯亮蘭染色3小時並用10％乙酸、45％甲醇和45％水脫色。實驗前直接在蒸餾水中製備樣品(f)，或者使它老化2天(a)。被試樣品在下列表中給出。凝膠a凝膠b泳道1人 bA4 洗滌 1f泳道 1 M35S bA4 洗滌 1f泳道2人 bA4 洗滌 2f泳道 2 M35S bA4 洗滌 2f泳道3人 bA4 洗滌 3f泳道 3 M35S bA4 洗滌 3f泳道4人 bA4 洗滌 4f泳道 4 M35S bA4 洗滌 4f泳道5人 bA4 洗滌 4a泳道 5 M35S bA4 洗滌 4a泳道6標準品BSA2mg泳道 6 標準品BSA10mg泳道7M35L bA4 洗滌 1f泳道 7 M35Q bA4 洗滌 1f泳道8M35L bA4 洗滌 2f泳道 8 M35Q bA4 洗滌 2f泳道9M35L bA4 洗滌 3f泳道 9 M35Q bA4 洗滌 3f泳道10 M35L bA4 洗滌 3a泳道 10 大鼠 bA4凝膠C給出點突變體M35Q bA4和M35E bA4的比較結果。點突變體M35E bA4含有額外的負電荷而導致在Beckman凝膠上的高遷移率(泳道8:M35E bA4；泳道9:M35QbA4)。當裂解後將M35E bA4與M35Q bA4混合時(泳道1)或當含有M35Q bA4的融合蛋白質與含有M35EbA4的融合蛋白質混合併按照本發明的方法裂解時(泳道3、4、5和6(洗滌1、2、3和4))，則觀察到一個指示單體bA4存在的清晰的間隔區。
圖7給出在體積排阻柱上對bA4進行層析分離的結果。
各收集250ml部分並用非變性電泳法分析它。泳道1上柱的bA4。泳道2至10峰值部分。
用於確定bA4大小的標誌蛋白質是血清白蛋白(MW=65000；滯留時間=19.98分鐘)，卵白蛋白(MW=45000；滯留時間=20.10分鐘)，乳清蛋白(MW=14200；滯留時間=21.43分鐘)，胰島素(MW=5734；滯留時間=21.68分鐘)。
滯留時間22.54分鐘指示分子量約4500道爾頓的單體。這是與光掃描數據和按Yphantis方法(D.A.Yphantis,Annalsof the N.Y.Acad.Sci.88,586-601(1960))進行的超濾實驗結果相一致的。
實施例1用於製備融合蛋白質6xHis-NANP-Met-Amy的表達質粒使用表達質粒p6xHis-NANP-Met-Amy(參見圖2和3)製備融合蛋白質6xHis-NANP-Met-Amy。根據布達佩斯條約，已於1993年5月18日將用質粒pREP4和p6xHis-NANP-Met-Amy轉化的大腸桿菌M15細胞保藏在Braunschweig,BRD的DeutscheSammlung von Mikroorganismen(DSM)，保藏登記號為DSM8310。
實施例2用於製備融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy的表達質粒使用表達質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy(參見圖4和5)製備融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy。用質粒pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy轉化的大腸桿菌M15細胞已按照布達佩斯條約規定，於1993年5月18日被保藏在Braunschweig,BRD的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM)，保藏登記號為DSM8311。
實施例3用於製備融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]的表達質粒分別使用只是編碼bA4澱粉狀蛋白肽之胺基酸35的核苷酸不同於質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy的表達質粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E](參見圖5)製備融合蛋白質6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]。已按照布達佩斯條約的規定，於1993年5月18日將分別用質粒pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]，以及pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]轉化的大腸桿菌M15細胞保藏在Braunschweig,BRD的Deutsche Sammlungvon Mikroorganisismen(DSM)，保藏登記號分別是DSM8313、DSM8314、DSM8315和DSM8312。
實施例4融合蛋白質的發酵生產和純化發酵按照標準方法(Sambrook et al.，文獻同上)分別將質粒p6xHis-NANP-Met-Amy、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]轉化列經含有質粒PREP4的大腸桿菌M15細胞中。使被轉化的細胞在100升發酵罐中，37℃下生長在含有100mg/l氨苄青黴素和25mg/l卡那黴素的Süper培養基(Stüber et al.,Immunological Methods,eds.Lefkovits and Pernis,AcademicPress,Inc.,Vol.IV 21-152(1990))中。在600nm光密度約為1.0時，加入IPTG至終濃度為2mM。在37℃繼續培養3小時後離心收穫細胞。在一典型發酵過程中，得到至少含3g重組體融合蛋白質的約500g生物量。
純化向細胞內加入2.5L含有6M鹽酸胍的0.1M磷酸氫二鈉，pH8，並攪拌24小時。離心除去粗細胞碎片，然後使用0.3mm濾膜以交叉流動過濾法進一步澄清上清液。然後使含在濾液中的蛋白質吸附到Ni-NTA柱(5cm×24cm，流速20ml/分)上。先用8M尿素，pH7.5洗滌除去汙染的大腸桿菌蛋白質。再用8M尿素，pH4進行洗脫。用SDS-PAGE法監測層析譜，並合併含融合蛋白質的部分。將小等分的該合併物與EDTA混合併對水透析脫鹽，凍幹後用電子流質譜法進行分析(表1)。
表1融合蛋白質的特徵融合蛋白質每個100L發酵罐理論質量以電子流MS的純化產率(克) 測得的平均質量人WT 3.013817 13820人Mut.M35S5.513773 13776人Mut.M35L5.713799 13802人Mut.M35Q4.513814 13817人Mut.M35E6.013813 無試大鼠WT6.013724 13728WT=野生型，Mut=突變體，如M35S(35位上的Met突變成Ser)實施例5裂解融合蛋白質以產生1-42b-澱粉狀蛋白肽首先以2ml/分鐘的流速，用8M尿素，pH4平衡半製備性RP-18HPLC(Vidac，說明書218TP152010,250mm×10mm)柱。然後將1等份含有400mg融合蛋白質(在8M尿素，pH4中)的NTA洗脫物以1ml/分鐘的流速泵到柱上。然後用8M尿素，pH4，以2ml/分鐘的流速洗柱。用水以2ml/分鐘的流速洗出尿素，直到柱出口處的吸光率達到基線水平。用加在由20％乙醇、40％甲酸和40％水組成的溶液中的45mg/mlCNBr，在20℃下以0.5ml/分鐘的流速將柱衝洗24小時，以實現裂解。然後用0.1MEDTA以2ml/分鐘的流速洗該柱，並用0.05％三氟乙酸以2.0ml/分鐘的流速洗出CNBr連同已釋放的MRGSHHHHHHGS-(NANP)19-RSM。使用在時間點上給出的下列乙醇梯度，以2ml/分鐘的流速冼脫1-42殘基b-澱粉狀蛋白肽(分鐘/O/O乙醇)0/0、,40/40,45/50,50/65,55/100,60/100,65/0。
含有b-澱粉狀蛋白肽的寬峰出現在45分鐘和60分鐘之間。該肽為單體的關鍵是立即用蒸餾水稀釋(如將洗脫物溶加到含200mlH2O的攪拌的燒杯中)，並立即凍幹。所得粉末稱為W1。因為有相當量的b-澱粉狀蛋白肽仍留在柱上，故使用上述方法重複洗脫三次，得到樣品W2,W3和W4。檢驗這些樣品的純度(表2)和單體bA4的量(圖6)。用電子流質譜法(表3)、胺基酸分析法和氨基末端序列測定法(表3)證實肽的正確化學結構。
表2:1-42b-澱粉狀蛋白肽的產生肽 檢驗序號 洗滌數產生的質量 純度(mg)(％)大鼠WT 4 1100±14 90±2(Seq ID No:2) 2 28±8 89±23/4 9±3 90±1人 WT 3 1 96±23 79±9(Seq ID No:1) 2 52±10 73±53 32±9 78±44 15±8 86±5人 M35S 3 1 71±13 80±8(Seq ID NO:4) 2 31±5 74±23 18±7 83±24 2±7 88±2人 M35L 3 1 59±15 72±8(Seq ID No:3) 2 23±9 71±43 8±3 78±3人M35Q 4 1 37±4 70±2(Seq ID No:5) 2 10±5 82±3人M35E 1 1 95 未檢驗(Seq ID No:6) 2 68 未檢驗3 46 未檢驗4 31 未檢驗純度是基於胺基酸分析得出的，融合蛋白質的含量根據Asp對Glu的比值測得。純的1-42b-澱粉狀蛋白肽有4個Glu和4個Asp殘基，純的融合蛋白質具有42個Asp對4個Glu的比例。表3:1-42b-澱粉狀蛋白肽的鑑定樣品質 譜 Edman 降解理論值 實測值 10-15次循環人WT4515.1 4531**DAEFRHDSGYEVHHQ人M35S 4471.0 4472DAEFRHDSGY人M35L 4497.1 4498DAEFRHDSGY人M35Q 4512.0 4512未檢測人M35E 4513.0 4512未檢測大鼠WT 4417.0 4435**DAEFGHDSGF**人WT和大鼠WT的蛋氨酸在裂解過程中被轉化成蛋氨酸亞碸。
實施例6單體1-42bM的純化小規模方法將含有1mgbA4的樣品上LKB UltroPac HPLC柱(直徑7.5mm，長度600mm，流速0.5ml/分，緩衝液12mM三(羥甲基)氨基甲烷含有200mM甘氨酸，pH7.8)。bA4出現在尖峰中，且峰值部分在圖7所示的瓊脂糖電泳凝膠上含有考馬斯亮蘭條帶。光掃描實驗沒給出存在高分子量形式(聚集物或纖維)的證據，而在同一條件下層析的校正標準則指出分子量約為4500，表明bA4是作為單體存在的。
製備規模方法使用BioRad生產的「連續洗脫電泳系統491型Prep Cell」。非變性不連續丙烯醯胺凝膠由4％丙烯醯胺/2.7％N,N′-亞甲基-雙丙烯醯胺分離膠(在0.375M三(羥甲基)氨基甲烷(pH8.8)中)組成，長度3cm，直徑37mm，並裝配有20mm直徑的冷凍管。
堆積膠由4％丙烯醯胺/2.7％N,N′-亞甲基-雙丙烯醯胺(在0.125M三(羥甲基)氨基甲烷(pH6.8)中)組成，長度為2cm。電泳緩衝液是25mM三(羥甲基)氨基甲烷/0.2M甘氨酸，pH8.3。使用同一緩衝液以0.75ml/分鐘的流速進行洗脫。將通常得自洗滌2、3或4的45mgbA4肽溶解在7mlH2O和1ml甘油中。以12瓦電壓(恆定，限制在500V和40mA)進行電泳，一般需進行4小時。典型的電泳結果示於圖7中。
實施例71-35HIV-1肽的純化將按照製備和純化含單體1-42bA4之融合蛋白質時所述的同樣方法(實施例1-4)製備並純化的400mg融合蛋白質MRGS(H)5GS(NANP)19RSM RILA VERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS(Seq ID No:12)加於Vydac RP18柱(說明書218 TP152010,250mm×10mm)上，並使用上述裂解1-42bA4融合蛋白質的同樣條件(實施例5)進行裂解。得到大約20-30mg凍幹的粉末。用電子流分析法分析該粉末。檢測出相當於1-35HIV-1肽(Seq ID No:11)的3902±2Da峰。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)姓名F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse124(C)城市Basle(D)州 BS(E)國家Switzerland(F)郵政號 CH-4002(G)電話061-6884256(H)傳真061-6881395(I)電傳 962292/965542hlr ch(ⅱ)發明題目 Process for producing hydrophobicpolypeptides,proteins or peptides(ⅲ)序號12(ⅳ)電腦可讀形式(A)介質類型Floppy disk(B)計算機 IBM PC compatible(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EP0)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度42胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學 線性(ⅱ)分子類型 肽(ⅴ)片段類型 N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 1015Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 2530Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala3540(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 42胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學 線性(ⅱ)分子類型 肽(ⅴ)片段類型 N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 2530Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala3540(2)SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 42胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 1015Leu Val Phe Phe Pla Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 2530Gly Leu Leu Val Gly Gly Val Val Ile Ala3540(2)SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 42胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO:4:Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 1015Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 2530Gly Leu Ser Val Gly Gly Val Val Ile Ala3540(2)SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 42胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學 線性(ⅱ)分子類型 肽(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 1015Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 2530Gly Leu Gln Val Gly Gly Val Val Ile Ala3540(2)SEQ ID NO:6的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 42胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學 線性(ⅱ)分子類型 肽(ⅴ)片段類型 N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 1015Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 2530Gly Leu Glu Val Gly Gly Val Val Ile Ala3540(2)SEQ ID NO:7的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 520鹼基對(B)類型 核酸(C)鏈股 單股(D)拓撲學 線性(ⅱ)分子類型 DNA(基因組)(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)定位115..516(D)其他信息/產物=「澱粉狀蛋白質AA」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT AATAGATTCA60ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGAA TTCATTAAAG AGGAGAAATT AACT ATG117Met1AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCT AAC GCG AAC CCG AAC165Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Ala Asn Pro Asn510 15GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC213Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn20 25 30GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC261Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn35 4045GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC309Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn50 5560 65GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC357Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn7075 80GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AGA TCT ATG GAT GCG GAG TTC GGA CAT405Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Arg Ser Met Asp Ala Glu Phe Gly His859095GAT TCA GGC TTC GAA GTC CGC CAT CAA AAA CTG GTG TTC TTT GCA GAA453Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu100 105110GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCC ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGT GGC501Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly115 120 125GTT GTC ATA GCA TAAGCTT 523Val Val Ile Ala130(2)SEQ ID NO:8的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度133胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學 線性(ⅱ)分子類型 蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Ala Asn Pro1 51015Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro2025 30Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro35 4045Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro505560Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro65 7075 80Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Arg Ser Met Asp Ala Glu Phe Gly859095His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala100 105110Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly115120125Gly Val Val Ile Ala130(2)SEQ ID NO:9的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 520鹼基對(B)類型 核酸(C)鏈股 單股(D)拓撲學 線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)定位115..516(D)其他信息/產物=「澱粉狀蛋白質AA」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT AATAGATTCA60ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGAA TTCATTAAAG AGGAGAAATT AACT ATG117Met1AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCT AAC GCG AAC CCG AAC165Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Ala Asn Pro Asn51015GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC213Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn2025 30GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC261Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn35 40 45GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC309Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn50 556065GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AAC357Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn70 7580GCG AAC CCG AAC GCG AAC CCG AGA TCT ATG GAT GCG GAG TTC CGT CAT405Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Arg Ser Met Asp Ala Glu Phe Arg His85 9095GAT TCA GGC TAT GAA GTC CAC CAT CAA AAA CTG GTG TTC TTT GCA GAA453Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu100105110GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCC ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGT GGC501Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly115120125GTT GTC ATA GCA TAAGCTT 520Val Val Ile Ala130(2)SEQ ID NO:10的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 133胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Ala Asn Pro1 510 15Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro2025 30Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro35 4045Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro505560Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro65 7075 80Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Arg Ser Met Asp Ala Glu Phe Arg85 9095His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala100 105110Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly115120 125Gly Val Val Ile Ala130(2)SEQ ID NO:11的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly1 510 15Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp202530Asn Ala Ser35(2)SEQ ID NO:12的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度 126胺基酸(B)類型 胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asn Ala Asn Pro1 5 1015Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro20 2530Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro3540 45Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro505560Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro6570 7580Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Arg Ser Met Arg Ile Leu Ala Val859095Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser100 105 110Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser11512012權利要求
1．一種製備和純化需要的疏水多肽、蛋白質或肽的方法，該方法包括下列步驟(a)使含有下列通式的融合蛋白質的水溶液通過疏水基質柱，A-B-C其中A是大體積親水肽，B是選擇性裂解位點，C是所需的疏水多肽、蛋白質或肽(b)用含有裂解試劑或酶的溶液衝洗柱，並(c)用水混溶性溶劑除去所得到的所需疏水多肽、蛋白質或肽。
2．根據權利要求1的方法，其中所說的融合蛋白質中大體積親水肽具有下列通式的肽序列(NANP)x其中x是10-40，較好是19。
3．根據權利要求1或2的方法，其中所說的融合蛋白質中選擇性裂解位點是化學裂解位點，較好是被溴化氰特異性裂解的該位點的蛋氨酸殘基。
4．根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所說的融合蛋白質中所需的疏水多肽、蛋白質或肽是b-澱粉狀蛋白肽或在35位上具有亮氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺或穀氨酸而不是蛋氨酸或蛋氨酸亞碸殘基的b-澱粉狀蛋白肽的點突變體。
5．根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所說的融合蛋白質中所需的疏水多肽、蛋白質或肽是1-35HIV-1肽。
6．根據權利要求1-5中任一項的方法，其中疏水基質柱是十八基結合的矽膠微顆粒柱。
7．根據權利要求1-6中任一項的方法，其中裂解試劑是溴化氰。
8．生產作為均質肽的單體b-澱粉狀蛋白肽的方法，該方法包括下列步驟(a)使含有權利要求4中述及的融合蛋白質的溶液通過疏水基質柱，(b)用含有裂解試劑或酶的溶液衝洗柱，(c)用水混溶性溶劑洗脫得到單體b-澱粉狀蛋白肽，並(d)用蒸餾水稀釋單體b-澱粉狀蛋白肽，然後凍幹，以及(e)必要時，在凍幹後將單體b-澱粉狀蛋白肽純化達到最大均質性。
9．根據權利要求8的方法，其中疏水基質柱是十八基結合的矽膠微顆粒柱。
10．根據權利要求8或9的方法，其中裂解試劑是溴化氰。
11．均一的單體b-澱粉狀蛋白肽。
12．根據權利要求11的單體b-澱粉狀蛋白肽，其在35位上具有亮氨酸(Seq ID NO:3)、絲氨酸(Seq ID NO:4)、穀氨醯胺、(Seq IDNO:5)或穀氨酸殘基(Seq ID NO:6)而不是蛋氨酸或蛋氨酸亞碸殘基。
13．根據權利要求1-7中任一項的方法，其中所需的疏水多肽、蛋白質或肽是1-35HIV-1肽。
14．用於篩選治療早老性痴呆的藥物的權利要求11或12的單體b-澱粉狀蛋白肽。
15．權利要求11或12的單體b-澱粉狀蛋白肽用於篩選治療早老性痴呆藥物的應用。
全文摘要
本發明提供了適用於生產和純化疏水多肽、蛋白質或肽的方法。本發明進一步提供了用於生產和純化疏水多肽、蛋白質或肽的融合蛋白質。此外，本發明還提供了均一的單體b－澱粉狀蛋白肽和使用所說的單體b－澱粉狀蛋白肽篩選澱粉狀蛋白毒性抑制藥物的試驗。
文檔編號C07K19/00GK1227846SQ9910139
公開日1999年9月8日 申請日期1994年7月4日 優先權日1993年7月6日
發明者H·德貝利, P·雅各, N·德雷格, D·施圖伯, G·H·特羅特曼 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司