一種人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的蛋白質與多肽序列及其應用的製作方法

2023-07-20 15:01:31 2

專利名稱：一種人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的蛋白質與多肽序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及與人白血病病因、發病機理及治療有關的逆轉錄病毒基因組編碼的新蛋白質，其具有SEQ ID NO.1、3或5所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的病毒蛋白多肽變體或衍生物。本發明還涉及該病毒基因組編碼的病毒蛋白質和多肽序列的製備方法。本發明還涉及一種用於檢測樣本中是否存在人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的病毒蛋白的方法和一種用於阻抑人白血病相關逆轉錄病毒方法。
本發明人首次從白血病患者原代白血病細胞中分離和克隆到一種全長逆轉錄病毒前病毒基因組。實驗證實該病毒基因組不僅存在於大多數白血病患者中，表達相應的病毒RNA和病毒蛋白，而且具有惡性轉化正常細胞的功能。並在此基礎上得到了與人白血病病因、發病機理及治療有關的逆轉錄病毒基因組編碼的新蛋白質。由此，為鑑定、治療和/或預防人類白血病提供了一條新的途徑。
本發明的另一方面提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組POL基因編碼的病毒蛋白多肽，其具有SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的病毒蛋白多肽變體或衍生物。
本發明的再一方面，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組ENV基因編碼的病毒蛋白多肽，其具有SEQ ID NO.5所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的病毒蛋白多肽變體或衍生物。
本發明的又一方面，提供了一種用於檢測樣本中是否存在人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的病毒蛋白的方法，其特徵在於利用了本發明所述的病毒蛋白多肽。
本發明的又一方面，提供了一種用於阻抑人白血病相關逆轉錄病毒方法，其特徵在於利用了本發明所述的病毒蛋白多肽。
圖2顯示GAG基因編碼的癌性蛋白與貓肉瘤病毒的編碼的酪氨酸蛋白激酶的胺基酸序列同源性比較結果。
圖3顯示ENV基因編碼的癌性蛋白與腫瘤病毒癌基因v-src編碼的癌性蛋白胺基酸序列同源性比較結果發明詳述在本發明中，術語「該病毒基因組編碼的病毒蛋白質和多肽的胺基酸序列」是指如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.5所述的GAG、POL、ENV基因編碼的病毒蛋白質和多肽的胺基酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.5所述的序列同源性在95％以上的所有具有生物學功能的蛋白質和多肽變體或衍生物。
「分離的」指「通過人工」從天然狀態改變和/或從天然環境分離。這樣，如果存在於自然界的「分離的」組合物或物質被「分離」，那麼它已被改變或已被從其最初的環境移走，或兩者都有。例如，天然存在於活的動物內的多核苷酸或多肽不是「分離」的，但從其天然狀態的共存物質中分離的同一多核苷酸或多肽是「分離的」，正如此處所用的該術語。
此處所用的術語「變體」是指多核苷酸或多肽，其分別不同於參考的多核苷酸或多肽，但保留了基本的特性，如基本的生物特性、結構特性、調節特性或生化特性。多核苷酸的一般變體之核苷酸序列不同於另一個，參考核苷酸。變體核苷酸序列的變化可改變或不改變多肽的胺基酸序列，其中所述的多肽由參考多核苷酸編碼。核苷酸的變化可導致參考序列所編碼的多肽中胺基酸的替換、添加、刪除、融合和截短，對此將在下面討論。多肽的一般變體之胺基酸序列不同於另一個，參考多肽。通常，差異是有限的，以使參考多肽之序列與變體總體上非常相似，並且在許多區域是相同的。變體和參考多肽胺基酸序列上的差異可以是一個或多個胺基酸以任一組合的替換、添加和刪除。替換或插入的胺基酸殘基可由遺傳密碼編碼，也可不由遺傳密碼編碼。多核苷酸或多肽的變體可以自然產生(如等位基因變體)，或者它可以是非自然產生的變體。多核苷酸和多肽之非自然產生的變體可通過誘變技術或直接合成而產生。
「同源性」是對核苷酸序列或胺基酸序列之同源性的量度。通常將序列排列起來，以獲得最大限度的匹配。「同源性」本身具有本領域認知的意義並且可用公開的技術計算。見例如(計算分子生物學(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY)，Lesk，A.M.，ed.，牛津大學出版社，紐約，1988；生物計算機學資訊學和基因組計劃(BIOCOMPUTINGINFORMATICS AND GENOME PROJECTS)，Smith，D.W.，ed.，學術出版社，紐約，1993；序列數據的計算機分析，第一部分(COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PARTI)，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，新澤西，1994；分子生物學中的序列分析(SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULARBIOLOGY)，von Heinje，G.，學術出版社，1987；以及序列分析導引(SEQUENCE ANALYSIS PRIMER)，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，紐約，1991)。雖然存在許多可用於測量兩個多核苷酸或多肽間同源性的方法，該術語「同源性」為技術人員周知(Carillo，H.，和Lipton，D.，工業與應用數學會應用數學雜誌(SIAMJ.Applied Math.)(1988)481073)。測定兩個序列間的同源性或相似性的常用方法包括(但不限於)公開於超大計算機指南(Guide to HugeComputers)，Martin J.Bishop，ed.，學術出版社，聖地牙哥，1994和Carillo，H.，和Lipton，D.，工業與應用數學會應用數學雜誌(1988)481073中的方法。測定同源性或相似性的方法已按規則編在電腦程式中。優選的、用於測定兩個序列間的同源性或相似性的電腦程式方法包括(但不限於)GCG程序包(Devereux，J.，等人，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)(1984)12(1)387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等人，分子生物學雜誌(J.Molec.Biol.)(1990)215403)。
通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ IDNO1的參考核苷酸序列至少具95％的「同源性」是指在SEQ ID NO1的參考核苷酸序列之每100個核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參考序列中多達5％的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入參考序列中，其中插入的核苷酸可多達參考序列之總核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5％。參考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5或3末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨散在於參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在於參考序列中。
類似地，一種多肽，其所具有的胺基酸序列例如與SEQ ID NO2的參考胺基酸序列至少具95％的「同源性」是指在SEQ ID NO2的參考胺基酸序列之每100個胺基酸中，該多肽之胺基酸序列除了含有多達5個胺基酸的變化外，該多肽之胺基酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得胺基酸序列與參考胺基酸序列至少95％相同的多肽，參考序列中多達5％的胺基酸殘基可被刪除或被另一胺基酸替代；或可將一些胺基酸插入參考序列中，其中插入的胺基酸多達參考序列之總胺基酸殘基的5％。參考序列的這些突變可發生在參考胺基酸序列的氨基或羧基末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨散在於參考序列的殘基中，或以一個或多個鄰近的組存在於參考序列中。
本發明的一個方面，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組GAG基因編碼的病毒蛋白多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。事實上，SEQ ID NO.1是由GAG基因(1570個核苷酸)編碼的由523個胺基酸組成的多聚蛋白，在氨基端含有一個逆轉錄病毒核殼體基質蛋白(MA)保守功能域(Conserved Domain，CD)，在羧基端含有一個逆轉錄病毒核殼體P30蛋白保守功能域(Conserved Domain，CD)。具體地，在本發明的一個實施方案中，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組GAG基因編碼的病毒蛋白多肽的片段，其特徵在於與腫瘤病毒癌基因v-abl高度同源，具有與SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。更具體地，在本發明的一個實施方案中，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組GAG基因編碼的病毒蛋白多肽的片段，其特徵在於具有SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列。事實上，由該病毒基因組中GAG基因編碼的癌性蛋白胺基酸序列與腫瘤病毒癌基因v-abl編碼的癌性蛋白的胺基酸序列的同源性高達36％(58/159)，與貓肉瘤病毒的編碼的酪氨酸蛋白激酶的胺基酸序列同源性高達47％(33/70)。
本發明的又一方面，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組POL基因編碼的病毒蛋白多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。事實上，SEQ ID NO.3是由POL基因(3550個核苷酸)編碼的由1183個胺基酸組成的多聚蛋白，從氨基端到羧基端依次含有逆轉錄病毒蛋白酶、逆轉錄酶、逆轉錄酶H和整合酶四個保守功能域(Conserved Domain，CD)。具體地，在本發明的一個實施方案中，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組POL基因編碼的病毒蛋白多肽的片段，其特徵在於與腫瘤病毒癌基因v-src高度同源，具有與SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物.更具體地，在本發明的一個實施方案中，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組POL基因編碼的病毒蛋白多肽的片段，其特徵在於具有SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列。
本發明的另一方面，提供了一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組ENV基因編碼的病毒蛋白多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID NO.5所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。事實上，SEQ ID NO.5是由ENV基因(2047個核苷酸)編碼的由682個胺基酸組成的多聚蛋白，在氨基端含有一個逆轉錄病毒外殼蛋白的表面糖蛋白，在羧基端含有一個逆轉錄病毒外殼跨膜蛋白TM保守功能域(Conserved Domain，CD)。本發明中，由該病毒基因組中ENV基因編碼的癌性蛋白胺基酸序列與腫瘤病毒癌基因v-src編碼的癌性蛋白的胺基酸序列的同源性高達32％(49/154)。
在本發明的另一方面，還提供一種載體，它包含了該病毒基因組中ENV基因全長表達序列。
本發明的又一方面， 提供一種利用基因重組技術生產上述新的人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的各種病毒蛋白和多肽及相應核酸序列的方法。在本發明的一個實施方案中，提供一種利用基因重組技術生產該病毒基因組中GAG基因編碼的病毒蛋白方法，其步驟如下(1)將編碼該病毒基因組中GAG完整蛋白的核苷酸序列可操作地連接於表達調控序列，形成GAG蛋白表達載體；(2)將步驟(1)中表達載體轉入宿主細胞，形成該病毒基因組中GAG基因編碼的病毒蛋白的重組細胞；(3)在適合表達病毒GAG蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有生物活性的病毒GAG蛋白。
在本發明的另一實施方案中，提供一種利用基因重組技術生產該病毒基因組中ENV基因編碼的病毒蛋白方法，其步驟如下(1)將編碼該病毒基因組中ENV完整蛋白的核苷酸序列可操作地連接於表達調控序列，形成ENV蛋白表達載體；(2)將步驟(1)中表達載體轉入宿主細胞，形成該病毒基因組中ENV基因編碼的病毒蛋白的重組細胞；(3)在適合表達病毒ENV蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有生物活性的病毒ENV蛋白。
本發明還提供了對上述逆轉錄病毒GAG、POL、ENV基因編碼的病毒蛋白及由GAG和ENV基因編碼的癌性蛋白特異性結合的各種抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來製備針對上述逆轉錄病毒GAG、POL、ENV基因編碼的病毒蛋白及由GAG和ENV基因編碼的癌性蛋白的各種特異性抗體。例如，將提純的上述各種病毒基因產物或他們的抗原片段注入動物體內(如兔、羊、馬、小鼠等)來產生多克隆抗體。同樣，也可以應用雜交瘤技術製備針對上述各種病毒蛋白特異性單克隆抗體。本發明的抗體包括可以抑制上述各種病毒蛋白生物功能的抗體，也可以是不影響所述功能的抗體。每一種抗體都可以通過對上述病毒基因產物片段或功能域致免疫而產生，而上述病毒基因產物及其片段還可以用重組的方法生產或多肽合成儀生產。
本發明的各種特異性抗體可以用來鑑定表達上述病毒GAG、POL、ENV基因編碼的病毒蛋白及由GAG和ENV基因編碼的癌性蛋白的細胞，如人白血病細胞。如可以用本發明的各種特異性抗體結合免疫螢光試驗、免疫細胞化學、流式細胞術等技術，檢測和分析表達相應病毒蛋白或多肽的細胞。也可以用本發明的抗體結合免疫印跡技術(Western Blot)定量分析細胞表達病毒蛋白或多肽。
本發明又一方面，提供了一種用於檢測樣本中是否存在人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的病毒蛋白的方法，其特徵在於利用了本發明所述的病毒蛋白多肽。在本發明的一個實施方案中，利用本發明所述病毒蛋白多肽製備了相應的單克隆抗體或多克隆抗體。進一步地，利用如上製備的單克隆或多克隆抗體用本領域周知的酶免疫試驗、免疫組織化學技術、免疫印跡如WESTERN BLOT等方法檢測生物學樣本中的與人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的多種病毒蛋白。
本發明的再一方面，提供了一種用於阻抑人白血病相關逆轉錄病毒方法，其特徵在於利用了本發明所述的病毒蛋白多肽。在本發明的一個實施方案中，利用本發明所述的病毒蛋白多肽製備相應的單克隆抗體或多克隆抗體；以及利用所得單克隆抗體或多克隆抗體直接封閉該病毒基因組編碼的多種活性病毒蛋白多肽。
本發明進一步構思了利用本發明所述的病毒蛋白多肽，從其中的功能域中尋找和設計相應的藥物來阻斷或抑制所述病毒蛋白，進而抑制該病毒的活性。具體地，本發明提供的該病毒基因組編碼的病毒蛋白或多肽胺基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4及SEQ ID NO.5，還可以用作設計抗病毒藥物靶分子或靶位點。可以根據這些序列設計相應的多克隆抗體或單克隆抗體用於阻抑和封閉病毒蛋白或多肽。也可以利用這些序列中的一些有重要功能的功能域(Domain)尋找和設計相應的化學藥物，來阻斷或抑制病毒。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人編著的《分子克隆實驗手冊》中所述的實驗條件，或按照試劑或試劑盒製造商提供的實驗條件。
將GAG基因編碼的癌性蛋白214胺基酸殘基用NCBI提供的BLAST工具對GenBank、EMBL等蛋白質資料庫進行同源性檢索，結果發現在胺基酸水平上它與腫瘤病毒癌基因v-abl編碼的癌性蛋白的胺基酸序列的同源性高達36％(58/159，結果見附

圖1)，與貓肉瘤病毒的編碼的酪氨酸蛋白激酶的胺基酸序列同源性高達47％(33/70，結果見附圖2)。
將編碼人白血病相關逆轉錄病毒基因GAG病毒蛋白多肽以GST融合蛋白形式在大腸桿菌中進行原核表達。
原核表達載體的構建根據SEQ ID NO.1提供的序列，設計擴增編碼完整GAG病毒蛋白多肽的核酸序列的PCR引物，經PCR擴增後將擴增的DNA片段克隆到pGEX-T載體。然後，用氯化鈣方法轉入合適的大腸桿菌中，篩選和鑑定含有能表達GAG病毒蛋白多肽的重組子。
表達GAG重組融合蛋白分離和純化取含有GAG病毒蛋白多肽的重組子的工程菌，放入含7ml LB培養液試管中，37℃振搖培養過夜。然後，按1∶100濃度比例將工程菌接種到新鮮的LB培養基中，37℃繼續振搖培養3小時，然後加入IPTG(終濃度1mmol/L)，37℃繼續振搖培養3小時。取IPTG誘導後的工程菌液，離心，棄上清液，用PBS懸浮細菌沉澱，然後用超聲粉碎法破碎細菌。然後用柱離心法純化重組GAG病毒蛋白。
SEQUENCE LISTING110養生堂有限公司浙江大學醫學院附屬第二醫院120一種新的人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的蛋白質與多肽序列及其應用130idc0200221605170PatentIn version 3.12101211523212PRT213Homo sapiens4001Met Leu Lys Asn Phe Lys Lys Gly Phe Asn Gly Asp Tyr Gly Val Thr1 5 10 15Met Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ile Leu Cys Glu Ile Asp Trp Pro Thr20 25 30Leu Glu Val Gly Trp Pro Ser Glu Gly Ser Leu Asp Arg Ser Leu Val35 40 45Ser Lys Val Trp His Lys Val Thr Gly Lys Ser Gly His Ser Asp Gln50 55 60Phe Pro Tyr Ile Asp Thr Trp Leu Leu Gln Leu Val Gln Asp Pro Pro65 70 75 80Gln Trp Leu Arg Gly Gln Ala Ala Ala Val Leu Val Ala Lys Gly Gln85 90 95Ile Ala Lys Glu Gly Ser Arg Ser Thr His Trp Gly Lys Ser Thr Pro100 105 110Glu Val Leu Phe Asp Pro Thr Ser Glu Asp Pro Leu Gln Glu Met Ala
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權利要求
1.一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組GAG基因編碼的病毒蛋白多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。
2.如權利要求1所述病毒蛋白多肽，其特徵在於與腫瘤病毒癌基因v-abl高度同源，具有SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。
3.一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組POL基因編碼的病毒蛋白多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。
4.如權利要求3所述的病毒蛋白多肽，其特徵在於與腫瘤病毒癌基因v-src高度同源，具有SEQ ID NO.4所示的胺基酸序列或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。
5.一種分離的人白血病相關逆轉錄病毒基因組ENV基因編碼的病毒蛋白多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID NO.5所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。
6.一種用於檢測樣本中是否存在人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的病毒蛋白的方法，其特徵在於利用了權利要求1-5中任一項所述病毒蛋白多肽。
7.權利要求6所述的方法，其中包括利用權利要求1-5中任一項所述病毒蛋白多肽製備相應的單克隆抗體或多克隆抗體。
8.一種用於阻抑人白血病相關逆轉錄病毒方法，其特徵在於利用了權利要求1-5中任一項所述病毒蛋白多肽。
9.權利要求8所述的方法，其中包括利用權利要求1-5中任一項所述病毒蛋白多肽製備相應的單克隆抗體或多克隆抗體；以及利用所得單克隆抗體或多克隆抗體直接封閉該病毒基因組編碼的多種活性病毒蛋白多肽。
10.權利要求8所述的方法，其中包括利用了權利要求1-5中任一項所述病毒蛋白多肽，中的功能域尋找和設計相應的藥物來阻斷或抑制病毒。
全文摘要
本發明涉及與人白血病病因、發病機理及治療有關的逆轉錄病毒基因組編碼的新蛋白質，其具有SEQ ID NO.1、3或5所示的胺基酸序列或其片段，或為與其同源性在95％以上的具有相同或相似生物學功能的病毒蛋白多肽變體或衍生物。本發明還涉及該病毒基因組編碼的病毒蛋白質和多肽序列的製備方法。本發明還涉及一種用於檢測樣本中是否存在人白血病相關逆轉錄病毒基因組編碼的病毒蛋白的方法和一種用於阻抑人白血病相關逆轉錄病毒方法。
文檔編號A61P35/02GK1461752SQ02121790
公開日2003年12月17日 申請日期2002年5月31日 優先權日2002年5月31日
發明者徐榮臻, 鄭樹, 鍾睒睒 申請人:浙江養生堂天然藥物研究所有限公司, 浙江大學醫學院附屬第二醫院