高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其製備方法與應用的製作方法

2023-07-20 07:59:51 2

高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其製備方法與應用，涉及一株抑藻細菌及抑藻活性化合物。化合物為C40H54O3。將Y35接種於平板上劃線分離，培養後挑取單菌落再培養後即得發酵液，離心去上清，所得菌體萃取，離心，上清液真空蒸乾，萃取，減壓濃縮，乾燥得粗提取物，再溶於甲醇中，上樣於葡聚糖凝膠柱，洗脫，層析，顯色，合併相似組分得到合併洗脫液，再真空蒸乾後溶解於DMSO進行抑藻活性驗證，選取具有抑藻活性的組分，再溶於乙酸乙酯中，上樣於矽膠柱，洗脫，間隔收集洗脫液，層析，顯色後合併相似組分得到合併洗脫液，真空蒸乾，再溶於DMSO驗證抑藻活性，選取具有抑藻活性組分，用高效液相色譜分析，即得產物。
【專利說明】高效抑藻活性化合物Deinoxanth in及其製備方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株抑藻細菌及抑藻活性化合物，尤其是涉及一種高效抑藻活性化合 物Deinoxanthin及其製備方法與應用。

【背景技術】
[0002] 海洋藻類過度繁殖會形成赤潮，赤潮的爆發往往引起海洋環境的改變，破壞了原 有的生態平衡[1]。特別是有毒藻引發的赤潮，其分泌的藻毒素造成了海洋生物的死亡，進 而產生了巨大的經濟問題和健康危機[2, 3]。塔瑪亞歷山大藻是一種全球分布的有毒渦鞭 毛藻，而且其具有的毒素經食物鏈傳遞後形成麻痺性貝毒對水域環境和人類健康都具有極 大的危害，在廈門海域常引發赤潮[4, 5]，是一種急需處理和控制的有毒藻。
[0003] 在控制海洋藻類生長的方法中，常用的有物理法[6]、化學法[7]和生物法。物理 法主要是通過超聲波、紫外線或者活性炭殺死藻細胞，化學法是化學藥品、絮凝劑等抑制藻 類生長，但是這兩種方法成本較高，不易操作，危害生態環境及非赤潮生物[8]。相對於這 兩種方法，生物法更加專一、高效，具有生物安全性。近年來，圍繞海洋細菌在赤潮生消過程 中的作用，科學家做了大量關於"以菌治藻"的研究[9-11]。研究表明，細菌可以通過直接 或間接的作用抑制藻類的生長，甚至裂解藻細胞，從而表現為殺藻效應。藻菌共培養的研究 結果表明殺藻細菌的作用方式可以歸結為兩種：一是細菌同藻細胞直接接觸、導致藻細胞 死亡的直接殺藻作用，Furusawa等從日本的Kagoshima海灣裡篩選出1株細菌SS98-5,超 薄部分的電子顯微照片中發現了滑行運動的現象，並觀察到滑行的細胞中具有類微管結構 [12]，說明該細菌通過這種滑動作用與藻細胞接觸；二是細菌不同藻細胞直接接觸，而通過 釋放某種化學物質導致藻細胞死亡的間接殺藻作用[13, 14]。目前所發現的殺藻細菌多數 屬於該類，其一般是通過分泌溶解性殺藻物質殺死藻細胞。Li等從殺藻弧菌BS02中分離到 一種脂肪酸類物質，能有效的抑制塔瑪亞歷山大藻的生長[15] ;Wang等發現從廈門海域分 離出的溶藻菌DHQ25,可通過分泌胞外蛋白來抑制和殺死赤潮藻[16]。
[0004] 為了有效地控制塔瑪亞歷山大藻的生長，我們繼續從不同生境進行殺藻細菌的 分離，從而不斷地擴大和豐富殺藻微生物資源。其中本研究所採用的細菌一耐輻射球菌 (Deinococcus)來自於水生環境，Deinococcus屬的細菌是一類極端環境微生物，不但能夠 對引起細胞致死效應的福射有極強抵抗能力，而且還能忍受強烈的高溫、乾燥、低溫、氧化 劑等極端環境；球狀菌多為革蘭氏陽性菌，杆狀菌則為革蘭氏陰性，菌落顏色呈紅色至橘紅 色，不同菌種對培養溫度要求有所差別，大部分的生長最適溫度在30°C到37°C之間，而從 熱泉中分離到的D. geothermalis和D. mwrayi是中度嗜熱，它們的最適生長溫度在45°C到 55°C之間。但是迄今為止，還沒有任何一篇報導稱該屬的細菌可以分泌殺藻活性物質，因此 我們是首次證實並成功分離到一種色素類的可以高效抑制塔瑪亞歷山大藻的生長的活性 物質。
[0005] 迄今為止，大多數篩選到的抑藻微生物是通過分泌特異的具有抑藻活性的物質來 起抑藻作用的。已經報導的抑藻活性化合物包括：蛋白質（含胞外酶）、多肽、胺基酸、抗生 素、含氮化合物等其他尚未定性的抑藻化合物[17-22]。通過篩選高效、專一的抑藻活性化 合物成為開發抑藻劑用於赤潮治理的一個新思路。然而目前國內菌藻關係的研究落後於國 夕卜，在抑藻物質的提取、純化、鑑定等研究方面仍處於起步階段，已被分離鑑定的抑藻物質 還遠遠不足以滿足有害赤潮的防控。
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【發明內容】

[0029] 本發明的第一目的在於提供一種耐福射球菌（Deinococcus xianganensis) Y35。
[0030] 本發明的第二目的在於提供一種高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其製備方 法。
[0031] 本發明的第三目的在於提供一種高效抑藻活性化合物Deinoxanthin在製備抑藻 劑中的應用。
[0032] 本發明的第四目的是提供一種耐福射球菌（Deinococcus xianganensis) Y35的篩 選方法。
[0033] 所述耐福射球菌（Deinococcus xianganensis) Y35已於2014年06月29日保藏 於中國典型培養物保減中心，地址為中國.武漢.武漢大學，郵編為430072,保減中心保減 編號為：CCTCC NO :M2014296。
[0034] 所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的分子式為C4(lH540 3，名稱為 Deinoxanthin,結構式如下所示：
[0035]

【權利要求】
1. 耐福射球菌（Deinococcus xianganensis)Y35,已於2014年06月29日保藏於中國 典型培養物保藏中心，保藏中心保藏編號為：CCTCC N0:M2014296。
2. 高效抑藻活性化合物De inoxanthin，其特徵在於，其分子式為C4(lH5403，名稱為 Deinoxanthin，結構式如下所示：
3. 如權利要求2所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的製備方法，其特徵在於， 包括以下步驟： 1) 將耐福射球菌（Deinococcus xianganensis)Y35接種於平板上劃線分離，培養後挑 取所述平板上的單菌落接種於蒸餾水配製的LB液體培養基中，再培養後即得發酵液； 2) 將步驟1)得到的發酵液離心後去掉上清液，所得紅色菌體用無水乙醇萃取，超聲振 蕩，再次離心； 3) 將步驟2)所得的上清液真空蒸乾，加入乙酸乙酯萃取過夜，減壓濃縮，乾燥，得到粗 提取物A ; 4) 將步驟3)所得的粗提物A溶於甲醇中，然後上樣於葡聚糖凝膠柱，採用甲醇為流動 相洗脫，在洗脫過程中，根據顏色不同收集洗脫液，並將洗脫液利用薄層層析進行層析，展 開劑按體積比的組成為二氯甲烷：甲醇=20 : 1，採用碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，然 後合併相似組分，得到合併洗脫液； 5) 將步驟4)所得的合併洗脫液真空蒸乾，然後溶解於DMS0進行抑藻活性驗證，選取經 驗證後具有抑藻活性的組分，記為組分B ; 6) 將步驟5)所得的組分B溶於乙酸乙酯中，然後上樣於矽膠柱，採用流動相梯度濃 度洗脫，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇的混合物，洗脫程序為體積比50 : 1，黃色、紅色雜質， 30 : 1，第一片紅色組分，15 : 1，第二片紅色組分，洗脫流速為lmL/min;在洗脫過程中，間 隔收集洗脫液，並將洗脫液進行層析，採用碘蒸氣顯色和硫酸銨乙醇顯色，然後合併相似組 分，得到合併洗脫液，然後將合併洗脫液真空蒸乾，再溶解於DMS0驗證抑藻活性，選取經驗 證後具有抑藻活性的組分，記為活性組分C ; 7) 將步驟6)所得的活性組分C利用高效液相色譜分析，分析柱SunFireTm C18 5μπι; 流動相按體積比為甲醇：乙腈：水=5 : 4 : 1，流速為lmL/min，柱溫為35°C，檢測波長為 480nm，每次進樣量為20 μ 1 ;在HPLC結果中，樣品只檢測到一個獨立的峰，所得化合物即為 所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin，結構式為：
4. 如權利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的製備方法，其特徵在於， 在步驟1)中，所述培養的條件是於28?37°C溫度下培養2?3d ;所述再培養的條件 可於28?37°C，180?250rpm培養2?3d ; 在步驟2)中，所述離心的條件可於12000?14000g離心10?20min ;所述超聲振蕩 的時間可為2?4h，所述再次離心的條件可於12000?14000g離心10?20min。
5. 如權利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的製備方法，其特徵在於， 在步驟3)中，所述上清液真空蒸乾的條件是將上清液置於旋轉蒸發儀下30°C真空蒸 幹，所述乙酸乙酯的加入量可為200?400mL ; 在步驟4)中，所述葡聚糖凝膠柱可採用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱。
6. 如權利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的製備方法，其特徵在於， 在步驟5)中，所述合併洗脫液真空蒸乾的條件是將合併洗脫液置於旋轉蒸發儀下 30°C真空蒸乾； 在步驟6)中，所述娃膠柱可採用170mmX 30mm，200?300目娃膠柱；所述合併洗脫液 真空蒸乾的條件可將合併洗脫液置於旋轉蒸發儀30°C真空蒸乾。
7. 如權利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的製備方法，其特徵在於， 在步驟 7)中，所述分析柱 SunFireTm C18 5μηι 為 4. 6mmX250mm Column。
8. 如權利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的製備方法，其特徵在於， 在步驟7)中，在HPLC結果中，樣品只檢測到一個獨立的峰，所述樣品通過Q Exactive LC-MS/MS系統和?-ΝΙ?檢測對化合物進行鑑定，純化合物即為所述高效抑藻活性化合物 Deinoxanthin。
9. 如權利要求2所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin在製備抑藻劑中應用。
10. 如權利要求1所述耐福射球菌（Deinococcus xianganensis)Y35的分離篩選方法， 其特徵在於，包括以下步驟： 1) 取福建廈門大學翔安校區湖水樣品，溶解於高壓滅菌的90mL LB培養基，置於150? 200rpm搖床震蕩20?30min，使樣品均勻分散；所述LB培養基的組成為胰蛋白腖10g，酵 母粉5g，氯化鈉10g，pH 7. 2,1L蒸饋水； 2) 用10倍稀釋法，塗布均勻分散的樣品於LB固體平板，置於28?37°C溫度下培養 3 ?5d ; 3) 挑取不同類型單菌落劃線於LB固體平板，置於28?30°C溫度下培養3?5d，驗證 是否純培養，重複該步驟直到得到純培養； 4) 接種分離出的純培養物單菌落於4mL LB液體培養基，置於28?37°C搖床，180? 250rpm震蕩培養3?5d ; 5) 將lmL發酵液加入到20mL指數期塔瑪亞歷山大藻培養液中，於20± 1 °C，12h光照， 12h黑暗，50 μ mol photons nT2s4光照強度條件下培養2d，LB培養基為對照加入藻液中， 分別設置3個平行；觀察塔瑪亞歷山大藻藻細胞是否死亡，從而篩選出抑藻活性菌株；將抑 藻菌株於_80°C保藏，待用。
【文檔編號】C07C49/743GK104152389SQ201410437123
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】鄭天凌, 李禕, 朱紅, 張化俊, 鄭偉 申請人:廈門大學