用於增強植物生長的殼寡糖和方法與流程

2023-07-13 19:46:56 2

本申請是申請號為201280057455.6、申請日為2012年9月24日、名稱為「用於增強植物生長的殼寡糖和方法」的發明專利申請的分案申請。

背景技術：

革蘭氏陰性土壤菌根瘤菌科(rhizobiaceae)和慢生根瘤菌科(bradyrhizobiaceae)與豆科植物例如大豆之間的共生有較多文獻記載。這些關係的生化基礎包括分子信號傳導的交換，其中，植物對細菌的信號化合物包括黃酮、異黃酮和黃烷酮類，而細菌對植物的信號化合物包括慢生根瘤菌和根瘤菌nod基因表達的終產物，稱為脂殼寡糖(lco)。這些細菌與豆科植物之間的共生使得豆科植物能夠固定大氣中的氮以用於植物生長，由此免去對氮肥的需求。由於氮肥會顯著增加作物的成本，並且與許多汙染效應相關，農產業繼續努力運用這種生物關係並開發新的用於提高植物產量而不增加氮類肥料的使用的試劑和方法。

美國專利第6,979,664號教導了增強植物作物的種子萌發或出苗的方法，包括以下步驟：提供包括有效量的至少一種脂殼寡糖和農業上合適的載體的組合物，以及在種子或幼苗的緊鄰處以相較於未經處理的種子或幼苗能增強種子萌發或出苗的有效量施用該組合物。

關於該概念的進一步拓展在wo2005/062899中有過教導，其涉及至少一種植物誘導劑(即lco)與殺真菌劑、殺蟲劑或其組合的結合，以增強植物特性如植物挺立(plantstand)、生長、活力(vigor)和/或產量。教導稱這些組合物和方法適用於豆科植物和非豆科植物，並且可以用於處理種子(臨種植前)、幼苗、根或植物。

相似地，wo2008/085958教導了用於在豆科植物和非豆科植物中增強植物生長和作物產量的組合物，其包含lco與另一種活性劑如幾丁質或殼聚糖、類黃酮化合物、或除草劑的組合，其可以同時或相繼地施用於種子和/或植物。與在'899公開中的情況一樣，'958公開教導了在臨種植前對種子進行處理。

最近，halford，「smokesignals」，chem.eng.news(2010年4月12日)第37～38頁報導，在森林起火後，煙中所含的卡裡金(karrikins)或丁烯羥酸內酯起到生長刺激劑的作用並促使種子萌發，並且能滋補已儲存的種子如玉米、蕃茄、萵苣和洋蔥。這些分子是美國專利第7,576,213號的主題。

然而，對於改進或增強植物生長的體系仍存在需求。

技術實現要素：

本發明的第一方面涉及一種增強植物生長的方法，其包括a)用有效量的至少一種殼寡糖(co)來處理(例如，施用於)植物種子或由種子萌發的植物，其中，與未經處理的植物或者從未經處理的種子收穫的植物相比較，在收穫時上述植物表現出按蒲式耳/英畝測量的植物產量增加、根數目增加、根長度增加、根質量增加、根體積增加和葉面積增加中的至少一種。

在一些實施方式中，使用至少兩種co。在一些實施方式中，對種子的處理包括將至少一種co直接施用於種子，然後可以將其進行種植或者在種植之前儲存一段時間。對種子的處理還可以包括間接處理，例如，通過將至少一種co引入至土壤中(在本領域中稱為犁溝內施用(in-furrowapplication))。在再其他的實施方式中，例如，經由葉噴，可以將至少一種co施用於由種子萌發的植物。該方法還可以包括使用其他的農藝學有益的試劑，例如，微量營養物；脂肪酸及其衍生物；(co以外的)植物信號分子，例如脂殼寡糖、(co以外的)幾丁質化合物、類黃酮、茉莉酸及其衍生物、亞油酸及其衍生物、亞麻酸及其衍生物和卡裡金(karrikins))；除草劑、殺真菌劑和殺蟲劑；以及解磷微生物、固氮細菌(根瘤菌接種物)和/或菌根真菌。

本發明的方法同樣適用於豆科植物和非豆科植物。在一些實施方式中，豆科種子是大豆種子。在一些其它實施方式中，經處理的種子是非豆科種子，例如大田作物種子，例如，穀類如玉米，或者蔬菜作物種子，例如馬鈴薯。

如工作實施例所說明，其總結了溫室中和田地中進行的實驗，本發明的方法所取得的結果顯示，將至少一種co施用於種子或由種子萌發的植物，導致植物生長的增強。這些結果據信是出人意料的，特別是就以下觀點而言：已知co參與系統獲得性抗性(sar)，但並非必要地參與植物生長的直接增強。本文所述的結果表明，在一些情形中，本發明的方法實現了與lco所實現的植物生長增強基本上相等的效果，或者在一些情形中，勝過lco所實現的植物生長增強。獲自溫室實驗的結果在這一方面特別顯著，在於其在基本上沒有疾病的條件下進行。

附圖說明

圖1a和2a顯示了可用於實施本發明的殼寡糖化合物(co)的化學結構。

圖1b和2b顯示了與圖1a和2a中的co相應且也可用於實施本發明的脂殼寡糖化合物(lco)的化學結構。

圖3a和4a顯示了可用於實施本發明的其他co的化學結構。

圖3b和4b顯示了與圖3a和3b中的co相應且也可用於實施本發明的myc-因子的化學結構。

圖5中的柱狀圖顯示了本發明的co(圖2a所示)與兩種不同來源的圖1b所示的lco以及對照相比較在三種不同的濃度(10-7、10-8和10-9m)下處理蕃茄種子的效果，其以幼苗平均根長度表示。

圖6中的柱狀圖顯示了本發明的co(圖2a所示)與兩種不同來源的圖1b所示的lco以及對照相比較在三種不同的濃度(10-7、10-8和10-9m)下處理蕃茄種子的效果，其以幼苗平均根鮮重表示。

圖7中的柱狀圖顯示了本發明的co(圖2a所示)與兩種不同來源的圖1b所示的lco相比較在(三種濃度的)平均濃度下處理蕃茄種子的效果，其以幼苗平均根長度表示。

圖8中的柱狀圖顯示了本發明的co(圖2a所示)與兩種不同來源的圖1b所示的lco相比較在(三種濃度的)平均濃度下處理蕃茄植物的效果，其以幼苗平均根鮮重表示。

圖9中的柱狀圖顯示了本發明的co(圖2a所示)與圖2b所示的lco以及對照相比較處理棉花植物的效果，其以每個幼苗的平均乾重/處理劑表示。

圖10(試驗1)和圖11(試驗2)中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co與圖2b所示的lco以及由幾丁質酶產生的(非本發明的)幾丁質化合物的混合物相比較處理玉米種子的效果，其以地上部(shoot)、根部的平均乾重和總乾重(地上部和根部的組合乾重)表示。

圖12中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co與圖2b所示的lco、由幾丁質酶產生的co的混合物、異黃酮以及對照相比較處理大豆種子的效果，其以葉表面積表示。

圖13中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co、圖1b所示的lco、異黃酮以及(經由酶促方法由殼聚糖得到的)非本發明的幾丁質化合物的混合物處理大豆種子的效果，其以大豆植物的平均乾重表示。

圖14中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與一種或兩種脂肪酸組合與圖2b所示的lco以及水相比較對色拉豆根毛變形的效果，其以百分比表示。

圖15中的圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與一種或兩種脂肪酸組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理油菜種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖16中的圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與一種或兩種脂肪酸組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理小麥種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖17中的圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與一種或兩種脂肪酸組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理苜蓿種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖18中的餅狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與一種或兩種不同脂肪酸組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理玉米種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖19中的圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與兩種不同脂肪酸之一組合與圖2b所示的lco、每種單獨的脂肪酸以及對照相比較處理玉米種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖20中的圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與兩種不同脂肪酸之一組合、co加兩種脂肪酸與圖2b所示的lco以及對照相比較處理小麥種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖21中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與四種不同脂肪酸之一組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理箭舌豌豆(viciasativa)種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖22中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與兩種不同脂肪酸之一組合與圖2b所示的lco以及對照相比較處理箭舌豌豆根部的效果，其以平均根長度表示。

圖23中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與兩種不同脂肪酸之一組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理綠豆、扁豆、紅扁豆和紅三葉草種子的效果，其以種子萌發的百分比表示。

圖24中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與兩種不同脂肪酸之一組合與圖2b所示的lco以及水相比較對蕃茄幼苗生長的效果，其以平均根長度表示。

圖25中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與兩種不同脂肪酸之一組合與圖1b所示的lco相比較對大豆種子的效果，其以平均胚根長度表示。

圖26中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co與圖2b所示的lco以及水相比較處理棉花種子的效果，其以平均植物乾重表示。

圖27中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co與圖1b所示的lco以及由幾丁質酶產生的co混合物相比較處理大豆植物的效果，其以平均植物幹生物質表示。

圖28中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與圖2b所示的lco組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理玉米種子的效果，其以平均植物乾重表示。

圖29中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與圖2b所示的lco組合與圖2b所示的lco以及水相比較處理高粱種子的效果，其以平均幼苗根長度表示。

圖30中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與微量營養物組合與水相比較處理棉花植物的效果，其以平均葉綠素含量表示。

圖31中的柱狀圖顯示了圖2a所示的co單獨或者與微量營養物組合與水相比較處理棉花植物的效果，其以平均植物乾重表示。

具體實施方式

殼寡糖

本領域已知co是β-1-4連接的n-乙醯基葡糖胺結構，其識別為幾丁質寡聚體，也識別為n-乙醯基殼寡糖。co具有獨特且不同的側鏈修飾，這使得它們與幾丁質分子[(c8h13no5)n，casno.1398-61-4]和殼聚糖分子[(c5h11no4)n，casno.9012-76-4]不同。參見，例如，hamel等人,planta232:787-806(2010)(例如，圖1顯示了幾丁質、殼聚糖、nod因子(lco)和相應的co(其缺少18c、16c或20c醯基)的結構)。本發明的co與幾丁質和殼聚糖相比較也是相對溶於水的，且在一些實施方式中，如下文所述，是五聚的。描述可適用於本發明的co的結構和製造的代表性文獻如下：muller等人,plantphysiol.124:733-9(2000)(例如，本文圖1)；vanderholst等人,currentopinioninstructuralbiology,11:608-616(2001)(例如，本文圖1)；robina等人,tetrahedron58:521-530(2002)；d'haeze等人,glycobiol.12(6):79r-105r(2002)；rouge等人,chapter27,"themolecularimmunologyofcomplexcarbohydrates"inadvancesinexperimentalmedicineandbiology,springerscience；wan等人,plantcell21:1053-69(2009)；pct/f100/00803(9/21/2000)；和demont-caulet等人,plantphysiol.120(1):83-92(1999)。

就結構而言co與lco的不同之處主要在於其缺少脂肪酸側鏈。源自根瘤菌的co及其非天然出現的合成衍生物可以用於實施本發明，其可以由下式表示：

其中r1和r2各自獨立地表示氫或甲基；r3表示氫、乙醯基或氨甲醯基；r4表示氫、乙醯基或氨甲醯基；r5表示氫、乙醯基或氨甲醯基；r6表示氫、阿糖基、巖藻糖基、乙醯基、硫酸酯、3-0-s-2-0-mefuc、2-0-mefuc和4-0-acfuc；r7表示氫、甘露糖基或甘油；r8表示氫、甲基或-ch2oh；r9表示氫、阿糖基或巖藻糖基；r10表示氫、乙醯基或巖藻糖基；並且n表示0、1、2或3。相應的根瘤菌lco的結構描述於以下文件中：d'haeze等人,見上。

圖1a和2a中顯示了兩種適用於本發明的co。它們分別相應於慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)和豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型(rhizobiumleguminosarumbiovarviciae)產生的與大豆和豌豆共生相互作用的lco，但缺少脂肪酸鏈。圖1b和2b中顯示了這些根瘤菌產生的相應lco(其也可用於實施本發明)。

可適用於實施本發明的再其他的co的結構很容易由獲得(即分離和/或純化)自菌根真菌，例如glomerocycota種群的真菌如根內球囊菌(glomusintraradices)的lco得到。參見，例如wo2010/049751和maillet等人,nature469:58-63(2011)(本文所述的lco也稱作「myc因子」)。代表性的源自菌根真菌的co由以下結構表示：

其中n＝1或2；r1表示氫或甲基；並且r2表示氫或so3h。圖3a和4a分別顯示了兩種適用於本發明的其他co，一種是硫酸化的，另一種是非硫酸化的。它們相應於由菌根真菌glomasintraradices產生的兩種不同lco，其顯示於圖3b和4b中(並且也可用於實施本發明)。

co可以是合成的或重組的。合成co的製備方法描述於，例如以下文獻中：robina,見上。例如使用大腸桿菌(e.coli)作為宿主製造重組co的方法是本領域已知的。參見，例如，dumon等人,chembiochem7:359-65(2006)；samain等人,carbohydrateres.302:35-42(1997)；cottaz等人,meth.eng.7(4):311-7(2005)；和samain等人,j.biotechnol.72:33-47(1999)(例如，本文圖1中顯示了可以在帶有基因nodbchl的不同組合的大腸桿菌中重組製備的co的結構)。出於本發明的目的，至少一種co與幾丁質、殼聚糖和其它使用幾丁質作為起始原料酶促製備的殼寡糖在結構上是不同的。

出於本發明的目的，至少一種重組co為至少60％純，例如，至少60％純，至少65％純，至少70％純，至少75％純，至少80％純，至少85％純，至少90％純，至少91％純，至少92％純，至少93％純，至少94％純，至少95％純，至少96％純，至少97％純，至少98％純，至少99％純，直至100％純。

可以將種子用至少一種co以若干種方式例如噴射或滴液處理。噴射和滴液處理可以通過以下方法進行：在通常性質為水性的農業可接受的載體中配製有效量的至少一種co，並經由連續處理系統(其校正為以與種子的連續流成比例的預定速率施用處理)例如鼓式(drum-type)處理機將組合物噴射或滴在種子上。這些方法有利地採用相對少量的載體，以使得處理過的種子相對快速地乾燥。以該方式，可以有效地處理大量的種子。也可以採用批次系統，其中將預定批量大小的種子和信號分子組合物輸送至混合器中。進行這些方法的系統和裝置可購於許多供應商，例如，bayercropscience(gustafson)。

在另一實施方式中，處理需要將種子用至少一種co塗覆。一種這樣的方法涉及以下步驟：將圓形容器的內壁用組合物塗覆，加入種子，然後轉動容器，以使種子與壁和組合物接觸，該方法在本領域中稱作「容器塗覆」。可以通過塗覆方法的組合對種子進行塗覆。浸泡通常需要使用含有植物生長增強劑的水溶液。例如，可以將種子浸泡大約1分鐘至大約24小時(例如，至少1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘、80分鐘、3小時、6小時、12小時、24小時)。一些類型的種子(例如，大豆種子)傾向於對溼氣敏感。因此，將這些種子長時間浸泡可能是不合意的，在該情況下浸泡通常進行大約1分鐘至大約20分鐘。

在施用至少一種co之後需要將種子儲存的實施方式中，在儲存期間的任意部分時間內，co對種子的附著並不是關鍵性的。無意拘泥於任何具體的操作理論，申請人認為，即使是處理不會導致在處理之後以及在任意部分的儲存期間植物信號分子與種子表面保持接觸的程度，co也可以通過稱作種子記憶或種子感知的現象實現其預期的效果。參見，macchiavelli等人,j.exp.bot.55(408):1635-40(2004)。申請人還認為，處理之後co朝著發育中的幼根擴散，並使共生和發育基因活化，這導致植物根結構的變化。儘管至合意的程度，含有co的組合物還可以含有粘著劑或塗覆劑。出於美學目的，組合物還可以含有塗覆聚合物和/或著色劑。

至少一種co的量對於增強生長是有效的，使得與未經處理的植物或者從未經處理的種子收穫的植物(任一是活性的)相比較，在收穫時植物表現出按蒲式耳/英畝測得的植物產量的增加、根數目增加、根長度增加、根質量增加、根體積增加和葉面積增加中的至少一種。用於處理種子的至少一種co的有效量以濃度單位表示，其範圍通常為大約10-5至大約10-14m(摩爾濃度)，且在一些實施方式中，為大約10-5至大約10-11m，且在一些其他的實施方式中，為大約10-7至大約10-8m。以重量單位表示時，有效量的範圍通常為大約1至大約400μg/英擔(cwt)種子，且在一些實施方式中，為大約2至大約70μg/cwt，且在一些其他的實施方式中，為大約2.5至大約3.0μg/cwt種子。

出於直接處理種子即犁溝內處理的目的，至少一種co的有效量範圍通常為大約1μg/英畝至大約70μg/英畝，且在一些實施方式中，為大約50μg/英畝至大約60μg/英畝。出於施用於植物的目的，co的有效量範圍通常為大約1μg/英畝至大約30μg/英畝，且在一些實施方式中，為大約11μg/英畝至大約20μg/英畝。

種子可以在臨種植之前或者在種植時用至少一種co加以處理。種植時的處理可以包括如上所述直接施用於種子，或者在一些其他的實施方式中，通過將活性物質引入到土壤中進行，其在本領域中稱作犁溝內處理。在需要在處理種子之後儲存的實施方式中，然後可以根據標準技術將種子包裝在，例如，50-lb或100-lb的袋子或散裝袋或容器中。在本領域已知的適當儲存條件下，種子可以儲存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月，甚至更久，例如，13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36個月，或者更久。儘管大豆種子可能必須在下一季種植，玉米種子可以儲存長得多的時間，包括3年以上。

其他農藝學有益的試劑

本發明還可以包括將種子或由種子萌發的植物用至少一種農業/農藝學有益的試劑處理。如本文所用，在本領域中，術語「農業或農業學有益的」是指當試劑施用於種子或植物時，導致與未經處理的種子或植物相比較，例如植物挺立、生長(例如，如關於co所定義)或活力的植物特性的增強(其在統計學上可以是顯著的)。可以將這些試劑與至少一種co配置在一起，或者經由單獨的製劑施用於種子或植物。可用於實施本發明的這類試劑的代表性例子包括微量營養物(例如，維生素和痕量礦物質)、脂肪酸及其衍生物、(co以外的)植物信號分子、除草劑、殺真菌劑和殺蟲劑、解磷微生物、固氮生物(根瘤菌接種物)和/或菌根真菌。

微量營養物

可用於實施本發明的代表性的維生素包括泛酸鈣、葉酸、生物素和維生素c。可用於實施本發明的痕量礦物質的代表性例子包括硼、氯、錳、鐵、鋅、銅、鉬、鎳、硒和鈉。

用於處理種子的至少一種微量營養物的量以濃度單位表示時，範圍通常為10ppm至100ppm，且在一些實施方式中，為大約2ppm至大約100ppm。以重量單位表示時，有效量範圍通常在一個實施方式中為大約180μg至大約9mg/英擔(cwt)種子，且在一些實施方式中，當施用於葉子時，為大約4μg至大約200μg/植物。換言之，出於處理種子的目的，至少一種微量營養物的有效量範圍通常為30μg/英畝至大約1.5mg/英畝，且在一些實施方式中，當在葉子上施用時，為大約120mg/英畝至大約6g/英畝。

脂肪酸

可用於實施本發明的代表性的脂肪酸包括作為天然出現的lco上的取代基的脂肪酸，例如硬脂酸和棕櫚酸。其他可以使用的脂肪酸包括飽和c12-18脂肪酸，其(除棕櫚酸和硬脂酸以外)包括月桂酸和肉豆蔻酸，以及不飽和c12-18脂肪酸，例如肉豆蔻油酸、棕櫚油酸、sapienicacid、油酸、反油酸、異油酸(vaccenicacid)、亞油酸、亞麻酸和反亞油酸(linoelaidicacid)。亞油酸和亞麻酸在茉莉酸(其如下文中所述，也是出於本發明目的的農藝學有益的試劑)的生物合成過程中產生。亞油酸和亞麻酸(及其衍生物)據報導是nod基因表達或根瘤菌產生lco的誘導物。參見，例如，mabood,fazli,"linoleicandlinolenicacidinducetheexpressionofnodgenesinbradyrhizobiumjaponicum,"usda3,2001年5月17日。

可用於實施本發明的可以使用的脂肪酸衍生物包括酯、醯胺、糖苷和鹽。代表性的酯是其中脂肪酸例如亞油酸和亞麻酸的羧基已被-cor基團取代的化合物，其中r是-or1基團，其中r1為：烷基，例如c1-c8直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如c2-c8直鏈或支鏈烯基；炔基，例如c2-c8直鏈或支鏈炔基；具有例如6-10個碳原子的芳基；或具有例如4-9個碳原子的雜芳基，其中雜芳基中的雜原子可以是，例如，n、o、p或s。代表性的醯胺是其中脂肪酸例如亞油酸和亞麻酸的羧基已被-cor基團取代的化合物，其中r是nr2r3基團，其中r2和r3獨立地為：氫；烷基，例如c1-c8直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如c2-c8直鏈或支鏈烯基；炔基，例如c2-c8直鏈或支鏈炔基；具有例如6-10個碳原子的芳基；或具有例如4-9個碳原子的雜芳基，其中雜芳基中的雜原子可以是，例如，n、o、p或s。酯可以通過已知的方法製備，例如酸催化的親和加成，其中在催化量無機酸的存在下使羧酸與醇反應。醯胺也可以通過已知的方法製備，例如，通過在中性條件下在偶聯劑例如二環己基碳二亞胺(dcc)的存在下使羧酸與適當的胺反應。適當的脂肪酸例如亞油酸和亞麻酸的鹽包括，例如，鹼加成鹽。可以用作製備這些化合物的代謝可接受鹼鹽的鹼包括源自陽離子例如鹼金屬陽離子(例如鉀和鈉)和鹼土金屬陽離子(例如鈣和鎂)的那些鹼。這些鹽可以很容易地通過將脂肪酸溶液與鹼溶液混合在一起製備。鹽可以從溶液中沉澱出來，並通過過濾收集，或者可以通過其他方式例如蒸發溶劑來回收。

脂肪酸或其衍生物的量通常為至少一種co的量的大約10％至大約30％，且在一些實施方式中為大約25％。

植物信號分子

本發明還可以包括將種子或植物用co以外的植物信號分子處理。出於本發明的目的，術語「植物信號分子」可以與「植物生長增強劑」互換地使用，其泛泛地指任何植物或微生物中天然出現的或合成的(其可以是非天然出現的)直接或間接活化植物生化途徑的試劑，與未經處理的植物或從未經處理的種子收穫的植物相比較，其導致植物生長增加，其至少在以下方面中的至少一種是可測量的：按蒲式耳/英畝測得的產量增加、根數目增加、根長度增加、根質量增加、根體積增加和葉面積增加。可用於實施本發明的植物信號分子的代表性例子包括脂殼寡糖、(co以外的)幾丁質化合物、類黃酮、茉莉酸、亞油酸和亞麻酸及其衍生物(同上)、和卡裡金。

脂殼寡糖化合物(lco)在本領域也稱作共生nod信號或nod因子，其由在非還原端處縮合有n-連接的脂肪醯鏈的β-l,4-連接的n-乙醯基-d-葡糖胺(「gicnac」)殘基的寡糖骨架組成。lco的不同在於骨架中gicnac殘基的數目，在於脂肪醯鏈的長度和飽和度，以及在於還原和非還原糖殘基的取代。參見，例如，denarie等人,ann.rev.biochem.65:503-35(1996)；hamel等人,同上；prome等人,pure&appl.chem.70(1):55-60(1998)。lco的例子如以下式i所示：

其中：

g是己糖胺，其可以是取代的，例如，在氮上被乙醯基取代，在氧上被硫酸基、乙醯基和/或醚基取代，

r1、r2、r3、r5、r6和r7可以相同或不同，其表示h、ch3co-、cxhyco-(其中x是0-17的整數且y是1-35的整數)、或者任何其他醯基，例如，如氨甲醯基，

r4表示含有至少12個碳原子的單-、二-或三不飽和脂族鏈，且n是1-4的整數。

lco可以獲得(分離和/或純化)自細菌，例如根瘤菌，如根瘤菌(rhizobiumsp.)、慢生根瘤菌(bradyrhizobiumsp.)、中華根瘤菌(sinorhizobiumsp.)和固氮根瘤菌(azorhizobiumsp.)。lco結構對於每種這樣的細菌物種來說是特徵性的，並且每種菌株均可以產生具有不同結構的多種lco。例如，來自草木樨中華根瘤菌(s.meliloti)的特定lco也已描述於美國專利5,549,718，其具有式ii：

其中r表示h或ch3co-，且n等於2或3。

再更多具體的lco包括nodrm、nodrm-1和nodrm-3。當乙醯化時(r＝ch3co-)，其分別變成acnodrm-1和acnodrm-3(美國專利5,545,718)。

來自慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)的lco描述於美國專利5,175,149和5,321,011中。泛泛地，其為包括甲基巖藻糖的戊糖類植物激素。描述了若干種這類源自慢生型大豆根瘤菌的lco：bjnod-v(c18:1)；bjnod-v(ac，c18:1)；bjnod-v(c16:1)；和bjnod-v(ac，c16:0)，「v」表示存在有5個n-乙醯基葡糖胺；「ac」表示乙醯化；「c」後面的數字表示脂肪酸側鏈中的碳的數目；且「:」後面的數字表示雙鍵的數目。

本發明的實施方式中使用的lco可以獲得(即分離和/或純化)自產生lco的細菌菌株，例如固氮根瘤菌、慢生型根瘤菌(包括慢生型大豆根瘤菌)、中慢生根瘤菌(mesorhizobium)、根瘤菌(包括豌豆根瘤菌(r.leguminosarum))、中華根瘤菌(包括草木樨中華根瘤菌)的菌株，以及基因工程改造成產生lco的菌株。

lco是豆科植物共生中宿主特異性的主要決定因素(diaz等人,mol.plant-microbeinteractions13:268-276(2000))。因此，在豆科家族內，特定屬和物種的根瘤菌與特定的豆科宿主發展出共生的固氮關係。這些植物-宿主/細菌組合描述於hungria等人,soilbiol.biochem.29:819-830(1997)中，這些細菌/豆科植物共生夥伴關係的例子包括草木樨中華根瘤菌/苜蓿和草木樨；豌豆根瘤菌蠶豆生物變異型(r.leguminosarumbiovarviciae)/豌豆和小扁豆；豌豆根瘤菌菜豆生物變異型(r.leguminosarumbiovarphaseoli)/菜豆；大豆慢生根瘤菌/大豆；以及豌豆根瘤菌三葉草生物變異型(r.leguminosarumbiovartrifolii)/紅三葉草。hungria還列出了根瘤菌物種的有效類黃酮nod基因誘導物，以及由不同根瘤菌物種產生的特定的lco結構。然而，lco特異性僅需用來在豆科植物中建立結瘤。在實施本發明時，給定lco的使用不限於對其共生豆科植物夥伴的種子進行處理，以便與從未經處理的種子收穫的植物相比較，或者與從臨種植之前或在種植一周或更短時間內用信號分子處理的種子收穫的植物相比較，實現按蒲式耳/英畝測得的植物產量的增加、根數目增加、根長度增加、根質量增加、根體積增加和葉面積增加。

因此，通過進一步的例子，可用於實施本發明的lco及其非天然出現的衍生物由下式表示：

其中r1表示c14:0、3oh-c14:0、iso-c15:0、c16:0、3-oh-c16:0、iso-c15:0、c16:1、c16:2、c16:3、iso-c17:0、iso-c17:1、c18:0、3oh-c18:0、c18:0/3-oh、c18:1、oh-c18:1、c18:2、c18:3、c18:4、c19:1氨甲醯基、c20:0、c20:1、3-oh-c20:1、c20:1/3-oh、c20:2、c20:3、c22:1和c18-26(ω-1)-oh(根據d'haeze等人，同上，其包括c18、c20、c22、c24和c26羥基化物種以及c16:1δ9、c16:2(δ2,9)和c16:3(δ2,4,9))；r2表示氫或甲基；r3表示氫、乙醯基或氨甲醯基；r4表示氫、乙醯基或氨甲醯基；r5表示氫、乙醯基或氨甲醯基；r6表示氫、阿糖基、巖藻糖基、乙醯基、硫酸酯、3-0-s-2-0-mefuc、2-0-mefuc和4-0-acfuc；r7表示氫、甘露糖基或甘油；r8表示氫、甲基或-ch2oh；r9表示氫、阿糖基或巖藻糖基；r10表示氫、乙醯基或巖藻糖基；並且n表示0、1、2或3。該結構所包括的天然出現的根瘤菌lco的結構描述於以下文獻中：d'haeze等人，同上。

通過再進一步其他的例子，圖1b所示的獲自慢生型大豆根瘤菌的lco可以用於處理大豆以外的豆科種子以及非豆科種子，例如玉米。作為另一個例子，圖2b所示的可獲自豌豆根瘤菌的lco(指定為lco-v(c18:1)，sp104)也可以用於處理豌豆以外的豆科種子和非豆科植物。

本發明還包括獲得(即分離和/或純化)自菌根真菌例如球囊菌(glomerocycota)種群的真菌(例如根內球囊黴(glomusintraradicus))的lco的應用。獲自這些真菌的代表性lco的結構描述於wo2010/049751和wo2010/049751(在此所述的lco也稱作「myc因子」)。代表性的源自菌根真菌的co及其非天然出現的衍生物由以下結構表示：

其中n＝1或2；r1表示c16、c16:0、c16:1、c16:2、c18:0、c18:1δ9z或c18:1δ11z；並且r2表示氫或so3h。在一些實施方式中，lco由菌根真菌產生，示於圖3b和4b中。

本發明還包括合成lco化合物例如wo2005/063784中所述者以及通過基因工程產生的重組lco的應用。基本的天然出現的lco結構可以含有天然出現的lco中發現的修飾或取代，例如以下文獻中所述的那些：spaink,crit.rev.plantsci.54:257-288(2000)；和d'haeze等人,glycobiology12:79r-105r(2002)。用於構建lco的前體寡糖分子(co，如下文所述，在本發明中也可用作植物信號分子)也可以通過基因工程改造的有機體合成，例如，如以下文獻中所述：samain等人,carbohydrateres.302:35-42(1997)；cottaz等人,meth.eng.7(4):311-7(2005)；和samain等人,j.biotechnol.72:33-47(1999)(例如，本文圖1顯示了可以在帶有基因nodbchl的不同組合的大腸桿菌中重組製備的lco的結構)。

lco可以以各種形式的純度使用，並且可以單獨使用或者以產生lco的細菌或真菌的培養物的形式使用。例如，(可購自novozymesbioaglimited)含有產生圖1b所示的lco(lco-v(c18:1，mefuc)，mor116)的慢生型大豆根瘤菌的培養物。提供基本上純的lco的方法包括簡單地從lco和微生物的混合物中除去微生物細胞，或者通過lco溶劑相分離，然後是hplc色譜，繼續分離和純化lco分子，例如，如美國專利5,549,718中所述。純化可以通過重複hplc增強，並且純化的lco分子可以進行冷凍乾燥，用以長期儲存。可以使用如上所述的殼寡糖(co)作為產生合成lco的起始原料。出於本發明的目的，重組lco為至少60％純，例如，至少60％純，至少65％純，至少70％純，至少75％純，至少80％純，至少85％純，至少90％純，至少91％純，至少92％純，至少93％純，至少94％純，至少95％純，至少96％純，至少97％純，至少98％純，至少99％純，直至100％純。

幾丁質和殼聚糖是真菌細胞壁以及昆蟲和甲殼綱動物外骨骼的主要組分，其也是由gicnac殘基組成。幾丁質化合物包括幾丁質，(iupac：n-[5-[[3-乙醯基氨基-4,5-二羥基-6-(羥甲基)環氧乙烷-2-基]甲氧基甲基]-2-[[5-乙醯基氨基-4,6-二羥基-2-(羥甲基)環氧乙烷-3-基]甲氧基甲基]-4-羥基-6-(羥甲基)環氧乙烷-3-基]乙醯胺)，以及殼聚糖，(iupac：5-氨基-6-[5-氨基-6-[5-氨基-4,6-二羥基-2(羥甲基)環氧乙烷-3-基]氧基-4-羥基-2-(羥甲基)環氧乙烷-3-基]氧代-2-(羥甲基)環氧乙烷-3,4-二醇)。這些化合物可以購自，例如，sigma-aldrich，或者由昆蟲、甲殼綱動物的殼或真菌細胞壁製備。幾丁質和殼聚糖的製備方法是本領域已知的，且已經描述於以下文獻中：例如，美國專利4,536,207(由甲殼綱動物的殼製備)；pochanavanich等人,lett.appl.microbiol.35:17-21(2002)(由真菌細胞壁製備)；和美國專利5,965,545(由蟹殼和市售殼聚糖的水解製備)。另外，參見，jung等人,carbohydratepolymers67:256-59(2007)；khan等人,photosynthetica40(4):621-4(2002)。可以得到小於35％至大於90％去乙醯化的去乙醯化幾丁質和殼聚糖，並且其涵蓋很寬的分子量譜，例如，小於15kd的低分子量殼聚糖寡聚體和0.5-2kd的幾丁質寡聚體；分子量為大約15okd的「實用級」殼聚糖；和高達70okd的高分子量殼聚糖。配製用於種子處理的幾丁質和殼聚糖組合物也是市售的。市售產品包括，例如，(plantdefenseboosters,inc.)和beyondtm(agrihouse,inc.)。

類黃酮是具有通過三碳橋連接的兩個芳香環通用結構的酚類化合物。類黃酮由植物產生，且具有許多功能，例如，作為有益的信號傳導分子，以及作為針對昆蟲、動物、真菌和細菌的保護。類黃酮的分類包括查耳酮、花青素、香豆素、黃酮、黃烷醇、黃酮醇、黃烷酮和異黃酮。參見，jain等人,j.plantbiochem.&biotechnol.11:1-10(2002)；shaw等人,environmentalmicrobiol.11:1867-80(2006)。

可用於實施本發明的代表性的類黃酮包括染料木黃酮(genistein)、大豆甙元(daidzein)、芒柄花黃素(formononetin)、柚皮素、橙皮素、木樨草素(luteolin)和芹菜素(apigenin)。類黃酮化合物是市售的，例如，可購自natlandinternationalcorp.,researchtrianglepark,nc；mpbiomedicals,irvine,ca；lclaboratories,woburnma。類黃酮化合物可以分離自植物或種子，例如，如美國專利5,702,752；5,990,291；和6,146,668中所述。類黃酮化合物還可以通過基因工程改造的有機體例如酵母產生，如以下文獻中所述：ralston等人,plantphysiology137:1375-88(2005)。

茉莉酸(ja，[1r-[1α,2β(z)]]-3-氧代-2-(戊烯基)環戊烷乙酸)及其衍生物(其包括亞油酸和亞麻酸(如上關於脂肪酸及其衍生物所述)，可以用於實施本發明。茉莉酸及其甲酯茉莉酸甲酯(meja)統稱為茉莉酸酯，是在植物中天然出現的十八碳酸類(octadecanoid-based)化合物。茉莉酸由小麥幼苗的根部產生，並由真菌微生物例如可可球二孢菌(botryodiplodiatheobromae)和藤倉赤黴(gibbrellafujikuroi)、酵母(釀酒酵母(saccharomycescerevisiae))以及大腸桿菌(escherichiacoli)的致病性菌株和非致病性菌株產生。亞油酸和亞麻酸在茉莉酸的生物合成過程中產生。類似於亞油酸和亞麻酸，茉莉酸酯(及其衍生物)據報導是nod基因表達或根瘤菌產生lco的誘導物。參見，例如，mabood,fazli,jasmonatesinducetheexpressionofnodgenesinbradyrhizobiumjaponicum,2001年5月17日。

可用於實施本發明的可用的茉莉酸衍生物包括酯、醯胺、糖苷和鹽。代表性的酯是其中茉莉酸的羧基已被-cor基團取代的化合物，其中r是-or1基團，其中r1為：烷基，例如c1-c8直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如c2-c8直鏈或支鏈烯基；炔基，例如c2-c8直鏈或支鏈炔基；具有例如6-10個碳原子的芳基；或具有例如4-9個碳原子的雜芳基，其中雜芳基中的雜原子可以是，例如，n、o、p或s。代表性的醯胺是其中茉莉酸的羧基已被-cor基團取代的化合物，其中r是nr2r3基團，其中r2和r3獨立地為：氫；烷基，例如c1-c8直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如c2-c8直鏈或支鏈烯基；炔基，例如c2-c8直鏈或支鏈炔基；具有例如6-10個碳原子的芳基；或具有例如4-9個碳原子的雜芳基，其中雜芳基中的雜原子可以是，例如，n、o、p或s。酯可以通過已知的方法製備，例如酸催化的親和加成，其中在催化量無機酸的存在下使羧酸與醇反應。醯胺也可以通過已知的方法製備，例如，通過在中性條件下在偶聯劑例如二環己基碳二亞胺(dcc)的存在下使羧酸與適當的胺反應。適當的茉莉酸的鹽包括，例如，鹼加成鹽。可以用作製備這些化合物的代謝可接受鹼鹽的試劑的鹼包括源自陽離子例如鹼金屬陽離子(例如鉀和鈉)和鹼土金屬陽離子(例如鈣和鎂)的那些鹼。這些鹽可以很容易地通過將亞油酸、亞麻酸或茉莉酸的溶液與鹼溶液混合在一起製備。鹽可以從溶液中沉澱出來，並通過過濾收集，或者可以通過其他方式例如蒸發溶劑來回收。

卡裡金是插烯4h-吡喃酮，例如2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮，包括其衍生物和類似物。這些化合物的例子由以下結構表示：

其中，z為o、s或nr5；r1、r2、r3和r4各自獨立地為h、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、羥基、羥基烷基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、cn、cor6、coor＝、滷素、nr6r7或no2；且r5、r6和r7各自獨立地為h、烷基或烯基，或者其生物學可接受的鹽。這些化合物的生物學可接受的鹽的例子可以包括與生物學可接受的酸形成的酸加成鹽，其例子包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽或硫酸氫鹽、磷酸鹽或磷酸氫鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽；甲磺酸鹽、苯磺酸鹽和對甲苯磺酸。其它生物學可接受的金屬鹽可以包括與鹼形成的鹼金屬鹽，其例子包括鈉鹽和鉀鹽。該結構所包括的且可以適用於本發明的化合物的例子包括以下：3-甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1＝ch3，r2、r3、r4＝h)、2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1、r2、r3、r4＝h)、7-甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1、r2、r4＝h，r3＝ch3)、5-甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1、r2、r3＝h，r4＝ch3)、3,7-二甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1、r3＝ch3，r2、r4＝h)、3,5-二甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1、r4＝ch3，r2、r3＝h)、3,5,7-三甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1、r3、r4＝ch3，r2＝h)、5-甲氧基甲基-3-甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1＝ch3，r2、r3＝h，r4＝ch2och3)、4-溴-3,7-二甲基-2h-呋喃並[2,3-c]吡喃-2-酮(其中r1、r3＝ch3，r2＝br，r4＝h)、3-甲基呋喃並[2,3-c]吡啶-2(3h)-酮(其中z＝nh，r1＝ch3，r2、r3、r4＝h)、3,6-二甲基呋喃並[2,3-c]吡啶-2(6h)-酮(其中z＝n-ch3，r1＝ch3，r2、r3、r4＝h)。參見，美國專利7,576,213。這些分子也稱為卡裡金。參見，halford，同上。

用於處理種子的至少一種植物信號分子的量以濃度單位表示時，其範圍通常為大約10-5至大約10-14m(摩爾濃度)，且在一些實施方式中，為大約10-5至大約10-11m，且在一些其他的實施方式中，為大約10-7至大約10-8m。以重量單位表示時，有效量的範圍通常為大約1至大約400μg/英擔(cwt)種子，且在一些實施方式中，為大約2至大約70μg/cwt，且在一些其他的實施方式中，為大約2.5至大約3.0μg/cwt種子。

出於直接處理種子即犁溝內處理的目的，至少一種植物信號分子的有效量範圍通常為大約1μg/英畝至大約70μg/英畝，且在一些實施方式中，為大約50μg/英畝至大約60μg/英畝。出於施用於植物的目的，至少一種植物信號分子的有效量範圍通常為1μg/英畝至大約30μg/英畝，且在一些實施方式中，為大約11μg/英畝至大約20μg/英畝。

除草劑、殺真菌劑和殺蟲劑

適當的除草劑包括苯達松(bentazon)、氟鎖草醚(acifluorfen)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、乳氟禾草靈(lactofen)、廣滅靈(clomazone)、吡氟禾草靈(fluazifop)、草銨膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、稀禾定(sethoxydim)、咪唑乙煙酸(imazethapyr)、甲氧咪草煙(imazamox)、氟磺胺草醚(fomesafe)、氟烯草酸(flumiclorac)、滅草喹(imazaquin)和烯草酮(clethodim)。含有各種這些化合物的市售產品是很容易得到的。組合物中除草劑的濃度將通常與所標記的對於特定除草劑的使用比率相對應。

本文和本領域所用的「殺真菌劑」是殺滅或抑制真菌生長的試劑。如果相對於未經處理的群，使用殺真菌劑的處理引起(例如，土壤中的)真菌群的殺滅或真菌群的生長抑制，則本文所用的殺真菌劑針對特定真菌菌種「表現出活性」。根據本發明的有效殺真菌劑將適當地針對較廣範圍的病原體表現出活性，病原體包括但不限於疫黴屬(phytophthora)、絲核菌屬(rhizoctonia)、鐮孢菌屬(fusarium)、腐黴菌屬(pythium)、擬莖點黴屬(phomopsis)或核盤菌屬(selerotinia)和層鏽菌屬(phakopsora)及其組合。

市售殺真菌劑可適用於本發明。適當的市售殺真菌劑包括rival或allegiancefl或ls(gustafson,plano,tx)、wardenrta(agrilance,st.paul,mn)、apronxl、apronmaxxrta或rfc、maxim4fs或xl(syngenta,wilmington,de)、captan(arvesta,guelph,ontario)和protreat(nitraginargentina,buenosares,argentina)。這些和其他市售殺真菌劑中的活性成分包括，但不限於，咯菌腈(fludioxonil)、精甲霜靈(mefenoxam)、嘧菌酯(azoxystrobin)和甲霜靈(metalaxyl)。市售殺真菌劑最適合根據製造商的說明以推薦的濃度進行使用。

如果相對於未經處理的群，使用殺蟲劑的處理引起昆蟲群的殺滅或昆蟲群的抑制，則本文所用的殺蟲劑針對特定昆蟲物種「表現出活性」。根據本發明的有效殺蟲劑將適當地針對較廣範圍的昆蟲表現出活性，昆蟲包括但不限於，線蟲、切根蟲、蠐螬、玉米根蟲、種蠅、跳甲、麥長蝽(chinchbugs)、蚜蟲、葉甲、和椿象。

市售殺蟲劑可適用於本發明。合適的市售殺蟲劑包括cruiser(syngenta,wilmington,de)、gaucho和poncho(gustafson,plano,tx)。這些和其他市售殺蟲劑中的活性成分包括噻蟲嗪(thiamethoxam)、噻蟲胺(clothianidin)和吡蟲啉(imidacloprid)。市售殺蟲劑最適合根據製造商的說明以推薦的濃度進行使用。

解磷微生物、固氮生物(根瘤菌接種物)和/或菌根真菌

本發明還可以包括將種子用解磷微生物處理。本文所使用的「解磷微生物」是能夠增加植物可利用的磷量的微生物。解磷微生物包括真菌菌株和細菌菌株。在實施方式中，解磷微生物是形成孢子的微生物。

解磷微生物的非限制性例子包括選自不動桿菌屬(acinetobacter)、節桿菌屬(arthrobacter)、節叢孢屬(arthrobotrys)、麴黴屬(aspergillus)、固氮螺菌屬(azospirillum)、芽孢桿菌屬(bacillus)、伯克霍爾德氏菌屬(burkholderia)、假絲酵母屬(candida)、金色單胞菌屬(chryseomonas)、腸桿菌屬(enterobacter)、正青黴屬(eupenicillium)、微小桿菌屬(exiguobacterium)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、克呂沃爾菌屬(kluyvera)、微桿菌屬(microbacterium)、毛黴屬(mucor)、擬青黴屬(paecilomyces)、類芽孢桿菌屬(paenibacillus)、青黴屬(penicillium)、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙雷氏菌屬(serratia)、寡養單胞菌屬(stenotrophomonas)、鏈黴菌屬(streptomyces)、鏈孢囊菌屬(streptosporangium)、swaminathania屬、硫桿菌屬(thiobacillus)、孢圓酵母屬(torulospora)、弧菌屬(vibrio)、黃色桿菌屬(xanthobacter)和黃單胞菌屬(xanthomonas)的菌種。

解磷微生物的非限制性實例選自乙酸鈣不動桿菌(acinetobactercalcoaceticus)、不動桿菌(acinetobactersp.)、節桿菌(arthrobactersp.)、少孢節叢孢菌(arthrobotrysoligospora)、黑麴黴(aspergillusniger)、麴黴菌(aspergillussp.)、azospirillumhalopraeferans、解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)、環狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、洋蔥伯克霍爾德菌(burkholderiacepacia)、越南伯克霍爾德菌(burkholderiavietnamiensis)、克瑞斯假絲酵母(candidakrissii)、淺黃金色單胞菌(chryseomonasluteola)、產氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)、阿氏腸桿菌(enterobacterasburiae)、腸桿菌(enterobactersp.)、泰洛腸桿菌(enterobactertaylorae)、微細正青黴(eupenicilliumparvum)、微小桿菌(exiguobacteriumsp.)、克雷伯氏菌(klebsiellasp.)、棲冷克呂沃爾菌(kluyveracryocrescens)、微桿菌(microbacteriumsp.)、多枝毛黴(mucorramosissimus)、蝙蝠蛾擬青黴(paecilomyceshepialid)、馬昆德擬青黴(paecilomycesmarquandii)、浸麻類芽孢桿菌(paenibacillusmacerans)、膠質類芽孢桿菌(paenibacillusmucilaginosus)、成團泛菌(pantoeaaglomerans)、擴展青黴(penicilliumexpansum)、pseudomonascorrugate、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、pseudomonaslutea、草假單胞菌(pseudomonaspoae)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、斯氏假單胞菌(pseudomonasstutzeri)、平凡假單胞菌(pseudomonastrivialis)、粘質沙雷氏菌(serratiamarcescens)、嗜麥芽寡養單胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、鏈黴菌(streptomycessp.)、鏈孢囊菌(streptosporangiumsp.)、swaminathaniasalitolerans、氧化亞鐵硫桿菌(thiobacillusferrooxidans)、球有孢圓酵母(torulosporaglobosa)、解蛋白弧菌(vibrioproteolyticus)、敏捷黃色桿菌(xanthobacteragilis)和野油菜黃單胞菌(xanthomonascampestris)。

在具體實施方式中，解磷微生物是青黴屬真菌的菌株。可用於實施本發明的青黴屬真菌的菌株包括拜賴青黴(p.bilaiae，早先稱為p.bilaii)、微白青黴(p.albidum)、桔灰青黴(p.aurantiogriseum)、產黃青黴(p.chrysogenum)、黃暗青黴(p.citreonigrum)、桔青黴(p.citrinum)、指狀青黴(p.digitatum)、常現青黴(p.frequentas)、褐青黴(p.fuscum)、p.gaestrivorus、光孢青黴(p.glabrum)、灰黃青黴(p.griseofulvum)、糾纏青黴(p.implicatum)、微紫青黴(p.janthinellum)、淡紫青黴(p.lilacinum)、微黃青黴(p.minioluteum)、蒙大拿青黴(p.montanense)、黑青黴(p.nigricans)、草酸青黴(p.oxalicum)、p.pinetorum、嗜松青黴(p.pinophilum)、產紫青黴(p.purpurogenum)、p.radicans、放射青黴(p.radicum)、雷斯青黴(p.raistrickii)、皺褶青黴(p.rugulosum)、簡青黴(p.simplicissimum)、離生青黴(p.solitum)、變幻青黴(p.variabile)、氈毛青黴(p.velutinum)、鮮綠青黴(p.viridicatum)、灰綠青黴(p.glaucum)、p.fussiporus和擴展青黴(p.expansum)。

在一個具體的實施方式中，青黴屬菌種為拜賴青黴。在另一具體的實施方式中，拜賴青黴菌株選自atcc20851、nrrl50169、atcc22348、atcc18309、nrrl50162(wakelin等人,2004.biolfertilsoils40:36-43)。在另一具體的實施方式中，青黴菌種為p.gaestrivorus，例如，nrrl50170(參見，wakelin，同上)。

在一些實施方式中，使用多於一種的解磷微生物，例如，至少兩種，至少三種，至少四種，至少五種，至少六種，其包括包括不動桿菌屬、節桿菌屬、節叢孢屬、麴黴屬、固氮螺菌屬、芽孢桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、假絲酵母屬、金色單胞菌屬、腸桿菌屬、正青黴屬、微小桿菌屬、克雷伯氏菌屬、克呂沃爾菌屬、微桿菌屬、毛黴屬、擬青黴屬、類芽孢桿菌屬、青黴屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、寡養單胞菌屬、鏈黴菌屬、鏈孢囊菌屬、swaminathania屬、硫桿菌屬、孢圓酵母屬、弧菌屬、黃色桿菌屬和黃單胞菌屬的任意組合，包括選自乙酸鈣不動桿菌、不動桿菌、節桿菌、少孢節叢孢菌、黑麴黴、麴黴菌、azospirillumhalopraeferans、解澱粉芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、越南伯克霍爾德菌、克瑞斯假絲酵母、淺黃金色單胞菌、產氣腸桿菌、阿氏腸桿菌、腸桿菌、泰洛腸桿菌、微細正青黴、微小桿菌、克雷伯氏菌、棲冷克呂沃爾菌、微桿菌、多枝毛黴、蝙蝠蛾擬青黴、馬昆德擬青黴、浸麻類芽孢桿菌、膠質類芽孢桿菌、成團泛菌、擴展青黴、pseudomonascorrugate、螢光假單胞菌、pseudomonaslutea、草假單胞菌、惡臭假單胞菌、斯氏假單胞菌、平凡假單胞菌、粘質沙雷氏菌、嗜麥芽寡養單胞菌、鏈黴菌、鏈孢囊菌、swaminathaniasalitolerans、氧化亞鐵硫桿菌、球有孢圓酵母、解蛋白弧菌、敏捷黃色桿菌和野油菜黃單胞菌的一種菌種。

在一些實施方式中，相同菌種的兩個不同菌株也可以組合，例如，使用青黴屬的至少兩個不同菌株。至少兩個不同的青黴屬菌株的組合使用具有以下優點。當施用於已經含有不溶性(或難溶性)磷酸鹽的土壤時，與僅使用一個青黴屬菌株相比，組合真菌菌株的使用將引起植物可攝取的磷的量的增加。與單獨使用單個菌株相比，這進而可以引起磷酸鹽攝取的增加和/或土壤中生長的植物的產量的增加。菌株的組合還使不溶性磷酸巖能夠用作可利用磷量不足的土壤中的有效肥料。因此，在一些實施方式中，使用拜賴青黴的一個株菌和p.gaestrivorus的一個菌株。在其他實施方式中，兩個菌株為nrrl50169和nrrl50162。在另外的實施方式中，至少兩個菌株為nrrl50169和nrrl50170。在另外的實施方式中，至少兩個菌株為nrrl50162和nrrl50170

解磷微生物可以使用本領域技術人員已知的任何適當的方法製備，例如，使用合適的碳源進行固態或液體發酵。解磷微生物優選地以穩定孢子的形式製備。

在實施方式中，解磷微生物是青黴屬真菌。根據本發明的青黴屬真菌可以使用固態或液體發酵和合適的碳源而生長。青黴屬分離物可以使用本領域技術人員已知的任何合適方法而生長。例如，真菌可以在例如馬鈴薯右旋糖瓊脂或麥芽汁瓊脂的固體生長介質上、或在含有合適的液體介質例如czapek-dox培養基或馬鈴薯右旋糖肉湯的燒瓶中進行培養。這些培養方法可以用於製備青黴菌接種物，該接種物用於處理(例如，塗覆)種子和/或施用於將要施用至土壤的農藝學可接受的載體。本說明書中使用的術語「接種物」意在指代任意形式的解磷微生物(真菌細胞、菌絲體或孢子，細菌細胞或細菌孢子)，其能夠在溫度、溼度等條件有利於真菌生長時在土壤上或土壤中增殖。

青黴屬孢子的固態產生可以通過接種固體介質例如泥炭或蛭石類基質或穀物而實現，穀物包括但不限於燕麥、小麥、大麥或稻。對滅菌的介質(通過高壓滅菌或輻照而實現)接種適當青黴菌的孢子混懸液(1x102～1x107cfu/ml)，並根據基質將溼度調節至20～50％。將材料在室溫下孵育2～8周。孢子也可以通過液體發酵而產生(cunningham等人,1990.canjbot.68:2270-2274)。液體產生可以通過在可以根據本領域標準步驟而確定的適當ph和溫度條件下在任何合適的介質例如馬鈴薯右旋糖肉湯或蔗糖酵母提取物介質中培養真菌而實現。

可以直接使用所得材料，或者可以收穫孢子，經離心濃縮，配製然後使用空氣乾燥、冷凍乾燥、或流化床乾燥技術進行乾燥(friesen等人,2005,appl.microbiol.biotechnol.68:397-404)，以產生可潤溼的粉末。然後將可潤溼的粉末混懸於水中，施用於種子的表面，並使其在臨種植前乾燥。可潤溼的粉末可以與其他種子處理(例如但不限於，化學種子處理)、載體(例如，滑石、粘土、高嶺土、矽膠、高嶺石)或聚合物(例如，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮)結合使用。或者，合適的青黴菌的孢子混懸液可以施用於合適的與土壤相容的載體(例如，泥炭類粉末或顆粒)，達到適當的最終含水量。材料可以在使用前在室溫下孵育，通常為大約1天至大約8周。

除用於培養解磷微生物的成分(包括例如以上在青黴屬培養中提及的成分)外，解磷微生物可以使用其他農藝學可接受的載體進行配製。在本文中與「載體」關聯使用的術語「農藝學可接受的」是指，任何可以用於將活性物輸送至種子、土壤或植物的材料，並且優選載體能夠添加(至種子、土壤或植物)而對植物生長、土壤結構、土壤排水等沒有不利影響。合適的載體包括但不限於，小麥殼、糠、研磨的麥秸、泥炭類粉末或顆粒、石膏類顆粒和粘土(例如，高嶺土、膨潤土、蒙脫石)。當將孢子加至土壤時，顆粒製劑將是優選的。作為液體、泥炭或可潤溼粉末的製劑將適用於塗覆種子。當用於塗覆種子時，材料可以與水混合，施用於種子並使其乾燥。其他載體的例子包括溼化糠，將其乾燥、過篩並施用至事先塗覆有粘合劑如阿拉伯樹膠的種子。在需要單一組合物形式的活性物質製劑的實施方式中，農藝學可接受的載體可以是水性的。

至少一種解磷微生物的量取決於種子或土壤的類型、作物植物的類型、磷源的量和/或土壤中存在的或向其添加的微量營養物的量等而變化。對於每個具體的情形，合適的量可以通過簡單的試錯法實驗發現。通常，對於青黴屬，例如，施用的量落入以下範圍內：0.001-1.0kg真菌孢子和菌絲體(鮮重)/公頃，或102-106集落形成單位(cfu)/種子(當使用塗覆的種子時)，或者在顆粒載體上施用1x106至1x1011集落形成單位/公頃。例如孢子形式的真菌細胞和載體可以添加到根水平處土壤的種子列中，或者可以在種植之前用於塗覆種子。

在例如需要使用解磷微生物的至少兩個菌株，例如，兩個青黴屬菌株的實施方式中，可以將市售的肥料代替天然的磷酸巖(或者甚至與其一起)添加至土壤。磷源可以含有原產自土壤的磷源。在其他實施方式中，可以將磷源添加至土壤。在一個實施方式中，磷源是磷酸巖。在另一實施方式中，磷源是製成的肥料。市售的製成的磷酸鹽肥料有許多種類型。一些常見的類型含有磷酸一銨(map)、三過磷酸鈣(triplesuperphosphate，tsp)、磷酸氫二銨、普通過磷酸鈣和多磷酸銨。所有這些肥料均通過在大規模肥料製造設施中對不溶性天然磷酸巖進行化學處理而製造，且產品昂貴。通過本發明，可以在仍保持自土壤攝取相同量磷的同時降低施用於土壤的這些肥料的量。

在進一步的實施方式中，磷源是有機的。有機肥料是指至少保證最小百分比的氮、磷酸鹽和鉀鹼的源自天然來源的土壤改良劑。例子包括植物和動物副產品、巖石粉末、海草、接種物和調節劑。代表性的具體例子包括骨粉、肉粉、畜肥、堆肥、汙泥或鳥糞。

當然也可以將其他肥料，例如氮源或其他的土壤改良劑與解磷微生物大約同時或者在其他時間添加至土壤，只要這些其他材料對真菌沒有毒性即可。

固氮生物是將大氣氮氣固定成更可用的形式例如氨的細菌和古生菌。固氮生物的實例包括來自根瘤菌屬(例如解纖維素根瘤菌(r.cellulosilyticum)、大田市根瘤菌(r.daejeonense)、菜豆根瘤菌(r.etli)、山羊豆根瘤菌(r.galegae)、高盧根瘤菌(r.gallicum)、賈氏根瘤菌(r.giardinii)、海南根瘤菌(r.hainanense)、洪特拉根瘤菌(r.huautlense)、木蘭根瘤菌(r.indigoferae)、豌豆根瘤菌(r.leguminosarum)、黃土根瘤菌(r.loessense)、羽扇豆根瘤菌(r.lupini)、r.lusitanum、草木樨根瘤菌(r.meliloti)、蒙古根瘤菌(r.mongolense)、r.miluonense、巖黃芪根瘤菌(r.sullae)、熱帶根瘤菌(r.tropici)、居水根瘤菌(r.undicola)和/或楊凌根瘤菌(r.yanglingense))、慢生根瘤菌屬(例如b.bete、b.canariense、埃氏慢生根瘤菌(b.elkanii)、b.iriomotense、大豆慢生根瘤菌(b.japonicum)、b.jicamae、遼寧慢生根瘤菌(b.liaoningense)、b.pachyrhizi和/或圓明慢生根瘤菌(b.yuanmingense))、固氮根瘤菌屬(例如莖瘤固氮根瘤菌(a.caulinodans)和/或德貝萊納固氮根瘤菌(a.doebereinerae))、中華根瘤菌屬(例如s.abri、粘著中華根瘤菌(s.adhaerens)、美洲中華根瘤菌(s.americanum)、木本樹中華根瘤菌(s.aboris)、費氏中華根瘤菌(s.fredii)、s.indiaense、柯斯帝中華根瘤菌(s.kostiense)、雞眼草中華根瘤菌(s.kummerowiae)、苜蓿中華根瘤菌(s.medicae)、草木樨中華根瘤菌(s.meliloti)、墨西哥中華根瘤菌(s.mexicanus)、莫雷蘭中華根瘤菌(s.morelense)、薩赫勒中華根瘤菌(s.saheli)、多宿主中華根瘤菌(s.terangae)和/或新疆中華根瘤菌(s.xinjiangense))、中慢生根瘤菌屬(合歡中慢生根瘤菌(m.albiziae)、紫穗槐中慢生根瘤菌(m.amorphae)、查克中慢生根瘤菌(m.chacoense)、鷹嘴豆中慢生根瘤菌(m.ciceri)、華癸中慢生根瘤菌(m.huakuii)、百脈根中慢生根瘤菌(m.loti)、地中海中慢生根瘤菌(m.mediterraneum)、m.pluifarium、北方中慢生根瘤菌(m.septentrionale)、溫帶中慢生根瘤菌(m.temperatum)和/或天山中慢生根瘤菌(m.tianshanense))的細菌及其組合。在具體實施方式中，固氮生物選自大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、草木樨根瘤菌、草木樨中華根瘤菌及其組合。在另一實施方式中，固氮生物是大豆慢生根瘤菌。在另一實施方式中，固氮生物是豌豆根瘤菌。在另一實施方式中，固氮生物是草木樨根瘤菌。在另一實施方式中，固氮生物是草木樨中華根瘤菌。

菌根真菌與維管植物的根形成共生關係，並因菌絲體相對較大的表面積提供例如對水和礦質營養的吸收能力。菌根真菌包括內生菌根真菌(也稱作泡囊叢枝菌根(vesiculararbuscularmycorrhizae)、vam、叢枝菌根(arbuscularmycorrhizae)、或am)、外生菌根真菌或其組合。在一個實施方式中，菌根真菌是球囊菌門以及球囊黴(glomus)屬和巨孢囊黴(gigaspora)屬的內生菌根。在又一實施方式中，內生菌根是聚叢球囊黴(glomusaggregatum)、glomusbrasilianum、明球囊黴(glomusclarum)、沙漠球囊黴(glomusdeserticola)、幼套球囊黴(glomusetunicatum)、集球囊黴(glomusfasciculatum)、根內球囊黴(glomusintraradices)、單孢球囊黴(glomusmonosporum)、或摩西球囊黴(glomusmosseae)、珠狀巨孢囊黴(gigasporamargarita)的菌株或其組合。

菌根真菌的例子包括包括擔子菌門(basidiomycota)、子囊菌門(ascomycota)和接合菌門(zygomycota)的外生菌根。其它例子包括雙色蠟蘑(laccariabicolor)、紅蠟蘑(laccarialaccata)、彩色豆馬勃(pisolithustinctorius)、rhizopogonamylopogon、rhizopogonfulvigleba、淺黃根須腹菌(rhizopogonluteolus)、rhizopogonvillosuli、光硬皮馬勃(sclerodermacepa)、黃硬皮馬勃(sclerodermacitrinum)的菌株或其組合。

菌根真菌包括杜鵑花類菌根(ecroidmycorrhizae)、漿果莓類菌根(arbutoidmycorrhizae)、或水晶蘭類菌根(monotropoidmycorrhizae)。叢枝和外生菌根與許多屬於杜鵑花目的植物形成杜鵑花類菌根，而與一些杜鵑花目形成漿果莓類菌根和水晶蘭類菌根。在一個實施方式中，菌根可以是優選子囊菌門的杜鵑花類菌根，例如石楠柔膜菌(hymenoscyphousericae)或樹粉孢屬真菌(oidiodendronsp.)。在另一實施方式中，菌根還可以是優選擔子菌門的漿果莓類菌根。在又一實施方式中，菌根可以是優選擔子菌門的水晶蘭類菌根。在又一實施方式中，菌根可以是優選絲核菌屬的蘭科菌根(orchidmycorrhiza)。

本發明的方法適用於豆科種子，其代表性例子包括大豆、苜蓿、花生、豌豆、小扁豆、菜豆和三葉草。本發明的方法也適用於非豆科種子，例如禾本科(poaceae)、葫蘆科(cucurbitaceae)、錦葵科(malvaceae)、菊科(asteraceae)、藜科(chenopodiaceae)和茄科(solonaceae)。非豆科種子的代表性例子包括大田作物例如玉米、稻、燕麥、黑麥、大麥和小麥、棉花和油菜，以及蔬菜作物例如馬鈴薯、蕃茄、黃瓜、甜菜、萵苣和甜瓜。

現將在以下非限定性實施例方面對本發明進行說明。除非另外指明，使用水作為對照(表示成「對照」或「chk」)。

實施例

1-17：溫室實驗

實施例1：體外蕃茄幼苗根生長生物檢定

將雜交蕃茄var.royalmounty的蕃茄種子用10％漂白劑溶液表面滅菌10分鐘，然後用滅菌的蒸餾水漂洗3次。然後將種子在層式氣流罩中乾燥3小時。然後將種子置於固化的瓊脂培養基上的陪替氏培養皿中，上述培養基含有各種濃度的不同來源的圖1b所示的lco(darmstadt,germany和grenoble,france製造)(在實施例中也稱作「大豆lco」)和圖2a所示的本發明的co(在實施例中也稱作「豌豆co」或「co-v」)。通過手持尺測量幼苗根部，且根部鮮重在第7天在微量天平上讀取。生長研究在生長室中在22℃下進行。

如豌豆co(本發明實施方式)和lco(非本發明的、比較的)之間的比較所反映，當測量蕃茄幼苗根長度時豌豆co比lco表現得更好(在10-7m和10-9m下)或相等(在10-8m下)(圖5)。在幼苗根部鮮重方面，豌豆co在所有三個濃度水平下均勝過lco(圖6)。在增加根長度和鮮重方面，lco和co均顯著優於對照幼苗。當對所有3種濃度下的平均根部生長進行作圖時，似乎co在增加蕃茄根部生長方面要顯著優於lco(圖7和8)。

實施例2：棉花葉實驗

種植棉花種子，且使其生長至v4階段(4葉階段)，然後噴以10-8圖2b所示的lco(在實施例中也稱作「豌豆lco」)和豌豆co，然後使其生長至多4周，不時以hoagland溶液澆灌。對照植物噴以水。

本發明實施方式(co)取得的結果表明，co和lco(非本發明的、比較的)比起對照均顯著增加了植物鮮重，但co顯示出的植物鮮重增加比起lco更多1.14％。

實施例3：玉米種子處理

在溫室中僅使用豌豆lco、豌豆co和通過酶促方法由殼聚糖得到的co混合物(在結構上與豌豆co不同，在實施例中也稱作「chinaco」)進行兩組種子處理實驗。將雜交玉米種子(92l90,petersonfarm,usa)用處理溶液(10-8m)以3floz/100lbs種子的比率處理。將種子種植在含有1:1沙子:珍珠巖混合物的塑料盆中。使種子生長大約3-4周，然後將其收穫，並測量其乾重。

獲自兩組實驗的結果表明，本發明(豌豆co)比非本發明的比較的lco表現出更大的地上部、根部和總生物質的增加。對於第一組試驗，co比lco的乾重增加為11.84％(圖10)。在第二組試驗中，co比lco的乾重增加為12.63％(圖11)。chinaco也可以視作是豌豆co的替代來源，其與非本發明的lco相比較也表現出植物乾重增加的增加。

實施例4：：用不同活性物質處理大豆

將大豆種子(jungseed,var.8168nrr)用不同的活性分子處理。將種子以3floz/100lbs種子的液體劑量率處理。使種子乾燥2小時，並將其在溫室中種植在含有1:1沙子:珍珠巖混合物的塑料盆中。使幼苗生長4周，不時地施以液肥，然後收穫植物。分離來自第二個三葉(從下往上)的中心小葉，並在winrhizo掃描儀上測量表面積。植物的剩餘部分用於植物乾重(dw)。

獲自實驗的結果說明，非本發明的豌豆lco、本發明的豌豆co和chinaco表現出顯著的葉表面積增加。但在這三種活性物質中，豌豆co產生的葉表面積最高(顯著高於對照(水))，且相對高於chineseco(圖12)。在另一組實驗中，就地上部或根部或植物總生物質而言，co產生的植物乾重最高。因此，很明顯，通過co增加生物質要優於大豆lco或任何其他處理(包括作為對照的水和作為單獨的植物信號分子的異黃酮(圖13))。

實施例5：根毛變形生物檢定

色拉豆(macropteliumatropurpureum)種子在陪替氏平皿中在溼濾紙上萌發。當幼苗根部為大約1英寸長時，將其從幼苗割斷，並在試管中在暗處用2ml10-8m處理溶液處理4小時。處理時間結束後，將溶液用剛果紅染色10分鐘。之後在化合物顯微鏡下觀察根片段，以對在根片段的最敏感的區域中變形的根毛數目進行計數。另外，使用紅三葉草以與以上色拉豆類似的方式進行根毛變形生物檢定，且僅進行視覺觀察，並以文本形式記錄。

lco和co溶液二者均在根片段中誘導根毛變形(圖14)。co和脂肪酸(硬脂酸或棕櫚酸)組合也表現出根毛變形，co加棕櫚酸以及co加棕櫚酸和硬脂酸二者在數字上比lco或co提供更好的根毛變形。總體上，在根毛變形反應方面co等於lco。加入棕櫚酸提高了變形反應。對照或chk用蒸餾水處理。

紅三葉草中的根毛變形模式對於co來說比起lco要好得多且突出。co組合棕櫚酸或硬脂酸具有與lco類似的變形模式。總體上，在紅三葉草中co是最好的根毛變形劑。

實施例6：油菜和小麥種子萌發

在陪替氏平皿中在以10-9m處理溶液潤溼的溼濾紙上，鋪上油菜和小麥種子以進行萌發。鋪好18小時後，與豌豆lco相比較，豌豆co誘導更多的油菜和小麥種子萌發。在21-24小時的時間內，lco和co的種子萌發率持平。實驗顯示，co相對於lco誘導早期萌發(圖15和16)。

實施例7：苜蓿種子萌發

在陪替氏平皿中在含有豌豆lco和豌豆co處理溶液(10-8m)的溼濾紙上使苜蓿(medicagosativa)種子萌發，並將陪替氏平皿在室溫(22℃)下在暗處放置。20和27小時之後，觀察種子的萌發。在20小時時，對照、lco和co之間萌發率沒有差異，但在27小時時，co比對照和lco多萌發6％。這表明，豌豆lco可能對苜蓿種子沒有效果，但豌豆co相對於對照和豌豆lco對於種子萌發有正面影響(圖17)。

實施例8：陪替氏平皿中玉米和小麥種子的萌發

將玉米和小麥種子鋪在濾紙上含有5ml處理溶液的陪替氏平皿中。將玉米種子置於溼濾紙上進行萌發。類似地，將小麥種子(春小麥)置於陪替氏平皿中。鋪好5天後，觀察玉米和小麥種子萌發的幼苗。收穫根部，並通過winrhizo系統測量其長度。

在玉米中，豌豆lco、豌豆co和co組合棕櫚酸顯示出萌發增加(圖18)，且相對於對照也顯著增加了幼苗根長度。它們的效果在統計學上沒有差異，co組合棕櫚酸對於萌發和根長度來說最高。棕櫚酸與co的組合添加似乎相對於lco或co略微有益(並非在統計學上)(圖19)。在小麥中，co通過產生更長的根而勝過lco。在小麥中通過lco和co的根長度增加並非在統計學上顯著，但一致地更大(圖20)。

實施例9：箭舌豌豆(viciasativa)種子萌發

將箭舌豌豆種子鋪在濾紙上含有5ml處理溶液的陪替氏平皿中。24小時後對22℃下的種子萌發進行計數，且在第5天時用winrhizo系統測量幼苗的根長度。

在萌發實驗中，使用豌豆lco和豌豆co與4種不同的脂肪酸組合。發現單獨的co或者與棕櫚酸或硬脂酸組合的co誘導早期種子萌發。在陪替氏平皿中鋪好1天後，co比對照和lco多萌發25％(圖21)。當測量根長度時，只有lco和co組合棕櫚酸相對於對照顯著增加了幼苗的根長度(圖22)。

實施例10：多種作物中的種子萌發

與上述的種子萌發實驗類似，將不同作物的種子置於各自含有5ml液體的陪替氏平皿中的溼濾紙上。然後將具有種子的陪替氏平皿在22℃下在暗處放置。24小時之後(除了扁豆(lablab)為30小時以外)，觀察種子的萌發。

豌豆co的總體種子萌發優於豌豆lco。在四種作物中(綠豆、扁豆、紅扁豆和紅三葉草)，co在除紅扁豆以外的三種作物中顯示出更好的萌發(圖23)。co加上棕櫚酸在綠豆和紅三葉草中誘導的萌發最高。lco僅對於紅扁豆來說優於co或co加棕櫚酸。

實施例11：蕃茄幼苗的根部生長

在陪替氏平皿種子萌發法中，將蕃茄var.royalmounty種子置於浸透有5ml處理溶液的溼濾紙上。在22℃下且在暗處5天之後，通過winrhizo系統測量蕃茄的幼苗根部生長。

與水對照相比，豌豆lco、豌豆co和豌豆組合脂肪酸均顯示出根長度的增加。co的平均幼苗根長度優於lco，但是並非顯著性地更好。co組合棕櫚酸或脂肪酸顯著增加了蕃茄幼苗的根長度(圖24)。實施例12：大豆種子處理

將大豆種子(pioneer9om80)鋪在陪替氏平皿中浸透有5ml處理溶液的溼育苗紙上，上述處理溶液含有水或大豆lco、豌豆co和co加上脂肪酸。48小時後分離幼苗根部，並測量其長度。

相對於對照和co，lco顯示出更好的種子根部生長增強，但表現出胚根長度顯著增加的是co加硬脂酸或棕櫚酸。co本身對於大豆比lco更不有效，但脂肪酸棕櫚酸或硬脂酸與co的組合添加可進一步增強幼苗胚根生長(圖25)。

實施例13：棉花種子處理

將棉花種子用lco和co10-8m處理溶液以3floz/100lbs種子的劑量率處理。次日，將種子種植在含有1:1沙子:珍珠巖混合物的塑料盆中。使種子在溫室中生長4周，然後將其收穫。

對照、lco和co在棉花植物乾重方面沒有顯著性差異。但是，co相對於對照和lco產生相對較高的植物乾重。co相對於對照增加的植物總乾重為3.29％(圖26)。

實施例14：用不同活性物質處理大豆葉

將大豆植物(jungseed,var.8168nrr)在v4生長階段用不同的活性分子處理。植物在溫室中在含有1:1沙子:珍珠巖混合物的塑料盆中由種子生長。使幼苗生長4周，不時地施以液肥，然後收穫植物。

大豆lco、豌豆co或china-co的葉施用對植物幹生物質增加沒有顯著影響(圖27)。對於lco、co和china-co中每一種的生物質相對高於對照植物，活性物質等效。

實施例15：玉米種子施用

將玉米種子用豌豆co(10-8m)和豌豆lco(10-8、10-9m)的各種組合處理。將種子種植在溫室中的含有1:1沙子:珍珠巖混合物的塑料盆中。種植後10天收穫幼苗，將其洗滌乾淨，然後在烘箱中在60℃下乾燥48小時。

如圖28所示，單獨的co(10-8m)(指定為co8)和lco(10-8m)(指定為sp8)二者均增加了玉米幼苗乾重。只有10-9lco/10-8co組合相比於豌豆lco(sp)或豌豆co增加了玉米幼苗乾重。

實施例16：陪替氏平皿中的高粱種子萌發

高粱種子在含有液體處理溶液的陪替氏平皿中萌發。5天之後收穫幼苗，並使用winrhizo掃描儀對其根部進行測量。如圖29所示，豌豆co(10-8m)和豌豆lco(10-8m)二者均增加了幼苗根長度，並且相比於單獨的co或lco的增加，10-8co和10-9lco的組合增加幼苗根長度更多。

實施例17：棉花葉施用

棉花植物在溫室中的含有沙子:珍珠巖1:1混合物的塑料盆中由種子生長。當幼苗處於v-階段時，將其用豌豆co(10-8m)和co加上各自為微量的微量營養物(泛酸ca和硼酸)葉噴。

處理之後4周收穫植物。在收穫之前，通過spad葉綠素計對葉子的綠度進行測量。如圖30和31所示，與對照相比，co顯著增加了葉子的綠度，並在平均植物乾重方面產生數字上的增加，並且co和微量營養物的組合處理實現了更高的增加。

18-20：田地試驗

實施例18：大豆

進行19組田地試驗，以在應用於大豆葉子時對本發明的實施方式在穀物產量方面進行評價。田地試驗在具有不同土壤特性和環境條件的8個狀態下進行。

試驗中使用的處理劑為對照(水)、純co(殼寡糖)—co-v(圖2a所示)和純lco(脂殼寡糖)—sp104(圖2b所示)。co和lco處理劑為8x10-8摩爾濃度，導致施用12μg/英畝。採用不同的市售大豆品種。將處理劑加入到草甘膦除草劑中，並在植物營養生長階段v4-v5噴在葉子上。將4盎司/英畝處理劑與除草劑和水合併，並以5-10加侖/英畝的比率施用。大豆生長至成熟，收穫，並測定穀物產量。

結果顯示於表1中。

表1

如對照與co之間的比較所反映，產量通過葉co處理提高了1.7bu/a，導致相比於對照增加3％，且在試驗中出現68.4％的正產量提高。

與葉lco反應相比較，co平均產量低0.1bu/a，但相對於對照百分比產量增加相同，且百分比正產量提高相同。因此，co和lco二者作為葉處理劑提供了基本上相等的產量提高。

實施例19：玉米

進行16組田地試驗，以在應用於玉米葉子時對本發明的實施方式在穀物產量方面進行評價。田地試驗在具有不同土壤特性和環境條件的8個狀態下進行。

試驗中使用的處理劑為對照(水)、純co(殼寡糖)—co-v(圖2a所示)和純lco(脂殼寡糖)—sp104(圖2b所示)。採用不同的市售玉米雜交體。將處理劑加入到草甘膦除草劑中，並在正常施用除草劑時噴在葉子上。將4盎司/英畝處理劑與除草劑加水合併，並以5-10加侖/英畝的比率施用。玉米生長至成熟，收穫，並測定穀物產量。

表2

如對照與co之間的比較所反映，產量通過葉co處理提高了9.2bu/a，導致相比於對照增加4.8％，且在試驗中出現93.8％的正產量提高。

與葉lco反應相比較，co平均產量為5.0bu/a更優，提供了高2.6％的產量增加，且具有正反應的試驗為18.8％更優。

因此，co和lco二者作為葉處理劑均提供了產量提高，但co的表現至少優於lco兩倍。

實施例20：玉米

進行10組田地試驗，以在種植之前應用於玉米種子時對本發明的實施方式在穀物產量方面進行評價。5組田地試驗在5種狀態下進行，且5組試驗在阿根廷進行。

試驗中使用的處理劑為對照(水)、純co(殼寡糖)—co-v(圖2a所示)和純lco(脂殼寡糖)—sp104(圖2b所示)。co和lco處理劑為1x10-8摩爾濃度，導致以1μg/英畝施用。採用不同的市售玉米雜交體。在種植之前將3液盎司的處理劑施用於50磅種子。玉米生長至成熟，收穫，並測定穀物產量。

結果示於表3中。

如對照與co之間的比較所反映，產量通過co處理劑的種子施用提高了6.5bu/a，導致相比於對照增加3.6％，且在試驗中出現80.0％的正產量提高。

在比較co和lco時，co平均產量少4.6bu/a，導致在對照之上少2.5％的產量增加，且在10組試驗中少10.0％正產量反應。

co和lco處理劑二者在施用於玉米種子時均提供了在對照之上的產量提高，且lco提供的反應最高。

該說明書中引用的所有專利和非專利出版物都是本發明所屬領域技術人員技術水平的指示。在此將所有這些出版物併入作為參考，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請均具體、單獨地指明併入作為參考。

儘管已經參考具體實施方式對本發明進行了描述，但應當認識到，這些實施方式僅僅是說明本發明的原理和應用。因此，應當理解到，可以在不偏離所附權利要求限定的本發明主旨和範圍的情況下對說明性的實施方式進行許多種修改，並且可以設計出其他的方式。