一種可長期自顯影的溫敏血管栓塞材料及其製備方法與流程
2023-07-15 13:24:01 5
本發明涉及醫用材料
技術領域：
，特別涉及一種長期自顯影的溫敏血管栓塞材料及其製備方法。
背景技術：
：化學栓塞治療目前是治療腫瘤的一種重要的方式，栓塞材料通過導管選擇性地注入到某一腫瘤的供應血管內，使得相應的血管閉塞、中斷血供達到治療目的。根據巴塞隆納臨床肝癌(BCLC)分類的統計，肝癌腫瘤化學栓塞治療對於50％以上的患者具有良好的治療效果。理想的血管栓塞材料應該具有良好的流動性、高的血管栓塞強度、高清晰度的顯影性以及好的生物安全性。至今已有多種栓塞材料，包括顆粒狀栓塞材料如明膠、白蛋白和聚乙烯醇等；液態栓塞材料如無水乙醇和碘油等；磁性栓塞材料如葡聚糖磁性複合微球和放射性栓塞材料等。但是，目前已經用於臨床的栓塞材料基本採用臨時性外加顯影劑，常用的鉭粉類顯影劑容易存在包埋不完全的問題，會影響顯影效果；而含碘的非離子型顯影劑在栓塞手術後均在短時間內代謝，術後複查需要再次注射顯影劑進行血管造影診斷，增加對病人身體傷害和治療費用。技術實現要素：本發明的目的在於提供可長期自顯影的溫敏血管栓塞材料及其製備方法。本發明提供了一種可長期自顯影的溫敏血管栓塞材料的製備方法，包括以下步驟：(1)將丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑混合後，進行液氮冷凍處理；(2)在保護氣氛下，將所述步驟(1)得到的液氮冷凍物料與雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物、配體和銅系催化劑混合，進行聚合反應；(3)將所述步驟(2)得到的聚合反應產物與三氟乙酸和有機溶劑混合，進行水解反應，得到聚丙烯胺醯胺類聚合物；(4)將所述步驟(3)得到的聚丙烯胺醯胺類聚合物與金納米溶膠混合，攪拌條件下進行反應，得到金納米凝膠；(5)將所述步驟(4)得到的金納米凝膠與分散介質混合，得到長期自顯影的溫敏血管栓塞材料。優選的，所述步驟(1)中丙烯胺醯胺類化合物和丙烯酸叔丁酯或其衍生物的摩爾比為40：(1～4)。優選的，步驟(1)所述丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑混合後得到的混合溶液中，丙烯胺醯胺類化合物的摩爾濃度為0.05～0.1mol/L。優選的，所述步驟(2)中液氮冷凍物料與雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物、配體的摩爾比為400:1:2。優選的，所述步驟(2)中聚合反應的溫度為-5～5℃，聚合反應的時間為24～48h。優選的，步驟(4)所述金納米溶膠中金納米粒子的粒度為13～17nm。優選的，步驟(4)所述金納米溶膠中金納米粒子的摩爾濃度為0.47～0.51mol/L。優選的，步驟(4)所述聚丙烯胺醯胺類聚合物的質量與金納米溶膠的體積比為(90～110)mg：1L。優選的，步驟(5)所述金納米凝膠在栓塞材料中的質量濃度為120～130mg/mL。本發明提供了上述技術方案所述製備方法製備得到的可長期自顯影的溫敏血管栓塞材料，包括金納米凝膠和分散介質，所述金納米凝膠包括金納米粒子核體和包覆在所述金納米粒子核體表面的聚丙烯胺醯胺類化合物類溫敏聚合物殼層。本發明提供了一種長期自顯影的溫敏血管栓塞材料栓塞材料及其製備方法，本發明提供的血管栓塞材料包括金納米凝膠和分散介質，所述金納米凝膠包括金納米粒子核體和包覆在所述金納米粒子核體表面的聚丙烯胺醯胺類化合物類溫敏聚合物殼層。本發明提供的栓塞材料僅以溫度作為相變調控因素，且具有良好的生物相容性，可在血管實現長期栓塞；並且具有長期顯影的能力，能夠用於多種腫瘤部位的血管栓塞，實現主動脈以及末端血管的栓塞，完全阻斷血液，切斷癌細胞血液供應達到抑瘤目的。實驗結果表明，本發明提供的血管栓塞材料具有良好的栓塞性，能夠達到抑瘤效果；GNP@PNA栓塞14天後仍主要蓄積在腫瘤部位，且不會造成其它器官功能的損傷。附圖說明圖1為實施例5～8製備的聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物的變溫紫外吸收曲線；圖2為實施例6製備的聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物在不同pH值下的變溫紫外吸收曲線；圖3為實施例1製備的金納米溶膠中金納米粒子的透射電子顯微鏡圖；圖4為實施例10製備的金納米凝膠的透射電子顯微鏡圖；圖5為實施例10製備的金納米凝膠的粒徑和Zeta電位隨溫度的變化曲線；圖6為實施例10製備的金納米凝膠的熱重曲線；圖7為實施例11製備的金納米凝膠的轉變相圖；圖8為實施例14製備的GNP@PNA分散體與PNA分散體的流變力學曲線；圖9為實施例14製備的GNP@PNA分散體與碘海醇溶液的CT值隨溫度變化曲線；圖10為實施例14製備的GNP@PNA分散體與碘海醇溶液的灰度值隨溫度變化曲線；圖11為實施例16中栓塞實驗前後的實驗兔右腎動脈的數字減影血管造影機圖像；圖12為實施例16中栓塞實驗後的實驗兔的CT掃描圖；圖13為實施例16中栓塞實驗後的實驗兔左腎組織切片；圖14為實施例16中栓塞實驗後的實驗兔左腎的大體照片；圖15為實施例17中栓塞實驗前後的實驗兔肝動脈的數字減影血管造影機圖像和栓塞實驗後的實驗兔肝的大體照片；圖16為實施例17中栓塞實驗後的實驗兔腫瘤部位的CT掃描圖；圖17為實施例17中栓塞實驗後的實驗兔的腫瘤體積增長曲線；圖18為實施例17中栓塞實驗後的實驗兔中的金含量分布圖；圖19為實施例17中栓塞實驗後的實驗兔腫瘤處金分布的透射電子顯微鏡圖；圖20為實施例17中栓塞實驗後的實驗兔的肝功能檢測圖；圖21為實施例17中栓塞實驗後的實驗兔的腎功能檢測圖。具體實施方式本發明提供了一種可長期自顯影的溫敏血管栓塞材料的製備方法，包括以下步驟：(1)將丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑混合後，進行液氮冷凍處理；(2)在保護氣氛下，將所述步驟(1)得到的液氮冷凍物料與雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物、配體和銅系催化劑混合，進行聚合反應；(3)將所述步驟(2)得到的聚合反應產物與三氟乙酸和有機溶劑混合，進行水解反應，得到聚丙烯胺醯胺類聚合物；(4)將所述步驟(3)得到的聚丙烯胺醯胺類聚合物與金納米溶膠混合，攪拌條件下進行反應，得到金納米凝膠；(5)將所述步驟(4)得到的金納米凝膠與分散介質混合，得到長期自顯影的溫敏血管栓塞材料。本發明將丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑混合後，進行液氮冷凍處理。在本發明中，所述丙烯胺醯胺類化合物(NIPAM)和丙烯酸叔丁酯或其衍生物(tBA)的摩爾比優選為40：(1～4)，具體可為40：1、40：2、40：3或40：4。在本發明中，所述丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑混合後得到的混合溶液中，丙烯胺醯胺類化合物的摩爾濃度優選為0.05～0.1mol/L，更優選為0.06～0.09mol/L，最優選為0.07～0.08mol/L。在本發明中，所述丙烯胺醯胺類化合物優選為N-異丙基丙烯醯胺、N-正丙基丙烯醯胺或N,N-二甲基丙烯醯胺；所述丙烯酸叔丁酯衍生物優選為甲基丙烯酸叔丁酯。本發明對於所述有機溶劑的種類沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的能夠溶解丙烯胺醯胺類化合物和丙烯酸叔丁酯或其衍生物的有機溶劑即可，具體如丙酮或四氫呋喃。本發明優選將丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑全部混合後再進行冷凍處理，防止低沸點的溶劑在抽真空時被抽走。本發明優選在攪拌條件下將所述丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑混合。在本發明中，所述攪拌的速率優選為800～1200rpm，更優選為900～1100rpm；所述攪拌的時間優選為3～7min，更優選為4～6min。將所述丙烯胺醯胺類化合物、丙烯酸叔丁酯或其衍生物與有機溶劑混合後，本發明將得到的混合溶液進行液氮冷凍處理。在本發明中，所述液氮冷凍處理的時間優選為3～7min，更優選為4～6min。完成所述液氮冷凍處理後，本發明在保護氣氛下，將得到的液氮冷凍物料與雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物、配體和銅系催化劑混合，進行聚合反應。在本發明中，所述液氮冷凍物料與雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物、配體的摩爾比優選為400:1:2。在本發明中，所述雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物作為引發劑，引發所述聚合反應。在本發明中，所述雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物優選以雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物溶液形式加入。在本發明中所述雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物溶液的摩爾濃度優選為2.8～3.5mmol/mL，更優選為3.0～3.3mmol/mL。在本發明中，所述雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物溶液中的溶劑優選包括丙酮和/或四氫呋喃。本發明對於所述配體的種類沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的用於丙烯胺醯胺類化合物和丙烯酸叔丁酯或其衍生物聚合的配體即可。在本發明中，所述配體優選為胺類配體，更優選為三[2-(二甲氨基)乙基]胺或N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺。本發明對於所述銅系催化劑的種類沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的銅系催化劑即可。在本發明中，所述銅系催化劑優選為無機銅鹽，更優選為滷化亞銅，最優選為CuCl或CuBr。本發明對於提供所述保護氣氛的保護氣種類沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的保護氣即可。在本發明的實施例中，具體採用氬氣作為保護氣。本發明對於提供所述保護氣氛的方式沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的提供保護氣氛的方式即可。在本發明中，提供保護氣氛的方式優選先抽真空，然後充保護氣。在本發明中，所述聚合反應前物料的混合順序具體優選為：將液氮冷凍物料先與雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物、配體混合，然後再與銅系催化劑混合。進行所述混合後，本發明優選對每次得到的混合物料進行液氮冷凍處理，於保護氣氛中進行後續處理，即所述聚合反應優選具體包括以下步驟：將液氮冷凍物料先與雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物、配體混合，依次進行液氮冷凍處理、抽真空、充保護氣；將所得物料與銅系催化劑混合，依次進行液氮冷凍處理、抽真空、充保護氣；將所得物料進行聚合反應。在本發明中，所述聚合反應的溫度優選為-5～5℃，更優選為-3～3℃，最優選為-1～1℃；所述聚合反應的時間優選為24～48h，更優選為30～40h，最優選為33～36h。完成所述聚合反應後，本發明優選對得到的反應料液進行後處理，得到聚合反應產物。在本發明中，所述後處理優選包括以下步驟：將所述聚合反應後得到的反應料液中的溶劑去除，再與乙醇混合，依次採用乙醇-水混合溶液和超純水透析；將所述透析後得到的溶液進行冷凍乾燥，得到聚合反應產物。本發明對於去除溶劑的方法沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的去除溶劑的技術方案即可。本發明優選通過旋蒸去除溶劑。將去除溶劑後得到的物料與乙醇混合後，本發明優選將混合物料置於透析袋中，依次採用乙醇-水混合溶液和超純水透析。在本發明中，所述去除溶劑後得到的物料與乙醇的質量比優選為20mL。在本發明中，所述透析袋的截留分子量優選為3500Da。在本發明中，所述乙醇-水混合溶液中乙醇與水的體積比優選為1：(0.9～1.1)，更優選為1：1；所述乙醇-水混合溶液中的水優選為超純水；採用乙醇-水混合溶液透析的時間優選為45～50h。在本發明中，採用超純水透析的時間優選為70～75h。本發明將所述透析後得到的溶液進行冷凍乾燥，得到聚合反應產物。在本發明中，所述冷凍乾燥的溫度優選為-50～-60℃；所述冷凍乾燥的時間優選為45～50h。本發明對於進行所述冷凍乾燥所採用的設備沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的進行冷凍乾燥的設備即可。本發明優選採用凍幹機進行所述冷凍乾燥。得到聚合反應產物後，本發明將所述聚合反應產物與三氟乙酸和有機溶劑混合，進行水解反應，得到聚丙烯胺醯胺類聚合物。在本發明中，所述聚合反應產物(PNtB)的質量、三氟乙酸的體積和有機溶劑的體積比優選為1g：(0.9～1.1)mL：(15～25)mL，更優選為1g：1mL：(18～22)mL。本發明對於所述有機溶劑的種類沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的有機溶劑即可，具體如二氯甲烷或丙酮。在本發明中，所述水解反應的溫度優選為25～35℃，更優選為28～32℃，最優選為30℃；所述水解反應優選為油浴條件下進行。在本發明中，所述水解反應的時間優選為20～30h，更優選為22～27h，最優選為24h。在本發明中，所述水解反應優選在攪拌條件下進行，所述攪拌的速率優選為800rpm。在本發明中，所述聚丙烯胺醯胺類聚合物(PNA)為無規聚合物，粒度優選為80～90nm，具體可用式I所示化學式表示：p(NIPAM400-co-AAcx)式I其中NIPAM為丙烯胺醯胺類化合物單體，AAc為丙烯酸單體，丙烯胺醯胺類化合物與丙烯酸單體的摩爾比為400：X，所述X＝10～40，具體可為10、20、30或40。所述400與X分別表示丙烯胺醯胺類化合物單體和丙烯酸單體的理論聚合度。所述水解反應完成後，本發明優選對水解反應的產物進行後處理，得到聚丙烯胺醯胺類聚合物。在本發明中，所述後處理優選包括以下步驟：將所述水解反應的產物進行洗滌、真空乾燥，得到聚丙烯胺醯胺類聚合物。本發明對於所述洗滌沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的洗滌的技術方案即可。本發明優選採用乙醚將所述水解反應的產物進行洗滌3～5次。在本發明中，所述真空乾燥的溫度優選為70℃；真空乾燥的時間優選為24h；真空乾燥的真空度優選為0.09MPa。得到聚丙烯胺醯胺類聚合物後，本發明將所述聚丙烯胺醯胺類聚合物與金納米溶膠混合，攪拌條件下進行反應，得到金納米凝膠。在本發明中，所述聚丙烯胺醯胺類聚合物的質量與金納米溶膠的體積比優選為(90～110)mg：1L，更優選為(95～105)mg：1L，最優選為100mg：1L。在本發明中，所述金納米溶膠中金納米粒子(GNP)的粒度優選為13～17nm，更優選為14～16nm。在本發明中，所述金納米溶膠中金納米粒子的濃度優選為0.47～0.51mol/L。在本發明中，所述金納米溶膠的製備方法優選包括以下步驟：將氯金酸水溶液加熱至沸騰，然後與檸檬酸鈉混合，進行還原反應，得到金納米溶膠。在本發明中，所述氯金酸水溶液的摩爾濃度優選為100mmol/L。在本發明中，所述氯金酸水溶液中的水優選為超純水。本發明優選在油浴條件下進行所述加熱。在本發明中，所述加熱的溫度優選為110～130℃，更優選為115～125℃，最優選為120℃。本發明優選在攪拌條件下進行所述加熱；所述攪拌的速率優選為700～900rpm，更優選為800rpm。在本發明中，所述氯金酸水溶液中氯金酸與所述檸檬酸鈉的摩爾比優選為100:49。在本發明中，所述檸檬酸鈉優選以檸檬酸鈉水溶液的形式加入。在本發明中，所述檸檬酸鈉水溶液的摩爾濃度優選為49mmol/L。在本發明中，所述檸檬酸鈉水溶液中的水優選為超純水。在本發明中，所述還原反應的時間優選為15～30min，更優選為20～25min。本發明將所述聚丙烯胺醯胺類聚合物與所述金納米溶膠混合，攪拌條件下進行反應，得到金納米凝膠。在本發明中，所述攪拌的速率優選為800rpm。在本發明中，所述反應的時間優選為48～72h，更優選為55～65h。在本發明中，所述反應的溫度優選為20～40℃，更優選為25～35℃；在本發明的實施例中，所述反應具體在室溫下進行。將聚丙烯胺醯胺類聚合物與金納米溶膠混合，攪拌條件下進行反應後，本發明優選對反應後得到的物料進行後處理，得到金納米凝膠。在本發明中，所述後處理優選包括以下步驟：對反應後得到物料進行超濾濃縮、冷凍乾燥，得到金納米凝膠。在本發明中，進行所述超濾濃縮的截留分子量優選為100K。在本發明中，進行所述超濾濃縮時所採用的轉速優選為2500～3500rpm，更優選為3000rpm；所述超濾濃縮的時間優選為10～20min，更優選為15min。本發明對於進行所述超濾濃縮所採用的裝置沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的用於進行超濾濃縮的裝置即可。本發明優選採用超濾管進行所述超濾濃縮。在本發明中，所述冷凍乾燥的溫度優選為-50～-60℃；所述冷凍乾燥的時間優選為45～50h。本發明對於進行所述冷凍乾燥所採用的設備沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的進行冷凍乾燥的設備即可。本發明優選採用凍幹機進行所述冷凍乾燥。得到金納米凝膠後，本發明將所述金納米凝膠與分散介質混合，得到栓塞材料。在本發明中，所述金納米凝膠在栓塞材料中的質量濃度優選為120～130mg/mL，更優選為123～127mg/mL，最優選為125mg/mL。本發明對於所述分散介質沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的用於栓塞材料的分散介質即可。在本發明中，所述分散介質優選包括注射用水或生理鹽水。本發明優選在攪拌或振蕩條件下將所述金納米凝膠與分散介質混合。在本發明中，所述攪拌的速率優選為400～600rpm；所述攪拌的時間優選為10min。在本發明中，所述振蕩的速率優選為150～250rpm；所述振蕩的時間優選為10min。本發明提供了上述技術方案所述製備方法製備得到的長期自顯影的溫敏血管栓塞材料，包括金納米凝膠和分散介質，所述金納米凝膠包括金納米粒子核體和包覆在所述金納米粒子核體表面的聚丙烯胺醯胺類溫敏聚合物殼層。在本發明中，所述金納米凝膠(GNP@PNA)中的聚丙烯胺醯胺類聚合物殼層通過金硫鍵鍵合到所述金納米粒子核體表面。在本發明中，所述金納米粒子核體的粒度優選為13～17nm，更優選為14～16nm。在本發明中，所述聚丙烯胺醯胺類聚合物殼層的厚度優選為5～7nm。下面將結合本發明中的實施例，對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。實施例1：將10mL摩爾濃度為100mmol/L的氯酸金溶液與92mL超純水混合，在800rpm攪拌下，於120℃油浴中加熱，至氯酸金水溶液沸騰時加入8mL摩爾濃度為49mmol/L(質量濃度或摩爾濃度)檸檬酸鈉溶液，繼續攪拌反應15min，得到金納米溶膠。採用超純水將實施例1製備得到的金納米溶膠進行稀釋，至金納米溶膠中的金納米粒子的質量百分濃度為0.01％，作為待測樣品；採用Nano-ZS90雷射粒度儀(英國Malvern公司)對待測樣品中金納米粒子的平均粒度進行測定，光源為氦-氖雷射(λ＝633nm)，檢測角為90°。實驗結果表明，25℃時所述待測樣品中金納米粒子的粒度為13±1nm。實施例2：將10mL摩爾濃度為100mmol/L氯酸金溶液與92mL超純水混合，在700rpm攪拌下，於130℃油浴中加熱，至氯酸金水溶液沸騰時加入8mL摩爾濃度為49mmol/L(質量濃度或摩爾濃度)檸檬酸鈉溶液，繼續攪拌反應30min，得到金納米溶膠。採用超純水將實施例1製備得到的金納米溶膠進行稀釋，至金納米溶膠中的金納米粒子的質量百分濃度為0.1％，作為待測樣品；採用Nano-ZS90雷射粒度儀(英國Malvern公司)對待測樣品中金納米粒子的平均粒度進行測定，光源為氦-氖雷射(λ＝633nm)，檢測角為90°。實驗結果表明，25℃時所述待測樣品中金納米粒子的粒度為15nm。實施例3：將10mL摩爾濃度為100mmol/L氯酸金溶液與92mL超純水混合，在900rpm攪拌下，於110℃油浴中加熱，至氯酸金水溶液沸騰時加入8mL摩爾濃度為49mmol/L(質量濃度或摩爾濃度)檸檬酸鈉溶液，繼續攪拌反應20min，得到金納米溶膠。採用超純水將實施例1製備得到的金納米溶膠進行稀釋，至金納米溶膠中的金納米粒子的質量百分濃度為0.05％，作為待測樣品；採用Nano-ZS90雷射粒度儀(英國Malvern公司)對待測樣品中金納米粒子的平均粒度進行測定，光源為氦-氖雷射(λ＝633nm)，檢測角為90°。實驗結果表明，25℃時所述待測樣品中金納米粒子的粒度為16nm。實施例4將1.13gN-異丙基丙烯醯胺(NIPAM)、74μL丙烯酸叔丁酯(tBA)與5mL丙酮混合，1000rpm攪拌5min，進行液氮冷凍處理5min、抽真空、充氬氣，然後將液氮冷凍物料與14μLN,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺和8μL3.27mmol/mL的雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物溶液混合，再次進行液氮冷凍處理5min、抽真空、充氬氣，最後加入20mgCuBr，第三次進行液氮冷凍處理5min、抽真空、充氬氣，於0℃下反應48h；反應完畢後，旋蒸除去溶劑，再與20mL乙醇混合，將所得混合物料置於截留分子量為3500Da的透析袋中，依次採用乙醇-水混合溶液(乙醇與水的體積比為1：1)透析2天、超純水透析3天，於凍幹機中-55℃條件下凍幹2天，得到聚合反應產物(PNtB)；將1g聚合反應產物與20mL二氯甲烷和1mL三氟乙酸混合，在800rpm、30℃條件下於油浴中進行水解反應24h；反應完畢後，用乙醚洗滌3次，於70℃、0.09MPa真空度條件下真空乾燥24h，得到聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物(PNA)。實施例5～8按照表1中提供的配比，將N-異丙基丙烯醯胺(NIPAM)、丙烯酸叔丁酯(tBA)與5mL丙酮混合，1000rpm攪拌5min，進行液氮冷凍處理5min、抽真空、充氬氣，然後將液氮冷凍物料與27μL三[2-(二甲氨基)乙基]胺和16μL3.27mmol/mL的雙[2-(2′-溴代異丁醯氧基)乙基]二硫化物溶液混合，再次進行液氮冷凍處理5min、抽真空、充氬氣，最後加入20mgCuCl，第三次進行液氮冷凍處理5min、抽真空、充氬氣，於0℃下反應48h；反應完畢後，旋蒸除去溶劑，再與20mL乙醇混合，將所得混合物料置於截留分子量為3500Da的透析袋中，依次採用乙醇-水混合溶液(乙醇與水的體積比為1：1)透析2天、超純水透析3天，於凍幹機中-55℃條件下凍幹2天，得到聚合反應產物(PNtB)；將1g聚合反應產物與20mL二氯甲烷和1mL三氟乙酸混合，在800rpm、30℃條件下於油浴中進行水解反應24h；反應完畢後，用乙醚洗滌3次，於70℃、0.09MPa真空度條件下真空乾燥24h，得到聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物(PNA)。表1N-異丙基丙烯醯胺(NIPAM)與丙烯酸叔丁酯(tBA)的配比實施例實施例5實施例6實施例7實施例8NIPAM與tBA摩爾比400：10400：20400：30400：40NIPAM(g)2.262.262.262.26tBA(μL)74147221294實施例9將實施例5～8製備的聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物(分別計為PNA10、PNA20、PNA30和PNA40)5mg分別與1mL超純水混合，於1000rpm攪拌5min，調節PNA10、PNA20、PNA30和PNA40溶液的pH值為5.3，測定不同溫度下PNA10、PNA20、PNA30和PNA40溶液的紫外吸收情況，如圖1所示。從圖1可以看出，PNA具有較好的溫敏性，PNA10的低臨界相轉變溫度(LCST)為31.4℃，PNA20為36.7℃，PNA30為44.3℃，PNA40的LCST消失。將實施例6製備的聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物(PNA20)5mg與1mL超純水混合，於1000rpm攪拌5min，分別調節PNA20溶液的pH值為3.0、5.0、6.0和8.0，測定不同pH值下PNA20溶液的紫外吸收情況，如圖2所示。從圖2可以看出，說明pH對於PNA的溫敏性具有影響。實施例10將0.1g實施例6製備的聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物與1L實施例1製備的金納米溶膠混合，室溫下800rpm攪拌72h；採用截留分子量為100K的超濾管，於3000rpm下進行超濾濃縮15min，於凍幹機中-55℃條件下凍幹2天，得到金納米凝膠(GNP@PNA)。將2mg實施例10製備的GNP@PNA與5mL超純水混合，於1000rpm攪拌5min，採用透射電子顯微鏡(TEM，TecnaiG220)觀察GNP@PNA的形貌(圖4)，並與金納米粒子的電鏡圖(圖3)進行對比。由圖4可知，聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物與金納米粒子結合，形成核殼結構，其中，金納米粒子作為核體，聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物作為殼層，厚度為5～7nm。將5mg實施例10製備的GNP@PNA與10mL超純水混合，於1000rpm攪拌5min，採用Nano-ZS90雷射粒度儀(英國Malvern公司)測定GNP@PNA的粒徑和Zeta電位隨溫度的變化情況，如圖5所示。由圖5可以看出，25℃時GNP@PNA的粒度為86nm，隨著溫度升高，GNP@PNA的粒度減小，GNP@PNA的Zeta電位變化不大。將2mg實施例10製備的GNP@PNA作為待測樣品，採用熱重分析儀測定GNP@PNA的組分含量，得到GNP@PNA的的熱重曲線，如圖所示6。由圖6可以看出，GNP@PNA中金納米粒子的含量為19.2％，聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物的含量為78.2％。實施例11將0.15g實施例4製備的聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物與1.5L實施例2製備的金納米溶膠混合，室溫下800rpm攪拌72h；採用截留分子量為100K的超濾管，於3000rpm下進行超濾濃縮15min，於凍幹機中-55℃條件下凍幹2天，得到金納米凝膠(GNP@PNA)。實施例12將0.1g實施例4製備的聚N-異丙基丙烯醯胺類聚合物與1L實施例3製備的金納米溶膠混合，室溫下800rpm攪拌72h；採用截留分子量為100K的超濾管，於3000rpm下進行超濾濃縮15min，於凍幹機中-55℃條件下凍幹2天，得到金納米凝膠(GNP@PNA)。實施例13分別將50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、180mg和200mg實施例11製備的GNP@PNA與1mL生理鹽水混合，於1000rpm攪拌5min，得到GNP@PNA分散體，在20～45℃測試溫度範圍內，採用目視瓶倒轉法測定樣品的相轉變溫度，並繪製金納米凝膠轉變相圖，如圖7所示。由圖7可以看出，隨著溫度的變化，GNP@PNA分散體經歷溶膠-收縮凝膠的轉變，說明GNP@PNA分散體具有較好的溫敏性能。實施例14將125mg實施例11製備的GNP@PNA與1mL生理鹽水混合，於1000rpm攪拌5min，得到GNP@PNA分散體，即栓塞材料；將70mg實施例5製備的PNA與1mL生理鹽水混合，於1000rpm攪拌5min，得到PNA分散體。在ARES2000Rheometer流變儀(TA)上測試所述GNP@PNA分散體和PNA分散體的線性粘粘彈行為，測試溫度為25～45℃，平行板夾具(Φ25mm)，間距0.5mm。升溫速率為5℃/min條件下，所述GNP@PNA分散體和PNA分散體的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨溫度的變化情況，即流變力學曲線，如圖8所示。由圖8可知，隨著溫度升高，G′和G″起初沒有明顯變化，當溫度高於相轉變溫度時，兩模量急劇增大，其中金納米凝膠為32℃。同時，金納米凝膠的G′和G″低於相同濃度的PNA分散體系，表明金納米凝膠具有更好的流動性，利於血管栓塞治療使用。實施例15將實施例12製備的GNP@PNA與生理鹽水混合，於1000rpm攪拌5min，得到不同濃度梯度的GNP@PNA分散體，其中，金納米粒子的濃度範圍為0.18～0.71molAu/L；配製不同濃度梯度的碘海醇溶液，其中，碘的濃度範圍為0.16～2.2molI/L。在CT掃描儀下測定GNP@PNA分散體和碘海醇分散體的CT值隨著濃度的變化曲線，在標準顯示程序下測得CT值，如圖9所示。將GNP@PNA分散體和碘海醇分散體加入96孔板中，在IVISLuminaXR系統中，選定有材料的加樣孔為測試區域，測得該區域的灰度值，如圖10所示。由圖9和圖10可知，GNP@PNA的CT成像能力和X射線屏蔽能力均高於同濃度下的碘海醇。實施例16動物實驗按照《湖北省實驗動物管理條例》進行，並經同濟醫學院醫學倫理委員會批准。用GNP@PNA分散體或者PVA分散體栓塞正常日本大耳兔的左腎動脈，進行腎動脈栓塞實驗，其中，介入操作在數字減影血管造影機(DSA)下嚴格按照無菌操作執行：取正常的日本大耳兔，耳緣靜脈注射2％戊巴比妥鈉麻醉，總用量30mg/kg，先注射3/4量，術中根據要求可臨時追加。注射完5～10分鐘痛覺反應消失後，兔仰臥位固定，右側腹股溝備皮，消毒、鋪巾，切開腹股溝皮膚，眼科鑷分離股動脈，其兩端用絲線套起，結紮遠端股動脈，提起近心端預留絲線，肉眼直視下用18G血管穿刺針直接穿刺股動脈，留置穿刺針外套管，拔出針芯後引入直導絲，拔出外套管後經直導絲引入4F血管鞘並用近心端預留絲線固定；將4FCobra導管插至右腎動脈開口處，以約0.5ml/s速度注射造影劑(碘海醇300mgI/mL)，形腎動脈造影；10分鐘後，推注栓塞材料，所述栓塞材料為將實施例12製備的GNP@PNA與生理鹽水混合後得到的125mg/mL的PVA分散體；再過10分鐘後，注射造影劑(碘海醇300mgI/mL)，形腎動脈造影。在DSA下觀察到兔子右腎動脈的栓塞效果，結果如圖11所示。由圖11可知，GNP@PNA同PVA均能夠起到很好的血管栓塞作用，阻斷了左腎的血流。栓塞實驗操作結束後，結紮股動脈，實驗兔在實驗室標準條件下飼養。術後1周、4周和8周對實驗兔進行CT掃描，結果如圖12所示。由圖12可知，直到術後第8周CT下，實驗兔左腎經GNP@PNA分散體栓塞後始終能夠顯影，具有長時間顯影的能力，同時相比術前左腎的體積有明顯減小。說明GNP@PNA分散體在血管部位形成凝膠，阻斷血流，適宜作為血管栓塞材料使用。取栓塞後實驗兔左腎製成組織切片，並進行HE和Masson染色，得到實驗兔左腎的組織病理學圖片，結果如圖13所示。由圖13可以觀察到腎血管部位的GNP@PNA，表明GNP@PNA可以在兔左腎處栓塞8周。術後1周、4周和8周猝死實驗兔，分別取GNP@PNA組和PVA組實驗兔的左腎，得到實驗兔左腎的大體照片，結果如圖14所示。由圖14可知，GNP@PNA分散體可以完全栓塞腎，同時不會出現PVA材料異位栓塞現象。實施例17(1)實驗動物同實施例16。(2)實驗材料：皮下VX2腫瘤瘤株由美國ATCC公司引進。兔麻醉用速眠新II由解放軍軍需大學獸醫研究所試研製，每毫升速眠新含保定寧60mg、鹽酸二氫埃託啡4μg、氟哌啶醇2.5mg。歐乃派克(碘海醇)購自德國貝朗公司(B.BraunAG)，本發明所使用的碘海醇均相同。(3)實驗方法：54隻紐西蘭大白兔建立VX2移植性肝癌模型，14天後行CT及MRI檢查，經腹正中切口打開腹腔，暴露肝動脈後，治療時以動脈夾暫時夾閉肝右動脈暫時夾閉肝右動脈，使插管超選擇栓塞肝左葉腫瘤血管；然後分為如下3組治療，每組15隻：A組：經肝動脈注入栓塞材料進行栓塞，所述栓塞材料為將實施例12製備的GNP@PNA與生理鹽水混合後得到的125mg/mL的GNP@PNA分散體；B組：經肝動脈注入PVA(粒徑：280-350nm)分散體；C組：經肝動脈注射超液態碘油/明膠海綿。使用DSA觀察栓塞材料經導管逐漸流向肝處的腫瘤內，結果如圖15所示。由圖15可知，A組GNP@PNA能夠完全栓塞腫瘤部位；B組PVA僅能栓塞腫瘤的主動脈，不能完全栓塞外周動脈，易形成側支循環，導致腫瘤再生。同時，由圖15可知，B組PVA栓塞7天後腫瘤體積比A組GNP@PNA栓塞後大；C組碘油/明膠海綿能栓塞腫瘤部位，但因為碘油在兔子體內很快被清除，動脈復通後最終會導致腫瘤再生，如圖15所示，栓塞7天後的大體照片中碘油/明膠海綿栓塞的腫瘤體積大。實驗表明GNP@PNA具有良好的栓塞性，能夠達到抑瘤效果。術後兩周內進行下列檢測：a.進行CT檢測，分別在術後0天、3天、5天、7天和14天對實驗兔的腫瘤部位進行掃描，結果如圖16所示。由圖16可知，GNP@PNA能夠在腫瘤部位選擇性沉積至少7天，採用多平面CT掃面技術測定腫瘤大小，按照式I計算腫瘤體積，得到實驗兔的腫瘤體積增長曲線，結果如圖17所示：其中a、b和c分別代表前後面、橫斷面和軸向直徑。由圖17可知，GNP@PNA分散體在14天內能有效抑制腫瘤生長。b.金元素組織分布檢測：取A組GNP@PNA分散體栓塞14天實驗兔猝死後，取實驗兔的腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、腦和血液，稱重後，切成片狀並搗碎，使用硝酸(質量百分含量為65～68％)和高氯酸(質量百分含量為70～72％)在320℃加熱板上硝化處理8～9h，直到溶液中沒有固體顆粒物存在、澄清透明為止。用10mL容量瓶定容硝化後溶液，採用原子吸收光譜儀(AA300)，在波長242.8nm處測定各組織中金元素含量，測試時使用金標準溶液配製標準曲線。如圖18所示，在腫瘤部位金含量最高，肝、腎、腦和血液中金元素含量低於2.0μg，實驗表明，GNP@PNA栓塞14天後仍主要蓄積在腫瘤部位。c.生物電鏡金元素分布檢測：取上述b中實驗兔的腫瘤部位，投入預冷的2.5％戊二醛固定液中，採用手術刀將腫瘤組織切割成1mm3大小或橫切面1mm2的長條形。取材後，經固定、漂洗、脫水和包埋處理，用透射電子顯微鏡觀察栓塞實驗後的實驗兔腫瘤處金的分布情況，結果如圖19所示。由圖19可知，GNP@PNA主要蓄積在腫瘤血管處，部分分布在血管外，表明GNP@PNA能夠轉移到腫瘤內部，達到更好的栓塞作用。d.肝腎功能檢測：圖20中①代表ALT丙氨酸轉氨酶指數，②代表天冬氨酸轉氨酶(AST)，由圖20可知，丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)在術後第3天達到峰值，之後在第14天回到正常水平，表明兔子的肝功能採用GNP@PNA栓塞，不會造成兔子的肝功能損傷。圖21中，③、④和⑤依次代表血尿素氮(BUN)，尿酸(UA)和肌酸酐(CRE)，由圖21可知，血尿素氮(BUN)，尿酸(UA)和肌酸酐(CRE)水平在栓塞後正常，表明兔子的腎功能在栓塞後的14天內幾乎不受影響。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3