一種用於預防和治療阿爾茲海默氏病的具有免疫原性的肽組合物的製作方法

2023-07-15 12:23:46

專利名稱：一種用於預防和治療阿爾茲海默氏病的具有免疫原性的肽組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種包含肽免疫原的用於預防和治療阿爾茲海默氏病的組合物。更具體地，該肽免疫原包含一個主要的功能/調控位點，一個與具有多個二類MHC結合基序的輔助T細胞表位(Th)連接的澱粉樣蛋白β(Aβ)肽的N末端片段。該肽免疫原引發針對Aβ肽的主要功能/調控位點的定點免疫反應並產生抗體，所述抗體與在阿爾茲海默氏病患者腦中形成的可溶性Aβ1-42肽及澱粉樣蛋白斑高度交叉反應。引發的對可溶性Aβ1-42肽交叉反應的抗體促進原纖維解聚，抑制原纖維聚集，導致「可溶性Aβ衍生的毒素」的免疫中和；而且與澱粉樣蛋白斑交叉反應，促進從腦中清除這些斑塊。因此，本發明的包含該肽免疫原的組合物可用於預防和治療阿爾茲海默氏病。
背景技術：
阿爾茲海默氏病(AD)是一種慢性神經變性疾病，其特徵表現為患者喪失認知能力並具有嚴重的行為異常，從而導致患者的最終死亡。目前在美國有250萬到400萬AD患者，全世界有1700萬到2500萬AD患者。該病在西方國家已經成為繼心臟病、癌症和中風之後第四位導致死亡的疾病。ARICEPT是一種乙醯膽鹼酯酶抑制劑，已被FDA批准用於減緩阿爾茲海默氏病患者的惡化速率。然而，該藥僅對限定的時期和某些患者有效。至今還沒有明確的治療或治癒該破壞性疾病。
兩種微觀的沉澱物即神經原纖維纏結(NFT)和老年澱粉樣蛋白斑由Alois Alzheimer鑑定為該病的病理標記。神經原纖維纏結由兩條10nm寬稱為成對螺旋絲(PHFs)的細絲相互纏繞而成，其主要組成部分是磷酸化的tau蛋白。tau蛋白262位胺基酸絲氨酸的磷酸化是一個關鍵步驟，導致tau蛋白生理上的功能紊亂。PHFs存在於胞內，並且在許多異常的樹突和軸突過程中或組成老年澱粉樣蛋白斑外圍的神經突中有發現。老年澱粉樣蛋白斑由橫截面面積高達150μm的紊亂的神經嗜細絲(neurophil filament)和一個澱粉樣沉積物的胞外核組成。腦澱粉樣蛋白斑在超微結構上不同於PHFs，由4-8nm寬的不成對纏繞在一起的細絲組成。斑核由最初命名為A4的相對分子量(M)約為4,000的肽聚集物組成(Masters等.，Proc Natl Acad Sci USA，1985，824245-4249)。
現在被重新命名為澱粉樣蛋白β肽(或Aβ1-42)的A4的部分胺基酸序列顯示與從阿爾茲海默氏病或唐氏綜合症的患者腦血管中分離的澱粉樣β蛋白相似(Glenner和Wong，Biochem Biophys Res Comm，1984；120885-890；1221131-1135)。
因許多原因已推測Aβ1-42與AD相關。首先，在外周澱粉樣變性病中，如初級輕鏈疾病或次級AA澱粉樣變性，大量的澱粉樣蛋白負荷與組織和器官功能紊亂強烈相關。第二，澱粉樣蛋白斑的密度與AD中XX痴呆值(premortem dementia score)正相關。第三，Aβ1-42沉澱物是AD和相關疾病，如唐氏綜合症中最早出現的神經病理標誌物，比NFT的形成早20-30年。第四，β-澱粉樣變性對AD和相關疾病是相對特異的。第五，Aβ1-42對神經元有毒性作用(Yankner等.，Science，1990；250279-282)。最後，在澱粉樣前體蛋白(APP)結構基因中的錯義突變導致家族性AD的早期發作(Goate等.，Nature，1991；349704-706；Mullan等.，NatureGenetics，1992；1345-347)。顯然，這樣的一個突變造成Aβ1-42的驚人的超量產生(Citron等.，Nature，1992；360672-674)。
1987年，Kang等(Nature，1987；325733-737)和其他三個研究組(見1987 Anderton的現狀文獻(status reports)，Nature，1987；325658-659和Barnes，Science，1987；235846-847)獨立地克隆到編碼Aβ1-42的基因。該基因編碼695個胺基酸殘基的MW約為79,000的蛋白質，該蛋白現在被命名為澱粉樣前體蛋白(APP)，並事實上在所有的組織中都有表達。APP至少有五種剪接變異體，其中四種包含β-澱粉樣蛋白肽序列。
在家族性形式的AD中已涉及四種基因。其中的三個基因，βAPP，presenilin 1和presenilin 2發生突變時，造成常染色體顯性早期形式的AD。第四個基因載脂蛋白E具有天然存在的多態形式，ApoE4，它代表該病發展的一個主要遺傳危險因子。可獲得的證據支持下述觀點幾個獨特基因的改變可導致Aβ1-42產生和其清除之間的長期不平衡，從而引起前42個殘基和隨後40個殘基肽聚集成細胞毒素斑。已有證據確切表明這些四個基因每個的缺陷通過(1)增加Aβ1-42肽的產生和/或沉澱或(2)通過減少ApoE4從組織中的清除來傾向於產生AD表型(Selkoe，JBiol Chem，1996；27118295-18298)。
從可獲得的數據顯示，似乎聚集的而非單體形式的Aβ1-42肽能在體外通過一系列推測的相關機制誘導細胞功能紊亂和死亡。這些包括氧化損傷(Thomas等.，Nature，1996；380168-171；Behl等.，Cell，1994；77817-827)，胞內鈣穩態改變(Arispe等.，Proc Natl Acad Sci USA，1993；90567-571)和細胞骨架重組(Busciglio等.，Neuron，1995；14879-888)。即使級聯反應假說仍處在激烈的爭論中，對澱粉樣蛋白誘導的級聯反應的一些基本步驟已形成了足夠的認識。
目前正充分開展鑑定可抑制澱粉樣蛋白誘導的級聯反應的一個或另一個步驟的小分子的藥學方法。特別感興趣的是以下兩個方法試圖通過降低Aβ1-42肽從神經細胞和神經膠質細胞中的分泌來幹擾Aβ1-42肽的聚集，或抑制這些胞外聚集物作用於神經細胞和神經膠質細胞以及它們的產生過程的毒性。第三種方法嘗試控制似乎由聚集的Aβ1-42引發的特定炎性反應(包括小膠質細胞性刺激，激活典型的補體級聯反應，細胞因子釋放和反應性星形細胞增生)，可能證明對阿爾茲海默氏病患者是有利的。
除了上述藥學方法對AD進行幹涉外，也已嘗試進行了免疫幹涉。Soloman等(Proc Natl Acad.Sci，1996；93452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；944109-4112)表明直接針對人Aβ1-42肽的N末端區一個位點的三種特異單克隆抗體可以在各種程度上與預先形成的原纖維結合，從而導致它們解聚，並抑制它們的神經毒性作用。而且還發現這些抗體防止纖維性Aβ1-42的形成。Solomon等(WO 01/18169)也嘗試製備噬菌體展示的Aβ1-42肽的表位，並通過腹腔注射將噬菌體展示的表位或包含該表位的肽對小鼠給藥，以引發針對Aβ1-42肽的抗體。通過大鼠嗜鉻細胞瘤(phenochromocytoma)的體外實驗表明，以1∶5稀釋的抗血清防止Aβ1-42的神經毒性。1∶5和1∶20稀釋的抗血清也表明由於廣泛破壞纖維形態體外破壞Aβ的纖維結構。然而，在第一次注射中所用的佐劑是弗氏完全佐劑，而第二次注射中所使用的是弗氏不完全佐劑。所用的佐劑完全不適用於人。而且，即使使用這些烈性(harsh)佐劑，所產生的抗體水平依然太低，幾乎沒有效用。
隨後，Schenk等(Nature，1999；400173-177)表明，在AD小鼠模型中，用Aβ1-42肽免疫抑制澱粉樣蛋白斑和相關營養不良神經突的形成。然而，由於Aβ1-42的低免疫原性，所用方法需要配合使用形成烈性損害的佐劑來重複給藥抗原，以獲得更高水平的抗Aβ1-42斑的抗體，其為影響斑的形成所必需的。另外，需要注意的是，用Aβ1-42免疫可能誘導更多的毒性澱粉樣蛋白自身的積累(Araujo，DM Cotman，CW，Brain Res，1992；569，141-145)。
儘管存在這些缺點，在轉基因AD小鼠模型中通過類似的活性免疫所進行的額外的研究已經對AD的免疫預防和免疫治療方法提供了保證。Janus等(Nature，2000；408979-982)描述了在AD小鼠模型中Aβ1-42肽免疫降低行為損害和斑。Morgan等(Nature，2000；408982-985)描述了Aβ1-42肽疫苗在小鼠模型中抑制記憶喪失。
免疫治療有效性的直接證據來源於對外周給藥抗Aβ肽的抗體，單克隆或多克隆抗體降低了澱粉樣蛋白的負荷的觀察(WO 99/27944；Bard等.，Nature Medicine，2000；6916-919)。雖然血清水平相對不多，但這些被動給藥的抗體，單克隆抗體3D6(抗Aβ1-5)和10D5(抗Aβ1-12)或多克隆抗Aβ1-42能夠進入中樞神經系統。在該處，抗體與斑塊結合併誘導對預先存在的澱粉樣蛋白斑的清除。Bard等報導，當用PDAPP小鼠(即用由血小板衍生的生長因子啟動子啟動的APP小基因轉基因的小鼠)腦切片或AD患者腦組織進行體內檢測時，抗Aβ肽的抗體啟動小神經膠質細胞通過FC受體介導的吞噬作用和隨後的肽段降解來清除斑塊。該研究證實，在AD小鼠模型中，被動給藥抗Aβ1-42肽和Aβ1-42N末端區的抗體降低了斑塊沉澱的程度；由定點疫苗引發的單克隆抗體或多克隆抗體能夠以治療相應水平進入CNS。
儘管在AD小鼠模型中有價值的發現免疫幹涉，但得到一個適於人的抗AD疫苗還有很長的一段路要走(Chapman，Nature，2000；408915-916)。在實用型AD疫苗完成前，在設計和配製一個可用於人的免疫原性的組合物所必需的廣泛工作中存在主要障礙。需要通過實驗數據來進行指導的一些問題是(1)在Aβ中，抗體識別的特異靶位點是什麼？(2)免疫原以何種方式呈現？(3)一個引發治療水平的抗體的免疫原在完成前，需要包括的其他位點是什麼？(4)使用適於人的臨床上可接受的佐劑的有效疫苗遞送系統是什麼？已有文獻中已公開的和需要進行的工作之間存在一個主要差距。合適的特異靶位點(即多聚Aβ1-42斑或單體可溶性Aβ1-42肽)是什麼及該特異位點如何進行加工以用於免疫幹涉。儘管在過去的二十年中發表了5,000篇關於Aβ1-42的文獻，澱粉樣蛋白級聯反應假說仍處於熱烈的爭論中，Aβ1-42以何種形式用於幹涉的論題仍存在爭議。如Terry及其同事所述，該論題的中心問題是纖維性澱粉樣蛋白負荷與神經機能障礙之間聯繫不大(The Neuropathology of Alzheimer Disease and the Structure Basisof its Alteratiohs，Terry等編輯.，Alzheimer Disease，187-206頁，Lippincott Williams和Wilkins，1999)。
在AD患者中，澱粉樣蛋白沉澱經常在遠離神經元損壞的地方形成。與病理性痴呆最有關係的是喪失突觸末端。然而，突觸末端的喪失與澱粉樣蛋白負荷的相關性很差。如果該病顯示與澱粉樣蛋白負荷相關性不大，那麼Aβ的作用是什麼？Klein等的題為「Targeting small A(1-42oligomersthe solution to an Alzheimer’s disease conumdrum？的文章(Trends in Neurosciences，2001；24219-224)表明原纖維不是Aβ的唯一毒性形式，而且可能不是與Aβ最相關的神經毒素。也稱為Aβ1-42衍生的擴散型配體(ADDLs)的小的寡聚體和初原纖維，也可以具有強烈的毒性神經活性。
進行成功免疫幹涉的AD疫苗需要設計一個引發定點高親和力抗體的免疫原，所引發的抗體可以與腦組織中的老年斑結合，從而促進通過神經膠質細胞對這些斑的清除，和免疫中和可溶性Aβ衍生的毒素。
多年來已經認識到產生高親和力的抗具有弱免疫原性的位點特異的肽的定點抗體的問題。如WO 99/27944中所證實，免疫學家和疫苗學家經常求助於經典的半抗原[肽]-載體蛋白偶聯物的方法。為了開發抗AD的定點疫苗，Frenkel等嘗試通過如上所述「EFRH」-噬菌體給藥來進行抗Aβ1-42斑的免疫反應(Proc Natl Acad.Sci 2000；9711455-11459，WO01/18169)。
一些方法使用Aβ1-42肽聚集物或Aβ1-42肽片段-載體蛋白偶聯物(WO99/27944)和用絲狀噬菌體展示的「EFRH肽」作為試劑來誘導針對患者中澱粉樣蛋白沉澱的免疫反應，這些方法是麻煩而且無效的。例如，在第四次用1011噬菌體展示的EFRH表位進行免疫後，在豚鼠免疫血清中＞95％的抗體是抗該噬菌體的。僅有一小部分(＜5％)抗體是抗可溶性Aβ1-42肽的(Frenkel等.，Vaccine 2001，192615-2619，WO 01/18169)。
在EP 526,511和WO 99/27944中描述了更簡便的方法，它們公開了給藥Aβ1-42肽來治療那些已確診的AD患者，及在AD患者中產生「有利的」免疫應答的條件下對患者給藥Aβ1-42或其他免疫原。然而，在WO99/27944的綜述中表明其中公開的疫苗設計存在主要缺陷。
特別是，問題在於缺少藥用和有效的疫苗遞送系統。WO99/27944公開了將Aβ1-42或Aβ1-42的活性片段連接到諸如霍亂毒素的載體分子上作為活性疫苗組分。見WO 99/27944第四頁。儘管第五頁教導了包含免疫原的藥物組合物不應該含有弗氏完全佐劑[CFA]，但表明Aβ1-42疫苗在治療患有AD的轉基因小鼠的有效性方面的實例使用了大劑量的在CFA中的聚集的Aβ1-42肽。儘管重複列舉了與公開的免疫原性試劑一起使用以增強免疫應答的優選的佐劑，但實驗數據表明只有使用CFA/ICFA的製劑才能提供足夠高滴度的抗體。見WO 99/27944第25頁。在實施例1中，驗證了PDAPP小鼠中抗AD的Aβ1-42的預防效果。然而，給藥的製劑包括每隻小鼠給藥100μg乳化在弗氏完全佐劑[CFA]中的聚集的Aβ42(見WO99/27944第34頁)，隨後多次注射激發劑量的乳化在弗氏不完全佐劑中的相同的Aβ1-42肽。在實施例IX中，對不同佐劑在小鼠中的免疫應答進行了研究。當佐劑MPL，明礬，QS21和CFA/ICFA與據稱有效的免疫原AN1792(即聚集的人Aβ42)一起使用時，對Aβ1-4的抗體水平與接受CFA/ICFA疫苗的小鼠相比在統計學意義水平上降低。見WO 99/27944表9和59-64頁。
在使用Aβ1-42肽片段(胺基酸1-5，1-12，13-28和33-42的人A Aβ1-42肽)的情形中，將每個片段連接到作為蛋白載體的羊抗小鼠IgG。在稍後的公開內容中，抗體對Aβ肽片段的功效僅在使用單克隆抗體進行被動免疫時才能表現出來(Bard等.，Nature Medicine 2000；6916-919)。這些與羊抗小鼠IgG連接的片段的效力還沒有表現出來。因此，表現出效力的唯一免疫原是溶於CFA/ICFA中的聚集的Aβ1-42肽。
直到目前，所有表現出效力的疫苗製劑都使用CFA/IFA作為佐劑。至此，針對Aβ1-42的肽免疫原已通過將各種Aβ1-42片段連接到羊抗小鼠免疫球蛋白上，將合成的Aβ13-28通過間-馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯連接到抗CD3的抗體上，或單獨的聚集的Aβ1-42肽來進行製備。這些免疫原，即單獨的Aβ42肽或Aβ1-42肽-載體蛋白偶聯物，在第一次免疫時用弗氏完全佐劑乳化，隨後在弗氏不完全佐劑中激發(Johnson-Wood等.，Proc Natl Acad Sci USA，1997；941550-1555；Seubert等.，Nature，1992；359325-327；Schenk等.，Nature，1999；400173-177；Janus等.，Nature 2000；408979-982；和Morgan等.，Nature，2000；408982-985)。WO 99/27944中公開的製劑或其他使用CFA和ICFA作為佐劑的製劑導致損害，而且對於用於人類而言過於烈性。因此，在現有技術中所描述的針對AD的疫苗組合物沒有一種是適於人的。
綜上所述，儘管綜述了考慮到Kline的先前公開(EP 526,511)提示Aβ1-42肽治療AD方面的潛力，但在WO99/27944中並沒有真正提供沒有問題解決的疫苗製劑以解決這個核心問題。
使用肽-載體蛋白偶聯物和Aβ1-42聚集物的另一個不利之處是這些分子非常複雜，難於表徵，而且對於生產過程也難於開發有效的質量控制程序。另一個不利之處是當對人體給藥時，Aβ1-42或其片段是自身分子。因此，它們在人體內缺少免疫原性或完全不具有免疫原性。這樣有必要開發臨床上可接受的疫苗製劑來對人給藥。
已知混雜的Th表位可用來引發有效的T細胞輔助作用，而且可以與弱免疫原性的B細胞表位結合以提供有效的免疫原。精心設計的混雜的Th/B細胞表位嵌合肽已顯示對於在表達多樣MHC單元型的遺傳上多樣的群體的多數成員中引發Th應答和得到的抗體應答是有用的。已知了來源於許多病原體的混雜Th，如麻疹病毒F蛋白和B型肝炎病毒表面抗原。表1和2列出了許多已知的混雜Th，它們已顯示在產生增強短的具有弱免疫原性的肽-十肽激素LHRH(US 5,759,551，和6,025,468)方面是有效的。
有效的Th表位長度大小約為15-40個胺基酸殘基，一般具有共同的結構特徵，而且可含有特異的標誌序列。例如，Th的共同特徵是包含兩性螺旋，具有疏水胺基酸殘基的α螺旋結構佔據螺旋的一面，而帶電荷的和極性殘基佔據外圍表面(Cease等.，Proc Natl Acad Sci USA，1987；844249-4253)。表位通常包含附加的一級胺基酸模式，如後面為2-3個疏水殘基的Gly或帶電荷的殘基，然後依次為帶電荷的或極性殘基。該模式被稱為Rothbard序列。Th表位一般遵守1，4，5，8規則，即帶正電荷的殘基在帶電荷的殘基後第4，5，和8位是疏水殘基。因為所有這些結構都是由共同的疏水性，帶電荷和極性胺基酸組成，在單個Th表位中可同時存在每種結構(Partidos等.，J Gen Virol，1991；721293)。多數情況下，如果不是所有，混雜的T細胞表位符合上述的至少一個周期。這些特徵可以結合到設計理想的人工Th位點中，包括組合的Th表位。關於設計組合的Th位點，對於MHC結合基序而言可變的位點以及優選的胺基酸的列表是可獲得的(Meister等.，Vaccine，1995；13581-591)。另外，對於稱為結構合成抗原文庫的組合庫肽，已公開了一種生產組合Th的方法(Wang等.，WO 95/11998)。因此，1，4，5，8規則可與已知的組合MHC結合基序一同應用以指定組合Th位點中的不變的和簡併的位點，和選擇適於簡併位點的殘基以極大地擴大人工Th的免疫應答的範圍。見WO 99/66957表2和WO 95/11998。
王等(US 5,759,551)建議使用免疫刺激元件來實現自身蛋白糊精的免疫原性。王等建議給藥具有免疫原性的合成糊精肽作為疫苗來治療非胰島素依賴的糖尿病(NIDDM)，該病是一種由糊精過量產生引起的澱粉樣(amyloidogenic)疾病(見US 5,759,551的19列，9-39行)。糊精是由胰島中的β細胞產生的37個胺基酸殘基的肽激素。糊精的過量產生將導致產生澱粉樣疾病的不溶性澱粉樣蛋白在胰腺中的沉積。類似於糊精的過量產生，Aβ1-42肽的過量產生將導致在AD患者腦中沉積不溶性澱粉樣蛋白。然而，糊精和Aβ1-42肽之間存在有限的序列同源性。糊精32-35的僅一段短序列的胺基酸殘基VGSN對應於Aβ24-27。考慮到Soloman等和Schenk等的研究，它們表明序列EFRH是至關重要的，所產生的抗糊精肽的抗體既不與可溶性Aβ1-42肽發生交叉反應，也不促進對腦中的澱粉樣蛋白斑進行清除。
本發明的目標是開發一種能夠產生抗Aβ1-42肽N末端功能位點並與AD患者腦中老年斑進行高度交叉反應的高水平高親和力抗體的免疫原。期待通過與Aβ1-42肽和老年斑結合產生的抗體加速從腦中清除這些斑塊，促進原纖維解聚，抑制原纖維聚集，和對「可溶性Aβ衍生的毒素」[也稱為Aβ衍生的擴散性配體或ADDLs]進行免疫中和。
本發明的另一個目標是開發一種適於人或牲畜的用於預防和治療阿爾茲海默氏病的疫苗遞送載體。
附圖簡述

圖1a，1b，1c，1d，1e和1f是顯示使用1∶100稀釋的免疫和免疫前血清，用抗生物素蛋白-生物素化的抗體複合物(ABC)方法，來自2個AD腦的連續切片的免疫過氧化物酶染色的照片，放大倍數為10X。圖1a和1d顯示抗體與硫磺素(thioflavine)S陽性血管(標記為″BV″)上老年斑和Aβ斑(均標記為″P″)均有很好的結合。抗體是用在ISA51油包水乳液中製備的Aβ1-28-εK-MVF Th1-16(SEQ ID NO74)在豚鼠中產生的。圖1b和1e所示的是針對CFA/ICFA中的相同肽免疫原產生的抗體的交叉反應。圖1c和1f所示的是使用免疫前血清的腦切片。
圖2a，2b，2c，2d和2e所示的是使用1∶100稀釋的免疫和免疫前血清AD腦的連續切片的免疫過氧化物酶染色的照片，放大倍數為40X。圖2a和2d所示的是抗體與形成核的斑(P)有強烈的染色反應，該抗體是用配製在ISA51油包水乳液中的Aβ1-28-εK-MVF Th1-16(SEQ ID NO74)在豚鼠中進行免疫而產生的。圖2b是利用CFA/ICFA製劑中相同的免疫原AD豬腦切片的染色模式的照片。抗血清主要與血管(BV)上的斑塊進行反應。圖2c是用免疫前血清的豚鼠腦切片的照片，顯示沒有染色。圖2e所示的是用Aβ1-28肽單獨在CFA/ICFA進行免疫所產生的高免疫血清所得到的腦切片，儘管ELISA中該血清與Aβ1-28強烈反應，但染色反應表現為令人驚訝的弱染色模式。
發明簡述本發明涉及一種包含合成肽的免疫組合物，該合成肽能夠誘導抗Aβ肽的主要功能/調控位點並與阿爾茲海默氏病(AD)患者腦中的可溶性Aβ1-42肽和斑塊具有高度交叉反應的抗體。當對AD患者或傾向於患AD的人給藥時，期望該免疫原性組合物促進腦中澱粉樣蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和，以預防和治療AD。特別是，本發明的肽免疫原包含連接到選自10-28個胺基酸殘基包含Aβ1-42肽的EFRH(SEQ IDNO65)的短N-末端Aβ1-42肽片段上或Aβ1-42肽片段的免疫功能類似物上的選自SEQ ID NOS1-64和它們的免疫功能類似物的Th表位。優選的Aβ1-42肽片段選自SEQ ID NOS66-69或它們的免疫功能類似物。
本發明還提供一種在藥用疫苗製劑中包含免疫有效量的肽組合物的免疫原性組合物，所述疫苗製劑包含佐劑或乳化劑，其選自liposyn，皂甙，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，Montanide ISA51，ISA35，ISA206和ISA 720以及其他有效的佐劑和乳化劑。
本發明還提供一種通過在足以誘導針對Aβ1-42肽的功能/調控位點的抗體的條件下，對哺乳動物給藥一種或多種免疫原性肽一段時間，來誘導腦中澱粉樣蛋白斑的加速清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和，以預防和治療哺乳動物的阿爾茲海默氏病的方法。本發明疫苗的一個典型實例是在疫苗中包含5-1000μg肽免疫原的肽組合物，所述疫苗在藥用佐劑和/或載體中被配製為油包水的乳劑。給藥疫苗的典型方法是在是0，4和8周間隔的免疫時間，以0.5-2mL每劑量肌肉注射疫苗製劑。
本發明的另一個方面涉及一種由輔助T細胞(Th)表位組成的約30-約60個胺基酸的免疫原性的合成肽，所述表位與每個片段包含Aβ1-42肽的胺基酸殘基1的選自10-28個胺基酸的N-末端Aβ1-42肽片段相連接。見SEQ ID NO65，其中D，天冬氨酸，被指定為胺基酸殘基1。優選地，N末端Aβ1-42肽片段選自SEQ ID NOs66-69或Aβ1-42肽N末端片段的肽類似物。任選地，可以包括分離免疫原性結構域的胺基酸間隔臂。如果基本上保留了肽半抗原的免疫反應性，或者產生對N末端Aβ肽片段、可溶性Aβ1-42肽和斑塊的免疫反應性，被間隔臂分離的免疫原性結構域元件可以以任何順序進行共價連接。
影響合成多肽對於N末端Aβ1-42片段免疫原的免疫原性的一個重要因素是通過T輔助細胞表位(Th)將其呈遞給免疫系統。通過對於靶Aβ肽而言是外源的、位於單獨的Th肽結構域元件上的外源Th表位，最可靠地將這種Th提供給肽免疫原。通過重組DNA表達來產生作為雜合多肽的這類肽免疫原。作為包含適於宿主的來自Aβ肽的靶半抗原B細胞位點和T輔助表位(Th)的合成肽免疫原，它們也可以被更簡單和更便宜地提供。除了抗體結合位點，這類肽與輔助T細胞受體和II類MHC分子反應(Babbitt等.，Nature，1985；317359)，從而刺激針對靶抗體結合位點的緊密的位點特異的抗體反應。以前通過對於聚集的全長Aβ肽而言固有的Th將這種Th提供給可用的Aβ1-42肽免疫原(WO 99/66957；WO1999/27944；Janus等.，2000，Morgan等.，2000)，也可由載體蛋白提供。全合成的肽免疫原與Aβ1-42肽聚集物，載體偶聯物和重組多肽相比，具有以下優點，因為為了容易控制質量，對產物進行化學定義。合成的肽免疫原是穩定的。不需要精細的下遊加工過程，也不需要精細的製造工具。免疫應答是位點特異的，並且集中在Aβ靶而不是載體。因此，避免了不利的應答如表位抑制。
合成的定位於Aβ肽免疫原的N末端功能位點的免疫原性可通過以下兩個方面進行優化(1)將N末端Aβ1-42肽片段與選擇的多數種群都有應答反應的外源混雜Th位點結合；(2)將Aβ肽片段與通過組合化學擴大了所有組成成分的Th結合，從而容納遺傳多樣的群體的變化的免疫反應性。
已發現，本發明的肽組合物在刺激產生抗Aβ肽主要功能/調控位點的抗體方面是有效的，所述抗體對AD患者腦中的可溶性Aβ1-42和斑塊具有交叉反應性。基於在豚鼠和狒狒中獲得的免疫原性數據，和獲自通過獲得的特異免疫血清對存在於人AD腦切片中的澱粉樣蛋白斑進行免疫過氧化物酶染色的數據，期待適當配製的本發明的肽免疫原對人體是有效的。值得注意的是從狒狒中獲得的數據特別有意義，因為該種屬的免疫應答與人的免疫應答十分相似。
發明詳述本發明涉及一種新型的肽組合物，用於產生對Aβ肽主要功能/調控位點特異的高滴度多克隆抗體，該抗體可與阿爾茲海默氏病(AD)患者腦中的可溶性Aβ1-42和斑塊具有交叉反應性。用該肽組合物產生的抗體是高度位點特異的，並與Aβ肽和腦中的澱粉樣蛋白斑結合。因此，本發明提供了一種用於促進腦中澱粉樣蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和從而預防和治療AD的有效方法。
選自10到28個胺基酸的N末端Aβ1-42肽片段，其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH(SEQ ID NO65)，它們是短的線性肽，其本身沒有免疫原性。該短的Aβ1-42肽片段可通過化學偶聯一個載體蛋白如鑰孔血藍蛋白(KLH)或通過重組DNA表達與載體多肽如B肝病毒表面抗原融合而被免疫強化。這類的「Aβ肽-載體蛋白」疫苗的缺點是所產生的抗體的主要部分是針對載體蛋白的非功能抗體。
本發明的免疫原是完全合成的肽免疫原，包含10到28個胺基酸的Aβ1-42肽N末端片段，每個片段包含共價連接到混雜Th表位的Aβ1-42肽的EFRH，所述表位選自SEQ ID NOs1到64。本發明的免疫原引發產生位點特異的，與Aβ1-42肽及其聚集物結合的，並與腦中澱粉樣蛋白斑有交叉反應的抗體，從而促進腦中澱粉樣蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和。因此，本發明的免疫原可用於預防和治療AD。
本發明中所用的輔助T細胞表位(Th)包含多個II類MHC結合基序。提供了共價連接到N末端Aβ1-42肽片段上的Th的具體實例。用本發明的免疫原肽免疫的動物的抗血清結果表明在遺傳上多樣的宿主群體中產生了有效的定位Aβ肽反應抗體。
一般來說，本發明的合成免疫原性肽大約為20-100個胺基酸長，並包含(i)選自SEQ ID Nos1到64的輔助T細胞(Th)表位；(ii)約10到約28個胺基酸殘基的Aβ1-42肽N末端片段，其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH；和(iii)任選地，由至少一個胺基酸組成的間隔臂以隔離免疫原性結構域。
優選地，Aβ1-42肽的N末端片段選自SEQ ID NOS66-69和其免疫有效類似物。Th肽共價連接在任選具有間隔臂(如Gly-Gly，ε-N Lys)的Aβ1-42肽的靶N末端片段的N-或C-末端。
本發明的肽免疫原由以下公式之一表示(A)n-(Aβ1-42肽的N末端片段)-(B)o-(Th)m-X；或(A)n-(Th)m-(B)o-(Aβ1-42肽的N末端片段)-X；其中每個A獨立是一種胺基酸；每個B是選自胺基酸，gly-gly，(α，ε-N)lys，Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO73)的連接序列；每個Th包含一個組成輔助T細胞表位的胺基酸序列或其免疫增強類似物或片段；(Aβ1-42肽的N末端片段)是一種合成的肽B細胞靶位點抗原，是約10到約28個胺基酸殘基的片段，其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH或其免疫功能類似物；X是胺基酸的α-COOH或α-CONH2；n是0到約10；m是1到約4；及o是0到約10。
本發明中的肽免疫原包含約20-約100個胺基酸殘基，優選地為約25-約60個胺基酸殘基。優選地，(Aβ1-42肽N末端片段)選自SEQ ID Nos66-69，並且優選Th表位選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。優選地，m＝1，n＝1，和o＝1或2。
當A代表一種胺基酸時，它可以是非天然存在的或天然存在的胺基酸。非天然存在的胺基酸包括，但不限於ε-N賴氨酸、β-丙氨酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥基脯氨酸，甲狀腺素，γ-氨基丁酸，高絲氨酸，瓜氨酸等。天然存在的胺基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、谷胺醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。當m大於1而且2個或多個A代表胺基酸時，那麼每個胺基酸可獨立地相同或不同。(A)n可以包括一個間隔臂，如Gly-Gly，ε-N Lys。
B是一個間隔臂，是一種如上所述的可天然存在的或非天然存在的胺基酸。每個B獨立相同或不同。B的胺基酸也可在混雜的Th表位和Aβ1-42肽N末端片段(如序列SEQ ID NOs66-69)或其免疫功能類似物之間提供一個間隔臂，如Gly-Gly，ε-Lys或賴氨酸。此外通過從B細胞表位，即Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能類似物，物理分離Th表位，，Gly-Gly或ε-Lys間隔臂可以打斷任何通過Th表位和Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能類似物連接而產生的人工二級結構，從而消除Th和/或B細胞應答的幹擾。B的胺基酸也可以形成一個間隔臂，其作為加強Th與Aβ1-42肽N末端片段之間分離的柔性鉸鏈。在免疫球蛋白重鏈鉸鏈區可發現編碼柔性鉸鏈的實例。柔性鉸鏈序列一般都富含脯氨酸。一個特別有用的鉸鏈序列由Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO77)提供，其中Xaa是任何胺基酸，優選天冬氨酸。B的胺基酸提供的構象隔離可使提呈的肽免疫原與適當的Th細胞和B細胞更有效地相互作用，從而加強對Th表位和抗體引發的表位或它們的免疫功能類似物的免疫應答。
Th是包含Th表位的胺基酸(天然或非天然胺基酸)序列。Th表位可以是連續或不連續的表位。在不連續的Th表位中，並非Th的每個胺基酸都是必須的。Th表位或其類似物或片段能夠加強或刺激對Aβ1-42肽N末端片段的免疫應答。免疫顯性和混雜的表位與具有廣泛趨異的MHC類型的動物和人種群發生高度和廣泛的交叉反應(Partidos等.，1991；美國5,759,551)。主題肽的Th表位有約10-約50個胺基酸，優選地約10到約30個胺基酸。當存在多個Th表位(即m≥2)時，每個Th表位可以相同或不同。Th片段包含足以加強或刺激對Aβ1-42肽N末端片段的免疫應答的Th表位的連續部分(contiguous portion)。
本發明的Th表位衍生自外源病原體的那些，包括但不限於列於表1的那些(SEQ ID Nos1-21)。另外，Th表位包括理想的人工Th和公開於WO 99/66957和列於此處表2的SEQ ID Nos 22-64的人工理想的組合Th。包含組合Th的肽是在一個單獨的固相肽合成中用Aβ1-42肽N末端片段，A和B來同時產生的。Th表位也包括其免疫功能類似物，只要基本不改變Th刺激功能，可對1-約10個胺基酸殘基進行保守的替代、添加、刪除和插入。
在本發明的合成肽中，Th表位通過間隔臂B共價連接到Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能類似物的N末端或C末端。只要可引發對Aβ1-42肽交叉反應的免疫應答，Aβ1-42肽N末端片段的免疫功能類似物可以包含從1到約4個胺基酸殘基的保守替代、添加、刪除或插入。保守替代、增加和插入可用上述的天然或非天然胺基酸來完成。
本發明優選的肽免疫原是那些包含選自SEQ ID NOs66-69的Aβ1-42肽片段的N末端片段或其免疫功能類似物；間隔臂(如Gly-Gly，ε-Lys)；Th表位，其選自HBsTh(SEQ ID NO1)；HBcTh(SEQ ID NO20)；MVF Th(SEQ ID NOS8，9)；PT Th(SEQ ID NOs4，5，7)；TT Th(SEQ ID NOs3，4，6)；CT Th(SEQ ID NOs12，21)；DT Th(SEQ ID NO13，14)，MVF Th衍生的人工Th，其選自SEQ ID Nos38-40，47-51；HBV Th衍生的人工Th，其選自SEQ ID NOS52-54。見表1和2。
包含帶有2個或多個Th表位的主題肽免疫原混合物的肽組合物可以在更廣泛的群體中增強免疫效率，因而提高對Aβ1-42肽及它們的片段的免疫應答。
本發明的肽免疫原可通過普通熟練技術人員所熟知的化學合成方法來製備。參見，例如Fields等合成肽(Synthetic Peptides)的第三章用戶指南(A User′s Guide)，Grant編輯，W.H.Freeman Co.，紐約，1992，77頁。因此，用t-Boc或F-moc化學保護α-NH2，利用側鏈被保護的胺基酸，在例如Applied Biosystems肽合成儀430A或431型上用自動化的Merrifield固相合成技術合成肽。製備包含Th表位組合庫肽的肽構建體可通過在給定的變異位點偶聯各種胺基酸混合物來完成。當所需的肽免疫原完全組裝後，根據標準程序對樹脂進行處理，以從樹脂上清除肽，並將胺基酸側鏈的功能基團解封閉。通過HPLC純化游離的肽，並進行生化表徵，如通過胺基酸分析或通過測序。肽的純化和表徵方法對本領域的普通技術人員是熟知。
本發明的免疫原也可以通過直接在分枝的多聚-賴氨醯核心樹脂上合成所需的肽構建體來製備成分枝的多聚物(Wang，等.，Science，1991；254285-288)。
備選地，更長的合成肽免疫原可通過眾所周知的重組DNA技術進行合成。在眾所周知的標準手冊中提供了這類技術的詳細方案。為了構建編碼本發明肽的基因，將胺基酸序列反翻譯以獲得編碼該胺基酸序列的核酸序列，優選用該基因將被表達的生物最偏愛的密碼子。然後，典型地通過合成編碼該肽和如果需要的任何調控元件的寡核苷酸來製備合成的基因。將合成的基因插入到合適的克隆載體上，並轉染宿主細胞。然後在適於選擇性表達系統和宿主的合適條件下將該肽進行表達。用標準方法純化和表徵肽。
本發明的肽組合物的效力可通過用包含本發明肽的免疫原性組合物注射動物，如豚鼠來確定。見表4，SEQ ID NOS70-75。對Aβ1-42肽N末端片段和可溶性Aβ1-42肽的體液免疫應答進行了監測。以下的實施例提供了所用流程的詳細描述。
本發明的另一個方面提供了在藥用遞送系統中包含免疫有效量的一個或多個本發明的肽免疫原的肽組合物。因此，利用藥用佐劑、載體或其它常規用於疫苗製備的成分，可將該主題肽組合物製備成疫苗。本發明中所應用的成分是佐劑或乳化劑，包括明礬、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)、多乙氧基醚、QS21、Montanide ISA51、ISA35、ISA206和ISA 720及其它有效的佐劑和乳化劑。組合物可以配製成瞬時釋放或持久釋放形式。組合物也可以配製來誘導系統免疫，如捕獲在微顆粒中或與微顆粒共同給藥。這類製劑對於本領域的普通技術人員而言是容易獲得的。
本發明的免疫原可通過任何常規途徑，如皮下、口腔、肌內、胃腸外或腸內途徑給藥。免疫原可以單劑量或多劑量進行給藥。合適的免疫方案對於推移本領域的普通技術人員而言容易確定和實現。
本發明的肽組合物包含有效量的一個或多個本發明的肽免疫原和藥用載體。這種合適的劑量單位形式的組合物每千克體重一般包含約0.25μg到500μg免疫原。當以多劑量遞送時，有效量可被方便地分為每一劑量單位。例如，起始劑量如每千克體重0.0025-0.5mg；優選每千克體重1-50μg的肽免疫原通過注射進行給藥，優選肌內注射，然後進行類似劑量的重複(激發)給藥。如在疫苗和治療領域所公認的，劑量依賴於患者的年齡、體重和一般健康狀況。
合成的Aβ1-42肽免疫原的免疫應答可通過捕獲在O』Hagan等所描述的類型(Vaccine，1991；9768-771)的可生物降解的微顆粒中或其上進行遞送來提高。可將免疫原密封於具有或不具有佐劑的可生物降解的微顆粒中以增強免疫應答，和為了持續或間歇應答和為了口服給藥提供控制時間的釋放(O』Hagan等.，1991；和，Eldridge等.，1991；28287-294)。
提供的下述實施例是用來闡明本發明。本發明的範圍並不限定為所提供的具體的肽免疫原和組合物。實施例闡明了本發明的肽免疫原對於早在最初免疫4周後引發針對Aβ1-10和Aβ1-14片段的定點抗體以及對可溶性Aβ1-42肽有交叉反應的抗體是有用的。
實施例1合成本發明Aβ肽免疫原的典型方法列於表4(SEQ ID NOS70-76)的肽免疫原是利用Fmoc化學在AppliedBiosystems自動肽合成儀(430，431和433A型)上用Merrifield固相合成技術單個合成的。包含組合庫Th即理想的人工Th位點如MvF衍生的Th1-8(SEQ ID NOs38-40)的肽免疫原的製備可通過在具體設計的特定位點提供化學偶聯的所需胺基酸混合物來完成。當完成所需肽的組裝後，用三氟乙酸根據標準程序處理樹脂以將肽從樹脂上清除下來，並對胺基酸側鏈的保護基團進行解封閉。清除下來的、提取並洗滌後的肽通過HPLC進行純化，並通過質譜和反向HPLC表徵。
實施例2評估本發明Aβ肽的免疫原性通過以下略述的實驗免疫方案和通過確定免疫原性的血清學試驗，按照說明在幾組豚鼠上評估Aβ衍生的肽免疫原。
標準實驗設計免疫原(1)單個肽免疫原；或(2)等摩爾肽免疫原混合物，按照每個實施例的說明。
劑量除非特別說明，每次免疫為0.5ml中100μg，。
途徑除非特別說明，肌內，佐劑除非特別說明，完全弗氏佐劑(CFA)/不完全佐劑(IFA)；或油包水乳劑。在CFA/IFA組中，第0周使用CFA，隨後的幾周使用IFA。
給藥時間表0、3、6周，或者特別說明。
採血時間表0、5、8周，或特別說明。
物種Duncan-Hartley豚鼠或特別說明試驗對每個免疫血清的抗肽活性進行特定的ELISAs檢測。固相底物為Aβ肽片段，如Aβ1-14或全長Aβ1-42(SEQ ID NOs67和65)，收集血液，加工成血清，並在用靶肽進行ELISA之前儲存。
用包被有作為免疫吸收劑的SEQ ID NOs67或65的Aβ1-42肽片段的96孔平底微滴定平板通過ELISA(酶聯免疫吸附測定)來檢測所引發的抗體抗Aβ肽及抗可溶性Aβ1-42肽的免疫反應性。等分的(100μL)濃度為5μg/mL的肽免疫原溶液在37℃溫育1小時。平板用3％明膠/PBS溶液37℃溫育1小時進行封閉。然後將封閉的平板乾燥並用於試驗。待測免疫血清最初在樣品稀釋緩衝液進行1∶100稀釋，隨後進行10倍系列稀釋，將等分的(100μL)的待測血清加到肽包被的平板上。平板在37℃溫育1小時。
平板用0.05％PBS/吐溫緩衝液洗滌6次。加入100μL適當稀釋在結合稀釋緩衝液(conjugate dilution buffer)(包含0.5M NaCl和正常羊血清的磷酸鹽緩衝液)中的辣根過氧化物酶標記的羊抗物種特異抗體。在如上述洗滌前，將平板在37℃溫育1小時。然後加入等分的(100μL)鄰-苯二胺底物溶液。顯色5-15分鐘後加入50μL 2N H2SO4中止酶的顯色反應。在平板讀數儀上讀取每個孔中內容物的A492nm值。根據吸收值的線性回歸分析對ELISA滴度進行計算，設定A492nm截斷值為0.5。稀釋的正常對照樣品的值小於0.15，因此嚴格選擇截斷值。
實施例3表徵Aβ1-42及其N末端片段相對免疫原性以優化基於定位Aβ1-42肽的合成疫苗的設計為了設計一個產生高水平高親和力抗Aβ肽並與AD患者腦中的可溶性Aβ1-42肽和斑塊高度交叉反應的抗體的完全合成的疫苗，首先表徵Aβ1-42及其N末端片段的相對免疫原性。在第一次研究中，為了測定Aβ1-42肽中各個區段的相對免疫性能，使用適於人使用的溫和佐劑—明礬。比較了Aβ1-42肽及其N末端片段，Aβ1-28的相對免疫原性。免疫原性的評估是根據實施例2描述的程序進行的。出人意料地是，Aβ1-28比Aβ1-42肽具有更強的免疫原性，這表明在C末端片段Aβ29-42中存在免疫抑制現象(表5)。
隨後，比較了Aβ1-28和Aβ1-42更短的N末端片段——Aβ1-14的免疫原性。為了配製疫苗，使用了適於人使用的更有效的佐劑(Montanide ISA51，Seppic，巴黎，法國)來製備油包水乳劑。基於列於表6中所獲得的數據，3個Aβ肽(即Aβ1-14，Aβ1-28和Aβ1-42)的相對免疫原性大小的順序是Aβ1-28＞Aβ1-42＞Aβ1-14。令人驚訝的是，丟失Aβ1-42C末端14mer使其免疫原性得到提高而不是降低。抗Aβ的抗體應答主要針對N末端區，特別是Aβ1-14N末端片段，如ELISA數據所示(表6)。然而，Aβ1-28片段從C末端的進一步縮短而形成的Aβ1-14片段降低了免疫原性。
如Solomor報導，短Aβ1-14片段包含主要的功能/調控位點，EFRH，位於Aβ1-42肽的3-6位。通過抗體封閉該表位可以調節聚集以及已形成聚集體的再增溶間的動態平衡(Soloman等.，Proc Natl Acad.Sci，1996；93452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；944109-4112)。多數抗Aβ1-28和Aβ1-42的抗體抗含該表位的Aβ1-42肽的N末端片段(表6)。然而，Aβ1-14片段本身具有弱免疫原性。該實驗結果表明在Aβ15-28片段中存在內源的Th表位。該內源Th表位解釋了在豚鼠中Aβ1-28和Aβ1-42肽的較低的免疫原性。
在Aβ15-28片段中存在Th表位是理想的。然而，當面對有限的人MHC分子、許多合適劑量和允許用於人的佐劑類型的有限的情況下，能夠產生更有效的免疫原作為能成功用於人的疫苗是理想的。因此，我們嘗試將一個外源或外部的Th如來源於HBV的Th(SEQ ID NO1)連接到Aβ1-28肽C末端(SEQ ID NO66)。外源Th表位顯著增強Aβ1-28片段的免疫原性，如表6所示。針對所構建的帶有Aβ1-28片段的免疫原的抗體應答仍保持針對肽免疫原(SEQ ID NO70)的功能N末端片段，使得該構建體比單獨的Aβ1-28片段或Aβ1-42片段是更好的免疫原。該肽免疫原(SEQ ID NO70)表示具有下述分子式的肽免疫原(A)n(Aβ肽N末端片段)-(B)o-(Th)m其中A是α-NH2，帶有是Aβ1-42N末端片段的Aβ1-28；B是甘氨酸；Th是來源於外源病原體HBsAg Th(SEQ ID NO1)的輔助T細胞表位，其中n為1，m為1，o為2。
實施例4AβN末端片段的下限以為了開發針對AD的基於Aβ的合成疫苗由於包含EFRH殘基的主要功能/調控位點位於Aβ1-42肽的3-6位(Soloman等.Proc Natl Acad.Sci，1996；93452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；944109-4112)，所以它對於研究作為Aβ上的最佳的B細胞靶位點的Aβ1-42肽的最短N-末端片段以整合到本發明的合成免疫原中是有用的。
將幾個短的無免疫原性的AβN末端片段，Aβ1-10、Aβ1-12、Aβ1-14和Aβ1-28每一個整合到用典型的理想人工Th(SEQ ID NO51)所設計的免疫原中。通過εN-Lys間隔臂進行連接。由於預計短的Aβ片段的免疫原性低，所以將涉及的構建與強佐劑一起配製。將3個合成的構建體配製在完全和不完全弗氏佐劑中，並基於實施例2中所述的程序檢測其免疫原性。如表7所示，所有4個肽免疫原具有高度免疫原性，ELISA Log10滴度從4.3到5.6[即104.3到105.6]，且在初次免疫僅四周後就對全長Aβ1-42肽具有非常高的交叉反應性。更重要的是，發現每個連接到理想人工Th(SEQ ID NO51)上的與Aβ1-10，Aβ1-12和Aβ1-14一樣小的片段在與公開的人工Th表位連接後具有高免疫原性(表7)。這些肽免疫原設計為符合以下公式
(A)n-(Aβ肽N末端片段)-(B)o-(Th)m其中A是αNH2，其中N末端片段是Aβ1-10，Aβ1-12，Aβ1-14或Aβ1-28；B是ε-N賴氨酸，一個間隔臂，通過其ε-氨基基團與下一個胺基酸連接；Th是來源於理想人工Th，MVF Th1-16(SEQ ID NO51)的輔助T細胞表位，其中n為1，m為1，o為1。
發現進一步縮短AβN末端片段的長度至少於10mer時，將導致更有限的因此不理想的免疫原性。似乎小於10個胺基酸的肽對於II類MHC分子的受體識別是有問題的(Immunology，第五版，Roitt等.，編輯，1998，Mosby International Ltd.，倫敦，88-89頁)。
基於Aβ的研究，有用的來源於Aβ1-42的B細胞位點的長度為約10-約28個殘基。
實施例5連接在人工Th表位上的合成肽免疫原靶向的定點免疫反應性將Aβ肽的無免疫原性的N末端片段如Aβ1-14通過εN-賴氨酸間隔臂連接到命名為MVF Th 1-16(SEQ ID NO51)的人工Th肽上，或通過標準化學偶聯程序連接到常規的載體蛋白KLH上。根據實施例2中所述的程序，在豚鼠中評估兩個免疫原性的構建體對Aβ肽的相對「定位」免疫原性和得到的抗體對其各自載體，人工Th表位或KLH載體蛋白的各自反應活性。單獨短的Aβ1-14肽作為對照免疫原，將兩個具有免疫原性的構建體在包含佐劑ISA51的油包水乳劑—適於人用的製劑中配製。如表8所示，如同所預料的，N末端Aβ1-14片段本身無免疫原性。發現合成的包含Aβ1-14片段和人工Th(SEQ ID NO73)的免疫原具有高免疫原性，引發抗Aβ1-14的定點抗體。也發現早在初次免疫後4周，抗體對可溶性Aβ1-42肽高度交叉反應(初次免疫後4周和6周的Log10滴度分別為4.094和4.126)。當用MVF Th1-16(SEQ ID NO 51)包被的平板通過ELISA來檢測這些Aβ反應性的高滴度免疫血清時，發現它們都是陰性(初次免疫後4周和6周的Log10滴度分別為0.038和0.064)，這表明沒有無關抗體產生。如表8所示獲得的數據清楚地證實本發明的肽免疫原的高特異定位的性質。
發現具有載體蛋白KLH的免疫原對常規肽—載體蛋白偶聯物有高度免疫反應性(如初次免疫後4周和6周的Log10滴度分別為4.903和5.018)。然而，所引發的抗體對可溶性Aβ1-42肽僅有較弱的交叉反應(如初次免疫後4周和6周的Log10滴度分別為3.342和2.736)。大約比SEQ IDNO73小10X到100X倍。出乎意料的是，本發明的肽免疫原是高度定位和聚焦的。僅產生針對Aβ肽N末端片段的抗聚集和解聚位點，而不針對無關載體位點的在功能上重要的抗體。
實施例6評估Aβ肽免疫原對老年斑的交叉反應性用具有斑塊和纏結的Aβ患者的腦和包含澱粉樣蛋白斑的硫磺素S陽性血管(TSBV)來評估在豚鼠和狒狒中得到的抗Aβ肽免疫原的免疫血清對多聚老年斑的交叉反應性。通過利用抗生物素蛋白—生物素化的抗體複合物(ABC)方法的免疫過氧化物酶染色，或通過利用羅丹明偶聯的物種特異的抗IgG的Fab片段的免疫螢光染色來檢測斑塊和TSBV反應活性。所有豚鼠血清以1∶100稀釋度進行檢測，通過一些樣本來確定滴定終點。所有狒狒血清以1∶50稀釋度進行檢測。免疫和免疫前血清的評估根據Dr.Gaskin所述的規程溫和地進行(Gaskin等.，J.Exp Med.165245，1987)。
圖1中，在10X放大倍數下最初檢測了2個AD患者腦系列連續切片。切片(a)，(b)和(c)來源於AD腦1，(d)，(e)和(f)來源於AD腦2。從豚鼠中收集免疫前正常血清和初次免疫6周後的免疫血清，通過用免疫過氧化物酶染色對富含斑塊和神經纖維纏結(NFT)的AD顳皮層的恆溫箱切片進行染色來檢測。圖1a和1d載玻片所示的第一次研究中所用的免疫血清是從用在ISA51油包水乳劑中製備的Aβ1-28-εK-MvF Th1-16(SEQ IDNO74)免疫的動物中獲得的。結果表明在硫磺素S陽性血管(TSBV)上對老年斑和澱粉樣蛋白斑都有顯著的結合。圖1b和1d載玻片所示的是抗在CFA/ICFA中製備的等價免疫原產生的免疫血清的交叉反應性。出人意料地是，與用ISA51配製的疫苗所獲得的結果相反，觀察到抗CFA/ICFA疫苗產生的血清在血管(TSBV)中優先與Aβ1-28斑結合。這表明用ISA51配製的疫苗所引發的抗體與在CFA/ICFA中配製的疫苗所產生的抗體不同。而且，用根據本發明配製的疫苗所產生的抗體對腦組織中老年斑有期望的更高的交叉反應性。免疫前血清在相應的連續切片中沒有顯色反應，如圖1c和1f中載玻片所示。
圖2a到2e所示的是40X放大倍數下，用免疫前血清和免疫血清以1∶100稀釋度對AD腦1的系列連續切片進行免疫過氧化物酶染色的照片。從用在ISA51油包水乳劑中製備的Aβ1-28-εK-MVF Th 1-16(Seq ID NO74)免疫的動物中獲得的血清強烈地染色形成核圖案的斑塊，如圖2a和2d載玻片所示。此外，令人驚訝的是，用製備的抗相應CFA/ICFA製劑的免疫血清進行的染色提供了不同的染色圖案，如圖2b所示，因為主要在血管上與斑有反應性，而不與腦組織中的斑有反應性。免疫前血清不染色切片，如圖2c所示。用在CFA/ICFA中的單獨的Aβ1-42肽免疫產生的超免疫血清在切片中得到一個令人驚訝的弱染色圖案，如圖2e所示，儘管其在ELISA檢測中與Aβ1-28有強烈反應。
用實施例3、4和5中所述的各種疫苗製劑免疫豚鼠所獲得的11種混合(pooled)免疫血清和免疫前血清對AD腦組織進行了類似的免疫染色。這些血清也通過Aβ1-14ELISA評估其對功能位點的抗體反應性，並通過Aβ1-42ELISA評估對可溶性Aβ1-42的抗體反應性(表9)。一般來說，用待測血清進行的所有3次試驗是趨於平行的。如表9所示，通過ELISA檢測，免疫前血清和抗在ISA51油包水乳劑中單獨配製的短肽Aβ1-14產生的血清的抗肽活性低，並且忽略了對斑塊的交叉反應性。用在明礬和ISA51中單獨配製的Aβ1-28肽和在ISA51中配製的連接到KLH上的Aβ1-14接種動物所獲得的血清有適度的反應活性。然而，來自用本發明的合成的Aβ/Th免疫原免疫的動物的血清對功能Aβ1-14位點，可溶性Aβ，AD患者腦組織切片中的斑塊和TSBV產生顯著的定點反應性。因此，從這些研究所獲得的結果證實，包含Aβ1-42N末端片段，胺基酸為1-28到大約1-10，並連接到外源Th表位上的肽免疫原的優異的並且有用的免疫原性。而且，結果表明外源Th表位的存在可以將本發明的肽免疫原的免疫原性提高到一個令人驚訝的程度上。在適於人用的臨床上可接受的疫苗製劑中的本發明的肽免疫原產生對AD患者腦組織中的老年斑有交叉反應性的抗體。
實施例7典型Aβ肽疫苗在狒狒中的免疫反應性作為對AD的免疫治療效果的預報因子將在ISA51油包水乳劑中以25μg/0.5mL，100μg/0.5mL和400μg/0.5mL劑量水平配製的典型的合成免疫原Aβ1-28-ε-K-MvF Th1-16(SEQID NO74)在初次免疫後0、3和6周的時間提供給3隻狒狒Y299，X398和X1198。收集免疫前血清和初次免疫後(wpi)5和8周的血清。為了進行比較，第四隻狒狒X798以100μg/0.5mL劑量給藥在批准用於人的標準佐劑-明礬中配製的游離Aβ1-28和Aβ1-42肽的等摩爾混合物。免疫前血清作為陰性對照。
收集所有4隻免疫動物的血清，通過Aβ1-14ELISA評估其對功能位點的抗體反應活性，通過Aβ1-42ELISA評估其對可溶性Aβ1-42的反應活性(在0，5和8wpi收集血清)。通過實施例6中所述的免疫染色方法評估抗血清(僅8wpi)對老年斑和硫磺素S陽性血管中斑塊的交叉反應性。代替使用抗狒狒Ig，所用的抗體檢測物質是識別所有人同型體並與狒狒IgG有交叉反應的來源於抗人IgG的Fab片段。
所有3次試驗中代測血清也具有平行趨勢。如表10所示，免疫前血清呈陰性。用來源於用在明礬中配製的Aβ1-28和Aβ1-42接種的動物X798的血清發現適度的ELISA反應性。然而，該血清的反應活性在識別老年斑時很弱。相反，用來自用本發明的典型組合物(SEQ ID NO74)以用ISA51配製的100μg/0.5mL和400μg/0.5mL的劑量免疫的動物最初免疫後8周收集的血清發現對Aβ1-14功能位點、可溶性Aβ1-42及AD患者腦切片中的斑塊和TSBV的顯著定點反應活性。因此，從該狒狒研究中獲得的結果證實本發明的免疫原在適於人的疫苗製劑中的用途。由於狒狒中的免疫應答與人非常類似，與現有技術的肽疫苗相比，免疫原性的提高(對Aβ功能位點的特異抗體滴度提高10-100X倍)是非常有意義的。
類似地，包含2到3種本發明的合成免疫原的混合物可以以每劑量約25到1000μg配製成疫苗，以在遺傳上多樣的人群中引發功能抗Aβ1-14的抗體，從而預防和治療AD。由於在本發明的肽免疫原中存在混雜的Th表位，從而可進行廣泛MHC識別，因此期待在人中的廣泛免疫原性。
表1病原體衍生的混雜T輔助細胞表位(Th)
a美國5,759,551bFerrari等.，J Clin Invest，1991；88214cStagg等.，Immunology，1993；711
表2人工理想的Th和組合庫理想的人工Tha.MVF Th和Th表位衍生自
b.HbsAg Th，原型和衍生物
表3Aβ1-42肽和它的N-末端片段的胺基酸序列
表4
表5
表6
表7
表8
表9
a系列稀釋@1∶100
表10
序列表110王長怡120作為疫苗用於預防和治療阿爾茲海默氏病的免疫原性肽組合物1301151-416714009/865,2941412001-05-2516077170PatentIn version 3.1210121115212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)4001Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp1 5 10 15210221130212PRT213百日咳桿菌(Bordetella pertussis)4002Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala1 5 10 15Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr20 25 30210321117212PRT213破傷風桿菌(Clostridium tetani)4003Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
1 5 10 15Leu210421122212PRT213破傷風桿菌(Clostridium tetani)4004Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys1 5 10 15Val Ser Ala Ser His Leu20210521115212PRT213百日咳桿菌(Bordetella pertussis)4005Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu1 5 10 15210621127212PRT213破傷風桿菌(Clostridium tetani)4006Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu1 5 10 15Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys20 252107
21124212PRT213Pertusaria trachythallina4007Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala1 5 10 15Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu20210821115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)4008Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val1 5 10 15210921120212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)4009Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp1 5 10 15Thr Glu Ser Tyr202101021117212PRT213破傷風桿菌(Clostridium tetani)40010Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys1 5 10 15
Thr2101121116212PRT213破傷風桿菌(Clostridium tetani)40011Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val1 5 10 152101221125212PRT213沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)40012Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser20 252101321123212PRT213白喉(Diphtheria)40013Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15Ile Leu Pro Gly His Gly Cys202101421139
212PRT213白喉(Diphtheria)40014Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala1 5 10 15Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala20 25 30Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys352101521121212PRT213惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)40015Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe1 5 10 15Asn Val Val Asn Ser202101621117212PRT213曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)40016Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg1 5 10 15His2101721114
212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)40017Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly1 5 l02101821119212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)40018Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu1 5 10 15Asp Val Asn2101921120212PRT213大腸桿菌(Escherichia coli)40019Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys202102021120212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40020Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala1 5 10 15
Leu Tyr Arg Glu202102121112212PRT213沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)40021Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu1 5 102102221115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40022Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val1 5 10 152102321116212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40023Asp Leu Ser Asp Leu Lys Gly Leu Leu Leu His Lys Leu Asp Gly Leu1 5 10 152102421116212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40024Glu Ile Ser Glu Ile Arg Gly Ile Ile Ile His Arg Ile Glu Gly Ile1 5 10 15
2102521116212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40025Asp Val Ser Asp Val Lys Gly Val Val Val His Lys Val Asp Gly Val1 5 10 152102621116212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40026Asp Phe Ser Asp Phe Lys Gly Phe Phe Phe His Lys Phe Asp Gly Phe1 5 10 152102721115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40027Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile1 5 10 152102821115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40028Met Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr Met1 5 10 152102921115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)
40029Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly Val1 5 10 152103021115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40030Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile1 5 10 152103121115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40031Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr Ile1 5 10 152103221115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40032Met Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly Met1 5 10 152103321115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40033Leu Thr Glu Met Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr Val1 5 10 15
2103421115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40034Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile1 5 10 152103521115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40035Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr Ile1 5 10 152103621115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40036Met Ser Glu Met Lys Gly Val Ile Val His Lys Met Glu Gly Met1 5 10 152103721115212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40037Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr Val1 5 10 152103821119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)
40038Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly1 5 10 15Ile Leu Phe2103921119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40039Ile Ser Met Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr1 5 10 15Met Leu Phe2104021119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40040Ile Ser Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly1 5 10 15Val Leu Phe2104121119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40041Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly
l 5 10 15Ile Leu Phe2104221119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40042Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe2104321119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40043Ile Ser Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly1 5 10 15Met Leu Phe2104421119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40044Ile Ser Met Thr Glu Met Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr1 5 10 15Val Leu Phe
2104521119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40045Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr1 5 10 15Val Leu Phe2104621119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40046Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe2104721119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40047Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly1 5 10 15Ile Leu Phe21048
21119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40048Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe2104921119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40049Ile Ser Met Ser Glu Met Lys Gly Val Ile Val His Lys Met Glu Gly1 5 10 15Met Leu Phe2105021119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40050Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr1 5 10 15Val Leu Phe2105121119212PRT213麻疹病毒(Measles virus)
40051Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg I1e Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe2105221115212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40052Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp1 5 10 152105321118212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40053Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser1 5 10 15Leu Asp2105421114212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40054Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu1 5 102105521118
212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40055Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Gln Ser1 5 10 15Leu Asp2105621118212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40056Arg Arg Arg Ile Lys Ile Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10 15Ile Arg2l05721118212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40057Lys Lys Lys Val Arg Val Val Thr Lys Val Val Thr Val Pro Ile Ser1 5 10 15Val Asp2105821118212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40058
Lys Lys Lys Phe Phe Phe Phe Thr Lys Phe Phe Thr Phe Pro Val Ser1 5 10 15Phe Asp2105921118212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40059Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Phe Ser1 5 10 15Leu Asp2106021118212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40060Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr1 5 10 15Ile Asp2106121117212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40061Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr1 5 10 15
Ile2106221118212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40062Lys Lys Lys Met Met Thr Met Thr Arg Met Ile Thr Met Ile Thr Thr1 5 10 15Ile Asp2106321116212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40063Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu Leu Ala Ser Thr His Ile Leu1 5 10 152106421119212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40064Lys Lys Lys Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu Leu Ala Ser Thr1 5 10 15His Ile Leu2106521142212PRT
213人(Homo sapiens)40065Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 402106621128212PRT213人(Homo sapiens)40066Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 252106721114212PRT213人(Homo sapiens)40067Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His1 5 102106821112212PRT213人(Homo sapiens)40068
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val1 5 102106921110212PRT213人(Homo sapiens)40069Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5 102107021145212PRT213B肝病毒(Hepatitis B virus)40070Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Gly Phe Phe20 25 30Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp35 40 452107121130212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40071Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Lys Ile Ser Ile Thr Glu1 5 10 15Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe20 25 30
2107221132212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40072Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Lys Ile Ser Ile1 5 10 15Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe20 25 302107321134212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40073Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gh Val His His Lys Ile1 5 10 15Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile20 25 30Leu Phe2107421148212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40074Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Lys Ile Ser Ile20 25 30
Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe35 40 452107521134212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40075Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Ile1 5 10 15Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile20 25 30Leu Phe2107621134212PRT213麻疹病毒(Measles virus)40076Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Ilel 5 10 15Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr Ile20 25 30Leu Phe210772116212PRT213人工220
223合成的肽接頭
220
221MISC_FEATURE222(3)..(3)223X＝任何胺基酸220
221MISC_FEATURE222(5)..(5)223X＝任何胺基酸40077Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro1 權利要求
1.一種長約20-100個胺基酸的肽免疫原，包含(i)一種選自SEQ ID Nos1-64的輔助T細胞(Th)表位；(ii)一個Aβ1-42肽N末端片段，SEQ ID NO65，由10-28個胺基酸殘基組成，其中每個片段包含Aβ1-42肽或Aβ1-42肽N末端片段的免疫功能類似物的胺基酸殘基1；和(iii)任選地，一個由至少一種胺基酸組成的間隔臂以隔離免疫結構域。
2.權利要求1的肽免疫原，其中所述間隔臂選自一種胺基酸，Gly-Gly，(α，ε-N)-Lys和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO73)。
3.權利要求2的肽免疫原，其中所述間隔臂是Gly-Gly。
4.權利要求2的肽免疫原，其中所述間隔臂是ε-N-Lys。
5.權利要求1的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N末端片段選自SEQ IDNOs66-69和其免疫功能類似物。
6.權利要求2，3或4任一項的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N末端片段選自SEQ ID NOs66-69和其免疫功能類似物。
7.權利要求1的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
8.權利要求2，3或4任一項的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
9.一種選自SEQ ID NOs70，71，72，73和74的肽免疫原。
10.權利要求9的肽免疫原，包含SEQ ID NO73。
11.權利要求9的肽免疫原，包含SEQ ID NO74。
12.由下述公式之一表示的肽免疫原(A)n-(Aβ1-42肽的N-末端片段)-(B)o-(Th)m-X；或(A)n-(Th)m-(B)o-(Aβ1-42肽的N-末端片段)-X；其中每個A獨立是一種胺基酸；每個B選自一種胺基酸，gly-gly，(α，ε-N)-lys，和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO73)的連接序列；Th包含一種組成輔助T細胞表位的胺基酸序列，選自SEQ ID NOs1-64和其免疫增強類似物；(Aβ1-42肽的N-末端片段)是10-約28個胺基酸殘基，並且其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH和其免疫功能類似物；X是一種胺基酸的α-COOH或α-CONH2；n是0-約10；m是1-約4；和o是0-約10。
13.權利要求12的肽免疫原，其中所述間隔臂是Gly-Gly。
14.權利要求12的肽免疫原，其中所述間隔臂是ε-N-Lys。
15.權利要求12的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N-末端片段選自SEQ IDNOs66-69和其免疫有效類似物。
16.權利要求13或14任一項的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N-末端片段選自SEQ ID NOs66-69和其免疫功能類似物。
1 7.權利要求12的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
18.權利要求13或14任一項的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
19.權利要求15的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
20.權利要求16的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
21.一種包含權利要求1的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
22.一種包含權利要求2的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
23.一種包含權利要求3的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
24.一種包含權利要求4的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA 720。
25.一種包含權利要求5的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
26.一種包含權利要求6的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
27.一種包含權利要求7的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
28.一種包含權利要求8的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
29.一種包含權利要求9的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
30.一種包含權利要求10的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
31.一種包含權利要求11的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
32.一種包含權利要求12的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
33.一種包含權利要求13的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
34.一種包含權利要求14的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
35.一種包含權利要求15的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
36.一種包含權利要求16的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
37.一種包含權利要求17的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
38.一種包含權利要求18的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
39.一種包含權利要求19的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
40.一種包含權利要求20的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
41.一種通過對哺乳動物給藥權利要求21的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
42.一種通過對哺乳動物給藥權利要求22的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
43.一種通過對哺乳動物給藥權利要求23的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
44.一種通過對哺乳動物給藥權利要求24的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
45.一種通過對哺乳動物給藥權利要求25的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
46.一種通過對哺乳動物給藥權利要求26的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
47.一種通過對哺乳動物給藥權利要求27的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
48.一種通過對哺乳動物給藥權利要求28的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
49.一種通過對哺乳動物給藥權利要求29的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
50.一種通過對哺乳動物給藥權利要求30的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
51.一種通過對哺乳動物給藥權利要求31的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
52.一種通過對哺乳動物給藥權利要求32的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
53.一種通過對哺乳動物給藥權利要求33的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
54.一種通過對哺乳動物給藥權利要求34的組合物來預防阿爾茲海默氏病的方法。
55.一種通過對哺乳動物給藥權利要求35的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
56.一種通過對哺乳動物給藥權利要求36的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
57.一種通過對哺乳動物給藥權利要求37的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
58.一種通過對哺乳動物給藥權利要求38的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
59.一種通過對哺乳動物給藥權利要求39的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
60.一種通過對哺乳動物給藥權利要求40的組合物來預防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
61.一種通過給藥權利要求21的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
62.一種通過給藥權利要求22的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
63.一種通過給藥權利要求23的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
64.一種通過給藥權利要求24的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
65.一種通過給藥權利要求25的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
66.一種通過給藥權利要求26的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
67.一種通過給藥權利要求27的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
68.一種通過給藥權利要求28的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
69.一種通過給藥權利要求29的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
70.一種通過給藥權利要求30的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
71.一種通過給藥權利要求31的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
72.一種通過給藥權利要求32的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
73.一種通過給藥權利要求33的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
74.一種通過給藥權利要求34的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
75.一種通過給藥權利要求35的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
76.一種通過給藥權利要求36的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
77.一種通過給藥權利要求37的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
78.一種通過給藥權利要求38的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
79.一種通過給藥權利要求39的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
80.一種通過給藥權利要求40的組合物生產抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那裡形成的腦組織斑交叉反應。
全文摘要
本發明涉及一種組合物，其包含用於預防和治療阿爾茲海默氏病的肽免疫原。更具體地，該肽免疫原包含一個主要的功能/調控位點，與具有多個II類MHC結合基序的輔助T細胞表位(Th)連接的澱粉樣蛋白β(Aβ)肽的N－末端片段。該肽免疫原引發抗Aβ肽的主要功能/調控位點的定點免疫反應並產生抗體，所述抗體與阿爾茲海默氏病患者腦中形成的可溶性Aβ
文檔編號C07K7/06GK1568329SQ02810621
公開日2005年1月19日 申請日期2002年4月2日 優先權日2001年5月25日
發明者王長怡 申請人:美國聯合生物醫學公司