有生物活性的蛋白質與其生產的方法

2023-07-26 21:14:41 1

專利名稱:有生物活性的蛋白質與其生產的方法
本發明一種在原核生物裡表達異源PNA順序(例如真核生物基因)的方法。在其中一個重要的實施例中，本發明指出了在原核生物裡生產具有一個N端為丙氨酸多肽以及用本方法能夠生產各種N端為丙氨醯的多肽。也包括能增加牛奶產量大到出人意料程度的一類纈氨酸bGH(牛生長激素)品種。
由真核生物和原核生物表達基因，在基因轉錄至信使RNA(mRNA)以及隨之又把這種mRNA轉譯成蛋白質中都具有相同的基本步驟時，則要應用細胞內的不同組合以控制這些步驟。
此外，在真核生物裡，許多成熟的蛋白質首先被轉譯成為前一蛋白質;即含有與引導順序或信號順序融合的成熟蛋白質順序的多肽。真核生物的信使RNA(mRNA)編碼整套前一蛋白質，它們在轉譯後被加工除去引導順序以後才成為這種成熟蛋白質的。真核生物細胞裝備有把這樣前一蛋白質轉變為成熟蛋白質的特異加工機制，原核生物的細胞一般不能識別存在於真核生物的蛋白質裡的這種加工處理信號。因此，如果真核生物信使RNA(mRNA)的完整互補DNA(cDNA)轉錄物被用作DNA順序在原核生物裡來表達，那就只發現前一蛋白質而無成熟蛋白質。前一蛋白質在體外轉變為成熟蛋白質是有可能的，但不能沒有重要的代價。
在編碼成熟蛋白質的DNA順序在原核生物裡用作成熟蛋白質表達的過程中，這一順序將是沒有真核的轉譯作用和通常包含在作引導順序DNA裡的轉譯後加工信號。因此，基於效能以及由於原核生物的宿主細胞也許不能識別真核生物的信號，現已證實，要在原核生物系統裡表達所克隆的真核基團或其它異源DNA順序。最理想的是應用原核生物控制訊號。
「異源DNA」一詞在此定義為核DNA至少其有一部分序列不是正常地包含在宿主細胞的染色體組內。異源DNA的實例包括，病毒及真核基因，基因此段，等位基因以及合成的DNA順序但不局限這些。「異源蛋白質」或「異源多肽」一詞在此定義為一種蛋白質或多肽，其中至少有一部分胺基酸順序不是正常地將其密碼編在宿主細胞的染色體組裡。
原核生物的控制訊號包括一啟動子，它引發轉錄啟始和轉譯控制訊號包括核糖體結合位點，轉譯啟動以及轉譯停止。除了轉譯停止信號外，所有這些訊號都必須位於真核基因或其它待表達DNA的前面。
技術界已採用一些方法在原核生物裡去表達異源DNA(即真核基因)。其中一個方法是，把編碼終產物蛋白的DNA片段與受細菌啟動子操縱編碼細菌的全部或一部分蛋白的DNA相連接。這種內生的原核DNA也需要有核糖體結合位點及轉譯啟動訊號。這樣連接的DNA的表達結果產生一種所謂融合蛋白，它由真核多肽與整個細菌蛋白或部分細菌蛋白組成，這種真核生物的蛋白質的分離就可以用位點特異酶的或化學的方法在內源的一一真核生物的蛋白質融合點上裂解而完成，或用原核生物對多肽順序的選擇降解而實現。
在細菌中，與生產真核生物蛋白融合的蛋白質，有關的出版物包括全歐專利申請47.600(1982，3，17出版)它涉及融合蛋白與非融合蛋白包括，牛前一一生長激素或牛生長激素，在其羧基端(C-)上帶有或在氨基端(-N)沒有。原核生物蛋白質部分的。大英國協專利申請GB2，073，245A(1981，10，14出版)論及bGH與大腸桿菌E，coliβ-乳醯胺酶(β-Lactamase)的融合蛋白質;E.Keshet等人，核酸研究，(Nucleic Acid Research)9∶19-30(1981)論及牛生長激素(bGH)與大腸桿菌β-乳醯胺酶的融合蛋白質;全歐專利申請95，361(1983，11，30出版)論及融合蛋白質包括依次為，在N基端的內源蛋白質，轉譯起動信號胺基酸，腸激酶切割優點以及羧基端(C-)上的外源蛋白質(即生長激素)。然而，這些融合蛋白質的方法都是繁瑣的，其間在純化之後還需要進行體外加工處理，而且達到商品化所需酶的成本過高。
不過，由於融合的產物似乎能保護終產物異源蛋白質免受細胞內的降解，因此已成為在原核生物細胞中表達某些真核基因或其它異源DNA的一種有吸引力的系統。細菌細胞似乎能識別出在其處產生的某些真核蛋白質是外來的，因而，在這些蛋白質合成時或剛合成後就儘快地使之降解。為保護目的而設計的融合蛋白質應用內源多肽順序放在異源蛋白質的氨基端或羧基端。後者方法的例子見於歐州專利申請111，814(1984，6，27出版)其中論及融合蛋白質、包括一種具有一合成的前一端(氨基端)以及在羧基端(C-)上有一大腸桿菌(E，coli)β-半乳糖苷酶(β-galactosida-se)形式的牛生長激素bHG。它的優越性仍然由於象前面討論過那樣需要最後從內生多肽切割異源蛋白而受貶。
在另一方法裡，轉譯啟動訊號，ATG，受細菌啟動子操縱之下，被直接連於編碼異源蛋白質(即真核的蛋白質)的DNA順序之前，該所產生的異源蛋白質在其氨基端(N-)及羧基端(C-)都沒有內源蛋白質。雖然由這樣構建的基因所產生的蛋白質不需要最後切割來產生期望獲得的蛋白質，它們典型的在N端上總會有蛋氨酸(某些情況下是甲醯蛋氨酸)，因為ATG啟動訊號本身也是蛋氨酸密碼子。因此，除非所期望的成熟蛋白質以一蛋氨酸開始否則這種蛋白質將一在氨基端(N-)被包含有蛋氨酸殘基在內的基團取代。
這樣基團結構的例子包括Guarente等人，細胞(Cell)(1980)20∶543-553其中具有N基端為纈氨酸的家兔β-球蛋白基因(β-globin gene)是應用剛敘述的基因結構在大腸桿菌(E.coli)裡表達的。研究者發現，有鑑於「在家兔β-球蛋白裡沒有氨基端的蛋氨酸，且發現亮氨酸位於3，14，28，31，32……位上。而在標記的蛋白質裡則發現亮氨酸在4，15，29，32和33位上，還發現有一蛋氨酸在1位上。這一結果表明，該蛋白質是家兔β-球蛋白加上一個在大腸桿菌上未除去的氨基端的蛋氨酸。同上文獻的546-547。
另一例子是與應用上述基因結構在細菌裡生產生長激素有關。Schoner等人Proc.Natl Acad，Scie U.S.A(1984)81∶5403-5407敘述了在細菌裡生產牛生長激素(bGH)一種高水平的表達系統。它導至產生出一種N-甲硫氨醯bGH;它是一種胺基酸順序與天然存在的牛生長激素品種相似。在其N端加有蛋氨酸的化合物在細菌裡生產在N端加蛋氨酸到各種生長激素品種裡去又被再一次在全歐專利申請103，395(1984，3，21出版)裡討論，而全歐專利申請75，444(1983，3，30出版)論述了bGH和Seeburg etal，在DNA(1983)2∶27-45論述了bGH及豬的生長激素(「PGH」)。
把一個N端蛋氨酸加到天然蛋白的N端去由於多種原因也許是不太理想的。首先，在一種有機體裡，它的內源蛋白質沒有為N一端蛋氨酸的，這種蛋氨酸就有可能會趨向於造成該蛋白質呈抗原。其次，把蛋氨酸加到蛋白質的N端部分對它的生物活性及它的物理學特性會有非所期望的影響。其三，蛋白質的這種改變形式會阻礙在測定天然蛋白質結構與功能相互關係上的科學嘗試。再者，一種生物合成的蛋白質，使其結構儘可能地與天然的接近這對在請求政府批准醫藥的或獸醫的申請時也許是有利的。
象細菌一樣的原核生物，無論蛋白質正在產生或產生之後，從蛋白質上除去N端蛋氨酸的能力，一直是相當有趣的課題。例如，Waller，J，Mol.Biol.(1963)7∶483-496考查了「可除的「N-端胺基酸成分，以及從無細胞的大腸桿菌E.coli抽提液得到的核糖體蛋白，以及全歐專利申請103，395(1984，3，21出版)公開了從大腸桿菌E，coli產生的真核蛋白質去除N端蛋氨酸。特別的是，蛋氨酸從二個在細菌上生產的牛生長激素的一個上除去，該二個牛生長激素都會有絲氨酸殘基緊接的是原先就存在的N端蛋氨酸。然而在這些研究裡應用的基因結構包含有合成的編碼5′-蛋氨酸-絲氨酸-亮氨酸-3′的啟動順序，它直接地插至緊接在牛生長激素編碼順序的5′端，在這bGH編碼順序裡編碼前面4個或9個天然存在的胺基酸的鹼基已被刪去。因此，在大腸桿菌裡產生的終產物蛋白質是一種非天然存在的蛋白質。大英國協專利申請2，073，245A(1981，10，4出版)公開在成熟的bGH蛋白質裡的丙氨酸被蛋氨酸、脯氨酸取代時，「蛋氨酸就能被細菌加工而成為用脯氨酸(Pro)，苯丙氨酸(Phe)，丙氨酸(Ala)脯氨酸(Pro)為一胺基酸順序開始的修飾過的牛生長激素(bGH)。
因此，需要發展一種既經濟而有預見性的在諸為細菌樣的微生物裡生產不帶N基端蛋氨酸的異源(即真核生物的)蛋白質的方法。明確的說，人們特別希望發展一種方法，依靠它可以在細菌裡生產這類蛋白質而不需要在體外進行發酵後加工處理，而且它不含有外加的非天然存在的N-端蛋氨酸。
生長激素(又稱somatotropins)是由垂體細胞產生或分泌的多肽，大多數具有專一的活性。它的作用除了促進骨骼生長外，還可對包括激發泌乳增加從胰腺釋放胰島素和增加糖源分泌等代謝過程的變異型發生影響，而且它們還起脂類調動的作用。例如，給牛施用外源生長激素(bGH)證明可增加產奶量，飼養率和/或生長率，可降低肥育時間和增加瘦肉比率。然而，還沒有完全弄清這種激素是怎樣起到這麼多效應的。
涉及人類生長激素(hGH)的工作已開始。例如人類垂體腺所分泌激素不是一個單一分子的實體而是多肽的混合物。不同類型的人類生長激素hGH的分級分離導至製成某些既不致糖尿病也不起脂解作用的人類生長激素(hGH)片斷。
同樣地，牛生長激素bGH是有多種類型在牛中產生的。明確地說，產生了四種類型的bGH，它們的差異是在蛋白質的兩個位點上。由於在訊號肽(引導)順序的除去上可能出現錯誤，所以N端胺基酸就會不同，因此成熟蛋白質就會用NH2-phe-pro開頭，或者用NH2-aLa-phe-pro開頭。此外，在胺基酸126位處有一變異性或是亮氨酸或是纈氨酸，這是顯然由於存在於牛種群裡的一個等位基因的變異而引起的。Wallis(1969)FEBS Latters 3;118-120;Fellows和Rogol(1969)J.Biol.Chem.244∶1567-1575;Fernandez等人(1971)PEBS Letters 18∶53-54，Fellows(1973)在Recent Progress in Hormon Research 29∶404的個人評述;Santome(1973)Eur.J.B′rochem.37∶164-170;Grat和Li(1974)Biochem.Biophyc.Res.Comm.56∶16 8-176.垂體bGH的4種分子型式(種)命名並縮寫如下Abbr.縮寫 結構bGH(L) NH2-phe(1)-pro(2)…Leu(126)…COOHbGH(A，L) NH2-ala(-1)-phe(1)-pro(2)…Leu(126)…COOHbGH(V) NH2-phe(1)-pro(2)…Val(126)…COOHbGH(A，V) NH2-ala(-1)-phe(1)-pro(2)…Val(126)…COOHbGH(A，V)和bGH(V)品種這裡有時合稱「纈氨酸等位的bGH品種」或「纈氨酸品種」。同樣，bGH(A，L)和bGH(L)品種這裡有時合稱「亮氨酸等位bGH品種」或「亮氨酸bGH品種」。在bGH蛋白中縮寫如上的胺基酸旁邊的號碼，只是為了鑑定和參照的目的。
Mills等人(1970)J.Biol.Chem，245∶3407-3415，在各個N端顯出不均一性的豬生長激素pGH同樣地鑑定出兩種溴化氰源Cyanogen bro mide能切的片段。確切地說，其中一個片段含有-N端苯丙氨酸而另一個有額外的N端丙氨酸。豬生長激素(pGH)的這些分子型式在此分別地縮寫為pGH(p)和pGH(A)。
全部DNA編碼順序以及與bGH(L)及pGH(p)的對應胺基酸順序已由Seebvrg等人在DNA(1983)2∶37-45上發表。在此它被編入參考文獻。
已發現單個牛的垂體細胞通常都至少含有bGH(A.L)和bGH(L)的混合物或bGH(A.V)和bGH(V)的混合物。
在培養的腦垂體細胞中所產生bGH蛋白的N端分析說明近50∶50分子混合物中含有N-端苯丙氨酸(Phe)或N-端丙氨酸(ala)從許多牛的垂體製成的在商業上有用的製劑通常包含有全部4種分子型的垂體牛生長激素。bGH而且，已有報告從腺體中收集得到的bGH製品中大約30%在126位胺基酸的亮氨酸已由纈氨酸代替(Ferandez等)(1971)FEBS Letters 18∶53-54用來分離已知4種bGH型的標準生化方法不容許按商業規模生產當中的每一品種或任一種類型。這些牛生長激素bGH的4種類型的不同生物活性將會被充分研究並用基本上沒有其它三種型中一種或多種以及/或其他牛源蛋白方法製成這類型中一種有商業效益的類型在這裡應用「基本上純的」術語是指基本上沒有在自然環境中或來源中與其結合的蛋白或其他物質。為了那些及其它目的，本發明的目標包括發明一種方法，藉助它至少能夠方便地生產那些牛生長激素單一型中的一些型。
據此，本發明的一個目的是在原核生物裡生產真核的或其它異源的不具N端蛋氨酸殘基的多肽。
本發明的另一目的是在原核生物裡生產真核的或其它異源的多肽，它是不需要在體外進行加工來除去其N端的蛋氨酸。
本發明還有另一目的是提供一種方法以便在原核生物裡生產真核的或其它異源的多肽它不需在體外進行加工就具有一N端丙氨酸。
本發明的一目的是在原核生物裡生產真核的或其它異源的多肽，它具有的胺基酸順序基本上與沒有N端蛋氨酸的天然存在的蛋白質相同。
本發明更深遠的目的是提供一種在原核生物裡生產多肽的方法，該多肽具有在成熟真核多肽裡例如在bGH(A.L)bGH(A.V)及pGH(A)中發現的胺基酸順序。
本發明還有另外一個更深遠的目的是提供實際上各自地不含牛或豬來的蛋白質的bGH(A、L)bGH(A.V)或PGH(A)，本發明還有一個深近的目的是提供一類能在奶牛中增加牛奶產量到很有用的程度的bGH品種。用本發明的方法生產的bGH多肽提供了一潛在的象增加產奶量、生長率以及/或者飼養率那樣的生長激素活性的手段。
本發明的這些或其它的目的將會從本發明隨後的一般的和詳細的說明而更加明白。
在一個實施方案中，本發明的目的是通過用細菌生產一種具有N端為丙氨酸能在所選擇的細菌裡促使染色體組DNA表達的異源多肽的方法而達到的。所說的DNA含有鄰接蛋氨酸的一個約到三個密碼子包括轉譯啟動訊號，緊接的是所說多肽的密碼子，後面接著的是轉譯停止信號密碼子，而且還回收在上述細菌內產生具有N端丙氨酸的終產物的異源多肽。
在另一實施例中，本發明提供了一種生產具有包含在所選擇過的細菌裡促使染色體組DNA表達的N端丙氨酸的異源多肽的方法，所說的DNA包含有轉譯啟始訊號/蛋氨酸密碼子，其後接有所說的多肽密碼子，接著為轉譯停止信號密碼子，而且回收在所說細菌內所產生的具有N端丙氨酸的終產物一異源多肽。
仍是在另一實施例中，本發明提供出一種在細菌裡製備胺基酸順序基本上與天然存在的真核多肽相同的異源多肽的方法。
在另一實施例中，本發明可提供包括象bGH(A.L)，bGH(A.V)，PGH(A)這樣的生長激素以及bGH(A、L、)和bGH(A.V)的混合物中各種組分，它們實際上各自沒有牛源或豬源的或其它生長激素品種的多肽。
仍是在另一個實施例中發現含有纈氨酸一類bGH品種的生化物其在奶牛中增加牛奶產量的程度比其他相同的亮氨酸bGH品種或bGH(A，L)都大。在一個較好的實施例中能達到這樣程度的增加牛奶產量的生化物基本上是所提供的純纈氨酸bGH品種。其它的實施例包括各種基因，DNA運載體和在前述方法上有用的轉化過的細菌，以及利用前述的組分以增加牛以及/或豬泌乳，成年前生長，以及/或飼養轉化率的某些方法。
在下列圖示裡，鑲線框代表細菌啟動子的編碼順序，黑框表示異源DNA編碼順序，線條表示附加的如所標明的DNA編碼順序，而定向箭頭表示從5′到3′的DNA編碼順序方位。有關的限制性核酸酶內切位點亦表示出。這樣標出的DNA區段只為圖解示意的目的而不是按比例尺繪製的。
圖1.M13mp 8/xbaⅠ的構建圖包含在SmaⅠ切點上插入一個xbaⅠ酶切片段的MBmp8運載體。
圖2.M13 mp 8/BGH ex-1的構建圖，包括帶有bGH(L)DNA編碼順序的M13 mp 8/xbaT圖3.以寡聚核苷酸導致一特異位點一誘發生成的bRH(A.L)DNA編碼順序的創造。
圖4.以寡聚核苷酸導致特異位點誘發的bGH(A.V)DNA編碼順序的創造。
圖5.PMON3209表達運載體的構建。其上在bGH(L)DNA編碼順序中帶有bGH(A.L)DNA編碼順序的PBGHex-1。
圖6.PMON3215表達運載體的構建，其上在bGH(L)DNA編碼順序中帶有bGH(A.V)DNA編碼順序的PBGHex-1圖7.M13 mp 9/PGHex-1的構建，其上帶有-PGH(P)DNA編碼順序的M13 mp 9。
圖8.由寡聚核苷酸導致特異位點一誘發的-PGH(A)DNA編碼順序的創造。
圖9.含有PBGHex-1的PBGHex-1的構建圖其中位於Ptrp DNA編碼順序5′端上遊的ECORⅠ限制性內切介位點已被除去。
圖10.PMON3213表達運載體的構建圖，它含有用PPGH(A)DNA編碼順序代替bGH(L)DNA順序的PBGH＊OX-1。
本發明提供一種在原核生物裡生產象真核生物(即哺乳動物或鳥類)蛋白質那樣的具有N端丙氨酸的異源多肽的方法。因此產生的多肽N端不具蛋氨酸，因而可省去在生產該種N端具蛋氨酸的多肽時所需的體外加工。持續生產這樣一種在基因編碼順序中缺N端蛋氨酸的多肽是一項嶄新的以及完全設想到的成果。
本發明提供一種有價值的方法以生產基本上純的具有N端丙氨酸的蛋白質。這樣的蛋白質範圍較廣，包括特定牛生長激素品種和豬生長激素品種及其變異型，植物蛋白核酮糖-1，5-磷酸二氫羧化酶小亞基，穀胱苷肽S-轉移酶，熱體克蛋白70，本發明對期望生產具有N末端丙氨酸而不是蛋氨酸其他多肽的生產亦是有用的。使N端丙氨酸比N端蛋氨酸更能合乎需要的是因為在多肽中，N-丙醯氨型的多肽也許致免疫性較少，或者可能有不同的物理性和修飾了的生物活性。
在本發明的例子裡，其中基本上純的bGH成PGH品種是由細菌細胞生產的除去N末端蛋氨酸的證據和技術，顯然還缺乏。事實上，由細菌細胞表達bGH的所有報導其中有關N端的包括與天然存在的bGHN端胺基酸順序相同的都報告N端蛋氨酸的存在。在See-burg等人，DNA(1983)2∶37-45中44頁裡報導bGH即bGH(L)的N端苯丙氨酸品種的基因順序是審慎地被選擇在大腸桿菌表達，部分原因是想避免予想中的第二個疏水胺基酸(蛋氨酸)加到其它bGH品種即bGH(AL)的疏水的N端丙氨酸上去。因此有用的研究至今教導在細菌上生產bGH品種要保留這種N端蛋氨酸。不管這些報導如何，我根據上面討論的理由認定，有必要生產兩種bGH品種bGH(A、L)和bGH(A、V)中任一種以及PGH的bGH(A)品種。然而，企圖在細菌裡生產這些生長激素品種是帶著產生的多肽將含有N端蛋氨酸的希望進行的。
正如在本發明例子裡詳細說明一樣，我把在細菌裡生產bGH(A、L)，bGH(A、V)及PGH(A)的方法簡述如下前面所說蛋白質的DNA編碼順序，圖3，4及8所示它是由含N端苯丙氨酸的牛和豬生長激素品種編碼順序的DNA往用寡聚核苷酸-導致位點一特導誘發而構建的。此後，這種bGH(A、L)，bGH(A、V)及pGH(A)的編碼順序插入到表達運載體，這樣所包含最後的基因順序依次為啟動子，核糖體結合位點，1ATG啟動/蛋氨酸密碼子它緊接在bGH(A、L)，bGH(A、V)或pGH(A)的任一種密碼順序DNA上以及一個轉譯停止密碼子。大腸桿菌隨後被帶有我們所期望得到的基因順序的特定表達運載體感染，而且使它在可讓這種所期望的異源DNA表達並能生產這種期望的蛋白質的條件下進行培養。這樣生產的蛋白質隨後進行順序分析及檢定它們適當的生物活性。
因此，人們在此發現當異源多肽含有的N-丙醯氨密碼子緊跟啟始訊號/蛋氨酸密碼子的DNA順序表達時，從原核生物有機體回收的蛋白質，在其N端上實際上是丙氨酸而不是蛋氨酸。人們相信，當丙氨酸密碼子被直接前移到約三個鄰接蛋氨酸的密碼子，其中包含編碼所期望得到多肽產物的信使RNA(mRNA)轉譯的啟動信號時就獲得相似的結果。例如用含有那種轉譯啟動信號和期望得到多肽產物的密碼子的DNA就能夠包含任何合適地為蛋氨酸丙氨酸(meta/a)，蛋氨酸蛋氨酸丙氨酸(met met a/a)，蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸丙氨酸(met met met a/a)成其它任何動能相等物編碼的順序。
在這裡把N丙氨酸多肽定義為其氨基端有-丙氨酸的一種多肽。然而申請人不希望受以下的機制原理所約束，人們相信轉譯之後，如果下一個胺基酸是丙氨酸或其它具有能使容易地除去N-蛋氨酸的，相似特性的胺基酸(即極性或疏水性)多肽上N-端的蛋氨酸就可被原核生物用酶除去。人們進一步相信，當上述N-端的蛋氨酸是直接地連有-丙氨酸，則許多原核生物是能從異源的以及/或內生的多肽上除去N-端的蛋氨酸。
這些原核生物(即熟知的以及通過公認的象ATCC或其它類似微生物保存機關獲得對公眾有益的各種細菌)包括大腸桿菌，但相信不限於大腸桿菌E.coli及其不同的品系。事實上期望的是對能產生具有N-端丙氨酸，DNA編碼順序開始約為1個到3個蛋氨酸密碼子，緊接的是丙氨酸密碼子之多肽的任何原核生物，這裡公開發明的實際可能是有用的。在商業上或其它方面有用的原核生物可以用插入一個基因到所說有機體的基因組中，而根據他們生產這樣的N-丙氨酸多肽的能力而被篩選到，插入的基因有序地包括一個在上述有機體起作用的啟動子，編碼核糖體結合位點的DNA，從約1個到3個鄰接的蛋氨酸密碼子，其中包括一個轉譯啟始信號緊接其後有異源的N-丙氨酸多肽密碼子及-轉譯停止訊號，此後，促使所說基因的表達並從而測定所產生的異源多肽的N-端的胺基酸的順序。在體內能產生這類異源N丙氨醯多肽的原核生物被發現時，按這裡專利公開和權利要求
的目的看，則此原核生物可被列入「選中」。
在本發明較佳的實施例中，大腸桿菌K12株的三種不同分離株，全都存放在美國馬裡蘭州(Maryland)洛克維蘭(Rsckville)標準菌種保存庫並已標有ATcc 39936，53010，及53009的登記號。並註明上述N端的蛋氨酸後緊接丙氨酸時有除去N端蛋氨酸的能力。
本發明由於它提供在原核生物裡生產具有N端丙氨酸的異源多肽的方法而有價值。
在其中一個較佳的具體實施例中，本發明的方法是用來生產兩種bGH品種，bGH(A、L)及bGH(A、V)以及一種pGH品種pGH(A)它們分別不帶有牛的或豬的蛋白質以及/或其他bGH或pGH品種。準確的說，本方法可為生產bGH(A、L)，bGH(A、V)或pGH(A)，作單一產種作準備。生產單一而胺基酸順序與天然存在的生長激素相同的bGH品種或pGH品種的能力對測定每個bGH和PGH的已知品種的精確生物反應性是相當重要，bGH和pGH的很多潛在作用，大體上如前所引。事實上，已發現服用兩種N-丙氨醯bGH品種中任一種都會產生例如象增加牛奶產量一樣的這樣bGH功能的可能性。此外。已發現的是給奶牛餵食按本發明生產的bGH(A、V)增加泌乳的劑量它的產奶量比用相似方法生產的bGH(A、L)在統計上有更大的增加(P＜0.05)。至今，在泌乳的哺乳動物裡，還無教知有增加牛奶產量比較有效的特異bGH類型(品種)。而且在體內或體外還無先有成果可資說明在bGH品種間將能觀察到在生物活性上的差異。因此，在牛奶產量上比亮氨酸等位bGH品種增加大的纈氨酸等位bGH品種的發現是既驚人又出乎意料。這個發現進一步說明bGH品種相對有效性的差異在增強其他生長激素特性如增高飼料效益和生長刺激也能同樣地被確定。因此應用本發明的方法可以在細菌裡生產至少二種垂體bGH分子型基本上是純型，和/或用其它有用的技術，現在也能生產在達到特異生長激素誘導反應上最有效的bGH品種。這樣有用的其它技術，包括，但不限於這些，化學合成整個bGH蛋白或它的片段，和/或用已知的重組DNA技術在其他微生物如酵母或在哺乳類細胞中進行生產。
此外，一旦測定了每種天然存在品種的生物學活性，就得考慮能否生產每個這樣品種的多肽變異型，它會進一步增加它們的生長激素的活性。因此，人們期望用核苷酸或用胺基酸刪減取代以及/或加入來生產生長激素變異型將會提供在此公開bGH組成的各種有用的等值物。這類變異型包括一種bGH的交換型，其中交換過程包括把一個蛋氨酸加到氨基端去。用遺傳上轉化過的細菌所生產的這種變異型，亦已發現當按增加泌乳劑量服用時，奶牛產奶量增至驚人的程度。
而且按照服用這個bGH(V)變種在泌乳上所觀察到的增加程度發現比依照服用其他在126位胺基酸上為亮氨酸的相同變種所觀察到的泌乳可測得的增加程度更大。
但申請者不希望拘束於下列理論的機制，該理論機制表明在126位亮氨酸被纈氨酸代替，可大大增加這些生長激素蛋白的生物有效性或生物反應性。明確地說，生長激素蛋白用X-線完成的晶體學表明，所說蛋白上大約90個胺基酸到135個胺基酸組成了相對的柔性區，其它蛋白的研究已說明柔性區常已含有生物活性位點(即與生物受體相互作用的位點或/和同一蛋白的其他部位以達到生物活性型)。因此，可以予見的是，bGH(A，V)的另外變株，它包括在上述柔性區內胺基酸代替、刪減、增加和/或倒位的變株，和/或在這個區域之外，但在泌乳增加(即牛奶生產)測度上有相同結果而比其他同樣的亮氨酸bGH品種或bGH(A，L)要大的變株，都能夠被製作。例如改變126位或126位左右的胺基酸，包括用更親水的和/或更小的胺基酸(指與亮氨酸相比)去代替以提供在牛奶產量上所說的增加到不能忍受程度前不減小。
進一步可以予見的是含N端phe，或N端ala-1的纈氨酸bGH品種，當給奶牛服用時能夠達到上述增加牛奶產量。也可以予見的是，變化其氨基末端(即mef-1)，它實質上與天然存在bGH的N端相同將不會干擾纈氨酸bGH品種增加牛奶產量比其他相同亮氨酸bGH品種或bGH(A，L)增加程度大到不能忍受程度的能力。還進一步可以預見到，其中纈氨酸bGH品種濃度，依據所有bGH在組成上的重量計實質上比在垂體bGH製品中所收集的纈氨酸bGH品種濃度大，因而將會達到上述增產牛奶的結果。
在其廣泛實施例中的一個實施例中，本發明細緻地應用DNA重組體技術直接在原核生物裡生產異源多肽。因此，發明的敘述是以所應用的重組DNA工藝學的技術基礎知識為先需條件，它包括編碼多肽的DNA順序的分離與克隆DNA順序的重排與交換，克隆了的或經修飾過的DNA順序在轉化過微生物中的表達。這樣的技術已處於工藝技術範疇之內。(見，例如，分子克隆化實驗手冊MolecularCloningAlaboratory Manual;Maniatis，Fvitrhd Sanbrooh ods，1982)異源DNA的分離以及/或構建在本發明的一個實施例裡，已被選得或分離到為在原核生物裡待生產想要得到的編碼異源多肽的DNA順序，或是說，編碼它的DNA順序已構建或已被化學合成。在許多重要的實施例中，這種多肽是一種真核生物蛋白質。如果這種多肽不大而且已知它的完整胺基酸順序，一個合成的DNA分子或編碼多肽的順序就能夠被構建。如果這種多肽的胺基酸順序不知道，或是它或過大而實際上不能合成相應的DNA順序，則可從表達這種多肽組織或細胞裡獲得的相應信使RNA，用它的逆轉錄能製備一個互補DNA(cDNA)順序。例如，在本發明的一個實施裡，bGH的順序能夠用Goodman等人，在酶學方法(Methods in Eniymolog)6875-90(1979)所述的目前常用的步驟從牛的重體獲得。另一方面，一個互補的DNA(cDNA)順序能夠用以一適當的探針從生產GH動物基因庫中分離得到的染色體組DNA轉化細胞再從中分離出信使RNA(mRNA)中製備。染色組DNA亦可在不同的運載體系統進行修飾，使能在原核生物裡表達。這些技術皆屬工藝技術範疇。
一旦獲得想要的多肽密碼子的異源DNA順序、有可能在該分子的核酸順序上作一那修飾。例如，如果這一分子已從mRNA模板逆轉錄產生，它往往含有至少一部分是編碼前-蛋白質的引導順序的DNA。因此，必須除去想得到的蛋白質第一個密碼子前面的所有帶引導順序的DNA。在某些情況下，如果這一順序還未具有-N-端的丙氨酸密碼子就有必要在編碼想要得的蛋白質順序引起點加進或替代一個丙氨酸密碼子。隨後在上遊引入一轉譯起動信號(它亦是一蛋氨酸密碼子)而且直接緊靠著丙氨酸密碼子。雖然這個啟始信號/蛋氨酸密碼子通常會(而且較常地)是核苷酸順序ATG，但GTG順序偶然也能用作啟動信號/蛋氨酸密碼子。此外在本發明的方法內，把出現多於一個蛋氨酸密碼子，即2，3或可能更多的鄰接蛋氨酸密碼子都理解為組建功能等值。
如果還未出現，也至少有一轉譯停止信號必須引到為羧基端胺基酸而編的密碼子之後。轉譯停止信號的例子包括脫氧核苷酸三聯體TAA，TGA，及TAG。因此，從本質上看，重組體DNA技術是用來組建重組體DNA順序的，這些順序按序地包括一個轉譯啟動信號/蛋氨酸密碼子，具有緊靠啟始信號N-端丙氨酸密碼子期望得到的多肽的密碼子以及至少一個靠著為C-端胺基酸密碼子的轉譯停止信號。
已發現在mRNA內由氫鍵結合將兩個互補的核苷酸系列形成二級結構能夠阻礙信使RNA的有效表達。消除這些互補的順序，特別是編碼N-端的分子的那段順序，有利於將核糖體結合到mRNA上，從而增加表達級別。因此，有可能用胺基酸相同的密碼子但包含不同的核苷酸三聯體去取代那些參與形成二級結構的密碼子。參閱全歐專利75，444(1983，3，30出版);Seebury等人，(1983)DNA 237-45和shoner等人(1984)。proc，Nat′l Acad.Sci.U.S.A.81.5403-5407。
組建異源DNA順序的其他方法對熟悉本行技術者們是很清楚的。例如，如果DNA分子合用的話，它編碼的多肽是以NH2-met-X-y的N-端結構表達的，式中的X是除丙氨酸外的任一種胺基酸，一個丙氨酸密碼子之間。另一方面，X密碼子可以刪去，而用丙氨酸密碼子代而插在其中。因此，在本發明的工藝過程裡，將會產生N-端分別具有NH2-ala-X-y或NH2-ala-y……的蛋白質。
同樣的，也許會對一個已知基因順序的任一胺基酸密碼子進行刪減，加入以及/或取代，所以在本發明的工藝過程裡就會表達出變異的多肽。一個「變異的」多肽在這裡定義為與已知多肽天然存在的胺基酸順序相比，有獨個或多個胺基酸被刪去，取代或加進。這樣的變異實例包括在，但不局限在met-bGH(L)及met-bGH(D)型，這些變異品種的bGH的胺基酸順序除了在N-端出現一個額外的蛋氨酸之外分別與bGH(L)和bGH(V)相同，都是用牛的垂體體細胞生產的。被構建成的這些變異的多肽的胺基酸順序具有與天然存在的多肽基本相似。只要其生物活性不會減到不允許的程度。為達到增加積留，提高蛋白質的穩定性，便於純化多肽以及/或使生物活性達到最適的程度，創建與表達變異多肽是有希望的。
上述編碼期望得到的多肽的DNA分子的修飾能夠使用限制性酶類，外切核酸酶，內切核酸酶等等的已知技術來完成。寡聚核苷酸一導致位點特異誘變的一般技術亦能在DNA分子的結構或順序上起到上述修飾的作用。而這些一般性技術是熟知本行技術的人所知道的。參閱例如，Eoller及Sncith(1982)Nuo.Acids Res.106487-6500;Ealler及Smith，(1983)Meth.Enrymol.100418500;Norris等人，(1983)Nuc.Acids Res，115103-5112。
按照重組體DNA技術，一旦獲得想要得到的異源DNA順序之後，就要將該順序插入到一個合適的能提供複製這一DNA順序的克隆運載體裡。任何合適的克隆運載體都可採用，但最好是採用那些含有標記功能的克隆運載體，它包括colEL，Hershfield等人，Proc Nat′l，Acad，Scio V.S.A(1974)713455;pBR322，Boliuer等人，Gene(1977)295，pBR325，Soberon等人;Gene(1978)4121;以及pKcT，Rao等人，Gene(1979)779;以及大腸桿菌E，cali噬菌體運載體，它包括Charon入L47.1，Loenen等人，Gene(1980)10249;以及M13mp8和M13mp9，Messing等人，Gene(1982)19269。把上述DNA順序插到一克隆運載體裡去生成一個重組體的運載體的一般技術是屬於工藝技術範圍。參閱，Malecular CloningA Laboralory Munual;Maniatis，Firtsch和Sam brooh，eds，(1982)。
一旦獲得期望得到的異源體DNA順序的多重拷貝，這些順序就可按後面較詳細的說明那樣從重組的運載體裡移去這順序，並把它插入到為生產和分離期望得到的異源蛋白的表達系統裡。在將這些DNA順序插入到一個表達運載體之前或之後可以用工藝熟練者所知的方法對異源體DNA順序進行修飾。
在本發明的一些例子裡，Mesring等人在Gene(1982)19269所說的，修飾成含有一個Xbaz位點的M13mp8如圖2所示，與M13mR9一道被選為克隆運載體，參考文獻同上一。M13mp8及M13mp9集合為「M13mp運載體」其雙鏈(ds)或複製型(RF)及單鏈(ss)DNA型都可作分離用的重組體運載體。RFDNA重組體運載體的分離，如圖5，6及10所示便於隨後把已複製了的希望得到的DNA順序插到表達運載體上。另一方面，分離這些單鏈型重組體運載體，對在合適的5′到3′表達位置上含有的所期望得到DNA順序的重組體運載體的分離，以及如圖3、4和8所示對用寡聚核苷酸導致特異位點誘變一類的技術所修飾的任何DNA順序的創建都是方便的。此外，M13運載體能按納長度是以克隆一個典型而又完整的真核基因順序高達四千對鹼基(4Kb)的DNA片段或基因。
用於M13運載體裡的功能標記，正如Messing等人在Gene(1982)19269所述，它涉及與β-半乳糖苷酶有關的酶。確切地說，期望得到的異源DNA順序被插到至M13運載體裡的LacⅠ基因片段上。這樣它就破壞了在M13運載體上lncE基因片段與寄主(即大腸桿菌JM101)細胞染色體上部分lncE基因片段間的正常互補作用，所以，所論的宿主不能再代謝在細菌培養基裡存在的乳糖。用無任何外來基因順序插入並承受有lacz基因片段的M13運載體去侵染的大腸桿菌E，coli，如果菌是在含有0.8%(W/V)胰蛋白腖，0.5%(W/V)酵母提取液，0.5%(W/V)氯化鈉以及一種β-半乳糖苷酶指示劑配成的1XYT培養基裡生長，是能夠代謝存在於細菌培養基裡的乳糖並產生出特微性的蘭色的噬菌斑。用在M13lacI基因片段上已插入有異源DNA順序的重組體運載體感染的大腸桿菌E.coli，如果仍是在上述培養基生長時，其噬菌斑的顏色就是透明的或無色的。據此，異源體DNA順序插到這些克隆運載體的陽性反應可根據重組體運載體感染大腸桿菌寄主細胞後形成的無色噬菌斑進行鑑定。把編碼bGH(L)及pGH(P)的DNA順序插入到M13載體分別如圖2和9所示。
在一個較準的實施例中，象在seeburg等人，DNA(1983)2(1)37-45所作一樣分別在細菌質粒pBGHex-1及pPGHex-1上的bGH(L)及pGH(P)DNA編碼順序是通過位點專一的限制性內切核酸酶切割方法從這些質粒分離得到的。應該注意的是，用細菌質粒pBGHex-1或pPGHex-1，分別對細菌轉化，隨後又分別在容許表達bGH(L)和PGH(P)密碼順序條件下進行培養可分別產生帶有N-端蛋氨酸(即met-bGH(L)或met-pGH(P))的促生長激素。然後分別地把各個順序插入到如圖2和7所學的經修飾了的M13mp8運載體(M13mp8/Xbal)和M13mp9載體的複製型DNA(RFDNA)上。把期望得到的bGH(L)及pGH(P)DNA順序插入到M13mp8/XbaL及M13mp9RFDNA是通過位點-專一的限制性內切核酸酶切割進行確定，仍分別如圖2和7所示。隨後，如Mcssing等人所述那樣，見酶學方法(Methods in Enzymology 1983)10120用這些重組運載體中的一些運載體去感染大腸桿菌Jmlol Messing等人，在Gene(1982)19269上所說那樣分離重組體運載體的單鏈DNA(SSDNA)Messing等人所引這些文獻的有關部分在此併作參考文獻。
一旦分離到這種重組體運載體的單鏈DNA(SSDNA)可通過寡聚核苷酸導致專一位點誘發進行修飾而創建bGH(A、V)，bGH(A、L)、bGH(V)及PGH(A)的DNA編碼順序。確切地說，DGH(L)是用加一個丙氨酸密碼子進行修飾，例如，在bGH(L)編碼順序的5′-末端上加GCC(如圖3所示。可以予見的是編碼丙氨酸4個密碼子中的任何一個都可以加入為得促生長激素最好產量而最好的編碼丙氨酸密碼子在這裡表達系統中應用的是GCC。加入一個丙氨酸密碼子而創建的bGH(A、L)編碼順序可借用Sanger等人1)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.(1977)745463的方法對整個bGH(A、L)的DNA順序或其5′-末端的DNA順序分析而進行確證。
bGH(A、V)編碼順序是通過bGH(A、L)密碼順序的寡聚核苷酸導致特異位點誘發而生成的如圖4所示、或是用127位胺基酸〔在bGH(A、L)是如此〕即亮氨酸、密碼子變為纈氨酸密碼子，例如轉變成GTG。再一次可以肯定的是，任何纈氨酸密碼子都可用於這類轉變。這類bGH(A、V)密碼順序的創建仍然是通過對終產物bGH(A、V)編碼順序的DNA序列分析進行確認。
能使感染有包括bGH(V)編碼序列的表達載體的細菌中產生met-bGH(V)蛋白的編碼順序也同樣可用寡聚核苷酸導致特異位點突變而創建，使bGH(L)編碼序列在126位(在bGHL上)胺基酸改變成纈氨酸密碼子GTG。
這種通過PGHCP)編碼順序的寡聚核苷酸導致特異位點誘發而創造PGH(A)編碼順序同樣地象圖8所示過程那樣以及象後面將要較詳細說明那樣進行完成的，而且仍是通過DNA順序分析進行確認的。
如果現在已分離和組建的這種期望得到的異源DNA順序象所列舉的bGH(A、L)bGH(A、V)及bGH(A)則，這些順序可以靠熟悉本行技藝者們用已知的方法和參照上述文獻擴增各個重組體運載體以複製和產生很多的拷貝數。現在這些異源DNA順序就可以被插入到任何適合表達運載體上使在原核生物裡生產這類期望得到的異源多肽。
N-端丙氨酸多肽的生產象前面討論的那樣在選定的宿主細胞裡，一個適合表達的運載體應該含有為生產異源蛋白必需的轉錄與轉譯信號和與之一起用以識別那些已插入有異源DNA順序的表達運載體上的功能標記。用原核生物的表達載體，能夠通過轉導作用，轉化作用，或者轉染作用(在此通稱「作轉染作用」)把重組體DNA順序引入與其基因互補的生物體中，然後所說的原核生物能夠在一定的條件裡培養C一般都由啟動子和所用宿主控制)從而導至生產出期望得到的異源蛋白質。因此，在本發明裡所用的「染色體組」DNA包含有染色體的和附加體的DNA。
為了表達異源基因及在源核生物的宿主細胞裡生產異源蛋白質。許多表達運載體已被描述，而且都為熟悉本行技藝者們掌握。
在本發明一個較佳的實施例裡，應用了表達運載體pBGHex-1參閱Seeburg等人」DNA(1983)2(1)37-45.以及pBGHex-1＊，還包括已修飾過的pBGHex-1運載體。
表達運載體bGHex-1是一種帶有bGH(L)基因的細菌值粒pBR322。這個基因依次包括一色氨酸啟動子(ptrp)。一Shine-Delgarro順序，一種除接在N-端苯丙氨酸編碼順序上的ATG轉譯啟動/蛋氨酸密碼子，bGH(L)多肽的第一個胺基酸，bGH(L)編碼順序以及一個轉譯停止密碼子。有關pBGHex-1表達載體的功能標記是抗菌素抗性。確切地說，pBGHex-1帶有兩種抗菌素抗性基因，一種是抗氨苄青黴素抗性(ampr)而第二種是抗四環素抗性(tetr)，這兩種抗性由於表達運載體授與其它敏感性宿主細胞以對抗菌素的特異抗性而穩定地被轉化。因此穩定的轉化體通入在含有四環素，氨苄青黴素或二者都有的培養基上生長可以被選出來。
在本發明的一些例子裡，表達運載體PMON3209以及包括有分別帶bGH(A、L)及bGH(A、V)編碼順序以代替bGH(L)編碼順序的pBGHex-1質粒在內的pMON3215都分別如圖5和6所示那樣過程產生的。象大腸桿菌樣的細菌隨後被這些表達運載體的一種所穩定地轉化，而且轉化體通過在含有適當抗菌素的培養基上生長而被選出，在轉化的細菌裡含有的這些表達運載體隨後用限制性酶切割方法查對在正確的5′至3′位置上篩選bGH(A，L)及bGH(A，V)編碼順序的存在。
在本發明的一個例子裡pBGHex-1＊包括位於ptrp編碼順序5′端上遊經除去EcoRI酶切位點方法修飾過的pBGHex-1也被應用以創造帶有pGH(A)編碼順序代替bGH(L)編碼順序的表達運載體PMOM3213終產物pBGHex-1運載體只含有單一的EcoR1位點如圖9所示在pBGHex-1＊裡用PGH(A)編碼順序代替bGH(L)編碼順序以創造表達運載體pMON3213圖10所示。然後用所說混合物轉化大腸桿菌，同時通過在含有抗菌素的培養基上生長選取轉化體。在經過轉化的細菌裡含有的表達質粒隨後用限制切割篩選pGH(A)編碼順序的存在。
在大腸桿菌裡生產bGH(A、L)，bGH(A、V)或bGH(A)是用表達運載體pMON3209，pMON3215或pMON3213中任一種按照後面較詳細說明的方法通過轉化大腸桿菌株多E Codi W3110LE392或294而實現的，這些株多的ATCC登記號分別為39936，53010，及53009。轉化了的大腸桿菌(E，COLi)W3110隨後在容許表達生長激素基因和生產這種期望得到的異源多肽的條件下進行培養。
所產異源肽的純化將隨蛋白質及所選的宿主細胞二者而定。例如，曾觀察到在象大腸桿菌那樣的細菌裡生產的異源蛋白質常常以「折射體」的形式在細胞裡沉積，採用「折射體」一詞是因為這些物體實際上用相差顯微鏡能夠看見的。一種回收異源蛋白質及回收在生物學上有活性物質有用的方法已在全歐專利申請114，506(1984.8.1出版)裡敘述，在此併作參考文獻。這個純化的方法簡言之包括濃縮宿主細胞，將它們裂解以產生細胞提取液或勻漿液，繼而用差速離心分離這些折射體，其中所有步驟對熟知本行技藝者都是知道的。分離得的折射體溶於一種象鹽酸胍一類的強變性劑裡，這種溶解了的蛋白質隨後在適當的溶劑裡(例如尿素)交換，用層析法純化。最後使之在生物學上活化。即容許它呈假定的活性構型然後進行氧化之。因而使這樣的構型就象在全歐專利申請114，506所述那樣，通過它合適的半胱氨酸殘基間的二硫鍵而保持它的構型。這種異源蛋白質更詳細的純化過程在兩個同時申請的美國專利裡敘述，其一是由storrs s.B題名生長激素可溶解化的方法「Method of somatotropin Solobibilitation」，而另一由Bentle，L.A storrs.S.B及Mitchell J.W.題名生長激素自然化的方法「Method of Sometotropin Natura-tion」，在此均併作文獻。」這兩個同時申請的美國專利以及本申請一起全都同意轉讓給mon Santo公司。從這種異源多肽上去除汙染的細菌性蛋白質的進一步純化，可通過象凝膠過濾處理或離子交換層析的常規層析方法能夠達到。經這樣處理純化過的組成物，典型地將含有N-丙氨酸、多肽大約為其全重的90%至99.5%而由細菌產生的蛋白質或在其它原核生物宿主上產生的多肽。大約為0.5%到10%。
已發現用本發明的方法所表達的異源肽，通常至少有大約80%具有-NH2-a/a的N端結構……其餘的多肽有代表性的是呈蛋氨醯型式，它具有-NH2-met-a/a……的N端結構。然而，以不同的培養條件以及/或者誘導基因表達的時間，就有可能提高N端具有丙氨酸的多肽的比值至少到95%或甚至更高一些。
在本發明的一個特別好的實施例中，根據前面敘述那樣生產和分離的多種生長激素多肽按照Tsushina及Frieses在J.clin，Endocpinol.Metab.(1973)37334-337所說那樣在家兔肝受體上分析完成的方法進行測定以及對小白鼠增重的生物分析都表明有類生長激素的生物活性。在後者的分析裡，大腸桿菌產生的生長激素的生物活性是通過切除重體小白鼠分別主入不同劑量待測生長激素與注入一些已知的生長激素(例如豬或牛的垂體生長激素)後所得小白鼠的相對增重進行評定。確切地說，給去除垂體的小白鼠(體重95-135克)注射滴定劑量未知的或標準的(0至60微克之間)生長激素，按日為基礎進行7天或更長的試驗時間。使用多重回歸分析，接受已知或未知激素組的動物的體重增量與劑量的對數變換值呈回歸，測試斜率以確定非平行現象及截距普遍性。生物活性是以斜率的比值乘標準的活性。
使用本發明的帶有N-丙氨酸的bGH產品增加了奶牛的產奶量，而且認為該奶牛獲得特定出奶量所需飼料量下降。對奶牛按增強泌乳量施用，在成熟蛋白質大約126位或相近處有一纈氨酸的bGH品種是特別適於促進這些奶牛產奶的。本發明的這類產品可以用注射，灌輸或移植在多聚物或其它眾所周知在循環系統裡達到輸送必要劑量的基質給奶牛施用，也許可以用象溶劑、乳劑或凝膠那樣的藥物上可接受的基本配製方法，也可用膠囊或不用膠囊，這些配方可單獨含有bGH品種或其變型，或前面說過的一些天然存在的複合型以及/或者變異多肽〔例如，一種bGH(A、V)和bGH(A、L)的混合物以及/或者bGH(A、V)和蛋氨酸-bGH(A)的混合物〕。每畜每天的劑量從少至大約0.005mg直至大約200mg，而每畜每天最佳劑量從大約5mg至大約40mg。增加產奶量和/或增加飼料牛奶效應最有效的劑量可以通過常規的試驗來測定。bGH實際的最佳劑量是由特定動物的大小，一般健康以及營養狀況的差異而決定的。在奶牛上，產奶雖然能用來分析bGH的作用，但牛的其它生產性能，象總生長率及產肉情況亦能用來分析。如果希望的話，bGH能和其它有益的製劑，象其它的生物活性蛋白質，抗原或類似物及由此而獲得增效的製劑一起施用。
正如前面討論過一樣，本發明亦期望bGH變異型的產品其上有-N-端丙氨酸，但此沿著多肽鏈可進行刪減、加進倒轉和/或取代。這種具有期望得到的泌乳和/或生長增效功能的修飾作用能夠通過在牛裡進行的常規試驗鑑定。
下列例子闡述了較佳的實施例本發明，但無論如何不想限制本發明的界限。雖然本發明已在與發明有關的較好的實施例中作了闡述熟知本行技術者從閱讀這個申請裡，提出各種各樣的修正那將是顯然的。
微生物及質粒下列微生物可從美國標準菌種庫(ATTC)1230 1 parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852，U.S.A.獲得ATCC 39936 - E. Coli W3110ATTC 53010 - E. Coli LE392ATTC 53009 - E. Coli Strain 294ATTC 53024 - E. Coli W3110(pMON3209)ATTC 53022 - E. Coli W3110(pMON3215)ATTC 53023 - E. Coli W3110(pMON3213)這些存放菌種可通過本申請的受讓人(Monsanto公司)取得美國專利(局)同意而為共眾使用。這些存放菌種將會由於這個申請具有申請日期開始獲利的任何這樣的美國(U.S)專利的有效期內而可取得使用。然而，必須明了這些存放菌種的可用性並不構成允許去實施本主題的發明以貶低政府同意頒發的專利權。況且本發明不限於存放微生物的範疇，因為這個存放菌種的實施例只是企圖作為本發明的具體闡述而已。
例一所有的寡聚核苷酸的合成都是依據製造廠應用生物系統公司(Applied Biosystem，Inc.Foster City，Califor-nia)提出的步驟用一個應用生物系統DNA合成儀在Monsanto公司生物科學部(Department of Biological Science，Monsanto)進行的、限制性內切酶和DNA修飾酶是由新英倫生物實驗室(New England Biolabs Beverly，MassaChu-setts)新英倫核子公司(New England Nuclear，Boston，MassachuSetts)及Bettesda研究實驗室(Bethesda Research Laboratories，(BRL)(Gaithersburg，Mary-land)供應。限制性核酶內切酶Xbal接頭(XbaI linker)是從合作研究公司(Collaborative Research，InC.(Lexing-ton，Massachus etts)獲得、T4DNA連接酶是由BRL供應。T4DNA激酶是從新英倫生物實驗室購買。32p-林記核苷酸是由Amercham(Arlington Heights，Illinois)供應。E.Coli DNA多聚酶I.Klenow片段，是由新英倫核子公司供應，E.Coli JMioi是從Dr.JoMessing，University of Minnesota(st.paul，Minnesots)處獲得。
限制性酶的酶解過程，T4DNA連接酶的連接及大腸桿菌E.Coli DNA多聚酶I，Klenow片段酶的反應都可以按製造商提出的步驟進行。對下列限制性酶的較佳緩衝液如下用於XbaI100毫摩爾Nacl，50毫摩爾Tris(三羥甲基氨基甲烷)pH7.5，10毫摩爾mgSO4;用於EcoRI，HindⅢ及SmaI50毫摩爾Nall，10毫摩爾Tris pH7.5，10毫摩爾mgSO4。T4DNA連接酶反應是在含在25毫摩爾Tris，pH8.0 10毫克Mgcl2，10毫摩爾dithiothritol(DTT)〔二巰基赤癬糖醇〕2毫摩爾亞精胺以及0.2毫摩爾ATp的緩衝液內進行，大腸桿菌E.Coli DNA多聚酶I，klenow片段酶，是在含有20毫摩爾Tris pH7.2，10毫摩爾Mgcl2，10毫摩爾(DTT)，1毫摩爾ATp，及1毫摩爾下列各物之一dATA，dGTp，dCTp，dTTq的緩衝液中使用。如果標記新合成的DNA鏈，則可加入Alpha-32p-dATp(400居裡/毫摩爾)至Klenow反應液裡。
標記寡聚核苷酸是用伽馬(γ)-32p-ATp(比活性大於5000居裡/毫摩爾)及T4DNA激酶於100毫摩爾Tris，pH8.0 10毫摩爾MgCl2，5毫摩爾DTT。
供bGH(L)及pGH(p)用的帶有DNA密碼順序的質粒(分別是pBGHex-1及pBGHex-1)是從遺傳工程有限責任公司Genen-tech Inc.獲得，So.San Francisco，California。這些質粒也能按在全歐專利申請75，444(1983、3、30出版);See-burg.等人，DNA(1983)2(1)37-45;Goed-del等人，Nature(1979)281∶544-548;DeBoer等人，在啟動子Promoters結構與功能(Structure and Function)(1982);M.J.Chamberlin and R.Rodriguer ed.Char-ptor293;Miozzari and yanofsky，J.Bacteriol。(1978)1331457-1466;以及Rosenberg and Court，Annual RevieW of Genetics B319-353所述製備。如在全歐專利申請75，444(DeBoer等人)所示，在bGH(L)DNA前面21個轉譯密碼是ATG，TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT或是它們的功能等值物編碼胺基酸相同的不同密碼子)(那些密碼子的功能等值物當然可以交換使用的。)這些出版刊物的有關部份在此皆並作文獻。
M13mp8及M13mp9是從明尼蘇達大學(聖保羅，密蘇裡)Mes-Sing Jo博士處獲得。
所有細菌培養基成份及抗菌素是Sigma(St.louis Mo)或是從DifCo實驗室(Detroit，MiChigan)獲得的。
例二下面的例子說明三種DNA密碼順序的組建，這些順序在細菌裡表達時，就提供直接在細菌裡生產具-N端丙氨酸的多肽。確切地說，DNA密碼順序就是建成這樣以致在轉譯啟始/蛋氨酸密碼子(ATC)之後緊接有一丙氨酸密碼子(即GCC)。這三種DNA編碼順序，它們包括bGH(A.L.)，bGH(A.v)及pGH(A)，是從以前分離的生長激素DNA順序通過寡聚核苷酸-導致特異位點-誘變而建成的。此例也說明在細菌中表達使產生metbGH(v)的編碼bGH(v)密碼順序的DNA的構建。
a.bGH(A、L)DNA密碼順序的組建生長激素bGH(L)的DNA密碼順序是由pGHex-1質粒上切出-XbaI片段並克降至一個修飾了的M13mp8運載體(M13mp8/XbaI)的XbaI位點上。在原來SmaI位點處含有一個XbaI接頭(或稱連接子)的M13mp8/XbaI運載體其組建過程在圖1示出。如圖2所示，XbaI能在bGH(L)密碼順序的任一端酶切，因此切出完整的bGH(L)密碼順序。在存在有T4DNA連接酶時，XbaI限制酶切過的pBGHex-1質粒與用XbaI限制性酶裂開後並用小牛腸鹼性磷酸酶去末端磷處理呈線形化複製型的(RF)M13mp8/XbaI DNA相混合。隨後這種混合物在14℃裡溫育過液，用小牛腸鹼性磷酸處理防止了M13mp8/XbaI運載體重新環化。將bGH(L)DNA密碼順序插到M13mp8/XbaI運載體裡製造成重組運載體M13mp8/BGHex-1，開始時是以在含有10微升100毫摩爾IpTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)和50微升2%(W/V)X-GAL(5-溴-4氯-3吲哚氧基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)加入到3ml上層瓊脂中並用前面所述的重組運載體去轉柒分子克隆化Molecular CloningAlaboratory Manual，Maniatis，Fritsch和Sambrook，eds(1982)p q.64，所說的運用軟瓊脂復蓋步驟(雙層法)，在I×yT培養基上生長的大腸桿菌E.ColiJM 101菌層上形成無色的噬菌斑進行確定，bGH(L)密碼順序插入可用酶解分離出的複製型(RF)DNA而確證，把重組運載體用XbaI酶切，產生含有插入序列590鹼基對片段。參閱分子克隆化Molecular CloningALabora-tory Manual，Maniatis，Fritsch and Sambrook，eds.(1982)第三章。這590對鹼基片段是在百分之一(W/V)瓊脂糖裡按在Molecular CloningALaboratory Manual，Maniatis，Fritsch Sambrook，eds(1982)所述用瓊脂糖凝膠電泳鑑定出的。所有後面的限制性酶酶切片段都用這種參比的方法鑑定。插入的bGH(L)密碼順序的方位是通過用SamⅠ和HindⅢ酶解RF重組運載體進行確定的。當這種密碼順序是在正確的5'至3'方位，用這些限制性酶酶解時應該產生-207對鹼基的片段。單鏈噬菌體DNA的分離是按Messing et al，在Gene(1982)19269裡的方法進行的。M13mp8/BGHex-1運載體以後在寡聚核苷酸導致特異位點誘變中被用作模板，基本上按Eoller和Smith，在NuC.Acids Res.(1982)1064876500，Eoller and Smith在Methods in EnZymol(1983)100468-500所述進行，Norris等人，NuC.ACids ResearCh(1983)115103-5112，其中有關部分在此並作文獻。
圖3繪出從bGH(L)密碼順序構建成一個為bGH(A.L)編碼的DNA順序的誘變步驟。簡言之含有希望突變順序寡聚核苷酸引物(見後表1)被用作合成單鏈DNA M13mp8/BGHex-1運載體的閉環DNA拷貝引物的模板。因此而產生的閉環雙鏈DNA分子按Zoller和Smith Methods in Enzymol(1983)100468-500裡所述那樣方法，用鹼性蔗糖梯度離心從不完整環和單鏈DNA環中分離開。這種閉環的雙鏈DNA分子隨後用來轉化大腸桿菌(E.Coli)JM101方法像MeSSing等人，Gene(1982)19269-276所述那樣，而且挑取出無色的噬菌斑，把它們放在從pall Vltrafine Filtration Corp.(Glen Cove，NeW york)獲得的pall濾器上與用以產生特異位點誘變並用32p標記的寡核苷酸引物作分子雜交進行篩選。上述噬菌體的挑取是按pall濾器製造廠所述方法進行。分子雜交篩選是用生物達因尼龍滬器實現的，該方法按pall超細滬器公司在其「DNA轉移到pall生物達因尼龍滬器上的指導方案」中所述。用升高溫度洗滌滬器，直到用M13mp8/bGHex-1製備的對照滬器洗盡放射性為止。一個標準的濾器清洗方案包括用6×SSC(0.9MNaCl和0.09M檸檬酸鈉)在室溫清洗10分鐘，接著在50℃用6×SSC洗5分鐘，最後升高5℃洗滌之。與放射性標記寡聚核苷酸引物分子雜交的噬菌斑，溫度比對照噬菌體高時，被假設為帶有新構建成的bGH(A.L)密碼順序，而且各之為潛在陽性。另一方面，從轉化的E.Coli JM101上挑取各個無色噬菌斑，並放在5ml 2XyT培養基(1.6%(W/V)胰蛋白腖Tryptone，1.0%(W/V)酵母抽提液，0.05%(W/V)Nacl)置37℃下好氣培養過液。依據Messing等人，在Gene(1982)19269方法製備噬菌體DNA隨後在硝酸纖維上與放射性標記引物一起分子雜交，並像上述一樣升溫洗滌之。顯示出雜交溫度比M13mp8/bGHex-1對照噬菌斑高的噬菌體DNA同樣地被各之為潛在陽性。從兩種篩選過程中取得具潛在陽性的噬菌斑按上述一樣培養，並用來製備單鏈(SS)噬菌體DNA，隨後又按Sanger等人，在proC.Nat′1，ACad-Sai U.S.A.(1977)745463-的方法進行序列分析以確證它們帶有bGH(A.l)密碼順序。因為丙氨酸密碼子可創造成一個附加的HalⅢ限制性位點，所以M13mp8/BGH(aLa)複製型也可以用HaeⅢ限制性內切配介分析篩選以證實加入的一個丙氨酸密碼子跟在啟始訊號/蛋氨酸密碼子ATG之後。在這種bGH(L)DNA密碼順序上加進丙氨酸密碼子的頻率大約是2%。
b.bGH(A.V)DNA密碼順序的組建bGH(A.V)DNA密碼順序的組建，篩選及順序確認除了模板如圖4所示是M13mp8/BGHex-1(ala)以及寡聚核苷酸引物是如後表1所示外都是使用前面同樣的步驟完成的。亮氨酸密碼子轉化為纈氨酸密碼子的頻率大約是10%。
C.bGH(V)DNA密碼順序的組建bGH(V)DNA密碼順序的組建，篩選，和順序硝定是用與上述相同的方法實現的。明確的說，模板，M13mp8/BGHex-1和寡核苷酸引物也與創建DGH(AV)所應用的相同，亮氨酸密碼子到纈氨酸密碼子的轉變頻率再次為約10%。
d.pGH(A1)DNA密碼順序的組建寡聚核苷酸-特異位點-誘變，像Seeburg等人，在DNA(1983)2(1)37-45裡所說的那樣同樣可以用來把丙氨酸密碼子加到pGH(p)DNA密碼順序裡。這一鏽變方法如圖8所示進行如後。
在pPGHex-1質粒上所帶的590對鹼基pGH(p)DNA密碼順序在pGH(p)密碼順序5′端和3′端分別用ECoRI和HindⅢ限制性酶切割質粒從質粒上把它移去，如圖7所示。這個限制性酶切過的PGex-1質粒隨後與MBmp9複製型DNA混合，該複製型DNA在混合之前同樣用E.CoPl及HindⅢ酶切開，並另外再用小牛腸鹼性磷酸酶予處理以予防該M13mp9的限制性片段重新連接。T4DNA連接酶隨後加入上述混合物裡。由於畸型的端部位於用兩種不同的限制性酶酶切生成RF噬菌體DNA和pGH(p)DNA密碼順序衛，所以pGH(p)DNA將能選擇地被插至RF噬菌體DNA裡，並且將會插到正確的5′至3′方位上，如圖7所示。如前面所述M13mp8/BGHex-1一樣，隨後大腸桿菌F.eoliM101用帶有pGH(p)DNA密碼序的重組體M13Mp9/pGHex-1運載體轉化。然後把這種轉化了的大腸桿菌E.ColiJM101放在有指示劑的1XTY培養基裡生長，而且也像前面所說那樣選擇無色噬菌斑。這種pGH(p)DNA密碼順序的插入是用下法確認的。挑取無色的噬菌斑，按前面所說方法分離M13mp9/pGHex-1的複製型DNA然後用ECoRl及HindⅢ切開，並在瓊脂糖凝膠上電脈產生含有所插入pGH(p)DNA的一個590對鹼基的片段。然後把M13mp9/pGHex-1噬菌體在大腸桿菌E.Coli JM101裡增殖並按前所說的方法分離單鏈噬菌體DNA。
隨後將M13mp9/pGHex-1DNA用作步聚核苷酸-特異位點-誘發的模板，如圖8所示，按前面所說的步驟構造成一個應用專性引物的bGH(AL)密碼順序(見後表1)。在這種pGH(p)密碼順序上加進一個在此是GCC的丙氨酸密碼子的頻率幾乎是12%。終產物pGH(A)密碼順序再用DNA順序分析法進行確認。
例三這個例子說明供直接在細菌裡生產含有N-端丙氨酸的多肽的三個重組的表達運載體的組建及表達。這樣生產出的三種多肽是bGH(A.L)，bGH(A.V)及PGH(A)型的生長激素。這個例子也說明bGH(V)表達運載體和bGH(L)表達運載體的組建。這樣產生的多肽分別是mef-bGH(V)和mef-bGH(L)。
a.bGH(A.L)、bGH(A.V)和bGH(L)的表達。
分別用重組的運載體M13mp8/BGHex-1(ala)，M13mp8/BGHex-1(ala，Val)及M13mp8/BGHex-1(Val)上帶有的bGH(A.l)及bGH(A.V)DNA密碼順序去代替在pBGHex-1表達質粒上帶有的bGH(L)DNA密碼順序(參閱圖5和圖6)。這是用XbaI酶解相應的M13RFDNA上片段而完成的。表達質粒pBGHex-1亦用XbaI酶解，並接著用小牛腸鹼性磷酸酶處理以防止這些限制性酶切片段重新連接。每種己酶解了的RFDNA的片段隨後分別與己酶解了和處理過的pBGHex-1DNA混合，並如前面所說那樣在14℃下連接過夜。這樣形成的重組的表達運載體把帶有bGH(A.L)bGH(A.V)和bGH(V)DNA密碼順序分別標記為pMoN3209、pMoN3215和pMoN3214。隨後大腸桿菌E.Coli W3110用含有pMoN3209或含有pMoN3215或含有pMoN3214或含有pBGHex-1的連接混合物轉化，並在Lauria肉湯上生長出Lauua肉湯含有1%(W/V)胰蛋白腖，0.5%(W/V)酵母抽提液和0.5%Nacl(W/V)以及含有12.5微克/毫升四環素和200微克/毫升氨苄青黴素。含pMoN3209的大腸桿菌E.Coli W3110其ATCC登記號為53024。含pMoN3215的E.Coli W3110其ATCC登記號為53022。轉化作用簡要地進行如下。把近50MlE.Coli W3110在LB培養液裡生長到光密度(oD)600＝0.60。隨後將其細胞收集成小丸並懸浮在含有25毫摩爾TriS，pHT、6.和10毫摩爾NaCl的10毫升緩衝液A裡。然後，又把這些細胞收集成小丸並再懸浮在1毫升緩衝液A內於其中加入14毫升緩衝溶液B使成懸浮液並在水中保持30分鐘，緩衝液B含有25毫摩爾Tris，pH7.6，10毫摩爾NaCl，50毫摩爾CaCl2。然後又把這些細胞再收集成小丸並再懸浮在3毫升緩衝溶液B內。取再懸浮的細胞的一份等分試樣0.2毫升隨後與0.1毫升緩衝液B及0.1-0.5μg理想的重組的表達運載體(PMoN3209或pMoN3215或pMoN3214或BGHex-1)混合，並在水上孵育60分鐘。這些孵育的混合液隨後在37℃上加熱1分鐘在此之後加入3毫升LB培養基，然後把終產混合物在37℃溫育60分鐘。隨後收集這些細胞成小丸並再將其懸浮在300毫升LB培養液內，並使它在如前面所述的含抗菌素的LB平板上生長。就這樣選出了抗性菌落以及按Molecular Cloning Alabor atory manual，maniatiS，Fritsch and Sambrook，eds(1982)所說的步驟分離出pMoN3209、pMoN3215，pMGHex-1和pMoN3214表達運載體DNA的片段。這些pMoN3209、pMoN3215，pBGHex-1和pMoN3214的DNA片段可用它存在有500對鹼基的XbaI片段與200鹼基對HindⅢ/Smal DNA片段進行篩選，因為它說明在正確的方位上存在有bGH(A.L)bGH(V)和bGH(A.V)DNA編碼順序。pMoN3209和pMoN3215表達質粒可以用HaeⅢ酶酶解分析進一步篩選，並從而確證由於加進GCC(丙氨酸)密碼子導致產生一個HaeⅢ新位點的存在。最後，從pMoN3209、pMoN3214和pMoN3215三運載體來的590鹼基對的XbaI片段，可按前面所述進行部分順序測定以確定在這些表達運載體上存在有bGH(A.L)bGH(V)與bGH(A.V)DNA編碼順序。
帶有pMoN3209 pMoN3214。BGHex-1′或pMoN3215的E.Coli W3110的單菌落分別接種在含有12.5Mg/ml四環素的5毫升培養基LB裡，而且在37℃下通氣培養過夜。然後取0.5毫升過夜培養物分別接種裝在250ml錐形瓶裡的25毫升的M9培養液。M9培養液組分為(按升計)100毫升10倍濃縮鹽液(按千毫升總體積計含有70克(g)Na2Hpo4，30gKH2po4，5gNau，10gNH4(l)，1.2毫升1M MgSO4，0.25毫升0.1%B1，12.5毫升20%(W/V)葡萄糖，0.025毫升1MCaCl2，並再補充0.5%(W/V)酪蛋白胺基酸液和6.25μg/ml四環素。隨後把這些接種物各自在37℃通氣培養至達到OD600(光密度在600毫微米)＝1.0。每份0.2ml等份試液再從每個上述的錐形瓶裡取出並逐個裂解後放在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電脈(pAGE)緩衝液裡，並按Laemmli，在Nature(1970)227680-685所說方法用SDS-pAGE分析。從這兩種基團結構得出的22，000道爾頓的蛋白質在大腸桿菌E.Coli W3110裡處於高水平。而且，與在Western浸漬分析中，兩種22，000道爾頓蛋白質由抗牛垂體生長激素所產生，單克隆抗體，F11-A1-B6結合(參圖Kriviand RoWold，Hybridoma(1984)，因此，證實這種多肽是與垂體生長激素有關。帶有親本的pBR322質粒的E.ColiW3110細胞不產生與抗生長激素抗體結合22，000道爾頓蛋白質。
帶有表達質粒pMoN320 pMoN3214，pBGHex-1及pMoN3215的細菌貯存方法如下，用這些質粒(pMoN3209或pMoN3215)或pMoN3214，或pBGHex-1)轉化了的E.Coli W3110的單菌落，放入5m′加有12.5μg/ml四環素的LB在37℃下通氣生長過夜。從每一過夜培養物裡取出1m(等分成液分別地加到各個含有25mlLB和12.5μg/ml四環素的三角瓶裡生長至oD600＝1.0，然後把每個瓶裡的細胞用6000Xg在4℃下離心5分鐘收集。離心集成小丸逐個地再懸浮在12毫升加有7.5%(V/N)DMSO的LB裡並且用1毫升等分試液立即在幹水上凍結。這些細胞隨後就貯存在一個液氮瓶內。另外，大約10毫克純化了的質粒DNA可貯存在-80℃。
b.pGH(A)DNA順序的表達如圖10所示，重組的運載體M13mp9/pGHex-1(a/a)上的pGH(A)密碼順序可代替在修飾過的pBGHex-1表達運載體上所帶的bGH(L)DNA密碼順序。一個修飾過的表達運載體pBGHex-1包括一個pBGHex-1表達載體，其上位於色氨酸啟動子(ptrp)上遊的ECoRI限制性位點已經被除去(見圖9)。已修飾的pBGHex-1＊表達運載體是先用pBGHex-1＊的ECoRI部分酶介之後用Sl核酸酶處理除去其粘性端面創建成。這種經限制性酶切的pBGHex-1運載體隨後用J4DNA連接酶環化並用它轉化E、ColiJM101，以上皆按前面所說方法進行。第二步就是從單菌落的質粒DNA中篩選帶有pGH(A)密碼順序的590對鹼基的EooR1/HindⅢ片段以及帶有色氨酸啟動區(ptrp)順序的1050對鹼基的ECoR1/pat1片段(見圖9)。這種ECoR1酶切位點的除去，使得在正確方位上把pGH(A)密碼順序插到pBGHex-1＊表達運載體上去的專性位點插入過程變得簡便，如圖10所示，由此形成的這種重組的表達運載體在下文皆稱作PMoN3213。含有pMoN3213的混合物隨後用來轉化E.Coli W3110，而且如上所述一樣對生長出的轉化體進行篩選。含有pMoN3213的E、COli W3110有-ATCC的登記號53023。在pBGHex-1＊表達運載體裡用pBGH(A)密碼順序取代pBGH(L)密碼順序的證實是用分離pMoN3213DNA，並隨後用E(oR)及HindⅢ酶切上述表達運載體產生出590對鹼基片段，以及用HaeⅢ酶切割表明pGH(A)DNA密碼順序裡含丙氨酸密碼子導致額外的一種HaeⅢ限制性酶片段的存在等方法進行。在pMoN3212表達運載體裡有pGH(A)DNA順序存在的最後確認是把EcoRI/HinclⅢ的590對鹼基的片段按前面所說方法作部分序列測定。
pGH(A)DNA密碼順序的表達以及pGH(A)在E.Coli W3110內的生產是按前所說生產bGH(A.L)及bGH(A.V)所提出的作法實現的。證明22，000道爾頓蛋白質的高水平同樣地是像前面所說那樣用SDS/pAGE來完成的。
帶有pMoN3212表達運載體的E.Coli W3110可按前面所說的那樣保存的，而且供大規模(10-100升發酵)生產pGH(A)用的亦像前面所說那樣進行。這種100升批量發酵的pGH(A)蛋白質含量按ROSner等人，J.lmmunol.Methods(1982)52175-181用放射免疫法測定產量接近1克/升肉汁培養基。
例四完成這個實例是為了測定在細菌裡生產的bGH(A、L)、bGH(A、V)met-bGH(V)、met-bGH(L)及pGH(A)等導源蛋白質的N端胺基酸順序而作為本發明方法的實例。
這種在大腸桿菌所產生的促生長激素多肽是從含有bGH(A.L)，bGH(A、V)met-bGH(V)met-bGH(L)或pGH(A)的粗而可溶的折射體中用按KriviROwold，Hybridoma(1984)3151-161所說的免疫吸附層析法被純化的。用免疫吸附層析法純化的所有三種促生長素品種似乎都比按Laemmli，Nature(1970)227680-685的方法用SDS-pAGE分析在7.5-15%(W/V)梯度凝膠裡處理所得/μg純化蛋白質所得95%純度要高。純化後的bGH品種的蛋白溶度按常規的高壓液相層析法分析。
由免疫吸附層析純化供N-端序列分析使用的蛋白質要對水充份透析，然後親水化。在作N-端序列分析之前，把純化蛋白質再懸浮在含有50毫摩爾重碳酸胺加0.1%(W/V)SDS的重碳酸胺緩衝液裡，而且對相同的緩衝液透析以除去殘留的tris(羥甲基)氨基甲醇(tris)及甘氨酸。然後用「應用生物系統」的蛋白質順序分析儀470A型(Applied、Biosystems，lnC.Foster(ity CA)按HunKapiller等人，(1983)，Methods in Enzymol、91399-413 and Hunkapiller等人(1983)，Method-SinEngmol、91486-493，所說的方法把所有的都進行N-端的序列分拆。
後面的表2列出了幾種bGH(A.L)，bGH(A.V)，met-bGH(V)，met-bGH(L)及pGH(A)多肽製品序列分析的結果。是N-端蛋氨酸的蛋白質含量是作為樣品內生長激素總量的百分比而列於表內的。兩種方法都在蛋氨酸定量中使用。使用直接法，NH2-met-ala-phe的量……在主要為NH2-ala-phe…組群裡根據遲滯訊號的差導進行計算。由於這一方法取決於對「正常」順序延遲滯的估計。這種延遲各環不同，所以只能是對NH2-ala-phe順序的粗略估計。直接法包括ECdan的降解反應，它能在用高壓液相層析從化學幹擾裡(Hplc)分開pTH-met，之後對pTH-met和pTH-ala的訊號強度進行比較。「pTH」指的是苯基-硫化乙內醯尿。確切地說，這個Edman降解順序反應是由與N端胺基酸作用的試劑組成，它促使胺基酸斷裂並隨之釋放出那個胺基酸的pTH-衍生物，這後一過程只要游離胺基酸汙染是低就會給met-ala-phe的百分比作出好的估計。根據後表2所列的N-端序列分析的結果表明，當N-端蛋氨酸之後是苯丙氨酸就見不到蛋氨酸加工的證據。然而有80%或更多的從MBs(A.L)及MBs(A.V)基因結構所產生的分子在其N-端具有丙氨酸而不是蛋氨酸。從不同發酵生產裡得到的細胞其N-端蛋氨酸的加工過程是各不相同的，但至少有80%生長激素分子經常發生的。此外，在轉化微生物裡生產生長激素的生產水平接近細菌蛋白質總量10-15%。
表2met-bGH(L)，bGH(A、L)，bGH(A.V)及bGH(A)蛋白質N-端順序分析%N-端蛋氨酸樣品 間接法 直接法met-bGH(L) 92.0 100.0bGH(A、L) 20.3218.4210.8 ＜6.0bGH(A、V) 7.52＜3.0216.7 9.0pGH(A) 16.7 17.0met-bGH(V) 沒有做 100.01、具N-端蛋氨酸蛋白質的含量是按樣品中生長激素總量的%列出2、兩個數字代表從2個單獨的發酵中純化而得蛋白質的數據。
例五完成這個實施例是為要確定在細菌中產生的bGH品種在奶牛中刺激牛奶增產的能力。如後面表3所示，bGH(A，V)和met-bGH(V)都有不可予計的刺激牛奶增產，其增加的程度比與其相當含亮氨酸的類似物，bGH(A，L)和met bGH(L)都大。此外受試的纈氨酸bGH品種對亮氨酸bGH品種進行集體比較時，也在統計上表現出牛奶產量增加大(P＝0.02)。
所進行的試驗簡述如下用荷蘭母牛在其第二，第三的三個月試乳期間每天單給5毫升重碳酸鈉溶液，pH9.8±.5(這裡當作對照樣本)或給以含約25毫克bGH(A，V)，bGH(A，L)，met-bGH(V)或met-bGH(L)(這裡，集合當作受試生長激素者)。所有受試生長激素者和對照樣本都用每天肌肉注射到半腱肌肉中的腸胃外給藥方式持續21天。每天上午和下午記錄每頭奶牛產奶數，在第一天注射之前開始的6天直到第21天都要記錄，牛奶脂肪，蛋白以及體細胞每周都要用DHTA實驗室的測試方法在Missowi，springfield，65803，DHIA測試中心進行分析。結果列在表3中，下面可說明的是從母牛給以bGH(A，V)所增加牛奶產量比給以bGH(A，L)的大50%，而給以met-bGH(V)比給以met-bGH(L)高約17%。通過這個發明的纈氨酸bGH品種所提供的這樣出於意料的生產能力優點，很明顯，對牛奶牧場主是有著很大的遊在經濟效益。
權利要求
1.本發明其特徵是至少包含有一個在126位或其附近含有纈氨酸的bGH品種成分，其中所說品種的濃度，根據所有bGH在所說成分中的重量，實質上是比在垂體收集的bGH中同樣含有纈氨酸品種的濃度要大。
2.根據權利要求
1的成分，其中所有的bGH基本上是所說含有纈氨酸品種。
3.根據權利要求
1的成分，適合於奶牛施用。
4.根據權利要求
1的成分，當給奶牛施用時，它提供增加該奶牛的泌乳量超過給該奶牛同樣施用等摩爾的垂體所收集的bGH成分所得的泌乳量。
5.根據權利要求
1的成分，給奶牛施用時，它通過該奶牛提供增加的泌乳量超過給該奶牛同樣施用等摩爾bGH(A，L)所得的泌乳量。
6.根據包含的成分基本上是純的纈氨酸bGH品種。
7.根據權利要求
6的成分其中纈氨酸bGH品種包括bGH(A，V)。
8.本發明其特徵是包含的成分基本上是純的纈氨酸bGH品種，它使奶牛牛奶產量增加的測定數大於施用其它相同的亮氨酸bGH品種等分子量的測定數。
9.根據權利要求
8的成分，其中基本上純的bGH是從由bGH(A，V)和met-bGH(V)所組成的群中篩選到的。
10.本發明其特徵是包含纈氨酸bGH品種成分通過重組DNA技術在微生物中產生。
11.增加奶牛泌乳的方法包括給所說的奶牛施用根據權利要求
1，4，或5的成分的泌乳增加給量。
12.增加奶牛泌乳的方法包括給所說的奶牛施用根據權利要求
1，2，6，或10的成分的泌乳增加給量，其中導致的泌乳增加量超過分別施用所收集的垂體bGH的等摩爾的泌乳增加量。
13.增加奶牛泌乳的方法包括給所說的奶牛施用根據權利要求
1，6，或10的成分之泌乳增加給量，其中導致所說的奶牛泌乳增加量超過以分開施用其他相同的亮氨酸bGH品種的等摩爾量的泌乳增加量。
14.在奶牛中增加牛奶的方法，其特徵是包括施用含有基本上純的纈氨酸bGH品種的泌乳增加給量的成分。
15.根據權利要求
14的方法其中纈氨酸bGH品種包括bGH(A，V)。
16.用細菌生產具有N-端丙氨酸的異源多肽的方法其特徵包括，促使染色體的DNA在選擇過的細菌中表達，所說的DNA含有所說多肽的密碼子，在它前面緊接有包含起始信號/蛋氨酸密碼子1個到約3個的蛋氨酸密碼子，以及回收在所說的細菌內產生具N-端丙氨酸的多肽產物。
17.根據權利要求
16的方法，其中在所說的細菌內由所說的DNA表達產生的多肽，最少約有它的80%重量含有N-端丙氨酸。
18.根據權利要求
16的方法，其中細菌是大腸桿菌(E.coli)。
19.根據權利要求
16的方法，其中所說產物多肽所含的胺基酸序列基本上與天然存在的真核生物多肽相同。
20.根據權利要求
19的方法其中所說的真核生物多肽具有生長激素活性。
21.根據權利要求
19的方法，其中所說的多肽產物具有使泌乳增加的活性。
22.根據權利要求
16的方法可製備有N-端丙氨酸的多肽。
23.根據權利要求
19的方法製備得的bGH(A，L)和bGH(A，V)中選得的多肽成分實質上是所說的無牛源蛋白質的成分。
24.包括pGH(A)的成分實質上沒有豬源蛋白質並可用權利要求
19的方法製備。
25.包括PGH(A)的成分其特徵實質上沒有豬源蛋白質。
26.根據權利要求
25的成分在加強成豬前生長是有用的。
27.本發明其特徵是重組DNA運載體是從細菌質粒和噬菌體中選得的，插入在每個上面的DNA含有1個約到3個相互鄰接的蛋氨酸密碼子，緊跟著的是從bGH(A，L)，bGH(A，V)和PGH(A)中選得的多肽密碼子，所說的蛋氨酸密碼子包含有轉譯起動信號/蛋氨酸密碼子，所說的運載體是能指導所說的DNA在細菌中表達的。
28.本發明其特徵是基因包括有一個在細菌中起功能的啟動子，一個核糖體結合位點，一個到約三個蛋氨酸密碼子，緊接著的是有N-端丙氨酸的異源多肽的編碼序列，其後緊接的是轉譯停止信號，所說的蛋氨酸密碼子包括轉譯啟動信號/蛋氨酸密碼子。
29.使奶牛增加泌乳的方法，其特徵是包括施用實質上無牛源蛋白質的bGH(A，L)的泌乳增加給量。
專利摘要
在細菌中生產具N-端丙氨酸不具N-端蛋氨酸的多肽的方法。所表達的NA順序有丙氨酸密碼子，直接緊靠的至少有一個蛋氨酸密碼子，並供具有基本上與這類天然存在的真核生物蛋白質的各種牛和豬生長激素品種的胺基酸順序的表達。在另一個重要的實施例中，本發明提供一類包含一定的含纈氨酸生長激素品種的成分，它在泌乳的哺乳動物中增加牛奶產量數比用其他相同的亮氨酸生長激素品種成分要大。
文檔編號C12N15/74GK86101830SQ86101830
公開日1986年9月3日 申請日期1986年2月21日
發明者格溫·格拉博斯基·克裡瓦 申請人:孟山都公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan