人卵巢間皮細胞及其分離和使用方法

2023-07-26 21:02:46 3

專利名稱：人卵巢間皮細胞及其分離和使用方法
技術領域：
本發明屬於發育生物學和細胞生物學領域。具體而言，本發明涉及能夠分化成卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞的卵巢間皮細胞群體、分離卵巢間皮細胞的方法、卵巢間皮細胞的表徵、和卵巢間皮細胞的用途。
背景技術：
卵巢癌是女性死於癌症的最常見起因之一(Boring C.C.等人，CA-Cancer J.Clin.，4119-36，1991)。在大約80-90％的卵巢癌病例中，認為卵巢表面上皮是發生癌性轉化的組織源(NicosiaS.V.，《Pathology of Human Neoplasms》即人腫瘤病理學，紐約，Raven出版社，第435-486頁，1988；Scully R.E.，Am.J.Pathol.，87686-720，1977)。卵巢表面上皮(OSE)是覆蓋卵巢表面的細胞單層，而且在卵巢門處與體腔間皮相連(Dubeau L.等人，AnticancerResearch，101233-1240，1990)。認為OSE細胞衍生自覆蓋性腺嵴的間皮細胞。間皮細胞基質化，遷移到卵巢內，並成為顆粒細胞。顆粒細胞(卵巢中的主要內分泌細胞類型之一)首先在出生前階段作為圍繞卵母細胞的單層細胞出現於原始卵泡。當每個卵泡變得活潑時，卵母細胞開始變大，而顆粒細胞開始分裂，數目增加，並分泌雌激素。當卵泡成熟時，顆粒細胞停止分裂，而卵泡在稱為排卵的過程中噴出卵母細胞。排卵後，顆粒細胞就分化成分泌孕酮的發育中黃體的黃體細胞。
由於缺乏人卵巢組織模型，因而難以確認卵巢表面上皮是否癌性生長的源頭。另外，由於仍在改進能夠分離OSE細胞並仍然保持其原始特徵的培養條件，因而缺乏關於卵巢表面上皮細胞在卵子發生和卵泡形成過程中的發育的理解。能夠可靠分化成多種細胞類型(諸如OSE細胞和顆粒細胞)的卵巢前身細胞的鑑定、分離、和表徵對於理解卵巢細胞的生物學和為什麼發生癌性轉化(像卵巢癌)及(或許)如何能夠預防轉化可能是重要的。然而，卵巢前身細胞像許多前身細胞一樣，數目較少且難以分離。一旦分離了，卻難以培養卵巢前身細胞而又保持它們的前身性狀。推測存在顆粒細胞和OSE細胞的前身，但是迄今完成的工作只分離得到OSE細胞和顆粒細胞，而未能分離得到這兩種細胞類型的共同前身。
已經有關於人OSE細胞的分離和培養方法的幾份報告(Kruk P.A.等人，Laboratory Investigation，63(1)132-136，1990；SiemensC.H.和Auersperg N.，Journal of Cellular Physiology，134347-356，1988；Auersperg N.等人，In Vitro，20(10)743-755，1984)。在這些報告中，分離和培養的人OSE細胞早已處於最終分化形式。還報告了兔OSE細胞和顆粒細胞的分離和表徵(Piquette G.N.和Timms B.G.，In Vitro Cell.Dev.Biol.，26471-481，1990)。然而，其中OSE細胞早已分化，因而使得對與早期OSE發育相關的事件或早期OSE發育過程中的早期癌性轉化的研究工作變得困難。有些研究項目已經完成了顆粒細胞前身的鑑定。通過隨機X染色體滅活技術和使用磷酸甘油酸激酶-1(PGK-1)(糖酵解酶變體)的X連鎖異源酶變體，測定得知小鼠卵巢中顆粒細胞克隆前身的數目較少(大約5個)(TelferE.等人，J.Reprod.Fert.，84105-110，1988)。涉及卵巢顆粒幹細胞的其它研究證明顆粒細胞而非卵母細胞是卵巢中端粒酶活性的來源，因而，正如作者所述，他們的結果支持他們的假設即顆粒細胞是由一群幹細胞產生的(Lavranos T.C.等人，Biol.of Reproduction，61358-366，1999)。卵巢前身細胞研究中的一種考慮提倡使用胎兒而非成年卵巢作為細胞來源，因為胎兒中的前身細胞可能具有比成人更高的活性和更多的數目。為此，已經描述了來自稱為卵巢網的卵巢區域的胎兒上皮細胞，但是並未描述這些細胞具有分化成任何其它類型的卵巢間皮細胞的多能性(Dubeau等人，Anticancer Research，101233-1240，1990)。
因此，需要鑑定、分離、培養、和表徵具有多能性的卵巢間皮細胞的方法。本文所述方法克服了許多上述缺點，還提供了相關優勢。
發明概述本發明涉及發育和細胞生物學領域。在一個方面，本發明涉及基本純的人卵巢間皮細胞群體，它們具有分化成卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞的多能性。
在另一方面，本發明涉及分離基本純的人卵巢間皮細胞群體的方法，它們具有分化成卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞的多能性。
在還有一個方面，本發明涉及維持基本純的人卵巢間皮細胞群體的方法，它們具有分化成卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞的多能性，以及維持或培養這些卵巢間皮細胞並使之保持多能性的方法。
在還有一個方面，本發明涉及提供免疫原的來源的方法，以及基本純的卵巢間皮細胞群體作為免疫原的用途。
在還有一個方面，本發明涉及通過將基本純的人卵巢間皮細胞群體導入非人哺乳動物受體來生成人卵巢組織模型的方法。
在另一方面，本發明涉及提供細胞療法的方法，即將基本純的人卵巢間皮細胞群體導入異源受體中能夠支持卵巢細胞的增殖和生長的部位。
在另一方面，本發明涉及提供卵巢間皮組織特異性生物學成分的來源用於開發藥物的方法，其中基本純的人卵巢間皮細胞群體用作卵巢間皮細胞生物學成分的來源，而且一種或多種上述卵巢間皮生物學成分是開發中藥物的作用靶。
在另一方面，本發明涉及提供核酸或蛋白質的來源用於生物測定法開發的方法，其中基本純的人卵巢間皮細胞群體用作核酸或蛋白質的來源，而且所述核酸或蛋白質用作生物測定法或生物測定法開發中的一種或多種主要成分。
圖的簡述本專利的文件包括至少一幅彩圖。專利和商標事務所將在收到請求和必需的費用後提供本專利及彩圖的拷貝。


圖1A的顯微照片顯示了人卵巢間皮細胞自實體卵巢組織向外生長。圖1B的顯微照片顯示了人卵巢間皮細胞作為細胞簇在懸浮培養中的生長。圖1C的顯微照片顯示了人卵巢間皮細胞作為單層的生長。
圖2顯示了免疫組織化學分析的結果，其中單克隆抗體5C8特異識別人胎卵巢組織中的卵巢間皮細胞。圖2A顯示了100x的放大倍數，圖2B顯示了400x的放大倍數。
圖3顯示了卵巢間皮細胞簇的免疫過氧化物酶染色結果。圖3A顯示了卵巢間皮細胞關於細胞角蛋白19的染色。圖3B顯示了卵巢間皮細胞關於細胞角蛋白13和16的染色。圖3C顯示了卵巢間皮細胞關於細胞角蛋白10、11、和18的染色。圖3D顯示了卵巢間皮細胞關于波形蛋白的染色。圖3E顯示了卵巢間皮細胞關於受到單克隆抗體5C8識別的卵巢間皮細胞表面抗原的染色。
圖4顯示了組織重組實驗的結果，其中將人卵巢間皮細胞與大鼠尿殖竇間充組織重組並移植到小鼠中。圖4A、4B、和4C顯示了卵巢表面上皮細胞類似囊狀結構的形態。
圖5顯示了免疫組織化學分析的結果，其中能夠通過抗卵巢單克隆抗體5C8特異檢測(棕色，以箭頭指示)卵巢癌中的癌性上皮細胞。
發明詳述為了幫助本領域技術人員實踐本發明而提供下文詳述。不應將詳述解釋成對本發明的限制，因為本領域普通技術人員可以修改本文公開的實施方案而不違背本發明的精神和範圍。在整篇公開書中，引用了多種發表物、專利、和已發表專利說明書作為參考。將這些發表物、專利、和已發表專利的公開書完整收入本公開書作為參考。
除非另有說明，本發明的實踐將採用免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、和重組DNA的常規技術，它們屬於本領域的技術範圍之內。參閱例如《MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL》即分子克隆實驗室手冊，Sambrook等人，第2版，1989；《CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY》即分子生物學通用方案，F.M.Ausubel等人編，1987；《METHODS IN ENZYMOLOGY》即酶學方法叢書，Academic出版公司，PCR 2PRACTICAL APPROACH即PCR 2實踐方法，M.J.MacPherson、B.D.Hames、和G.R.Taylor編，1995；《ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL》即抗體實驗室手冊，Harlow和Lane編，1988；和《ANIMAL CELL CULTURE》即動物細胞培養，R.I.Freshney編，1987。定義在用於說明書和權利要求書時，單數形式「一個」和「一種」包括複數指稱，除非文章另有清楚說明。例如，術語「一個細胞」包括一群細胞，還包括它們的混合物。
在用於說明書和權利要求書時，術語「卵巢表面上皮細胞」和「OSE細胞」可以互換，指人類來源的「卵巢表面上皮細胞」和「OSE」細胞。
「卵巢間皮細胞」指衍生自中胚層且早就定型成為具有卵巢本質的細胞的人類細胞。更具體的說，本發明的卵巢間皮細胞指處於間皮細胞階段與成為最終分化成卵巢表面上皮細胞或顆粒細胞之前階段之間的細胞。本發明卵巢間皮細胞就是駐留在間皮細胞階段，而且恰好在定型成為最終分化的卵巢間皮細胞類型之前。本發明的卵巢間皮細胞具有成為卵巢表面上皮細胞或顆粒細胞的多能性。
「多能性」指細胞仍能成為多種細胞但不再能夠成為身體內任何細胞類型(即不再全能)的階段。「多能」細胞不是指「幹細胞」，而是指「祖細胞」，因為它們是一種或多種細胞群體的祖先。
在用於本文時，「預定的卵巢」指多能細胞處於原始卵泡階段之前且處於最終分化的卵巢細胞(諸如顆粒細胞或卵巢表面上皮細胞)階段之前的發育階段。稱為「預定的卵巢」的細胞被定型成為卵巢細胞，但尚未開始發育成最終分化的卵巢細胞。引起預定的卵巢細胞開始分化的因素有多種。非限制性範例包括暴露於血清、暴露於孕酮、雌激素、促黃體素(LH)、與周圍組織的接觸、細胞的微環境、和與周圍組織的細胞-細胞接觸。
「抗體」指能夠結合抗原的免疫球蛋白分子。在用於本文時，該術語不僅涵蓋完整的免疫球蛋白分子，還包括抗獨特型抗體、突變體、片段、融合蛋白、人源化蛋白質、和包含具有所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的修飾。
術語「抗原」指包含抗體能夠結合的一個或多個表位的分子。抗原可能是具有免疫原性的分子，即能夠誘導免疫應答。抗原被認為是一類免疫原。在用於本文時，術語「抗原」意欲指全長蛋白及其包含一個或一群表位的肽片段。
術語「表面抗原」和「細胞表面抗原」在本文中可以互換，指細胞的質膜成分。這些成分包括但不限於整合型和外周型膜蛋白、糖蛋白、多糖、脂類、和糖基磷脂醯肌醇(GPI)連接蛋白。「整合型膜蛋白」指穿越細胞質膜脂雙層的跨膜蛋白。典型的整合型膜蛋白包含至少一個跨膜區段，它通常包含疏水胺基酸殘基。外周型膜蛋白不伸入脂雙層的疏水內部，它們通過與其它膜蛋白的非共價相互作用而結合膜表面。GPI連接蛋白是通過插入脂雙層的脂尾而停留在細胞表面的蛋白質。
術語「單克隆抗體」在用於本文時指具有基本同質的抗體群體的抗體組合物。它並非意欲限制抗體的來源或生成方式(如通過雜交瘤或重組合成)。單克隆抗體是高度特異的，針對單一的抗原位點。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。
「單克隆抗體群體」指一群異質單克隆抗體，即群體所包含的各個單克隆抗體可能識別彼此不同的抗原決定簇。
「免疫原」指能夠誘導免疫應答的任何物質。將稱為免疫原的物質描述成具有「免疫原性」。誘導免疫應答包括但不限於激活體液應答(如生成抗體)或細胞應答(如引發細胞毒性T細胞)、炎症應答(如募集白細胞)、和分泌細胞因子和淋巴因子。
術語「異源」在指稱用於免疫或移植的細胞時指細胞衍生自基因型與受體不同的實體。例如，異源細胞可以衍生自相對於受體的不同物種或相同物種的不同個體。衍生自一種物種的個體的胚細胞與相同物種的成體是異源的。「異源」在指稱受體時指受體的基因型與將要導入受體的細胞的來源不同。
「外植體」指取自人胎的卵巢組織。通常將外植體用作卵巢細胞的來源。可以通過幾種方法由外植體分離細胞。一種方法是將卵巢組織外植體(整個組織或切成小塊)置於已知成分基本培養基中，並使卵巢細胞由實體組織塊自然遷移到培養基中。另一種方法是將卵巢組織進行酶促消化或機械處理，促使細胞離開實體組織。
若細胞衍生自胚胎的三種胚層(外胚層、內胚層、或中胚層)之一，則細胞分別具有「外胚層」、「內胚層」、或「中胚層」起源。外胚層是外層，生成表皮細胞和神經系統。內胚層是內層，生成消化管的內襯及其相關器官。中間層即中胚層生成幾種器官(包括但不限於心臟、腎臟、間皮、和性腺)、結締組織(如骨、肌肉、腱)、和血細胞。
在用於本文時，「基本純的」卵巢間皮細胞群體指包含至少大約85％、優選至少大約90％、甚至更優選至少大約95％或更多卵巢間皮細胞的細胞群體。
術語「培養基」和「細胞培養基」可以互換，指培養過程中哺乳動物細胞生長其中的水性微環境。培養基包含物理化學、營養、和激素微環境。
「已知成分培養基」、「基本細胞維持培養基」、「營養培養基」、和「基本營養培養基」在本文中可以互換，指包含培養過程中細胞存活和/或生長所必需的營養和激素需求且其成分已知的培養基。通常通過加入生長和/或存活所必需的營養物和生長因子來配製已知成分培養基。已知成分培養基通常提供至少一種來自下列一項或多項的成分1)所有必需胺基酸，通常是基本的一套20種胺基酸加胱氨酸；2)能源，通常是碳水化合物的形式，諸如葡萄糖；3)維生素和/或有低濃度需要的其它有機化合物；4)游離脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定義為通常有很低濃度(通常是微摩爾級範圍)需要的無機化合物或天然存在元素。已知成分培養基還可任選的添加一種或多種來自下列任何項的成分1)一種或多種促有絲分裂劑；2)鹽和緩衝液，例如鈣、鎂、和磷酸；3)核苷和鹼基，諸如腺苷、胸苷、次黃嘌呤；和4)蛋白質和組織水解物。
在用於本文時，「條件培養基」指不含完整細胞、卵巢細胞曾在其中生長的培養基。在營養培養基中生長的卵巢細胞可能釋放促進前分化原始狀態的卵巢間皮細胞連續存活、生長、和維持的因子。條件培養基可用於重建細胞沉澱，或者加到早已存在於培養板中的細胞中。條件培養基可以單獨使用，或者添加用於飼養卵巢細胞的營養培養基。
「標準保溫條件」指在放置細胞的保溫箱中為了組織培養而設計的物理化學條件。標準保溫條件通常是大約37℃和大約5％CO2及增溼。應當在無菌條件下執行所有組織培養技術和設備。
「卵巢間皮細胞簇」、「卵巢間皮細胞球」、和「卵巢細胞簇」在全文中可以互換，指卵巢間皮細胞群體塊。卵巢間皮細胞簇能夠形成約略類似球形的三維結構。
「移植重組體」在用於本文時指卵巢間皮細胞簇與間充組織一起放置的組合單位。間充組織可以具有卵巢或非卵巢來源。間充組織可以來自移植受體的異源物種。間充組織還可以來自卵巢間皮細胞來源的異源物種。可以將移植重組體在底層(優選柔軟的生物學底層，如瓊脂)上保溫一段時間，即大約1小時-96小時、更優選大約6小時-48小時、甚至更優選過夜(大約24小時)。
「血清」在用於本文時指哺乳動物血液中在血液凝結後剩餘的流動相。
「血清生物分子」在用於本文時指在血清中發現的生物學組合物。範例包括但不限於清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、和γ-球蛋白。血清生物分子可以包括在血清中自然發現的或衍生自對血清的加工和處理的生物學組合物(整個或部分)。
術語「哺乳動物」指溫血脊椎動物，包括但不限於人、小鼠、大鼠、兔、猿猴、運動動物、和寵物。人卵巢間皮細胞的分離和維持本發明的卵巢間皮細胞是由人胎卵巢組織分離得到的。胎兒的年齡在大約1周-大約40周之間、優選大約8周-大約30周之間、甚至更優選大約17周-大約25周之間。可以通過大體解剖、外觀、和在胎兒中的定位來鑑定卵巢組織。辨別卵巢的幾個大體解剖和外觀特徵是其新月形狀和在腹腔中的定位。卵巢還可能與輸卵管相連。一旦進行了鑑定，即首先通過基本營養培養基的清洗來清理胎兒卵巢組織，然後進行顯微解剖。顯微解剖的目的是除去與卵巢相連的組織，將實體卵巢組織塊分成完整組織塊的小塊使得基本營養培養基更多的接觸組織塊中的卵巢細胞，和/或將卵巢細胞與卵巢組織塊分開。顯微解剖的非限制性範例包括實施機械剪切強制的裝置(即勻漿器、缽與杵、搗碎機、等)、實施切割或撕裂的裝置(即解剖刀、注射器、鑷子、等)、或超聲裝置。或者，顯微解剖胎兒卵巢組織的另一種方法是使用酶處理。本領域眾所周知用於顯微解剖組織的多種酶。一種方法包括在維持由卵巢組織分離的細胞存活的緩衝培養基中使用膠原酶-分散酶消化經部分剪切的卵巢組織。酶量取決於胎兒的年齡和卵巢組織的大小。在一個實施方案中，使用膠原酶-分散酶的酶處理可能降低總的細胞產量。因此，應降低酶的用量，或者根本不用。在其它實施方案中，酶處理可能增加總的細胞產量。因此，可以單獨使用酶處理，或者聯合顯微解剖方法使用。極其多種基本細胞維持培養基可用於將液體的pH維持在促進卵巢間皮細胞存活的範圍內並提供能夠在其中進行酶促消化的額外體積。非限制性範例包括F12/DMEM、Ham氏F10(Sigma)、CMRL-1066、極限必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏修改Eagle氏培養基(DMEM，Sigma)、和Iscove氏修改Eagle氏培養基(IMEM)。另外，可以使用Ham和Wallace，1979，Meth.Enz.，5844；Barnes和Sato，1980，Anal.Biochem.，102225；或MatherJ.P.和Roberts P.E.，1998，《Introduction to Cell and TissueCulture》即細胞和組織培養導論，Plenum出版社，紐約中描述的任何基本營養培養基。
然後將小塊卵巢組織置於基本細胞維持培養基中。可以使用多種基本細胞維持培養基。範例包括但不限於Ham氏F12培養基、RPMI-1640、和CMRL-1066。為了獲得促進卵巢間皮細胞存活和生長的更佳條件，可以向基本培養基中添加多種營養物。範例包括但不限於胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子、α-生育酚、重組人heregulin、抑酶肽、胎牛血清、和牛血清清蛋白。在一個優選實施方案中，使用下列量的營養物來促進卵巢間皮細胞的存活和生長至少大約10ng/ml胰島素且不超過大約1mg/ml胰島素，更優選大約10μg/ml胰島素；至少大約1μg/ml轉鐵蛋白且不超過大約100μg/ml轉鐵蛋白，更優選大約10μg/ml轉鐵蛋白；至少大約1ng/ml表皮生長因子且不超過大約1000ng/ml表皮生長因子，更優選大約50ng/ml表皮生長因子；至少大約0.1μg/ml α-生育酚且不超過大約1mg/ml α-生育酚，更優選大約5μg/ml α-生育酚；至少大約0.1nM重組人hergulin且不超過大約100nM重組人heregulin，更優選大約10nM重組人heregulin；至少大約1μg/ml抑酶肽且不超過大約100μg/ml抑酶肽，更優選大約5μg/ml抑酶肽；至少大約0.1％牛血清清蛋白(BSA)且不超過大約50％BSA，更優選大約2％BSA。
卵巢間皮細胞由卵巢組織遷移至卵巢組織所處培養基中。在一個實施方案中，卵巢間皮細胞以簇形式由卵巢組織遷移至培養基中。在另一個實施方案中，卵巢間皮細胞以單細胞形式由卵巢組織遷移至培養基中。在另一個實施方案中，由卵巢組織遷移出來的卵巢間皮細胞不再包埋在卵巢組織中，而只是與組織鬆散相連。可以在不同底層上培養卵巢間皮細胞。可以使用的底層的非限制性範例包括纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、聚賴氨酸、硝酸纖維素、尼龍、和聚四氟乙烯。在一個實施方案中，在經層粘連蛋白包被的組織培養板上在上文所述優選營養培養基中培養卵巢間皮細胞。在一個優選實施方案中，在經層粘連蛋白包被的組織瓶中在上文所述優選營養培養基中培養卵巢間皮細胞。組織培養板或瓶的大小與將要置於板或瓶中的卵巢組織的量成正比。熟練技術人員可以通過逐步增加置於組織培養板或瓶中的卵巢組織來確定瓶或板的正確大小。當首次將卵巢組織置於板或瓶中時，培養基就總濁度而言通常是清澈的。當卵巢間皮細胞由卵巢組織碎塊遷移出來後，培養基將變得越來越不透明和越來越混濁。當由於由卵巢組織遷移出來的卵巢間皮細胞的數量增加或由於卵巢間皮細胞的生長而培養基高度混濁時，向板或瓶中加入更多營養培養基以補充卵巢細胞消耗掉的營養物。或者，當隨著卵巢間皮細胞的數量增加而培養基變得混濁時，可以由培養板或瓶取出少量細胞並檢查細胞存活力，例如通過錐蟲藍染色檢查。已經超越限度容納過多細胞的板或瓶將開始顯示細胞存活力下降。熟練技術人員就可以將板或瓶的內容物轉移至更大(如更大的體積)的其它板或瓶以容納數目漸增的細胞。在一個實施方案中，將板或瓶的整個內容物轉移至更大體積的另一個板或瓶。在另一個實施方案中，將卵巢細胞懸浮液分成幾份，將每份置於分開的板或瓶中，然後向卵巢細胞中加入營養培養基(也稱為「傳代培養」)。當在上文所述優選營養培養基中在經層粘連蛋白包被的瓶中培養時，卵巢間皮細胞形成細胞簇。組織培養瓶與層粘連蛋白包被的聯合培養能夠將間充質細胞與卵巢間皮細胞簇分開。間充質細胞遷移遍及整個培養基，而卵巢間皮細胞簇與卵巢組織在物理距離上緊密相連。在另一個實施方案中，在上文所述優選營養培養基中在經層粘連蛋白包被的組織培養板中培養卵巢間皮細胞。在這個實施方案中，卵巢間皮細胞形成單層。
在優選營養培養基中在經層粘連蛋白包被的組織培養瓶中培養的卵巢間皮細胞將形成在物理距離上與卵巢組織緊密相連的細胞簇。當需要富集卵巢間皮細胞時，可以採用的一種方法是通過酶處理解離卵巢間皮細胞，隨後分離卵巢間皮細胞簇。可以用於酶處理的酶的範例包括但不限於膠原酶-分散酶和胰蛋白酶。在一個實施方案中，使用膠原酶-分散酶由培養瓶壁和由卵巢組織解離卵巢間皮細胞簇，優選使用至少大約10％(w/v)膠原酶-分散酶，更優選使用至少大約1％膠原酶-分散酶，最優選使用至少大約0.1％膠原酶-分散酶。使用密度梯度分離卵巢間皮細胞簇。可用於實現細胞分離的化合物包括但不限於血清(即牛血清清蛋白或BSA)、卵清蛋白、蔗糖的非離子型合成聚合物(即菲可TM)、膠體樣聚乙烯吡咯烷酮包被的矽膠(即珀可TM)、聚乙烯吡咯烷酮或PVP、和甲基纖維素。在一個優選實施方案中，使用能夠中和膠原酶-分散酶的密度梯度。這種密度梯度的一個範例是BSA。BSA的用量是優選營養培養基的大約50％(v/v)、更優選大約25％、更優選大約10％、更優選至少大約0.1％、最優選大約1％-3％。在有些情況中，一次密度梯度足以富集卵巢間皮細胞群體。在其它情況中，將需要應用超過一次密度梯度。期望的產物是基本純的卵巢間皮細胞簇群體。
在一個實施方案中，基本純的卵巢間皮細胞簇群體是通過以足以沉澱卵巢間皮細胞簇且使單個間充質細胞留在上清液中的離心速度將卵巢細胞通過密度梯度(像BSA)離心而分離得到的。將包含卵巢間皮細胞的細胞沉澱重懸於足以維持卵巢間皮細胞存活的營養培養基中，並置於經生物學底層(例如層粘連蛋白)包被的組織培養瓶中。可以將整個卵巢間皮細胞重懸液置於一個瓶中。或者，若重懸的卵巢間皮細胞高度富集且具有高密度的卵巢間皮細胞，則可以將卵巢間皮細胞重懸液分到幾個裝有優選營養培養基的瓶中。在一個優選實施方案中，使用下列量的營養物來促進基本純的卵巢間皮細胞群體的存活和生長至少大約10ng/ml胰島素且不超過大約1mg/ml胰島素，更優選大約10μg/ml胰島素；至少大約1μg/ml轉鐵蛋白且不超過大約100μg/ml轉鐵蛋白，更優選大約10μg/ml轉鐵蛋白；至少大約1ng/ml表皮生長因子且不超過大約1000ng/ml表皮生長因子，更優選大約50ng/ml表皮生長因子；至少大約0.1μg/ml α-生育酚且不超過大約1mg/ml α-生育酚，更優選大約5μg/ml α-生育酚；至少大約0.1nM重組人hergulin且不超過大約100nM重組人heregulin，更優選大約10nM重組人heregulin；至少大約1μg/ml抑酶肽且不超過大約100μg/ml抑酶肽，更優選大約5μg/ml抑酶肽；至少大約0.1％(體積比) 牛血清清蛋白(BSA)且不超過大約50％BSA，更優選大約0.5％BSA。
飼養卵巢間皮細胞的頻率可以是每天一次或隔天一次。在一個實施方案中，可以通過用新的營養培養基更換整個舊的營養培養基來飼養卵巢間皮細胞。在另一個實施方案中，可以用曾經培養這些細胞的條件培養基來飼養卵巢間皮細胞。因為要求保護的卵巢間皮細胞對於本發明而言是獨特的，而且將分泌這些細胞特異的因子，所以由卵巢間皮細胞衍生的條件培養基也是獨特的。在本發明中，當在上文所述優選營養培養基中在經層粘連蛋白包被的組織培養瓶中培養時，卵巢間皮細胞形成簇。當底層是經層粘連蛋白包被的組織培養板時，卵巢間皮細胞形成貼壁的基質單層。在本發明的一個優選實施方案中，在卵巢間皮細胞的整個培養過程中維持卵巢間皮細胞彼此的細胞-細胞接觸以促進較高的增殖速度。添加條件培養基也可以促進卵巢間皮細胞更好的生長。熟練技術人員能夠通過隨著向營養培養基中添加漸增量的條件培養基來確定添加條件培養基是否有利於卵巢間皮細胞的生長。可以通過對添加條件培養基之前和之後單位體積培養基中的細胞計數來測定細胞的生長。或者，細胞的存活力(如錐蟲藍)可用於評估向培養條件中添加條件培養基是否有利於卵巢間皮細胞的生長。促進卵巢間皮細胞存活和生長的飼養頻率優選每周一次，甚至更優選每周兩次，最優選隔天一次。本發明的卵巢間皮細胞可以傳代多次而不誘導這些卵巢間皮細胞分化成最終分化的卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞。卵巢間皮細胞的表徵以本文公開的方式分離得到的本發明的卵巢間皮細胞群體具有幾個定義特徵。首先，卵巢間皮細胞處於可以描述成「預定的卵巢」的階段。在間皮祖細胞中，有些預定將成為卵巢間皮細胞。本文要求保護的卵巢間皮細胞群體就駐留在這種發育階段。本發明的卵巢間皮細胞具有成為卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞的能力，但是尚未開始分化成其中任一種細胞。
可以通過形態學或特異標記或者這兩種技術的聯合來實現卵巢間皮細胞的鑑定。顆粒細胞系形成卵泡的壁。顆粒細胞的形態是立方形。可用於檢測卵巢間皮細胞的標記包括但不限於卵巢間皮細胞表面上的波形蛋白、細胞角蛋白(CK)1、5、6、7、8、10、11、13、15、16、18、和19、以及抗卵巢單克隆抗體5C8。可以使用的、對CK和波形蛋白特異的抗體的範例包括但不限於來自Sigma化學公司的抗細胞角蛋白(CK)抗體克隆4.62、克隆8.12、克隆8.13和來自Sigma化學公司的抗波形蛋白抗體克隆13.2。抗CK抗體和抗波形蛋白抗體可用於免疫組織化學或流式細胞計量術中對MTE細胞的直接或間接染色。用於檢測卵巢間皮細胞的標記可用於直接和間接免疫螢光、免疫組織化學、和流式細胞計量術。
在基本營養培養基中將本發明的卵巢間皮細胞維持在它們的原始前分化狀態。本文公開的基本細胞維持培養基或優選營養培養基或者條件培養基可用於在體外培養卵巢間皮細胞。組織培養板上的不同類型的底層可用於獲得卵巢間皮細胞的簇或單層。經層粘連蛋白包被的瓶聯合本文公開的優選營養培養基的使用將產生卵巢間皮細胞簇，而經層粘連蛋白包被的板聯合本文公開的優選營養培養基的使用將產生卵巢間皮細胞單層。本發明的卵巢間皮細胞可以在不含血清的營養培養基或包含血清的營養培養基中培養。正如本領域普通技術人員眾所周知的，通常向營養培養基中添加血清以進一步增強細胞的生長。血清中包含許多血清生物分子，但是本發明的卵巢間皮細胞可以在缺乏這些血清生物分子群體時生長。可以通過添加在血清中發現的一種或多種蛋白質(例如牛血清清蛋白或BSA)來增強卵巢間皮細胞的生長。
本發明的卵巢間皮細胞具有在本文公開的優選基本營養培養基中傳代多次的能力。在每次傳代的過程中和在每次傳代後的任意時間點，多能性得到維持，本發明的卵巢間皮細胞能夠分化成卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞。另外，正如本文公開的，在每次傳代後的任意時間點，卵巢間皮細胞可以用作免疫原、用於細胞療法、用於生物測定法、用於建立人卵巢模型、或用於藥物發現和/或開發。
本發明卵巢間皮細胞的另一個特徵是在移植到受體哺乳動物的腎膜下後能夠分化成卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞。在移植前，卵巢間皮細胞具有分化成顆粒細胞或卵巢表面上皮細胞的能力。正如本文公開的，卵巢間皮細胞可以卵巢間皮細胞簇或單層的形式生長，然後聯合間充組織並置於受體哺乳動物的腎膜下。優選的是，將人卵巢間皮細胞簇聯合大鼠尿殖道間充組織，並置於受體哺乳動物的腎膜下。可以取下部分移植物用於使用標記、形態學、或其聯合的分析來鑑定卵巢細胞。卵巢間皮細胞的用途作為免疫原的用途卵巢間皮細胞的一種用途是作為免疫原。通過本文公開的方法分離和培養的卵巢間皮細胞可以作為免疫原施用於異源受體。可以通過幾種方法來實現卵巢間皮細胞作為免疫原的施用。將卵巢間皮細胞作為免疫原施用於異源受體的方法包括但不限於免疫接種、通過直接接觸(諸如擦拭或刮塗裝置)施用於膜、通過氣霧劑施用於黏膜、和口服施用。正如本領域眾所周知的，免疫接種可以是消極的或積極的免疫接種。可以通過不同路徑來執行免疫接種方法，包括但不限於腹膜內注射、皮內注射、局部注射。免疫接種的受試者包括哺乳動物，諸如小鼠。免疫接種的路徑和方案通常遵循已建立的用於抗體刺激和生成的常規技術，例如每周一次將免疫原注射到小鼠足墊中達幾周。雖然此實施方案採用小鼠，但是可以依照本發明方法操作任何哺乳動物受試者包括人或由此而來的抗體生成細胞，作為生成哺乳動物雜交瘤細胞系的基礎。通常，將小鼠接種免疫原性量的卵巢間皮細胞，然後用相似量的免疫原進行加強。或者，通過外科手術將在非生物學膜基質上生長的細胞移植到宿主哺乳動物腹膜內。最後一次加強後幾天收集淋巴樣細胞(優選來自小鼠的脾淋巴樣細胞)，並由此製備細胞懸浮液用於融合。
使用Kohler B.和Milstein C.，1975，Nature，256495-497的一般體細胞雜交技術，依照Buck D.W.等人，1982，In Vitro，18377-381的修改方案，由淋巴細胞和永生化骨髓瘤細胞製備雜交瘤。可以利用的骨髓瘤系，包括但不限於X63-Ag8.653和來自美國加利福尼亞州聖地牙哥市細胞分配中心(Cell Distribution Center)索爾克研究所(Salk Institue)的細胞系，可用於雜交。該技術包括使用融合劑諸如聚乙二醇或者通過本領域技術人員眾所周知的電手段來融合骨髓瘤細胞和淋巴樣細胞。融合後，將細胞與融合培養基分開，並在選擇生長培養基諸如HAT培養基中培養，以消除未雜交的親本細胞。本文所述任何培養基都可用於培養分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細胞融合技術的另一種變通方法，可以將EBV永生化B細胞用於生成本發明的單克隆抗體。如果需要，將雜交瘤進行擴增和亞克隆，並通過常規免疫測定流程(如放射免疫測定法、酶免疫測定法、或螢光免疫測定法)對上清液測定抗免疫原活性。
可以使用已知流程在體外或在體內培養生成這些抗體的雜交瘤。如果需要，可以通過常規免疫球蛋白純化流程，諸如硫酸銨沉澱、凝膠電泳、透析、層析、和超濾，由培養基或體液分離單克隆抗體。若存在非期望活性，則可以通過例如使製劑流過由免疫原附著於固相而製成的吸附劑並由免疫原洗脫或釋放期望抗體而進行消除。
以這種方式，可以使用本發明的卵巢間皮細胞作為免疫原，生成針對卵巢間皮細胞階段特異性細胞表面抗原的一組新抗體。一旦通過本文公開的方法生成了針對卵巢間皮細胞上的細胞表面抗原的單克隆抗體，就可以將抗體用於幾種用途。為了構建重組抗體或人源化抗體，可以將抗體測序和克隆。卵巢間皮細胞特異抗體的其它用途包括但不限於生物學測試和純化(即例如通過流式細胞計量術或抗體淘選來分離卵巢間皮細胞)、治療性用途(即通過抗體與靶細胞的結合來促進或阻滯細胞的生長或者通過抗體與靶細胞的結合來促進或阻滯細胞團的生長)、生物學標記(即其它卵巢或非卵巢細胞的鑑定)、臨床診斷(即組織樣品中癌性卵巢細胞的鑑定)。
作為免疫原的另一種用途是調控異源受體中總的免疫應答。正如本領域詳細記錄的，導入異源受體的外源物質諸如細胞或器官可以誘導多種免疫應答。免疫應答可能是排斥(如在器官移植中)、T細胞激活(如交叉引發)、無反應性、或耐受的形式。總的免疫應答可能是全身的或局部的。在期望局部免疫應答的情況中，例如在性腺區域中，可以有效量將免疫原諸如卵巢間皮細胞導入性腺區域。可以將數量漸增的卵巢間皮細胞導入異源受體，隨後監測免疫應答，由此以逐步方式測定有效量。可以通過許多方法來監測總的免疫應答(如抗體生成、細胞因子生成、T細胞增殖、無反應性、耐受、等)，包括但不限於ELISA、增殖實驗、使用細胞表面標記的流式細胞計量術、和免疫組織化學。卵巢間皮細胞用於藥物發現的用途卵巢間皮細胞的另一種用途涉及藥物發現。既然尚未以本文公開的方式分離和培養多能的、預定的卵巢間皮細胞群體，那麼卵巢間皮細胞群體可能分泌迄今尚未發現或表徵的蛋白質。因此，由卵巢間皮細胞分泌的蛋白質可以作為作用靶用於藥物發現。在一個實施方案中，可以將藥物製成在體內靶向卵巢間皮細胞上的特異蛋白質。藥物的結合可能促進卵巢間皮細胞分化成卵巢表面上皮細胞或顆粒細胞。當期望卵巢表面上皮細胞或顆粒細胞新生時，例如用於在癌症治療(如化療、放療、等)後取代受損細胞，這種方法可能是有用的。在另一個實施方案中，對卵巢間皮細胞的調控蛋白特異的藥物可用於阻滯特定細胞類型的生長，例如在癌症(即卵巢癌、子宮癌、等)的情況中。卵巢間皮細胞用於細胞療法的用途在另一種用途中，將卵巢間皮細胞系用於細胞療法。卵巢間皮細胞移植是細胞療法的這樣一種範例。在期望不同類型的卵巢細胞(即OSE細胞或顆粒細胞)的情況中，可以採用卵巢間皮細胞移植，因為本發明的卵巢間皮細胞具有多能性，而且能夠分化成卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞。為了實踐這種用途，使用本文公開的方法分離卵巢間皮細胞，並在基本營養、已知成分營養培養基中進行培養。在經層粘連蛋白包被的組織培養瓶中培養卵巢間皮細胞以獲得卵巢間皮細胞簇。將卵巢間皮細胞簇在標準保溫條件下培養大約半天-至少大約一次細胞周期傳代、更優選至少大約兩次細胞周期傳代、最優選至少大約三次細胞周期傳代。然後可以將卵巢間皮細胞聚集體施用於受體並使之分化。或者，卵巢間皮細胞聚集體可用作基因療法的細胞載體，其中用一種或多種基因轉染卵巢間皮細胞，裝入投遞裝置，然後施用於受體。在另一個實施方案中，將卵巢間皮細胞聚集體置於腎膜下，並使之分化成OSE或顆粒細胞。在另一個實施方案中，將卵巢間皮細胞聚集體用於包含細胞且限制其它細胞接近的裝置(即Theracyte)，以限制免疫系統應答。卵巢間皮細胞用於生成人組織模型的用途卵巢間皮細胞的另一種用途是在非人哺乳動物中構建人卵巢組織模型。人卵巢組織模型可用於研究卵巢發育或卵巢癌變的多個方面，這是卵巢癌研究的重要領域。將卵巢間皮細胞球置於間充組織的頂端以形成移植重組體。為了形成移植重組體，將大約1-15個、更優選大約5-8個卵巢間皮細胞球置於間充組織的頂端。間充組織可以是卵巢或非卵巢組織，而且可以衍生自與用於分離卵巢間皮細胞的物種不同的物種。在一個工作實施例中，將人卵巢間皮細胞置於大鼠間充質尿殖道組織的頂端以形成移植重組體。通過首先使用本文公開的方法分離人卵巢間皮細胞，然後聯合來自不同器官的間充組織，熟練技術人員可以逐步方式確定人卵巢間皮細胞生長的最佳組合。在有些實施方案中，使用不同物種(如大鼠)作為間充組織的來源，聯合人卵巢間皮細胞使用。異源物種的使用允許將人特異標記用於測定已分化人卵巢細胞的身份。若使用大鼠間充組織，則假陽性的可能性降低。同樣，使用尿殖道間充組織取代卵巢間充組織降低了鑑定已分化卵巢細胞時假陽性的可能性。在一個優選實施方案中，將大約1-12個卵巢間皮細胞球、甚至更優選大約5-8個卵巢間皮細胞球置於大鼠尿殖道間充組織的頂端。優選使用大約1×104-大約5×106個間充質細胞，甚至更優選使用大約2×105-大約5×105個間充質細胞。然後將包含卵巢間皮細胞球且其置於間充組織上的移植重組體置於受體哺乳動物的腎膜下。可能的受體哺乳動物包括但不限於小鼠和大鼠。通常，在移植部位，供體組織容易受到受體免疫系統的攻擊。為了減輕移植排斥，可以使用幾種技術。一種方法是以亞致死劑量輻射受體，以破壞可能攻擊移植物的免疫細胞。另一種方法是給予受體環孢菌素或其它T細胞免疫遏制藥物。在使用小鼠作為受體哺乳動物時，多種方法可能減輕移植排斥。這樣的一種方法是使用免疫缺陷小鼠(裸鼠或重度聯合免疫缺陷或SCID)。在一個工作實施例中，將人卵巢間皮細胞球置於大鼠尿殖間充組織上，並置於免疫缺陷小鼠的腎膜下。將移植重組體在受體中保留大約1周-大約52周、優選大約5周-大約40周、甚至更優選大約6周-大約8周，然後收穫移植物並分析卵巢間皮細胞分化。在有些情況中，需要取移植物的一小部分用於分析。卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞特異標記(包括但不限於細胞角蛋白1、5、6、7、8、10、11、13、15、16、18、和19、促卵泡激素(FSH)受體、促黃體素(LH)受體、和芳香酶(aromatase))可用於確認已分化卵巢間皮細胞的身份。確認標記的非限制性方法是免疫組織化學分析、免疫螢光、和流式細胞計量術。鑑定已分化卵巢間皮細胞和評估移植成功與否的另一種方法是對卵巢表面上皮細胞(OSE)中存在的17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSDH)或顆粒細胞中存在的δ5-3β-羥基類固醇脫氫酶進行染色。這些標記可以分開使用，或者彼此聯合。另外，這些標記的一種或多種的聯合可以聯合細胞形態學使用，以測定移植的功效。
在一個實施方案中，可以在SCID(重度聯合免疫缺陷)小鼠中構建人卵巢模型。可以如下構建人卵巢模型通過本文公開的方法分離和培養的人卵巢間皮細胞，使用人卵巢間皮細胞生成移植重組體，然後將移植重組體置於小鼠的腎膜下。在植入腎膜下大約1-10周、優選大約6-8周後，收穫移植物或其部分，並進行免疫組織化學分析。卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞特異標記包括但不限於細胞角蛋白(即CK1、5、6、7、8、10、11、13、15、16、18、和19)、促卵泡激素(FSH)受體、促黃體素(LH)受體、和芳香酶。將卵巢表面上皮細胞和顆粒細胞特異標記用於分析組織模型系統的功效。或者，使用已分化卵巢間皮細胞特異標記。這些標記的非限制性範例是細胞角蛋白19、波形蛋白、和單克隆抗體5C8。評估卵巢間皮細胞分化結果的還有一種方法是形態學。卵巢表面上皮細胞具有扁平或柱狀上皮細胞的外觀。卵巢間皮細胞在生物測定法中的用途本文公開的卵巢間皮細胞可用於多種生物測定法。在一種用途中，將卵巢間皮細胞用於測定哪種生物學因子是分化所必需的。通過以逐步方式使用卵巢間皮細胞並聯合不同生物學化合物(諸如激素、特定生長因子、等)，可發現一種或多種特定生物學化合物能夠誘導卵巢間皮細胞分化成OSE細胞。採用相同的逐步聯合，可發現一種或多種特定生物學化合物能夠誘導卵巢間皮細胞分化成顆粒細胞。卵巢間皮細胞在生物學測定法中的其它用途是差異顯示(即mRNA差異顯示)和使用來自卵巢間皮細胞的分泌型蛋白質的蛋白質-蛋白質相互作用。可以通過諸如酵母雙雜交系統等技術來測定蛋白質-蛋白質相互作用。來自卵巢間皮細胞的蛋白質可用於鑑定與卵巢間皮細胞相互作用的其它未知蛋白質或其它細胞類型。這些未知蛋白質可以是下列一種或多種生長因子、激素、酶、轉錄因子、翻譯因子、和腫瘤抑制基因。涉及卵巢間皮細胞和這些細胞形成的蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質-蛋白質或甚至細胞-細胞接觸的效果的生物測定法可用於測定周圍組織(諸如間充組織)如何促進卵巢間皮細胞的分化。
實施例實施例1卵巢間皮細胞的分離和培養由加利福尼亞州Alameda縣的Advanced Bioscience Research即高級生物科學研究所獲得孕齡17-25周的人胎卵巢。取得卵巢，並在組織培養基中在溼冰浴中運至實驗室。抵達後，立即將卵巢清除過多的結締組織，小心的與輸卵管分開，並用新鮮的組織培養基清洗五次。
將卵巢用剪刀剪碎或用刀片切成小塊(厚度小於1mm)。將每個卵巢的組織塊直接置於經層粘連蛋白新鮮包被且裝有10ml本文所述優選營養培養基的T75燒瓶中。可以進行進一步解離，即將卵巢用膠原酶-分散酶(0.5％)於37℃消化30分鐘，但是該步驟將降低卵巢間皮細胞的回收率。在添加10μg/ml胰島素、10μg/ml轉鐵蛋白、5μg/ml α-生育酚、10nM重組人heregulin β1、50ng/ml表皮生長因子、5μg/ml抑酶肽、和2％(體積比)BSA的F12/DMEM中於標準保溫條件培養細胞。在一周內，細胞由外植體遷移出來，並增殖形成匯合的細胞培養物。該階段的培養物包括卵巢間皮細胞和間充質細胞二者。間充質細胞遷移至整個燒瓶，但卵巢間皮細胞保持在組織外植體附近(圖1A)。為了富集卵巢間皮細胞，通過用0.1％膠原酶-分散酶保溫30分鐘，將培養物從培養瓶上脫壁。該處理將間充質細胞解離成單個細胞，但卵巢間皮細胞仍然成簇。然後通過離心穿過BSA梯度(1％-3％BSA溶於F12/DMEM)5分鐘來分離卵巢間皮細胞。吸去包含大多數間充質細胞的上清液，而剩餘的細胞沉澱包含大多數卵巢間皮細胞。將卵巢間皮細胞重懸於培養基，並以1∶5(1份細胞懸浮液5份總懸浮液體積)的稀釋倍數進行塗布。培養基是添加10μg/ml胰島素、10μg/ml轉鐵蛋白、5μg/ml α-生育酚、10nM重組人heregulin β1、50ng/ml表皮生長因子、5μg/ml抑酶肽、和0.5％(體積比)BSA的F12/DMEM。細胞在懸浮液中生長成簇(圖1B)。以這種方式將細胞增殖大約4-5代。當培養基中存在血清或平板經過層粘連蛋白的包被時，在懸浮培養中生長的細胞能夠附著於平板側壁，並生長成卵巢間皮細胞單層(圖1C)。當卵巢間皮細胞保持彼此接觸時，單層培養物傳代良好。實施例2卵巢間皮細胞系的表徵由懸浮培養物收穫卵巢間皮細胞。為了直接將成簇的細胞染色，將細胞簇包埋在最佳切割溫度(OCT)化合物中，並在乾冰上冷凍。由OCT塊上切下冷凍切片(5-10μm厚)，在蓋玻片上解凍，並用3％低聚甲醛固定1小時。通過將來自懸浮培養物的細胞簇在存在2％BSA時塗布在分室載玻片上來製備卵巢間皮細胞的單層培養物。將單層細胞培養物用3％低聚甲醛原位固定1小時。用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗去固定劑後，將細胞在封閉緩衝液(5％山羊血清和0.1％吐溫20溶於PBS)中保溫30分鐘，用PBS漂洗，然後在一抗中保溫1小時，用PBS漂洗，然後用抗小鼠Ig-辣根過氧化物酶保溫1小時。用於表徵卵巢間皮細胞的標記和例示抗體是來自Sigma化學公司的CK19和抗細胞角蛋白抗體克隆4.62(圖3A)、來自Sigma化學公司的CK13和CK16和抗體克隆8.12(圖3B)、來自Sigma化學公司的CK10、CK11、和CK18和抗體克隆8.13(圖3C)，來自Sigma化學公司的波形蛋白和抗波形蛋白單克隆抗體克隆13.2(圖3D)，和抗卵巢上皮單克隆抗體5C8(圖3E)。單克隆抗體5C8是使用卵巢間皮細胞作為免疫原而製備的。實施例3為了生成針對卵巢間皮細胞的單克隆抗體而提供免疫原的來源的方法正如本文公開的分離和培養卵巢間皮細胞，然後作為免疫原用於生成針對卵巢間皮細胞的一組單克隆抗體。每隻小鼠通過一次注射大約1×106個卵巢間皮細胞而每周免疫一次。在每隻小鼠的足墊進行免疫。5次注射後，由小鼠取血，檢查卵巢間皮細胞的滴度。當小鼠中卵巢間皮細胞的滴度超過1∶1000(卵巢細胞∶總細胞)時，處死小鼠，並收穫淋巴結。由淋巴結製備淋巴細胞，並融合骨髓瘤細胞系以生成雜交瘤。通過流式細胞術(螢光激活細胞分揀機或FACS)和免疫組織化學對雜交瘤篩選特異結合卵巢間皮細胞的單克隆抗體。通過重複有限稀釋來獲得克隆雜交瘤細胞系。雜交瘤克隆5C8是結合卵巢間皮細胞的單克隆抗體克隆。圖2顯示了免疫組織化學分析的結果，其中單克隆抗體克隆5C8可特異識別人胎卵巢中的卵巢間皮細胞。實施例4卵巢間皮細胞用於生成人卵巢組織模型的用途為了移植到異源受體中或在異源受體中生成人卵巢組織模型而製備組織移植重組體。為了製備組織移植重組體，將由傳代3次後的單層培養物收穫的卵巢間皮細胞置於大鼠尿殖竇間充組織的頂端。將移植重組體在瓊脂平板上培養大約24小時。然後將移植重組體植入裸鼠腎膜下。在切除移植重組體組織並進行組織學分析前，使植入物生長大約2個月。結果顯示卵巢間皮細胞形成囊狀結構(圖4A、4B、和4C)。在有些囊中，卵巢表面上皮細胞的上皮細胞襯是一層薄薄的、稀疏的、鬆散附著的細胞(圖4A、4B、和4C)。實施例5卵巢表面上皮細胞在生物測定法中的用途使用本發明的卵巢間皮細胞作為免疫原，生成了對卵巢間皮細胞特異的單克隆抗體，諸如克隆5C8。將這些抗體用於對來自卵巢癌女性患者的卵巢組織冷凍切片染色。單克隆抗體5C8在卵巢癌患者中顯示對癌性上皮細胞的強烈染色(圖5)。因此，單克隆抗體(諸如克隆5C8)的功用可以延伸至臨床環境下的診斷目的。
權利要求
1.基本純的人卵巢間皮細胞群體，其中所述卵巢間皮細胞具有分化成卵巢表面上皮細胞或顆粒細胞的多能性。
2.依照權利要求1的卵巢間皮細胞，其中在營養培養基中維持的所述卵巢間皮細胞保留了分化成卵巢表面上皮細胞或顆粒細胞的多能性。
3.依照權利要求1的卵巢間皮細胞，其中所述卵巢間皮細胞能夠通過至少一種細胞表面標記的表達而得到鑑定。
4.依照權利要求3的卵巢間皮細胞，其中所述細胞表面標記是細胞角蛋白。
5.依照權利要求4的卵巢間皮細胞，其中所述細胞角蛋白選自下組細胞角蛋白1、細胞角蛋白5、細胞角蛋白6、細胞角蛋白7、細胞角蛋白8、細胞角蛋白10、細胞角蛋白11、細胞角蛋白13、細胞角蛋白15、細胞角蛋白16、細胞角蛋白18、和細胞角蛋白19。
6.依照權利要求5的卵巢間皮細胞，其中所述卵巢間皮細胞還表達波形蛋白作為細胞表面標記。
7.依照權利要求6的卵巢間皮細胞，其中所述卵巢間皮細胞具有立方上皮細胞的形態。
8.分離基本純的卵巢間皮細胞群體的方法，包括a)顯微解剖人胎卵巢間皮細胞來源；b)將卵巢間皮細胞來源置於營養培養基中，其培養條件足以維持所述卵巢間皮細胞的存活，而且其中營養培養基所含營養物包括胰島素、轉鐵蛋白、表皮生長因子、α-生育酚、重組人heregulin β1、牛血清清蛋白、和抑酶肽；c)維持合適的培養條件，該條件足以使卵巢間皮細胞由卵巢間皮細胞來源遷移至營養培養基中；d)維持合適的培養條件，該條件足以使卵巢間皮細胞形成聚集體或單層結構；並e)將所述聚集體或單層結構傳代培養，以獲得基本純的卵巢間皮細胞群體。
9.向異源受體提供免疫原的來源的方法，包括以在所述受體中有效誘導免疫應答的量將權利要求1所述卵巢間皮細胞群體施用於所述受體。
10.在非人哺乳動物受體中生成人卵巢組織模型的方法，包括將權利要求1所述人卵巢間皮細胞群體施用於所述受體，其中首先在基本營養培養基中維持所述卵巢間皮細胞，然後施用於所述受體中能夠支持所述卵巢間皮細胞的生長和分化的部位。
11.向受體提供細胞療法的方法，包括將權利要求1所述人卵巢間皮細胞施用於所述受體，其中首先在營養培養基中培養所述卵巢間皮細胞，然後施用於所述受體中能夠支持所述卵巢間皮細胞的生長和分化的部位。
12.提供卵巢間皮組織特異性生物學成分的來源用於至少一種藥物的藥物開發的方法，包括分離權利要求1所述人卵巢間皮細胞群體，並使用所述卵巢間皮細胞或其任意部分作為開發中藥物的作用靶。
13.在生物測定法的開發中提供核酸或蛋白質的來源的方法，包括由權利要求1所述人卵巢間皮細胞分離核酸或蛋白質，並使用所述核酸或蛋白質作為生物測定法中的一種或多種主要成分。
全文摘要
本發明公開了基本純的人卵巢間皮細胞群體，以及分離和培養卵巢間皮細胞的方法。通過小心操作卵巢間皮細胞的微環境，可以得到多次傳代，其中卵巢間皮細胞能夠成為卵巢表面上皮細胞或顆粒細胞。另外，本文還公開了使用人卵巢間皮細胞的幾種方法。
文檔編號G01N33/574GK1422332SQ01807877
公開日2003年6月4日 申請日期2001年4月10日 優先權日2000年4月10日
發明者李榮皓, L·鮑爾德, J·P·瑪瑟 申請人:雷文生物技術公司