一種豬源a型流感病毒頭部蛋白及其製備方法和應用的製作方法
2023-07-05 14:14:01
專利名稱：一種豬源a型流感病毒頭部蛋白及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種流感病毒蛋白及其製備方法和應用，特別是一種高表達量的功能性豬源A型流感頭部蛋白。
背景技術：
流行性感冒(簡稱流感)(influenza)是由流感病毒引起的一種人、禽、畜共患的急性傳染病。流感病毒在病毒分類上屬於正粘病毒科。按照病毒核蛋白(nucleocapside protein, NP)和基質蛋白(matrix protein)的特徵，流感病毒分為甲(A)、乙(B)和丙(C) 3個型。根據病毒顆粒表面血凝素(hamagglutinin，HA)和神經氨酸酶( neuraminidase, NA)蛋白抗原性的差別，甲型流感病毒又可進一步分為不同的亞型。目前所發現的甲型流感病毒有16個HA亞型，9個NA亞型。甲型流感病毒於1901年被發現，然而， 人甲型流感病毒直到1933年才被分離出來，它常以流行形式存在，能造成世界性流感大流行。自人流感病毒被發現以來，人甲型流感病毒曾出現過數次亞型毒株即1957年的H2N2 亞型，也稱亞洲流感；1968年的H3N2亞型，也稱香港流感；1977年的Hmi亞型，也稱俄羅斯流感，它們均首發於我國。1997年和1998年在我國香港特別行政區及內地還發現了禽 H5N1和H9N2流感病例。同時，1998年以來WHO每年所公布的流感病毒疫苗株中大多數來自中國。因此，我國被世界公認為流感的多發地。
流感病毒的編碼產物共有10種蛋白，其中RNA聚合酶有3種，分別為PB1，PB2和PA。 核蛋白(NP)，Ml和M2蛋白、NSl和NS2蛋白以及血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)。除NSl 和NS2為非結構蛋白外，其餘均為結構蛋白。甲型流感病毒粒表面有3種結構蛋白，即HA、 NA和M2。HA首先在細胞內質網合成分子量為76kD，含有562-566個胺基酸的HA蛋白前體 (HAO)，隨後HAO分子水解成HAl (47kD)和HA2 U9kD)兩個多肽，前者含有319-3 個胺基酸，後者含有221-222個胺基酸，兩者間靠二硫鍵相連形成具有典型的I型膜蛋白結構的 HA分子。HA蛋白的大部分位於膜外，近HA2羧基末端的疏水區穿過雙層類脂膜，將HA分子鑲嵌在膜上。利用X射線衍射技術證實，流感病毒的HA蛋白以三聚體的形式存在於雙層類脂膜上，即由3個非共價結合的HA蛋白單體所組成。HA蛋白三聚體可分為呈杆狀的基底部和呈球狀的頭部。病毒的受體結合部位呈淺口袋狀，位於HA蛋白的頭部，受體結合部位的胺基酸組成在不同亞型病毒HA蛋白中高度保守。HA在病毒複製中起重要作用，它識別並結合宿主細胞表面上的受體，能使病毒囊膜與宿主細胞膜發生融合，並能刺激機體產生保護性中和抗體。NA在新合成病毒粒釋放過程中起重要作用，它能防止新合成病毒粒相互聚集在宿主細胞表面，無法釋放再去感染新的宿主細胞。它的抗體能減少病毒排洩量和噬斑形成量，但不能中和病毒感染性。M2則起離子通道作用，能使Ml膜打開，病毒RNP (核糖體蛋白)進入胞漿。其餘結構蛋白均在病毒粒內部，無法刺激機體產生保護性抗體。HA蛋白是流感病毒的主要抗原之一，其抗體能中和流感病毒的感染，是主要的保護性抗體。分子流行病學研究的結果證明，流感病毒HA基因，主要是HAl編碼區在持續不斷地、快速的發生突變。造成HA基因快速變化的原因包括其RNA基因本身的快速改變及人群自然選擇壓力兩種因素，前者是由於病毒RNA多聚酶缺少DNA多聚酶所具有的審閱功能，不能糾正RNA複製中的錯誤，是子代病毒的基因不完全忠實於親代病毒。後者指人群特異性免疫對HA蛋白進化的作用。當今預防流感的最有效手段仍是流感病毒疫苗的接種，對於流感疫苗的研究從上世紀30年代起就開始進行。1937年雞胚培養流感病毒獲得成功，使大量生產疫苗成為可能。流感病毒滅活疫苗於1941年在美國首次被批准使用。1943年美國開始在軍隊使用，並證實有效。1945年開始在美國廣泛應用。這種早期粗製的疫苗，使用含流感病毒粒的雞胚尿囊液，經紅細胞吸附和釋放，進行有限的純化，然後加強滅活。接種疫苗後，局部和全身的反應都很強。20世紀60年代，超速離心機和層析色譜技術的應用，使病毒粒純化操作大大提高，製成了純化全病毒粒疫苗。然而，兒童使用時仍可出現不良反應。如用裂解的純化疫苗，不良反應就大為減少。1968年美國首次批准使用裂解疫苗。20世紀70和80年代，在裂解疫苗的基礎上，又研製出了毒粒亞單位(HA和NA)疫苗。在英國使用證實了免疫效果與裂解苗相同，並可用於兒童。1980年英國首次批准使用，而後擴展到其他國家。為了進一步提高疫苗產量，降低成本，研究出了高產的重配疫苗株。如用在實驗室長期適應的A/ PR/8/34(HlNl) (PR8)毒株與野毒株進行重配的疫苗株。這樣重配的疫苗株不但具備野毒株的表面抗原(HA和NA)，同時也獲得PR8毒株在雞胚中的複製能力。近來還應用基因克隆技術,在杆狀病毒絲蠶系統(baculovirus silk worm system)中獲得大量高純度、高效價的流感毒粒HA亞單位。隨著分子生物學的飛速發展，促進了基因工程和蛋白質工程技術的建立。分子生物學的飛速發展，促進了基因工程和蛋白質工程技術的建立。運用此類技術對疫苗進行了多方面的研究。沿著這個方向，流感疫苗已有下列開拓性工作。有人研製NP、 Ml和M2疫苗，因它們抗原性保守並具有型的特異性，故刺激機體所產生的抗體在不同亞型毒株間有交叉保護，具廣譜性，不必隨流行毒株抗原性變異而改變，但它們目前仍處於試驗階段。MDP-微毒粒疫苗是利用佐劑來提高免疫效果的，日本已開始在志願者中使用。該疫苗的抗體陽轉率較為理想，但有不良反應。近年來發展一種流感DNA疫苗，其不但能使機體產生保護性抗體還產生強烈的細胞應答。但至今仍較一致認為DNA疫苗仍處於嬰兒時期， 許多問題仍有待解決。我國生產流感疫苗主要是通過雞胚培養擴增病毒，而後收集尿囊液中的病毒進行滅活處理，然後與免疫佐劑混合製備成全病毒滅活疫苗。其在生產過程中面臨生產周期長生產成本高的問題，而且在生產過程中需要大量的SPF雞胚。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種豬源A型流感病毒蛋白。所述流感蛋白為(a)或(b)的蛋白質
(a)有SEQID NO. 1所示的胺基酸組成的蛋白質，
(b)在(a)中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個胺基酸或幾個胺基酸且具有流感蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白質。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種產所述流感蛋白的基因工程菌。所述基因工程菌為大腸桿菌BL21。所述基因工程菌使用分泌型表達載體，所述表達載體為pET系列。
本發明要解決的另一個技術問題是提供一種製備所述流感蛋白的方法。為解決上述技術問題，本發明的具體技術方案為
(1)根據GenBank:FJ966082. 1序列，人工合成編碼SEQ ID NO. 1所述蛋白質的核苷酸序列 SEQ ID NO. 4 ；
(2)將步驟(1)中得到的核苷酸片段克隆到表達載體pET21a;
(3)將步驟2得到的表達載體轉化大腸桿菌BL21；
(4)誘導表達權利要求1所述蛋白質；
(5)純化步驟(4)得到的蛋白質，得到大量包涵體；
(6)將步驟(5)得到的包涵體進行復性處理，製備有活性的病毒蛋白。所述復性條件為lmL dissolution buffer(6M Guanidine Hydrochloride ； 10% 甘油；IOOmM NaCl ； IOmM EDTA ； IOmM DTT)，4 °C 攪拌溶解；配製 refolding buffer (IOOmM Tris pH8. 0 ；400mM L-Arginine monohydrochloride ；2mM EDTA ；5mM GSH ；0.5mM GSSG)於冰上或4°C預冷；用5mL注射器將溶解後的包涵體約3_5mL分兩次每次間隔8小時加入注射器，使之一滴一滴地往refolding buffer內滴下，慢慢攪拌8_10小時。發明原理接種疫苗仍是當今預防流感最有效的一種手段，然而流感病毒抗原性容易變異導致疫苗接種無效，是流感發病和流行至今無法完全控制的主要原因之一。HA頭部區是主要的變異部位，可以通過流行病學調查分離到優勢血清型的流感病毒毒株，並將其HA頭部區基因克隆到本實驗所設計的表達載體中，利用大腸桿菌的表達系統以最快的時間大量生產HA頭部區蛋白，從而應對流感病毒抗原性的變異。本發明在前期研究基礎上，克隆HA頭部區亞單位免疫元片段，利用大腸桿菌表達系統以最快的時間大量生產HA頭部區蛋白亞單位。本發明可以提高流感病毒HA的產量，每兩升培養基可以得到純化的HA蛋白大於 200毫克。只需5-6天即可得到一批純化的蛋白，縮短生產時間。由於不會使用流感病毒因此可以保證疫苗的生物安全性，不會出現散毒的危險，而且不需要雞胚擴增病毒大大降低了生產成本。通過western blotting實驗證明純化獲得的HA蛋白可以與流感病毒的多克隆抗體結合(圖1)，表明原核表達的HA蛋白具有免疫原性。本發明構建了流感病毒HA頭部區蛋白的表達載體，因而可根據需要隨著流感病毒抗原性變異而不斷改變病毒基因即可獲得大量蛋白用於製備疫苗。
圖1 HlHA頭部蛋白抗原性檢測
圖2 HlHA頭部區蛋白純化和SDS-PAGE
AiHlHA頭部區蛋白純化B: HlHA頭部區蛋白SDS-PAGE檢測
圖3 HlHA頭部區攻毒保護實驗。
具體實施例方式實施例1流感病毒蛋白
所述流感蛋白胺基酸組成如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1:APLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHH PSTSADQQSLYQNADTYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAME RN
所述流感病毒蛋白胺基酸組成還可以為SEQ ID NO. 1所示蛋白中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個胺基酸或幾個胺基酸且具有流感蛋白抗原性的蛋白質，如SEQ ID NO. 2
APLQLGKCNIAGWLLGNPECDLLLTASSWSYIVETSNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFEKFEIFPKT SSWPNHETTKGVTAACSYAGASSFYRNLLWLTKKGSSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPPTGTDQQSLYQNADA-YVSVGSSKYNRRFTPEIAARPKVRDQAGRMNYYWTLLEPGDTITFEATGNLIAPWYAFALN ；或 SEQ ID NO. 3
APLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYP⑶FIDYEELREQLSSVSSFERFEIFP KESSWPNHNTTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPSNSKDQQNIYQN ENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKP⑶TIIFEANGNLIAPRYAFALS 所示，SEQ ID NO. 2及SEQ IN NO. 3蛋白的製備方法參考SEQ ID NO. 1蛋白。
實施例2流感病毒蛋白的製備 1、目的基因的獲得
本實驗所選擇的流感病毒 A/California/04/2009 (Hmi), GenBank:FJ966082. 1，根據 GenBank:FJ966082. 1序列人工全合成(本合成由上海生工生物工程技術服務有限公司)核苷酸序列SEQ ID N0. 4，
gccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg■ gatcctgggaaatccagagtgtgaatcactctccacagcaagctcatggtcctacattgtggaaacacctagttcagacaatggaacgtgttacccaggagatttcatcgattatgaggagctaagagagcaattgagctcagtgtcatcatttgaaaggtttgagatattccccaagacaagttcatggcccaatcatgactcgaacaaaggtgtaacggcagcatgtcctcatgctggagcaaaaagcttctacaaaaatttaatatggctagttaaaaaaggaaattcatacccaaagctcagcaaatcctacattaatgataaagggaaagaagtcctcgtgctatggggcattcaccatccatctactagtgctgaccaacaaagtctctatcagaatgcagatacatatgtttttgtggggtcatcaagatacagcaagaagttcaagccggaaatagcaataagacccaaagtgagggatcaagaagggagaatgaactattactggacactagtagagccgggagacaaaataacattcgaagcaactggaaatctagtggtaccgagatatgcattcgcaatggaaagaaatO
2、載體的製備
將PCR產物及表達載體pET2Ia用限制性內切酶進行切割，而後進行DNA電泳，通過DNA凝膠回收試劑盒分別將載體和DNA片段回收出來，在將回收的載體與片段通過T4DNA 連接酶，16°C過夜連接，最後將連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5 α中。將得到的重組子分別通過菌液PCR和質粒酶切的方法進行鑑定，表明克隆正確。而後將鑑定好的陽性克隆提取質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞BL21中。本實驗使用的限制性內切酶均是大連寶生物工程有限公司產品。根據使用的限制性內切酶使用Takara公司提供的使用說明選擇合適的緩衝液和酶切溫度，酶切體系為 20μ L。10ΧΗ Buffer2μ L EcoRl 1 μ LXhol DNA
1 μ L 16 μ L
37°C酶切4小時。回收時使用DNA凝膠回收試劑盒。
連接體系如下
Vector DNA Insert DNA
10XT4 DNA Ligation Buffer T4 DNA Ligase
IOOng Variable
1 μ L 1 μ L
總體系10 μ L，連接混合物置於16°C連接2h，然後4°C過夜。在每個連接體系中載體的摩爾數插入DNA的摩爾數比例約為1 :1或1 :3。連接產物及質粒的轉化取_70°C凍存的感受態細胞於冰上融化後，加入連接產物5μ ，輕輕混勻，冰浴30分鐘。42°C水浴熱激90秒，再迅速放回冰上2min。加入400μ LB 液體培養基，37°C 200r/min-220r/min振蕩培養45min後，以恢復質粒的抗性。4°C 4000r/ min離心5min，棄去上清400μ ，將剩餘的ΙΟΟμ 菌液混勻後塗氨苄平板，37°C培養30min (平皿正放)，待菌液吸收完全，再將平皿倒置培養約12h - 16h，至單菌落出現。重組子鑑定PCR快速鑑定用無菌牙籤挑取細菌轉化子，塗抹於無菌的EP管底部，加入20 μ L無菌的蒸餾水，渦旋混勻，煮沸5 min，於冰上驟冷，12，000 r/min離心1 min，取上清用作PCR擴增的模板，進行PCR鑑定，結果標明重組子中含有轉化後的質粒。重組質粒酶切鑑定挑取快速鑑定為陽性的重組子，接種到含相應抗性的液體 LB培養基中，37°C 250-300 r/min培養過夜，提取質粒，用適當的限制性內切酶消化，1%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察結果。3、克隆基因表達
小量表達挑取含有正確表達質粒的大腸桿菌BL21單菌落，接種到5mL含有氨苄青黴素的LB培養基中，0. ImM IPTG 37°C誘導4小時，同時設置不加IPTG的空白對照。SDS-PAGE 驗證該蛋白的可溶性。大規模表達與純化挑取新鮮平板上含有正確表達質粒的單菌落接種於2mL含氨苄青黴素的LB液體培養基，37°C震蕩培養過夜，然後轉接到20mL LB液體培養基中同樣培養過夜。將20mL菌液全部轉接到2L含氨苄青黴素的LB液體培養基中，37 °C震蕩培養約3_5 小時。待0D600達到0. 4左右時加入IPTG至終濃度0. ImM，37°C誘導導4小時，6000 rpm離心收穫菌體。菌體在4°C下用PBS重懸後，放置於冰上用超聲破碎儀裂解細菌。12，OOOrpm 離心30分鐘，棄去上清液用玻璃棒將細菌碎片剝掉，沉澱即為包涵體。4、從包涵體中純化表達蛋白蛋白質在大腸桿菌中的高水平表達，常常導致形成相差顯微鏡下可見的細胞質顆粒或包涵體。這些由表達蛋白聚集成的包涵體很容易與可溶性蛋白和膜結合蛋白分離。高水平表達外源蛋白的細菌經離心濃縮後，可通過機械法、 超聲處理法或溶菌酶加去汙劑的方法進行裂解。包涵體經離心沉澱後可用Triton X-100 和EDTA或用尿素洗滌。洗滌的目的是儘可能從聚集的外源蛋白中除去可溶的、粘附的細菌蛋白。為獲取可溶性的活性蛋白，必須將洗滌過的包涵體溶解，然後進行重摺疊。HA頭部區蛋白包涵體復性的方法
用 washing buffer (0. 5% TritonX-100；50mM Tris pH8. 0；300mM NaCl；IOmMEDTA;10mM DTT)將包涵體懸起。離心後可看到細菌有無完全裂解，若無可以再次超聲(4 秒，10秒，43次)，超聲條件可以自行調整。超聲後12，OOOrpm離心10-20分鐘，用washing buffer 洗滌儘量去除細菌碎片。Mresuspension buffer (50mM Tris ρΗ8· 0 ； IOOmM NaCl ； IOmM EDTA ； IOmM DTT)重懸包涵體12，OOOrpm離心10-20分鐘棄去上清，並將包涵體稱重。 按照 30mg 包涵體力口 ImL dissolution buffer (6M Guanidine Hydrochloride ； 10% 甘油； IOOmM NaCl ；IOmM EDTA ；IOmM DTT)，4°C攪拌溶解。包涵體復性配製 refolding buffer (IOOmM Tris pH8. 0 ；400mM L-Arginine monohydrochloride ；2mM EDTA ；5mM GSH ；0. 5mM GSSG)於冰上或 4°C預冷。用 5mL 注射器將溶解後的包涵體約3-5mL分兩次每次間隔8小時加入注射器，使之一滴一滴地往refolding buffer內滴下，慢慢攪拌8-10小時。復性後可用濃縮杯濃縮樣品，然後換成適合於此蛋白的緩衝液，再轉到濃縮管內濃縮，如果復性體系小的話可直接用濃縮管換液。將得到的蛋白用Superdex 200 (Amersham Biosciences)凝膠過濾柱進一步純化(圖2)，收集含目的蛋白的洗脫峰，用超濾管將蛋白濃縮至約30 mg.mL—1。實施例3蛋白質動物試驗 HlHA頭部區蛋白免疫原性實驗
實驗動物^？？雞對只，每6隻分成一組共4組，分別為空白對照組、佐劑對照組、 50 yg抗原量組、100 μ g抗原量組
試劑弗氏完全佐劑、不完全弗氏佐劑購自sigma公司方法分別以純化的HlHA頭部區重組蛋白50 μ g和100 μ g與弗氏完全佐劑混合進行肌肉注射免疫，3周後以相應的抗原與不完全弗氏佐劑混合後加強免疫。同時設空白對照組及佐劑對照組。免疫前及末次免疫後10天收集雞血清。末次免疫後第21天經鼻腔接種 50 μ L含IO6EID50 A/California/04/2009 (HlNl)病毒量的稀釋液，並觀察20天監測雞死亡情況及存活的平均體重變化，結果表明經HlHA頭部區蛋白免疫後的SPF雞死亡率低(圖3)。實施例4 HlHA頭部區蛋白在亞單位疫苗製備中的應用
將純化得到的HlHA頭部區蛋白，與佐劑混合製成含有流感病毒血凝素的亞單位疫苗， 肌肉注射免疫動物，使動物獲得主動性免疫，從而抵抗流感病毒的感染。亞單位疫苗生產中的應用可參考下列文獻。[1] Oriol Manuel, Manuel Pascualj Katja Hoschler. Humoral Response to the Influenza A H1N1/09 Monovalent AS03_Adjuvanted Vaccine in Immunocompromised Patients. Clin Infect Dis. 2011 Jan;52 (2):248-56 Robert B. Bel she, Sharon E. Freyj Irene Graham. Safety and immunogenicity of influenza A H5 subunit vaccines: effect of vaccine schedule and antigenic variant. J Infect Dis. 2011 Mar；203(5):666-73
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種豬源A型流感病毒頭部蛋白，其特徵在於如(a)或(b)的蛋白質(а)由SEQID NO. 1所示的胺基酸組成的蛋白質；(b )在(a )中的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個胺基酸或幾個胺基酸且具有流感蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白質。
2.一種產權利要求1所述流感蛋白的基因工程菌，其特在在於所述基因工程菌為表達 SEQ ID NO. 1所示蛋白質的大腸桿菌BL21。
3.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特在在於所述工程菌使用分泌型表達載體。
4.根據權利要求3所述的基因工程菌，其特徵在於所述表達載體為pET系列。
5.一種製備權利要求1所述病毒蛋白的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)根據GenBank:FJ966082. 1序列，人工合成編碼SEQ ID NO. 1所述蛋白質的核苷酸序列 SEQ ID NO. 4 ；(2)將步驟(1)中得到的核苷酸片段克隆到表達載體pET21a;(3)將步驟( 得到的表達載體轉化大腸桿菌BL21；(4)誘導表達權利要求1所述蛋白質；(5)純化步驟(4)得到的蛋白質，得到大量包涵體；(б)將步驟(5)得到的包涵體進行復性處理，製備有活性的病毒蛋白。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述誘導條件為菌體0D600達到0.4左右時加入IPTG至終濃度0. ImM, 37°C誘導導4小時，6000 rpm離心收穫菌體。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述復性件為lmL包涵體溶解緩衝液(6M Guanidine Hydrochloride ； 10% 甘油；IOOmM NaCl ； IOmM EDTA ； IOmM DTT)，4°C攪拌溶解；(IOOmM Tris ρΗ8. 0 ；400mM L-Arginine monohydrochloride ；2mM EDTA ；5mM GSH ；0. 5mM GSSG)於冰上或4°C預冷；用5mL注射器將溶解後的包涵體約3_5mL 分兩次每次間隔8小時加入注射器，使之一滴一滴地往refolding buffer內滴下，慢慢攪拌8-10小時。
8.權利要求1所述流感病毒頭部蛋白應用於亞單位疫苗製備。
全文摘要
本發明公開了一種豬源A型流感病毒頭部蛋白及其製備方法和應用，其胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示。使用本發明所提供的方法可以提高流感病毒HA的產量，每兩升培養基可以得到純化的HA蛋白大於200毫克。只需5-6天即可得到一批純化的蛋白，縮短生產時間。此外，由於不會使用流感病毒因此可以保證疫苗的生物安全性，不會出現散毒的危險，而且不需要雞胚擴增病毒大大降低了生產成本，具有很好的應用前景。
文檔編號A61K39/145GK102174090SQ201110069590
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月23日 優先權日2011年3月23日
發明者宣春玲, 高福 申請人:中國科學院微生物研究所