β-咔啉釕配合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-07-08 03:02:21

專利名稱：β-咔啉釕配合物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及藥物化學領域，尤其涉及β-咔啉釕配合物及其製備自噬誘導劑作為 抗腫瘤藥物的用途。
背景技術：
1. β -咔啉釕配合物簡介近年來，以具有生物活性的分子作為配體的金屬配合物的發展，為追求高效，針對 靶向活性的新藥設計提供了更為廣闊的空間。這類配合物的研究表明，金屬的固有屬性和 生物活性配體分子的結合為克服當前的耐藥性途徑的可能性提供了線索。β -咔啉生物鹼是一類人工合成和天然化合物，具有包括鎮靜，抗焦慮，催眠，抗驚 厥，抗腫瘤，抗病毒，抗寄生蟲和抗菌等廣譜生物藥理學活性。(曹，彭等。2007年)據報 道，β-咔啉生物鹼可以通過多種機制發揮抗腫瘤作用的活性，如插入DNA(肖，林等。2001 年)，抑制拓撲異構酶I和II (Funayama,Nishio等。1996年)，抑制⑶K(細胞周期蛋白依 賴激酶)(李，梁等。2007年)和IkB激酶(Castro，Dang等。2003年)。合成出了一類 以-1，-3和-9位不同亞基取代的β -咔啉為基本骨架的衍生物以闡釋這種化合物的構效 關係(曹，彭等。2007)。由於其與苯二氮，咪唑啉，中樞神經系統(CNS)羥色胺受體的親和 力，β-咔啉顯示了相當的急性毒性，阻礙了其作為抗癌藥物的臨床應用。(陳，趙等。2005 年)一定數量的釕化合物已被證明可以顯示出顯著的抗癌活性，兩個釕(III)配 合物已成功地進入臨床試驗階段，即NAMI-A(Alessio, Mestroni等。2004) ([ImH] Ltrans-RuCl4 (DMSO) (Im)]，其中 Im =咪唑，DMSO = 二甲基亞碸和 KP1019 (Hartinger， Jakupec 等。2008) ([IndH] [trans_RuCl4(Ind)2]，其中 Ind =吲唑)· Ru(II)。釕(II)也已 作為抗癌藥物研究物。含不穩定集團如Ru(II) 「半三明治」芳烴複合物的化合物顯示出在 體內和體外雙重活性(Bugarcic，Habtemariam 等。2009 年)。一些 α -[Ru(II) (azpy)2Cl2] (azpy = 2-(苯)吡啶)型複合物相對於順鉬顯示出類似甚至更好的細胞毒性潛力(Hotze， Bacac等。2003年)。另據報導，飽和配位的釕(II)多吡啶配合物[Ru (bpy)2 (dppn) ]Cl2 帶擴展芳香配體在低濃度下針對兩株抗腫瘤細胞展現出較強的細胞毒活性(IC50值)。 (Schatzschneider, Niesel ο 2008)。2.自噬誘導劑用於治療癌症簡介自噬作用(autophagy)是細胞在飢餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過程， 細胞內的蛋白、細胞器和胞質通過自噬作用被包裹、消化，降解成核苷、胺基酸和脂肪酸循 環利用，合成新的大分子和ATP，從而維持細胞的正常代謝和生存。同時，在某些情況下它可 以選擇性地清除某些細胞成分，如受損或多餘的過氧化物酶體、內質網、線粒體、DNA，減少 異常蛋白、細胞器的堆積，維持細胞自我穩態。自噬作用不僅具有維持細胞自我穩態、促進 細胞生存的作用，過度上調的自噬作用也可以引起細胞死亡，即「自噬性細胞死亡」，也稱為 II型程序化細胞死亡。
自噬作用在機體的生理和病理過程中都能見到，與人類的多種疾病，尤其是惡性 腫瘤存在密切關係。在代謝壓力下，腫瘤細胞可以依靠自噬作用維持生存和活性。但在進 一步研究中，卻發現了自噬抑制與腫瘤的發生存在相關性。通過對自噬作用的研究，進一步 揭示了腫瘤發生、發展的潛在機制，為腫瘤的預防和治療提供了新的思路。 自噬誘導劑(Autophagy inducer):由於自噬作用的缺失可以造成細胞突變的累 積，形成腫瘤甚至轉移灶，藥物作用可通過促進自噬作用，預防腫瘤的發生發展，或使腫瘤 在過度的自噬作用下發生自噬性死亡。這一設想在治療與異常蛋白積聚有關的退行性疾病 中取得了一定的效果。目前的許多化療藥物及放療都可以增加腫瘤細胞中的自噬小體數 量。它莫西芬(Tamoxifen)可以提高MCF7乳腺癌細胞的自噬水平，並且促進腫瘤細胞的死 亡。同時，自噬也可抑制腫瘤的發生。首先，自噬可清除受損細胞器以避免有害自由基及突 變的發生，從而避免更大的損傷。然而，在人類多種腫瘤中，自噬誘導基因Beclinl存在缺 失或突變，從而失去對腫瘤的抑制作用。在體外實驗中，將BECNl重新導人人乳腺癌細胞株 MCF-7中，自噬可被誘發，從而抑制細胞增殖及腫瘤形成。其次，自噬可限制DNA損傷，維持 基因組完整性。在永生化鼠腎上皮細胞中，自噬活性降低可導致細胞DNA損傷，基因擴增， 染色體非整倍性等。這種基因組的不穩定增加了致癌性突變率，促進了腫瘤的發生。再次， 自噬可抑制細胞生長，誘發凋亡性細胞死亡。透射電鏡檢測常被認為是檢測自噬體的金標準，在透射電鏡下可見損傷的細胞 器，如腫脹變性的線粒體，其周圍出現空泡狀雙層膜樣結構，繼而雙層膜環繞成自噬體，並 與溶酶體融合、消化，也可見自噬溶酶體內最終不能降解的殘體等。腫瘤復發是臨床上的一個極其常見而又棘手的問題。原發腫瘤被根除後，經過長 時間的「休眠期」，腫瘤出現復發。而且，其恢復增殖能力的過程是迅速而高效的。真正致命 的，往往並不是那些新生的原發腫瘤細胞，而是那些經歷長時間的代謝壓力後「重獲新生」 的殘餘細胞。這些殘餘的腫瘤細胞是如何恢復活性的，是亟需解決的問題，也是腫瘤治療的 關鍵。而自噬作用很可能是問題的答案。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種新的β "咔啉釕配合物。本發明的目的之二是提供上述β "咔啉釕配合物的製備方法。本發明的目的之三是提供上述β-咔啉釕配合作為製備抗腫瘤藥物的應用。本發明的技術方案是一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N~N)2(Nh)xClY] (A"A)Z，其中 N~N 選自 bpy 或 phen ；A~A 選自 PF6 或 SO3CF3 ；X = 1 或 2，Y = 2-Χ,Ζ = 1 或 2。一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru (Nl)2 (I-Py-β C)] (PF6)2其中Ν~Ν選自 bpy, phen 或 DIP。上述配合物作為製備抗腫瘤藥物的應用。上述抗腫瘤藥物組合物，含有上述β -咔啉釕配合物作為有效成分以及藥學上可 接受的輔助劑。本發明在分子機理上證明了 β-咔啉釕配合物可以用於治療癌症，且效果優於廣 泛應用的順鉬和在臨床試驗中的ΝΑΜΙ-Α，β -咔啉釕配合物作為細胞自噬誘導劑用於治療 癌症填補了現有技術的空白，為開發新一代高效的治療惡性腫瘤的藥物開拓了新思路。


圖 1 為[Ru (bpy) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 晶體結構圖；
圖 2 為[Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的晶體結構圖；圖3為I-Py- β C晶體結構圖；圖4 為[Ru (bpy) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 晶體結構圖；圖5Α-5Ε分別為β -咔啉釕配合物(Β1-Β3)誘導腫瘤細胞自噬系列實驗附圖。
具體實施例方式本發明的β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N~N)2(Nh)xClY](A~A)z，其中Ν~Ν選 自bpy或phen ；A~A選自PF6或SO3CF3 ；X = 1或2，Y = 2-Χ,Ζ = 1或2 ；上述配合物對應的 陽離子部分的分子結構式如Α1、Α2、Α4、Α5所示 上述配合物的製備方法，將 cis-[Ru (bpy) 2C12] · 2H2O 或 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 與9H-吡啶[3，4-b] B引哚(Norharman)溶於乙醇水溶液，回流，減壓蒸發，過濾去除沒有反應 的9H-吡啶[3，4-b] Π引哚配體，加入NH4PF6，析出產物後清洗然後真空乾燥，純化，重結晶，得 到[Ru (bpy)2 (Nh) Cl] (PF6)或[Ru (phen)2 (Nh) Cl] (PF6)；或者，將 cis-[Ru (bpy)2Cl2] · 2H20 或 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 與與 AgSO3CF3 反應後濾去 AgCl，加入 9H-吡啶[3，4_b]吲哚， 回流，反應混合物冷卻至室溫後再次過濾，緩慢蒸發母液得到[Ru (bpy) 2 (Nh)2] (SO3CF3)2或 [Ru(Phen)2(Nh)2] (SO3CF3) 2，反應式如下
一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru (Ν~Ν)2 (I-Py-β C)] (PF6)2其中Ν~Ν選自 2,2'-聯吡啶(bpy)，l，10-鄰菲羅啉(phen)或4，7-二苯基-1，10-鄰菲羅啉(DIP)；上 述配合物對應的陽離子部分的分子結構式如Bi、B2、B3所示 上述配合物的製備方法，首先將吡啶-2-甲醛(pyridine-2-carboxaldehyde)和色胺投入苯甲醚加熱，力口 入鈀/碳(Pd/C)後回流，反應混合物趁熱過濾，旋蒸至濾液呈暗綠色，用甲醇溶解，蒸發得 到 1-(2_ 吡啶)-β -咔啉(l-(2-pyridyl)-0-carboline)；然後將1-(2-批啶)-β-咔啉與 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20、 cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20 或 cis-[Ru (DIP)2Cl2] · 2H20 中的一種溶於乙醇的混合液通氬氣 回流，直至呈現明顯的紅色液體，趁熱過濾後真空濃縮，加入NH4PF6後混合液放入冰箱過夜 冷卻，過濾得到產物，用乙醇/水混合物重結晶，真空乾燥，即得；反應式如下
上述配合物作為製備抗腫瘤藥物的應用。上述抗腫瘤藥物組合物，含有上述β -咔啉釕配合物作為有效成分以及藥學上可 接受的輔助劑。以下通過具體的例子對本發明作進一步說明。試齊[J:9Η- 口比唆[3, 4-b] 口引哚(Snyder, Walker et al. 1949), cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20(B. P. Sullivan 1978)，cis_[Ru(phen)2Cl2] · 2H20(B. P. Sullivan 1978), cis-[Ru(DIP)2Cl2] ·2Η20(Β. P.Sullivan 1978 ；Puckett andBarton 2008), [(Imidazole)H] [trans-RuCl4(DMSO) (Imidazole)] (NAMI-A) (Mestroni 1998)由文獻方法合成。1.釕(II)配合物[Ru (N~N)2(Nh)XC1Y](A~A)Z 的合成，其中 N~N 選自 bpy 或 phen ； A"A 選自 PF6 或 SO3CF3 ；X = 1 或 2，Y = 2_X，Z = 1 或 2。1. 1 [Ru (bpy) 2 (Nh) Cl] (PF6)的合成(Al)cis-[Ru (bpy)2C12] · 2H20(0. 520g, 1. Ommo 1)和 9H_ 吡啶[3,4-b]吲哚(0. 252g, 1. 5mmol)溶於50mL 1 1乙醇水溶液(ν/ν)，混合液用氬氣清洗15分鐘然後用力攪拌回 流8小時。將深紅色溶液減壓蒸發至IOmL再加入30mL水。剩餘沒有反應的9H-吡啶[3， 4-b]吲哚配體用過濾法去除。紅色溶液中加入過量的NH4PF6保證了足量的紅色析出物。產 物用水(20mLX2)洗後用(20mL)乙醚清洗，然後真空乾燥。原產物用利用甲苯-乙腈(ν/ ν = 1 2)做洗脫液的氧化鋁柱層析法純化，再在丙酮-乙醚中重結晶。產量0.607g， 81%。C31H24ClF6N6PRu ·H2O 理論值C 47. 73%,H 3. 36%,N 10. 77%;實驗值C 47. 62%,H 3. 35%;N 10.81%。ESI-MS(CH3OH) :C31H24ClN6Ru+[M-PF6]+m/z 理論值 617. 1，實驗值 616. 8。1.2 [Ru (bpy) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的合成(A2)在(250mL)水甲醇中加入(0.550g，2. 2mmol) AgSO3CF3 與(0. 520g, 1. Ommol) cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 反應獲取，過濾 AgCl 後，加入(0. 403mg，2. 4mmol) 9H-吡啶[3， 4-b]吲哚，溶液回流3天。反應混合物冷卻至室溫後再次過濾。緩慢蒸發母液得到紅色晶體用於X射線衍射，晶體結構如圖1所示。產量0. 881mg, 84%。C44H32F6N8O6RuS2理論值C 50. 43%, H 3. 08%, N 10. 69% ；實驗值C50. 37%，H 3. 09%, N 10.65%。ESI-MS(CH3OH) 理論值 C43H32F3N8O3RuS+[M-SO3CF3]+m/z 899. 1，實驗值 898. 8，C42H32N8Ru2+[M_2S03CF3]2+m/z 理 論值 399. 1，實驗值 399. 0。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 11. 48 (s，2H)，9. 20 (d，J = 5. 0Hz，2H)， 8. 65-8. 59(m，6H)，8. 25 (d, J = 8. 0Ηζ，2Η)，8· 19 (t, J = 7. 5Ηζ，2Η)，8· 11 (q, J = 6. OHz, 6Η)，8· 05 (t，J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 91 (t，J = 7. 0Ηζ，2Η)，7· 61 (d，J = 3. 5Ηζ，4Η)，7· 57 (t, J = 7. 0Ηζ，2Η)，7· 31-7. 28 (m，2Η) ·1· 3 [Ru (phen) 2 (Nh) Cl] (PF6)的合成(Α4) 與1. 1 例子的方法相同，使用(0. 570g，l_ol) cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20 替代 cis-[Ru(bpy)2Cl2] ·2Η20 進行合成。產量0. 632g，78 %。C35H24ClF6N6PRu · H2O 理論值C 50. 76%,H 3. 16%,N 10. 15%;實驗值C 50. 61%,H 3. 15%,N 10. 19%。ESI-MS(CH3OH) C35H24ClN6Ru+[M-PF6]+m/z 理論值 665. 1，實驗值 664. 8。1.4 [Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3) 2 的合成(A5)與1. 2 例子的方法相同，使用 cis-[Ru (Phen)2Cl2] · 2H20(0. 570g，Immo 1)， AgSO3CF3(0. 550g，2. 2mmol)禾Π 9Η-吡啶[3，4_b]吲哚(0. 403mg，2. 4mmol)來合成。產 量0· 872g，80 %。C48H32F6N8O6RuS2 理論值C 52.60 %，H 2. 94%, N 10.22%;實驗值 C 52. 75%, H 2. 95%, N 10.15%。ESI-MS(CH3OH) =C47H32F3N8O3RuS+[M-SO3CF3]+m/ζ 理論值 947. 1，實驗值 946. 8，C46H32N8Ru2+[M_2S03CF3]2+m/z 理論值 375. 1，實驗值 375. 0。其晶體結 構圖如圖 2 所示。1H NMR (ppm, (CD3)2SO) 11. 42(s，2H)，9· 67 (d, J = 5. OHz, 2H) ,8. 90 (d, J =8. 5Hz，2H)，8. 78(s，2H)，8. 61(d，J = 8. 5Hz，2H)，8. 34-8. 29(m，6H)，8. 26 (d, J = 6. 5Hz, 2H)，8. 21 (t，J = 9. 0Hz，4H)，8. 07 (d, J = 6. 5Hz，2H)，7. 74 (q, J = 5. 0Hz，2H)，7. 58 (t, J = 3. 5Hz，4H)，7. 28-7. 24(m，2H).2.釕(II)配合物[Ru(N"N)2(l-Py-^ C)] (PF6)2 的合成，其中 N~N 選自 bpy, phen 或DIP2. 11-(2-批啶)-β _ 咔啉(l-Py—β C)的合成將吡啶-2-carboxaldehyde(535mg, 5. OOmmo 1)和色胺(8IOmg, 5. OOmmol)投入 200mL乾燥苯甲醚的混合物在105°C加熱2小時，加入10%鈀/碳(1. 20g)後回流22h。反 應混合物趁熱過濾，旋蒸至濾液呈暗綠色，用甲醇(20mL)溶解，溶液緩慢蒸發可得到可用 於測X射線衍射的黃色晶體，晶體結構圖如圖3所示。過濾後可得純配合物(1. 05g,86% )。 (Hassani, Cai et al. 2005) 2. 2 [Ru (bpy) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(Bi) 1-(2-吡啶)-β -咔啉(0. 245g, 1. Ommol)和 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20(0. 520g， 1. Ommol)溶於75%乙醇(IOOmL)的混合液通氬氣回流8小時。呈現明顯的紅色液體，趁熱 過濾後真空濃縮。加入NH4PF6 (0. 244g, 1. 5mmol)後混合液放入冰箱過夜冷卻。過濾得到產 物，用乙醇/水混合物重結晶，真空乾燥。產量0. 797g (84% )0室溫下用甲醇溶液緩慢蒸發 得到可用於X射線衍射的晶體，結構圖如圖4所示。元素分析=C36H27F12N7P2Ru ·Η20理論值C 44. 73%,H 3. 02%,N 10. 14%;實驗值C 44. 65%,H 3. 03%,N 10.17%。ESI-MS(CH3CN) C36H27F6N7PRu+[M-PF6]+m/z 理論值 804. 1，實驗值 803. 9 ;C36H27N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理論值 329.6，實驗值 329.8。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 12. 36 (s, 1H) ,9. 06 (d, J = 8. OHz, 1H),8.85 (q, J = 8· 5Ηζ，4Η)，8· 31(m，3H)，8. 19 (q, J = 10. 0Hz,2H) ,8. 14 (q, J = 6.5Hz，2H)， 7. 88 (d, J = 5. OHz, 1H), 7. 86 (d, J = 8. OHz, 1H), 7. 78-7. 71 (m，4H)，7. 64 (d，J = 5. 5Hz, 1H)，7. 57-7. 52 (m, 3H)，7. 48 (t，J = 6. OHz，2H)，7. 44-7. 40 (m, 2H).
2. 3 [Ru (phen) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(B2)與2. 2 合成方法相同，用 cis-[Ru(Phen)2Cl2] · 2H20(0. 570g, 1. Ommo 1)替代 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20。C40H27F12N7P2Ru · H2O 理論值:C 47. 35%, H 2. 88%, N 9. 66% ； 實驗值C 47. 47%,H 2. 87%,N 9. 64% ESI-MS(CH3CN) C36H27F6N7PRu+[M-PFj+m/z 理論值 852. 1，實驗值 851. 9 ；C36H27N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理論值 353. 6，實驗值 353. 8。1H NMR (ppm, (CD3)2SO) 12. 34 (s，1H)，9. 07 (d，J = 8. 0Hz，1H)，8. 81 (q，J = 4. 0Hz,2H) ,8. 74 (t, J =
9.5Ηζ，2Η)，8· 41-8. 36(m，4H)，8· 27 (t, J = 8. 0Hz，2H)，8· 24 (d, J = 4. OHz, 1Η)，8· 18 (d, J =5. 5Hz, 1Η)，8· 13 (d, J = 4. OHz, 1Η)，7. 98 (t, J = 6. 5Ηζ，2Η)，7· 90 (q, J = 5. OHz, 1Η)， 7· 86-7. 83(m，3H)，7· 75-7. 70(m，3H)，7· 44(t，J = 6. OHz, 1Η) ,7. 48 (t, J = 6·5Ηζ，1Η)，
7.40 (d, J = 8. OHz，1Η).2. 4 [Ru (DIP) 2 (I-Py- β C) ] (PF6) 2 的合成(Β3)與2. 2 合成方法相同，用 cis-[Ru(DIP)2Cl2] · 2Η20(0. 872g, 1. Ommo 1)替代 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20。C64H43F12N7P2Ru · H2O 理論值:C 58. 27%, H 3. 44%, N 7. 43% ； 實驗值C 58.38 %，H 3. 39 %, N 7. 37 ESI-MS(CH3CN) C64H43F6N7PRu+[M-PF6]+m/z 理 論值 1156. 2，實驗值 1155. 9 ；C64H43N7Ru2+[M-2PF6]2+m/z 理論值 505. 6，實驗值 505. 8。1H NMR(ppm, (CD3)2SO) 12. 42 (s, 1H) ,9. 14(d,J = 8. 5Hz, 1H)，8· 36(t, J = 5. OHz, 1H)，8· 32 (d, J = 6. OHz, 1Η)，8· 30 (d, J = 6. OHz, 1Η)，8· 27 (q, J = 3. 5Ηζ，6Η)，8· 22 (d, J = 5. 5Hz, 1Η)，
8.01 (d, J = 5. OHz, 1Η)，7. 91 (d, J = 5. 5Hz, 1Η)，7. 88 (d, J = 8. 5Hz, 1Η)，7. 85 (d, J = 6. OHz, 1Η)，7· 78 (q, J = 5. 5Ηζ，2Η)，7· 74 (t, J = 8. OHz, 1Η)，7· 69-7. 60 (m，22Η)，7· 56 (t, J =6. OHz, 1Η)，7. 42 (t, J = 8. OHz, 1Η) ·3.實驗及分析3. 1 β _咔啉釕配合物腫瘤細胞抑制活性IC5tl測試使用!fepG2和HeLa兩種細胞進行腫瘤細胞抑制活性IC5tl的測試將細胞以約105個/mL的密度接種於96孔板，每孔接種100 μ L，置CO2培養箱中 培養至對數生長期。然後按預設的濃度梯度加入待測樣品，每一梯度至少3個重複。對照 組加入等體積的溶解樣品用的溶劑。繼續培養48小時後，每孔加入20 μ 1的MTT(5mg/mL)， 然後置於37°C溫育4小時。小心除去上清後，每孔加入100 μ 1的DMS0，振蕩約IOmin溶解 沉澱，隨後用酶標儀檢測OD值，波長630nm。用下式求出每一樣品濃度下的細胞存活率存活率％=樣品組平均OD值/對照組平均OD值χ100%以細胞存活率對藥物濃度作圖，按作圖法求出每個樣品細胞存活50%的值，即 IC50值(見表1)。表 1.
表1.使用肌1~方法檢測配合物41^2^4^5和81，82，83對兩種癌細胞株0fepG2 和HeLa)的IC5tl值，並用臨床廣泛應用的順鉬(cisplatin)作為對照。從表格數據中可以 看到在進行配合物合成後使得合成產物的IC5tl值明顯下降，使其具有更高的抗癌活性，其 中A2，A4，A5和B3更是優於現在臨床廣泛應用的順鉬，極具開發潛力。3. 2 β -咔啉釕配合物(Β1-Β3)誘導腫瘤細胞自噬系列實驗3. 2. 1透射電子顯微鏡(TEM)HeLa細胞(5 X IO5) 37°C時處理24h。細胞洗兩次後用2% 4°C的戊二醛固定1小時， 再用2%的四氧化鋨固定。細胞用50%，70%，80%，90%和100%乙醇連續清洗脫水，然後 嵌入Spurrs樹脂。獲得超薄切片，安裝進銅網，用醋酸鈾和檸檬酸鉛復染，使用JEM-100CX 透射電子顯微鏡進行觀察。使用Eversmart Jazz程序(Scitex)進行圖像掃描和拍攝。如圖5A所示，TEM圖像顯示配合物處理24小時後HeLa細胞的超微結構。a :100μΜ 配合物1處理後的HeLa細胞。b :50 μ M配合物2處理的HeLa細胞。c :2. 5 μ M配合物3處 理的HeLa細胞。在a，b，c中可以觀察到大量的自噬空泡。Insert 高倍率的典型的自噬 空泡。比例尺(a-c) 5 μ m，(放大圖)1 μ m。3. 2. 2質粒轉染按照jetPEI 轉染試劑製造商的說明(Q-biogen，法國)將綠色螢光蛋白標記的 LC3 (GFP-LC3)質粒轉染進HeLa細胞(GFP-LC3，由中華人民共和國廣州中山大學陳忠平教 授提供)。每24孔板轉染1 μ gGFP-LC3表達質粒。經過20小時，用配合物1_3處理細胞， 使用螢光顯微鏡(Axio Observer ZLCarl Zeiss，德國)檢測GFP-LC3的螢光以及計算空 泡(自噬體)中GFP-LC3的蛋白率。如圖5B所示，GFP-LC3的細胞定位檢測Ru(II)配合物1_3誘導細胞自噬的能力。將HeLa細胞鋪在蓋玻片上生長至70%，然後轉染GFP-LC3質粒，細胞用相應濃度的配合物 1-3處理，使用多聚甲醛固定，然後用顯微鏡觀察。Ru(II)處理後，細胞中GFP-LC3出現點 狀結構，說明了自噬體相關的自噬標誌分子LC3-II出現。3. 2. 3自噬泡(AVO)的丫啶橙(AO)定量染色HeLa細胞加入或不加入配合物1_3培養24小時。為了用於顯微鏡研究，用PBS 洗兩次貼壁生長的細胞，用含培養基的1 μ g/mL丫啶橙(AO)染色，使用螢光顯微鏡(Axio Observer Zl, Carl Zeiss，德國)立即使用490nm帶藍色濾光器激發波長和515nm長通障 礙濾光器檢測。為用於流式細胞儀研究，將細胞從60mm毫米皿(Corning)上刮下，用胰蛋白 酶-EDTA和用PBS洗兩次。用丫啶橙(AO)染色15分鐘後，收集細胞至苯酚無紅色生長培 養基。使用488nm藍色光波長激發10000個細胞的綠色(510-530nm)和紅色(650nm)的熒 光發射由FACSCalibur (Becton Dickinson)的CellQuest軟體進行檢測和計算。如圖5C所示，在12小時計數自噬體的形成，數據為GFP-LC3-轉染的含點狀螢光細胞的比率。計數至少300個GFP-LC3-轉染細胞，0. 1 % DMSO作為對照也包含在內。如圖5D所示，丫啶橙(AO)染色的HeLa細胞12小時處理後用螢光顯微鏡進行 檢測。大型橙色染色為AVOs (自噬體的標記)。在沒有轉染的細胞中沒有發現AVOs。a， control ；b, 100 μ M配合物1_處理細胞；c，50 μ M配合物2-處理細胞；d，2. 5 μ M配合物 3-處理細胞。比例尺1μπι。如圖5Ε所示，使用FACS掃描定量AO染色的AVOs。細胞用配合物處理後12小時 進行AO體外活體染色。a，control ；b, 100 μ M配合物1_處理細胞；c，50 μ M配合物2-處 理細胞；d，2. 5μ M配合物3-處理細胞。顯示經過Ru(II)配合物1_3處理，處理後的細胞 的AVO數量大幅增加。結論在分子機理上證明了 β-咔啉釕配合物可以用於治療癌症，且效果優於廣 泛應用的傳統金屬配合物順鉬和在臨床試驗中的釕系配合物ΝΑΜΙ-Α，其中系列B可以作為 細胞自噬誘導劑用於治療癌症，填補了化合物作為自噬誘導劑治療癌症的空白。
權利要求
β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N^N)2(Nh)XClY](A^A)Z，其中N^N選自bpy或phen；A^A選自PF6或SO3CF3；X＝1或2，Y＝2-X，Z＝1或2；上述配合物對應的陽離子部分的分子結構式如A1、A2、A4、A5所示FSA00000129175200011.tif
2.權利要求1所述配合物的製備方法，其特徵在於將 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20 或 cis-[Ru(bpy)2C12] · 2H20 與 9H-吡啶[3，4_b]吲哚 溶於乙醇水溶液，回流，減壓蒸發，過濾去除沒有反應的9H-吡啶[3，4-b]吲哚配體，力口 入NH4PF6，析出產物後清洗然後真空乾燥，純化，重結晶，得到[Ru(bpy)2(Nh)Cl] (PF6)或 [Ru(phen)2(Nh)Cl] (PF6)；或者，將 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 或 cis_[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20 與與 AgSO3CF3 反應後 濾去AgCl，加入9H-吡啶[3，4-b]吲哚，回流，反應混合物冷卻至室溫後再次過濾，緩慢蒸發 母液得到[Ru (bpy)2 (Nh)2] (SO3CF3)2 或[Ru (phen) 2 (Nh) 2] (SO3CF3)2 ； 反應式如下
3.權利要求1所述配合物作為製備抗腫瘤藥物的應用。
4.根據權利要求3所述的抗腫瘤藥物，含有權利要求1所述β-咔啉釕配合物作為有 效成分以及藥學上可接受的輔助劑。
5.β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N~N)2(l-Py-i3C)] (PF6)2其中Ν~Ν選自bpy，phen 或DIP ；上述配合物對應的陽離子部分的分子結構式如Bi、B2、B3所示
6.權利要求5所述配合物的製備方法，其特徵在於首先將吡啶-2-甲醛和色胺投入苯甲醚加熱，加入鈀/碳後回流，反應混合物趁熱過 濾，旋蒸至濾液呈暗綠色，用甲醇溶解，蒸發得到1- (2-吡啶)-β -咔啉；然後將 1-(2-批啶)-β _ 咔啉與 cis-[Ru(bpy)2Cl2] · 2H20、cis-[Ru(phen)2C12] · 2H20 或cis-[Ru (DIP)2Cl2] · 2H20中的一種溶於乙醇的混合液通氬氣回流，直至呈現明顯的紅色 液體，趁熱過濾後真空濃縮，加入NH4PF6後混合液放入冰箱過夜冷卻，過濾得到產物，用乙 醇/水混合物重結晶，真空乾燥，即得；反應式如下
7.權利要求5所述配合物作為製備細胞自噬誘導劑的應用。
8.權利要求5所述配合物作為製備抗腫瘤藥物的應用。
9.根據權利要求8所述的抗腫瘤藥物，含有權利要求5所述β-咔啉釕配合物作為有 效成分以及藥學上可接受的輔助劑。
全文摘要
本發明公開了一種β-咔啉釕配合物，其分子式為[Ru(N^N)2(Nh)XClY](A^A)z，其中N^N選自bpy或phen；A^A選自PF6或SO3CF3；X＝1或2，Y＝2-X，Z＝1或2；或者，其分子式為[Ru(N^N)2(1-Py-βC)](PF6)2其中N^N選自bpy，phen或DIP。本發明在分子機理上證明了上述β-咔啉釕配合物可以用於治療癌症，且效果優於廣泛應用的傳統金屬配合物順鉑和在臨床試驗中的釕系配合物NAMI-A，β-咔啉釕配合物作為細胞自噬誘導劑用於治療癌症填補了現有技術的空白，為開發新一代高效的治療惡性腫瘤的藥物開拓了新思路。
文檔編號A61K31/4745GK101845060SQ201010173100
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月5日 優先權日2010年5月5日
發明者吳壽海, 彭文烈, 徐安龍, 朱一平, 王旻諝, 譚彩萍, 賴森森, 連武 申請人:中山大學