一種納米金抗菌劑的工業化生產方法與流程

2023-07-28 16:24:45 2

本發明涉及一種納米金抗菌劑的製備方法，具體涉及一種納米金抗菌劑的工業化生產方法，以及通過該方法製備的納米金抗菌劑。
背景技術：
：納米銀(AgNPs)由於優異的抗菌性能被廣泛應用，但是由於納米銀的不穩定性以及對人體細胞的毒性較大，在醫用等某些方面限制了其使用。近年來，穩定性更好、對人體細胞毒性更小的納米金作為抗菌劑的研究逐漸被報導。納米金(AuNPs)作為新型的抗菌劑，大部分的研究製備納米金抗菌劑的規模處於實驗室的小規模階段，製備過程較複雜，難以工業化，有的研究報導的納米金抗菌劑的抗菌效果不是太好。專利CN102188383A報導的巰基嘧啶修飾的納米金抗菌劑對革蘭氏陽性菌，比如金黃色葡萄球菌的抗菌效果較差。Hong-ZhengLai(LaiHZ,ChenWY,WuCY,etal.Potentantibacterialnanoparticlesforpathogenicbacteria[J].ACSappliedmaterials&interfaces,2015,7(3):2046-2054.)報導萬古黴素修飾的納米金抗菌劑相比於單純的萬古黴素，抗菌性有了較大的提高，但是納米金上存在的抗生素萬古黴素，由於細菌耐藥性的問題，其使用依然對人類和自然存在隱患。Zhaoyuyun等(ZhaoY,JiangX.Multiplestrategiestoactivategoldnanoparticlesasantibiotics[J].Nanoscale,2013,5(18):8340-8350.和ZhaoY,YeC,LiuW,etal.TuningthecompositionofAuPtbimetallicnanoparticlesforantibacterialapplication[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2014,53(31):8127-8131.)報導的氨基嘧啶/含氨基小分子的雙組份藥物修飾的納米金抗菌劑和納米金鉑雙金屬抗菌劑有很強的廣譜抗菌性，其對人體細胞的毒性遠遠低於納米銀，並且不會產生細菌耐藥性，是一類非常有前途的抗菌劑，但是其在製備過程中還原劑NaBH4是以滴加的方式加入到反應溶液中，大規模生產時這將非常耗時，不容易實現，其次，納米金反應完後，需要用透析袋透析，工業生產時依然很難實現。因此，將已研發的具有優異的廣譜抗菌性、無細菌耐藥性，對人體細胞毒性小的納米金在實現工業化生產的進程中依然存在問題需要解決。技術實現要素：因此，本發明的目的在於克服現有技術中的上述缺陷，提供一種工藝簡單、效率更高、成本低廉的納米金抗菌劑的工業化生產方法，以及通過該方法製備的納米金抗菌劑。為實現上述目的，本發明提供了一種納米金抗菌劑的工業化生產方法，該方法包括以下步驟：(1)將氯金酸溶液與含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液或氯鉑酸鉀溶液混合，得到混合溶液。(2)在攪拌下向所述混合溶液中快速加入還原劑的溶液，充分反應後即得到所述納米金抗菌劑。其中，所述納米金抗菌劑的體積可以為5L以上，可以優選為5～100L，例如可以為50～100L。並且還原劑的加入時間可以不超過5分鐘，可以優選不超過1分鐘，可以更優選10s～60s。還原劑的加入時間可依不同的反應體積而變化，但可以選自本發明記載的時間範圍，例如可以為10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s等。本領域技術人員容易理解，用於製備氯金酸溶液的氯金酸原料可以是四水合氯金酸。根據本發明的方法，其中，所述納米金抗菌劑中的含金納米顆粒的平均粒徑為1～20nm，優選為1～10nm，例如2～10nm。更優選地，所述含金納米顆粒在納米金抗菌劑中的濃度為10～2000ppm，優選為400～2000ppm，進一步優選為800～2000ppm，例如400～1000ppm，或800～1000ppm。其中，1ppm通常可換算為1mg/L。根據本發明的方法，其中，相對於所述納米金抗菌劑的總體積，所述氯金酸的濃度可以約為10～2000ppm，優選為400～2000ppm，進一步優選為800～2000ppm。根據本發明的方法，其中，所述還原劑為硼氫化鈉、抗壞血酸鈉或檸檬酸鈉。優選地，所述還原劑與氯金酸的摩爾比或者所述還原劑與氯金酸和氯鉑酸鉀(的總摩爾數)的摩爾比為1:1～10:1，優選為2:1～3:1。進一步優選地，步驟(2)中的反應時間為0.5～3小時，反應溫度為室溫以下，例如可以在25℃以下，如20～25℃。根據本發明的方法，其中，當氯金酸溶液與含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液混合時，在所得納米金抗菌劑的含金納米顆粒中，氨基嘧啶類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1，例如1:1，氨基類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1，例如1:1。所述金元素的摩爾量可以對應於氯金酸的摩爾量。優選地，所述氨基嘧啶類小分子選自2-巰基-4,6-二氨基嘧啶、2-巰基-4-氨基嘧啶和2,4-二氨基-6-巰基嘧啶中的一種或多種。更優選地，所述氨基類小分子選自胍、二甲雙胍、鹽酸二甲雙胍、1-(3-氯酚)雙胍、氯喹、鹽酸乙醯膽鹼和三聚氰胺中的一種或多種。更進一步優選地，當氯金酸溶液與氯鉑酸鉀溶液混合時，在所得納米金抗菌劑的含金納米顆粒中，鉑的原子百分比為10～65％。根據本發明的方法，其中，所述含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液中還包含有機酸或無機酸，優選為乙酸、丙酸或鹽酸。更優選地，所述有機酸或無機酸在所述納米金抗菌劑中的質量百分比為0.05％～10％。例如可以為0.1～0.2％。根據本發明的方法，其中，所述含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液中還包含非離子表面活性劑，優選為吐溫或聚乙二醇。更優選地，非離子表面活性劑在所述納米金抗菌劑中的質量百分比為0.01％～10％。例如可以為0.01～0.1％。根據本發明的方法，其中，所述氯金酸溶液、含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液、氯鉑酸鉀溶液或還原劑的溶液的溶劑各自獨立地為水，例如可以為去離子水。根據本發明的方法，其中，所述方法不包含純化所述納米金抗菌劑的步驟。優選地，純化所述納米金抗菌劑的步驟包括用透析袋透析處理或離心過濾處理。換言之，本發明生產方法不需要用透析袋透析處理或離心過濾處理等方式來純化含金納米顆粒。作為更進一步的限定，本發明的生產方法也可以表述為由步驟(1)和步驟(2)組成。本發明還提供了一種納米金抗菌劑，該納米金抗菌劑由本發明的上述方法製得。本發明還提供了本發明的上述納米金抗菌劑的工業化生產方法或上述納米金抗菌劑在製備抗菌產品或藥物中的應用。優選地，所述抗菌產品或藥物可以為抑菌和/或殺菌的產品或藥物。更優選地，所述抗菌藥物可以為用於治療燒傷、燙傷、褥瘡感染、皮膚炎症、婦科疾病或肛腸疾病的藥物。與現有技術相比，本發明提供的納米金抗菌劑的工業化生產方法具有但不限於以下有益效果：1、本發明適用於反應溶液體積在5L以上，優選10L以上，甚至100L以上的生產規模，該生產方法工藝簡單、成本較低，所生產的納米金抗菌劑具有優異抗菌效果且對人體細胞低毒。2.採用本發明方法所生產的納米金抗菌劑中的含金納米顆粒比小規模生產的粒徑更小，尺寸更均一，並且在抗菌效果方面無明顯差異，且抗菌效果與納米銀相近。3、文獻報導為得到顆粒小且尺寸均一的納米顆粒，採用了滴加還原劑(如硼氫化鈉或檸檬酸鈉)溶液的方式。例如，相對於25mL的混合溶液，5mL的還原劑溶液需要在2分鐘滴完。如果在大規模生產也採用該方式，例如體積為100L規模時，那麼滴加還原劑溶液的時間則需要數天，這會極大降低生產效率，不適合工業化生產。相比之下，在本發明的生產方法中，還原劑的溶液是一次性快速加入(即100L時加入時間最多不超過5分鐘)到反應液(本發明的混合溶液)中，因此更節約時間，有助於提升生產效率。4.採用一次性快速加入還原劑溶液和滴加還原劑溶液相比，所製得的納米金抗菌劑中的含金納米顆粒在粒徑、尺寸均一度方面均無明顯差異，並且在抗菌效果方面也無明顯差異。5、文獻報導中的含金納米顆粒在反應後需要用透析袋透析24至48小時，並且工業化生產中的透析工藝非常複雜，透析設備非常昂貴。本發明生產方法不需要用透析袋透析處理或離心過濾處理等方式來純化含金納米顆粒，因此工藝更為簡單，降低了生產成本，進一步提升了生產效率。6.本發明不採用透析等純化步驟所製備的納米金抗菌劑與透析處理的納米金抗菌劑相比，抗菌效果十分優異，而且對人體細胞的毒性同樣很低，且遠遠低於市售納米銀抗菌劑和硝酸銀。附圖說明以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：圖1示出了本發明的實施例1～2與對比例1～2的納米金抗菌劑中的含金納米顆粒的TEM圖；圖2示出了本發明的實施例3與對比例3～5的納米金抗菌劑中的含金納米顆粒的TEM圖(以納米銀AgNPs作為對照)；圖3示出了本發明的實施例4、對比例6的納米金抗菌劑的細胞毒性圖(以納米銀和硝酸銀作為對照)。具體實施方式下面通過具體的實施例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例僅僅是用於更詳細具體地說明之用，而不應理解為用於以任何形式限制本發明。本部分對本發明試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作儘可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在上下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。以下實施例中使用的試劑和儀器如下：試劑：儀器：電感耦合等離子體原子發射光譜儀(ICP-OES)，型號iCAP6300，美國ThermoScientific公司。透射電子顯微鏡(TEM)，型號TecnaiG220S-TWIN，美國FEI公司。實施例1本實施例用於說明本發明的納米金抗菌劑的工業化生產方法及通過該方法製得的納米金抗菌劑。本實施例採用的製備方法為：(1)將80g的四水合氯金酸溶於20L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的2-巰基-4,6-二氨基嘧啶和鹽酸二甲雙胍溶於20L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助於促進氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解於水中，得到含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。(2)將一定量的硼氫化鈉溶於10L的去離子水中，在攪拌下將上述硼氫化鈉溶液快速加入(用時1分鐘)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應，不需採用透析等純化工藝，即得到約50L的濃度為約800ppm的(按照投料比算出的)納米金抗菌劑。根據投料比，2-巰基-4,6-二氨基嘧啶與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1，鹽酸二甲雙胍與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1，還原劑硼氫化鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1，乙酸佔納米金抗菌劑的質量百分比為0.1％，表面活性劑吐溫80佔納米金抗菌劑的質量百分比為0.01％。由ICP-OES測得，該納米金抗菌劑含有濃度約為800ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4,6-二氨基嘧啶和鹽酸二甲雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)。由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為2～6nm，具體見圖1。實施例2本實施例用於說明本發明的納米金抗菌劑的工業化生產方法及通過該方法製得的納米金抗菌劑。實施例2的納米金抗菌劑的製備方法基本與實施例1相同，區別在於，各試劑(包括原料和溶劑等)的用量均按比例縮小，以使所得納米金抗菌劑的體積為5L。其中，由ICP-OES測得實施例2的納米金抗菌劑(5L)含有濃度約為800ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4,6-二氨基嘧啶和鹽酸二甲雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)，由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為3～7nm，具體見圖1。根據投料比，2-巰基-4,6-二氨基嘧啶與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1，鹽酸二甲雙胍與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1，還原劑硼氫化鈉與金元素的摩爾含量比為3:1。對比例1～2按照與實施例1相同的製備方法分別製得對比例1、2的納米金抗菌劑，其區別在於，各試劑(包括原料和溶劑等)的用量均按比例縮小，以使所得納米金抗菌劑的體積分別為250mL、25mL。由ICP-OES測得對比例1的納米金抗菌劑(250mL)含有濃度約為800ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4,6-二氨基嘧啶和鹽酸二甲雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)，由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為5～10nm，具體見圖1。根據投料比，2-巰基-4,6-二氨基嘧啶與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1，鹽酸二甲雙胍與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1。由ICP-OES測得對比例2的納米金抗菌劑(25mL)含有濃度約為800ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4,6-二氨基嘧啶和鹽酸二甲雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)，由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為5～10nm，具體見圖1。根據投料比測定，2-巰基-4,6-二氨基嘧啶與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1，鹽酸二甲雙胍與金元素(或氯金酸)的摩爾含量比為1:1。試驗例1按照微孔稀釋方法(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.，Methodsfordeterminingbactericidalactivityofantimicrobialagents,M26-A,1999.)測定最小抑菌濃度(MIC)：將100μL不同濃度的納米金抗菌劑或納米銀加入到96微孔板中，10μL相同濃度(104CFU/mL)的細菌培養液加入每個微孔中，37℃培養24小時後觀察，沒有可看見的細菌生長的微孔中最低的納米金抗菌劑或納米銀的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)，MIC越小證明該樣品抗菌性能越好。以上述方法測定實施例1～2和對比例1～2的納米金抗菌劑(以納米金顆粒AuNPs的濃度計)的MIC，並且以市售納米銀(AgNPs)(購自張家港耐爾納米公司)的MIC作比較。細菌培養液分別為E.coli(大腸桿菌)、S.aureus(金黃色葡萄球菌)和P.aeruginosa(綠膿桿菌)，測定三組，結果見表1。表1實施例1～2及對比例1～2的納米金抗菌劑的抗菌性能比較(以市售納米銀作對照)從表1可知，採用體積大於5L的規模(如5L、50L)生產的納米金抗菌劑與小規模(25mL、250mL)生產的納米金抗菌劑在抗菌性能方面無明顯改變，其中還出現了某些效果提升。例如，實施例1(50L)對金黃色葡萄球菌的抗菌能力強於對比例1和2，實施例2(5L)對綠膿桿菌的抗菌能力強於對比例1(250mL)。實施例3本實施例用於說明本發明的納米金抗菌劑的工業化生產方法及通過該方法製得的納米金抗菌劑。本實施例採用的製備方法為：(1)將20g的四水合氯金酸溶於2L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的2-巰基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)雙胍溶於2L的水中，還加入一定量的聚乙二醇和乙酸，以有助於促進氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解於水中，得到含氨基嘧啶類小分子和氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。(2)將一定量的檸檬酸鈉溶於1L的去離子水中，在攪拌下將上述檸檬酸鈉溶液快速加入(用時10秒)到上述混合溶液中，在室溫(如25℃)以下攪拌0.5小時至充分反應，不需採用透析等純化工藝，即得到約5L的納米金抗菌劑。由ICP-OES測得，該納米金抗菌劑含有濃度約為2000ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)。由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為3～7nm，具體見圖2。根據投料比，2-巰基-4-氨基嘧啶與金元素的摩爾含量比為1:1，1-(3-氯酚)雙胍與金元素的摩爾含量比為1:1，還原劑檸檬酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1，乙酸佔納米金抗菌劑的質量百分比為0.2％，表面活性劑聚乙二醇佔納米金抗菌劑的質量百分比為0.1％。對比例3～5對比例3～5的納米金抗菌劑的製備方法基本與實施例3相同，區別在於，檸檬酸鈉溶液的加入(可採用滴加方式)時間分別為2分鐘、20分鐘和200分鐘。其中，由ICP-OES測得對比例3的納米金抗菌劑(2分鐘)含有濃度約為2000ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)，由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為5～8nm，具體見圖2。根據投料比，2-巰基-4-氨基嘧啶與金元素的摩爾含量比為1:1，1-(3-氯酚)雙胍與金元素的摩爾含量比為1:1。由ICP-OES測得對比例4的納米金抗菌劑(20分鐘)含有濃度約為2000ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)，由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為6～9nm，具體見圖2。根據投料比，2-巰基-4-氨基嘧啶與金元素的摩爾含量比為1:1，1-(3-氯酚)雙胍與金元素的摩爾含量比為1:1。由ICP-OES測得對比例5的納米金抗菌劑(200分鐘)含有濃度約為2000ppm的含金納米顆粒(即2-巰基-4-氨基嘧啶和1-(3-氯酚)雙胍雙組份修飾的納米金顆粒)，由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為7～10nm，具體見圖2。根據投料比，2-巰基-4-氨基嘧啶與金元素的摩爾含量比為1:1，1-(3-氯酚)雙胍與金元素的摩爾含量比為1:1。試驗例2按照試驗例1中描述的相同方法測定實施例3和對比例3～5的納米金抗菌劑(以納米金顆粒AuNPs的濃度計)的MIC，並且以市售納米銀(AgNPs)(購自張家港耐爾納米科技有限公司)的MIC作比較。細菌培養液分別為E.coli(大腸桿菌)、S.aureus(金黃色葡萄球菌)和P.aeruginosa(綠膿桿菌)，測定三組，結果見表2。表2實施例3和對比例3～5的納米金抗菌劑的抗菌性能比較(以市售納米銀作對照)樣品E.coliS.aureusP.aeruginosa實施例3(10s)1.4392.8782.878對比例3(2min)1.4165.6662.838對比例4(20min)2.8425.6845.684對比例5(200min)2.7805.5595.559AgNPs1.8343.6673.667從表2可知，一次性快速加入還原劑(如實施例1採用10s)而生產的納米金抗菌劑與更長加入時間(如2min、20min、200min或更長)生產的納米金抗菌劑相比，雖然用時大幅縮短，但抗菌性能無顯著差異，其中在某些方面還呈現效果提升。例如，實施例3(10s)對大腸桿菌、綠膿桿菌的抗菌能力強於對比例4(20min)和對比例5(200min)，對金黃色葡萄球菌的抗菌能力則最佳。實施例4本實施例用於說明本發明的納米金抗菌劑的工業化生產方法及通過該方法製得的納米金抗菌劑。本實施例採用的製備方法為：(1)將25g的四水合氯金酸和55g氯鉑酸鉀溶於60L的去離子水中，得到混合溶液。(2)將一定量的硼氫化鈉溶於40L的去離子水中，在攪拌下將上述硼氫化鈉溶液快速加入(用時60秒)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌3小時至充分反應，不需採用透析等純化工藝，即得到約100L的納米金抗菌劑。根據投料比，還原劑硼氫化鈉與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾含量比為2:1，鉑的原子百分比為65％，因此該金-鉑納米顆粒可表示為Au35Pt65納米顆粒。由ICP-OES測得，該納米金抗菌劑含有濃度為400ppm的含金-鉑納米顆粒(即金-鉑雙金屬組分納米顆粒)。由TEM測得納米金顆粒的粒徑約為7～10nm。對比例6及試驗例3試驗例3用於比較採用和不採用透析純化處理所製得的納米金抗菌劑的抗菌效果。按照實施例4的方法製備對比例6，其區別僅在於，將反應後的溶液用截止分子量為3KDa的透析袋在純水中透析48小時，每6小時換一次水，得到含金-鉑納米顆粒的納米金抗菌劑溶液，作為對比例6。按照試驗例1中描述的相同方法測定實施例4和對比例6的納米金抗菌劑(以含金納米顆粒的濃度計)的MIC。細菌培養液分別為E.coli(大腸桿菌)、S.aureus(金黃色葡萄球菌)和P.aeruginosa(綠膿桿菌)，測定三組，結果見表3。表3實施例4和對比例6的納米金抗菌劑的抗菌性能比較試驗例4本試驗例用於比較採用和不採用透析純化處理所製得的納米金抗菌劑的細胞毒性(同時以市售納米銀和硝酸銀溶液作對照)。細胞毒性試驗操作過程：人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)中培養。在96微孔板的每個孔中加入104個HUVEC細胞，每個孔中加入不同濃度的實施例4的納米金抗菌劑、對比例6的納米金抗菌劑、商品化納米銀、硝酸銀溶液到200微升。微孔介質中在37℃下培養48小時，沒有加入抗菌劑的HUVEC細胞作為對照。培養完後，微孔中的溶液用磷酸緩衝溶液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介質中，在37℃下培養2小時。在酶聯免疫檢測儀450nm處測量各樣品孔以及對照孔的吸光值。計算各個樣品孔細胞相對活力。各樣品孔細胞相對活力定義為：各個孔吸光值/對照孔的吸光值×100％。試驗結果見圖3。從圖3所示的試驗結果可知，本發明的不採用透析處理的納米金抗菌劑在不同濃度下的細胞毒性均明顯低於納米銀和硝酸銀溶液。儘管本發明已進行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發明的精神和範圍的條件下，可進行各個條件的適當變化。可以理解，本發明不限於所述實施方案，而歸於權利要求的範圍，其包括所述每個因素的等同替換。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp