誘導玉米單倍體的方法

2023-08-06 18:47:31

誘導玉米單倍體的方法
【專利摘要】本發明公開了誘導玉米單倍體的方法。該方法包括用玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系作父本給母本授粉，收穫雜交當代籽粒，得到玉米單倍體；所述玉米單倍體誘導系按照包括如下步驟的方法培育：1）將著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因導入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的雜交第一代植株中，得到轉基因玉米植株；2）以所述轉基因玉米為母本與所述CAU5進行雜交得到F1代，將所述F1代作為母本與所述CAU5進行雜交得到BC1F1代，將所述BC1F1代作為母本與所述CAU5進行雜交得到BC2F1代；將所述BC2F1代連續自交至少5代，得到所述玉米單倍體誘導系。
【專利說明】誘導玉米單倍體的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及誘導玉米單倍體的方法。

【背景技術】
[0002] 單倍體是指具有配子染色體數目的個體。由於單倍體的染色體條數僅為配子體染 色體數目，一經加倍，即可獲得純系，而純系選育是雜種優勢利用中非常關鍵的環節，因此 單倍體的利用價值無疑是巨大的。
[0003] 單倍體育種指通過各種方法獲得單倍體，通過染色體加倍獲得純合二倍體，並在 單倍體和二倍體水平上選擇，以便育成優良的純系品種的途徑。1964年曼陀羅花葯培養成 功獲得單倍體植株（Guha and Maheshwari，1964)，隨後掀起了單倍體研究的熱潮，單倍體 研究迅速發展。單倍體育種優勢有以下幾點：1)縮短育種進程，常規育種中一般需要6到 8個世代才能獲得穩定的育種材料，而通過單倍體育種獲得純系只需要兩代；2)單倍體育 種沒有基因互作效應，與分子標記結合，可以提高選育的效率，以及選育的準確性（Geiger and Gordillo, 2009) ; 3)單倍體育種有利於產量、抗性等數量性狀有利等位基因的快速聚 合，經過加倍得到的DH系，無分離現象，穩定性強，可長期應用；4) DH群體有豐富的遺傳類 型，育種價值高。
[0004] 單倍體產生方式有：
[0005] 1、配子體培養產生單倍體
[0006] 應用植物細胞全能性原理，主要是利用組織培養技術進行雌配子或雄性配子的誘 導，常用的有花葯培養和小孢子培養，但由於此種方法操作不方便，生產成本高，另外在一 些物種中利用離體培養產生單倍體很難，包括玉米，所以商業化應用價值不高。
[0007] 2、雜交獲得單倍體
[0008] 遠緣雜交產生單倍體在許多報導中出現過。用玉米或珍珠粟的花粉給小麥授 粉，會刺激小麥形成單倍體（Laurie and Bennett, 1988 ;Gernand et al.，2005)。用球 莖大麥給大麥授粉也可以產生單倍體（Kasha and Sadasivaia，1971;Subrahmany and Kasha, 1973)。通過胚拯救的方式可以增加單倍體的成活率。但同一物種相互雜交產生單 倍體的現象比較少見，通常也是利用兩個倍性不同的植株雜交得到的。
[0009] 3、玉米中單倍體的產生方式
[0010] 遺傳誘導目前是誘導玉米單倍體的最有效的方法。Chase於1952年報導了玉 米單倍體的自發頻率為〇. 1%左右。之後玉米遺傳學家發現了兩類特殊的玉米材料，可 以用來誘導單倍體。利用誘導系誘導產生單倍體主要有兩種。一種是利用雌配子增生 (indeterminate gametophyte，ig)突變體作母本與普通玉米材料作父本進行雜交，在其後 代中就有一定頻率的父本單倍體或母本單倍體的產生（1^1'1111(316，1969出 ￥&118,2007)。另 一種是利用來源於Stock6的母本單倍體誘導系作父本與普通材料作母本進行雜交，來產 生母本單倍體（Coe，1959)。這一自交系將玉米單倍體誘導率由自發突變的0. 1%提高到了 1%-2%。國內外在選育優良誘導系上有較大進展，如玉米單倍體誘導系WS14誘導率為2%-5% (Lashermes et al.，1988)，玉米單倍體誘導系CAU5 (Xu et al.，2013)的平均誘導率約為 9%。雖然近年來選育出的單倍體誘導系在誘導率上逐漸提高，但進一步提高誘導率、改良誘 導系性狀及增強篩選標記，對於單倍體育種的貢獻將是巨大的。


【發明內容】

[0011] 本發明所要解決的技術問題是提供一種高誘導率的誘導玉米單倍體的方法。
[0012] 本發明所提供的誘導玉米單倍體的方法，包括用玉米單倍體誘導率高於玉米單倍 體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系作父本給母本授粉，收穫雜交當代籽粒，得到玉米單倍 體；
[0013] 所述玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系按照包 括如下步驟的方法培育：
[0014] 1)將著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因導入玉米自交系HiIIA和玉米自交系 HiIIB的雜交第一代植株中，得到含有所述著絲粒特異組蛋白突變體的轉基因玉米植株； 所述著絲粒特異組蛋白突變體為a)或b)或c):
[0015] a)著絲粒特異組蛋白與螢光蛋白融合得到的所述螢光蛋白在羧基端的融合蛋白； 所述著絲粒特異組蛋白的胺基酸序列為SEQ ID No. 1的第1-183位胺基酸殘基；
[0016] b)將SEQ ID No. 1的第1-183位胺基酸殘基組成的胺基酸序列經過一個或幾個氨 基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與著絲粒功能相關的的蛋白質；
[0017] c)將b)的蛋白質與所述螢光蛋白融合得到的所述螢光蛋白在羧基端的融合蛋 白；
[0018] 2)以所述轉基因玉米植株為母本與所述玉米單倍體誘導系CAU5 (父本）進行雜 交得到Fl代，將所述Fl代作為母本與所述玉米單倍體誘導系CAU5 (父本）進行雜交得到 BClFl代，將所述BClFl代作為母本與所述玉米單倍體誘導系CAU5 (父本）進行雜交得到 BC2F1代；將所述BC2F1代連續自交至少5代，得到玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導 系CAU5的玉米單倍體誘導系。
[0019] 上述方法中，所述玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的雜交第一代植株是以 玉米自交系HiIIA為母本，玉米自交系HiIIB為父本得到的Fl代植株，或是以玉米自交系 HiIIA為父本，玉米自交系HiIIB為母本得到的Fl代植株。
[0020] 上述方法中，所述螢光蛋白可為黃色螢光蛋白（YFP)、綠色螢光蛋白（GFP)、增強 綠色螢光蛋白（EGFP)、紅色螢光蛋白（RFP)等。在本發明的一個實施方式中，所述著絲粒特 異組蛋白CENH3的突變體為所述著絲粒特異組蛋白與黃色螢光蛋白融合得到的融合蛋白。
[0021] 在本發明的一個實施方式中，所述著絲粒特異組蛋白突變體的胺基酸序列具體為 SEQ ID No. 1。
[0022] 在本發明的一個實施方式中，所述著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因的編碼序 列具體為SEQ ID No. 2的第9897-11216位。
[0023] 在本發明的一個實施方式中，所述著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因通過核苷 酸是SEQ ID No. 2的第8423-11975位所示的表達盒導入所述玉米自交系HiIIA和玉米自 交系HiIIB的雜交第一代植株。
[0024]在本發明的一個實施方式中，所述著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因通過核苷 酸是SEQ ID No. 2的表達載體導入所述玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的雜交第一 代植株。
[0025] 上述方法中，所述BC2F1代連續自交至少5代中，從所述BC2F1代開始，每一代從 群體中按照染色體有螢光信號且對作為母本的玉米的單倍體誘導率由高到低的順序選擇 單株進行自交。
[0026] 在本發明的一個實施方式中，所述2)中，將所述BC2F1代連續自交5代得到玉米 單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系，BC2F1代群體大小為大 於等於100株(如120株)，從所述BC2F1代群體中按照染色體有螢光信號且對作為母本的 玉米的單倍體誘導率由高到低的順序選擇單株作為中選BC2F1單株，所述中選BC2F1單株 的株數是所述BC2F1代群體大小的至少6% (如7%);將所述中選BC2F1單株分別自交得到 BC2F2代群體，所述BC2F2代群體大小為大於等於100株(如154株)，從所述BC2F2代群體 中按照染色體有螢光信號且對所述作為母本的玉米的單倍體誘導率由高到低的順序選擇 單株作為中選BC2F2單株，所述中選BC2F2單株的株數是所述BC2F2代群體大小的至少9% (如10%);將所述中選BC2F2單株分別自交得到BC2F3代群體，所述BC2F3代群體大小為大 於等於100株(如211株)，從所述BC2F3代群體中按照染色體有螢光信號且對所述作為母本 的玉米的單倍體誘導率由高到低的順序選擇單株作為中選BC2F3單株，所述中選BC2F3單 株的株數是所述BC2F3代群體大小的至少8% (如9%);將所述中選BC2F3單株分別自交得 到BC2F4代群體，所述BC2F4代群體大小為大於等於100株(如360株)，從所述BC2F4代群 體中按照染色體有螢光信號且對所述作為母本的玉米的單倍體誘導率由高到低的順序選 擇單株作為中選BC2F4單株，所述中選BC2F4單株的株數是所述BC2F4代群體大小的至少 3% (如3%);將所述中選BC2F4單株分別自交得到BC2F5代群體，所述BC2F5代群體大小為 大於等於50株(如63株)，從所述BC2F5代群體中按照染色體有螢光信號且對所述作為母 本的玉米的單倍體誘導率由高到低的順序選擇單株作為中選BC2F5單株，所述中選BC2F5 單株的株數是所述BC2F5代群體大小的至少1% (如2%);將所述中選BC2F5單株分別自交 得到BC2F6代群體，該BC2F6代即為誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的單倍體誘導系。
[0027] 上述方法中，用玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘 導系作父本給母本授粉中的所述母本和所述作為母本的玉米均可為符合育種目標的自交 系、基礎群體或雜交種。
[0028] 上述方法中所述的基礎群體指由多個自交系或品種按一定方式混合授粉後形成 的玉米群體。
[0029] 上述方法中所述的雜交種指單交種、三交種或者雙交種。在本發明的一個具體實 施方式中所述作為母本的玉米和所述母本均為鄭單958。
[0030] 實驗證明，本發明採用玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單 倍體誘導系CAU5 YFP比玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導率顯著提高，達到11. 81%。 玉米單倍體誘導系CAU5YFP在抗倒性方面與玉米單倍體誘導系CAU5類似，莖杆更加強壯，雄 穗發達，散粉性強，果穗結實性好。玉米的加倍效率較低，利用組培加倍技術可以獲得更高 的加倍效率，由此看來，單倍體的早期篩選就尤為重要了。一般Rl-nj標記在授粉後18天 才能顯現，所以在幼胚組培階段很難進行篩選。本發明方法得到的玉米單倍體可利用螢光 信號鑑別單倍體；可以在幼胚和籽粒成熟期兩個時期鑑別單倍體，且鑑定準確率較高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為玉米單倍體誘導系CAU5YFP的選育過程示意圖。
[0032] 圖2為玉米單倍體誘導系CAU5YFP的根尖YFP螢光信號觀察。
[0033] 圖3為玉米單倍體誘導系CAU5YFP農藝性狀圖。
[0034] 圖4為螢光體式顯微鏡下玉米單倍體誘導系CAU5與玉米單倍體誘導系CAU5YFP種 子螢光觀察對比圖。
[0035] 圖5為體式螢光顯微鏡觀察單倍體與二倍體種子螢光差異。
[0036] 圖6為單倍體種子染色體條數鑑定。
[0037] 圖7為二倍體種子染色體條數鑑定。

【具體實施方式】
[0038] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0039] 玉米單倍體誘導系CAU5 (陳紹江，黎亮，李浩川，徐小煒.玉米單倍體育種技 術，2012,中國農業大學出版社)，公眾可以從中國農業大學獲得，以重複本申請實驗。下文 中簡稱CAU5。
[0040] 玉米雜交種鄭單958 (北京德農公司），下文中簡稱鄭單958。
[0041] 玉米自交系HiIIA和HiIIB(ArmstrongCL，GreenCEandPhillipsR LDevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformation response.MaizeGeneticsCooperationNewsLetter, 1991,65:92-93.)，公眾可以從中國 農業大學獲得，以重複本申請實驗。
[0042] 實施例1、培育玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導 系CAU5yfp
[0043] 一、將著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因導入玉米自交系HiIIA(母本）和玉米 自交系HiIIB(父本）的雜交第一代植株中，得到含有所述著絲粒特異組蛋白突變體的轉基 因玉米植株HiIIYFP
[0044] 轉基因的受體為自交系HiIIA和HiIIB的雜交Fl代。著絲粒特異組蛋白 突變體的編碼基因通過著絲粒特異組蛋白突變體CENH3-YFP編碼基因的表達載體 PZY101-35S-CENH3-YFP導入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的雜交第一代（Fl)植 株。pZY101-35S-CENH3_YFP來自JimingJiang實驗室（WeiweiJin,JimingJiang.Histone modificationsassociatedwithbothAandBchromosomesofmaize.Chromosome Research(2008) 16:1203 - 1214)，pZY101-35S-CENH3-YFP的核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所示，第6399-6423位為LB，第8423-11975位為著絲粒特異組蛋白突變體CENH3-YFP編 碼基因表達盒35S-CENH3-YFP-0CS，第12212-12236位為RB。著絲粒特異組蛋白突變體 CENH3-YFP編碼基因表達盒 35S-CENH3-YFP-0CS中，SEQIDNo. 2 的第 8423-9889 位為 35S 啟動子，SEQIDNo. 2的第9897-11216位為著絲粒特異組蛋白突變體CENH3-YFP基因的編 碼序列，編碼SEQIDNo. 1所示的著絲粒特異組蛋白突變體CENH3-YFP;SEQIDNo. 2的第 11234-11975位為OCS終止子。著絲粒特異組蛋白突變體CENH3-YFP基因的編碼序列中， SEQ ID No. 2的第9897-10445位為著絲粒特異組蛋白基因的編碼序列，SEQ ID No. 2的第 10497-11216位為黃色螢光蛋白YFP基因的編碼序列。
[0045] 首先在田間種植玉米自交系HiIIA和HilIB，到自交系散粉時分別套袋；然後準備 授粉，HiIIA作母本，HiIIB作父本，授粉後10-12天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，通過 基因槍轉化方法將PZY101-35S-CENH3-YFP轉入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的 雜交第一代（Fl)植株。篩選著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因CENH3-YFP表達，同時又 不損傷正常生長發育的轉基因植株，並自交使之純合。
[0046] 具體轉化過程如下：
[0047] 1、HiIIA作母本，HiIIB作父本，授粉後10-12天的玉米果穗作為愈傷組織誘導 的材料，在超淨臺分離玉米幼胚，將幼胚胚軸面緊貼於繼代培養基（N6+2mg/L2, 4-D+O. 7g/L L-脯氨酸+0.lg/L肌醇+30g/L蔗糖+0.lg/L水解酪蛋白+2. 7g/L瓊脂（pH5. 8)，滅菌後加 入AgNO3至其終濃度為0. 85mg/L)上，約30個/皿，暗培養7-10天，可見愈傷組織。在繼代 培養基中培養2周左右，取鬆散的II型愈傷組織，轉到高滲培養基（N6+2mg/L2, 4-D+O. 7g/ LL-脯氨酸+0?lg/L肌醇+30g/L蔗糖+0?lg/L水解酪蛋白+36. 4g/L山梨醇+36. 4g/L甘 露醇+2. 7g/L瓊脂（pH5. 8)，滅菌後加入AgNO3至其終濃度為0. 85mg/L)中。
[0048] 2、將載體膜、鐵絲網及圓形鋼圈等用70%酒精浸泡滅菌。稀釋 PZY101-35S-CENH3-YFP 至 30-60ng/ii 1。
[0049] 3、微彈粒子的準備。取50ill冷凍金粉溶液解凍，用手振蕩均勻，在超淨臺中加入 適量PZY101-35S-CENH3-YFP的DNA(60-100ng)用手振蕩均勻。加入 50IilCaCl2 溶液，在 低速渦旋器上振蕩，邊振蕩邊加入亞精胺。靜置後，200rpm離心15s，吸取上清，加入250ill 冰凍無水乙醇，洗滌兩次，待用。
[0050] 4、消毒超淨臺及基因槍表面和內部，在載體膜加上IOiU用質粒包裹好的微彈粒 子，自然瞭幹。打開氣瓶，壓力2000psi，射擊參數：Gap distance:20min;微彈載體飛行距 離：10mm;微彈飛行距離：7cm;壓力：1350psi ;真空度25inches Hg。把愈傷組織放在託盤 上，插入倒數第二檔。打開基因槍的電源，打開真空泵，當讀數到25inches Hg,按下射擊鍵 直到射擊結束，按放氣鍵，真空表歸零，取出培養皿，封口膜封好。1小時後倒入上述繼代培 養基，28 °C暗培養。
[0051] 5、篩選愈傷組織以及植株再生。繼代培養7-10天的愈傷組織，放入含有甘露糖的 篩選培養基（N6+L5mg/L 2,4-D+0.7g/L L-脯氨酸+0.5g/L MES+5g/L 蔗糖+7.5g/L 甘露 糖+2. 7g/L瓊脂（pH5. 8)，滅菌後加入AgNO3 (終濃度為0. 85mg/L)和cef (終濃度為IOOmg/ L)，28°C暗培養，每三周更換一次培養基，篩選2個月左右，挑選抗性愈傷組織，轉入再生培 養基（MS+50g/L蔗糖+5g/L甘露糖+0. lg/L肌醇+2. 7g/L瓊脂（pH5. 8))，光照培養。待分化 出小苗，轉入壯苗培養基。長到10多釐米時洗去培養基，轉入土中。收穫轉基因當代植株 所結的種子即Tl代種子，生根取根尖檢測染色體有無YFP信號，留下有YFP信號的植株，提 取葉片基因組DNA通過PCR鑑定進一步驗證，將PCR檢測陽性的植株進行自交，自交2代， 得到Hi II YFP的種子。
[0052] 其中，PCR 檢測陽性為用 5' -ATGGCTCGAACCAAGCACC-3' 和 5' -CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3'為引物對待檢測植株基因組擴增得到1236bp的PCR產 物。
[0053] 二、選育玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系 CAU5yfp
[0054] 螢光誘導系CAUYFP的選育方法如圖1，選育過程中採用了連續2代的以誘導係為 輪迴親本的回交後連續自交5代到BC2F6。由於採用了北京與海南一年兩季的選育方式，具 體選育流程如下：
[0055] 2008年北京（5月中旬)，將Hi II YFP的種子室內發芽6粒，對籽粒根尖進行 CENH3-YFP信號的檢測，發芽的6粒籽粒中有4粒的根尖染色體具有YFP信號，將這4粒幼 苗移植到營養缽中（營養土 ：蛭石=3:1)，待幼苗長至3葉1心時，帶土球移栽至地裡。作為 受體親本的誘導系CAU5 (父本）在5月底直播至大田中(誘導系的生育期較早)。配置雜交 組合Hi II YFP (母本）XCAU5,同時還組配了 Hi II YFP (母本）XUH400,每個雜交組合各收穫 2穗（Fl代）。
[0056] 2008年海南（11月初)，每個雜交組合的Fl代各種植兩個穗行，每個穗行各種植10 個單株。HiII YFP (母本）XCAU5的Fl代穗行的每個單株以CAU5為父本進行回交，收穫得 到20個BClFl果穗；HiII YFP (母本）XUH400的Fl代穗行的每個單株以UH400為父本進 行回交，收穫得到20個BClFl果穗。
[0057] 2009年北京（5月中旬)，每個組合選取200個BClFl籽粒(來自20個不同的果穗） 進行籽粒根尖染色體YFP螢光信號的檢測，將染色體有YFP螢光信號的單株移栽至田間。 HiII YFP (母本）XCAU5組合的BClFl單株3行，每行17個單株；HiII YFP (母本）XUH400組 合的BClFl單株3行，每行17個單株。HiII YFP (母本）XCAU5組合的BClFl單株用CAU5 為父本對每個單株進行回交，收穫得到BC2F1種子。HiIIyfp (母本）XUH400組合的BClFl 單株用UH400為父本對每個單株進行回交，收穫得到BC2F1種子。
[0058] 2009年海南（11月），每個組合BC2F1種子發芽，進行籽粒根尖染色體YFP螢光信 號的檢測，將染色體有YFP螢光信號的單株移栽至田間。其中，移栽HiIIyfp (母本)XCAU5 組合的BC2F1單株120個（BC2F1代群體)，共10行；移栽HiII YFP (母本）XUH400組合的 BC2F1單株120個（BC2F1代群體)，共10行；在單株自交的同時利用鄭單958 (作為母本） 進行單倍體誘導率的測定(每個BC2F1單株測定3穗，即BC2F1單株用的是花粉，每個BC2F1 單株的花粉分別授給3穗鄭單958)，收穫得到120個果穗的BC2F2種子與測交種子。檢測 測交種子的單倍體數，計算每個BC2F1單株的測交單倍體誘導率。結果表明HiIIyfp (母 本）XCAU5組合的120個BC2F1單株（BC2F1代群體）對鄭單958的誘導率為5. 71±2. 00。 根據120個BC2F1單株對鄭單958的單倍體誘導率，按照對鄭單958的單倍體誘導率由高 到低的順序選擇單株作為中選BC2F1單株，HiII YFP (母本）XCAU5組合的BC2F1的中選單 株數為8。
[0059] 2010年北京（6月初)，將8個Hi II YFP (母本）XCAU5組合的BC2F1中選單株收穫 的8個BC2F2果穗每個果穗隨機取籽粒發芽，進行籽粒根尖染色體YFP螢光信號的檢測，將 染色體有YFP螢光信號的單株移栽至田間，共移栽了 8個穗行，每個穗行19-20株，共154 個BC2F2單株（BC2F2代群體)，在單株自交的同時利用鄭單958 (作為母本）進行單倍體誘 導率的測定(每個BC2F2單株測定3穗，即BC2F2單株用的是花粉，每個BC2F2單株的花粉 分別授給3穗鄭單958)，收穫得到154個果穗的BC2F3種子與測交種子。檢測測交種子的 單倍體數，計算每個BC2F2單株的測交單倍體誘導率。結果表明HiIIyfp (母本）XCAU5組 合的154個BC2F2單株（BC2F2代群體）對鄭單958的誘導率為5. 54±2. 10。根據154個 BC2F2單株對鄭單958的單倍體誘導率，按照對鄭單958的單倍體誘導率由高到低的順序選 擇單株作為中選BC2F2單株，HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F2的中選單株數為15。
[0060] 由於HiIIYFP (母本）XUH400組合的BC2F2群體生長不正常，農藝性狀差被淘汰。
[0061] 2010年海南（11月初)，將15個HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F2中選單株收 獲的15個BC2F3果穗每個果穗隨機取籽粒發芽，進行籽粒根尖染色體YFP螢光信號的檢 測，將染色體有YFP螢光信號的單株移栽至田間，共移栽了 15個穗行，每個穗行14-15株， 共211個BC2F3單株（BC2F3代群體)，在單株自交的同時利用鄭單958(作為母本)進行單倍 體誘導率的測定(每個BC2F3單株測定3穗，S卩BC2F3單株用的是花粉，每個BC2F3單株的花 粉分別授給3穗鄭單958)，收穫得到211個果穗的BC2F4種子與測交種子。檢測測交種子 的單倍體數，計算每個BC2F3單株的測交單倍體誘導率。結果表明HiIIYFP (母本）XCAU5 組合的211個BC2F3單株（BC2F3代群體)對鄭單958的誘導率為6. 12±2. 18。根據211個 BC2F3單株對鄭單958的單倍體誘導率，按照對鄭單958的單倍體誘導率由高到低的順序選 擇單株作為中選BC2F3單株，HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F3的中選單株數為18。
[0062] 2011年北京，將18個HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F3中選單株收穫的18個 BC2F4果穗每個果穗隨機取籽粒發芽，進行籽粒根尖染色體YFP螢光信號的檢測，將染色體 有YFP螢光信號的單株移栽至田間，共移栽了 18個穗行，每個穗行20株，共360個BC2F4 單株（BC2F4代群體)，在單株自交的同時利用鄭單958 (作為母本）進行單倍體誘導率的測 定(每個BC2F4單株測定3穗，即BC2F4單株用的是花粉，每個BC2F4單株的花粉分別授給 3穗鄭單958)，收穫得到360個果穗的BC2F5種子與測交種子。檢測測交種子的單倍體數， 計算每個BC2F4單株的測交單倍體誘導率。結果表明HiIIYFP(母本)XCAU5組合的360個 BC2F4單株（BC2F4代群體)對鄭單958的誘導率為8. 61±2. 17。根據360個BC2F4單株對 鄭單958的單倍體誘導率，按照對鄭單958的單倍體誘導率由高到低的順序選擇單株作為 中選BC2F4單株，HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F4的中選單株數為10。
[0063] 2011年海南（11月初)，將10個HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F4中選單株收 獲的10個BC2F5果穗每個果穗隨機取籽粒發芽，進行籽粒根尖染色體YFP螢光信號的檢 測，將染色體有YFP螢光信號的單株移栽至田間，共移栽了 10個穗行，每個穗行6-7株，共 63個BC2F5單株（BC2F5代群體)，在單株自交的同時利用鄭單958 (作為母本）進行單倍體 誘導率的測定（每個BC2F5單株測定3穗，即BC2F5單株用的是花粉，每個BC2F5單株的花 粉分別授給3穗鄭單958)，收穫得到63個果穗的BC2F6種子與測交種子。檢測測交種子 的單倍體數，計算每個BC2F5單株的測交單倍體誘導率。結果表明HiIIYFP (母本）XCAU5 組合的63個BC2F5單株（BC2F5代群體）對鄭單958的誘導率為10. 64±1. 89。根據63個 BC2F5單株對鄭單958的單倍體誘導率，按照對鄭單958的單倍體誘導率由高到低的順序選 擇單株作為中選BC2F5單株，HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F5的中選單株數為1。
[0064] 2012年北京（5月初)，將該1個HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F5中選單株收 獲的1個BC2F6果穗隨機取24個籽粒發芽，進行籽粒根尖染色體YFP螢光信號的檢測，結 果表明每個籽粒的染色體均有YFP螢光信號，將該24個BC2F6單株（BC2F6代群體)移栽至 田間，在單株自交的同時利用鄭單958 (作為母本)進行單倍體誘導率的測定(每個BC2F6單 株測定10穗，即BC2F6單株用的是花粉，每個BC2F6單株的花粉分別授給10穗鄭單958)， 收穫得到24個果穗的BC2F7種子與測交種子。檢測測交種子的單倍體數，計算每個BC2F6 單株的測交單倍體誘導率。結果表明由HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F5中選單株收 獲的1個BC2F6果穗中隨機取的24個單株對鄭單958的誘導率為11. 81 ±1.09 (表1)，每 個單株的誘導率均高於玉米單倍體誘導系CAU5對鄭單958的誘導率8. 77%。
[0065] 由HiIIYFP (母本）XCAU5組合的BC2F5中選單株收穫的1個BC2F6果穗（共150 個BC2F6籽粒）即為玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系， 命名為玉米單倍體誘導系CAU5 YFP (表1)。
[0066] 上述方法中，單倍體誘導率的測定方法為：以被測單株為父本，以鄭單958為母本 (測驗種)，雜交後測定每個單株對母本材料鄭單958的單倍體誘導率。其中，單倍體鑑別及 單倍體誘導率的計算方法如下：
[0067] 利用Rl-nj標記挑選出紫色糊粉層無色胚子粒為擬單倍體，由於挑選出的擬單倍 體存在一定的誤選率，需要對擬單倍體進行田間種植。田間條件下，單倍體植株較二倍體雜 合植株生長勢弱，葉片上衝，與雜合二倍體植株差異明顯。取田間鑑定為單倍體的根尖固 定，酶解製片，進行細胞學鑑定，單倍體的染色條數為10條，二倍體的染色條數為20條。驗 證結果表明田間鑑定結果和細胞學鑑定結果一致。
[0068] 每個被測單株的單倍體誘導率（HIR)的確定，是將該父本誘導的擬單倍體收集在 一起，進行田間種植，由田間鑑定結果，得出某一父本的單倍體誘導率（HIR)=(擬單倍體籽 粒數/有標記的總籽粒數）X (田間單倍體數/出苗總數）X 100%。
[0069] 上述方法中，玉米單倍體誘導系CAU5對鄭單958的玉米單倍體誘導率在田間測 定，測定方法如下：取24個CAU5單株的花粉混合後給10株鄭單958 (母本）授粉，在田間 進行雜交誘導玉米單倍體，收穫雜交種子，檢測雜交種子的單倍體數，計算玉米單倍體誘導 系CAU5對鄭單958的單倍體誘導率，結果表明共收穫2179粒雜交種子，其中191粒為單倍 體，單倍體誘導系CAU5對鄭單958的單倍體誘導率為8. 77%。
[0070] 表1玉米單倍體誘導系CAU5YFP的選育進程
[0071]

【權利要求】
1. 誘導玉米單倍體的方法，包括用玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的 玉米單倍體誘導系作父本給母本授粉，收穫雜交當代籽粒，得到玉米單倍體； 所述玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系按照包括如 下步驟的方法培育： 1) 將著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基因導入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB 的雜交第一代植株中，得到含有所述著絲粒特異組蛋白突變體的轉基因玉米植株；所述著 絲粒特異組蛋白突變體為a)或b)或c): a) 著絲粒特異組蛋白與螢光蛋白融合得到的所述螢光蛋白在羧基端的融合蛋白；所述 著絲粒特異組蛋白的胺基酸序列為SEQ ID No. 1的第1-183位胺基酸殘基； b) 將SEQ ID No. 1的第1-183位胺基酸殘基組成的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與著絲粒功能相關的的蛋白質； c) 將b)的蛋白質與所述螢光蛋白融合得到的所述螢光蛋白在羧基端的融合蛋白； 2) 以所述轉基因玉米植株為母本與所述玉米單倍體誘導系CAU5進行雜交得到F1代， 將所述F1代作為母本與所述玉米單倍體誘導系CAU5進行雜交得到BC1F1代，將所述BC1F1 代作為母本與所述玉米單倍體誘導系CAU5進行雜交得到BC2F1代；將所述BC2F1代連續自 交至少5代，得到玉米單倍體誘導率高於玉米單倍體誘導系CAU5的玉米單倍體誘導系。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述螢光蛋白為黃色螢光蛋白、綠色螢光 蛋白、增強綠色螢光蛋白或紅色螢光蛋白。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於：所述著絲粒特異組蛋白突變體的氨 基酸序列為SEQ ID No. 1。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於：所述著絲粒特異組蛋白突變體的編碼基 因的編碼序列為SEQ ID No. 2的第9897-11216位。
5. 根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於：所述著絲粒特異組蛋白突變體 的編碼基因通過核苷酸是SEQ ID No. 2的第8423-11975位所示的表達盒導入所述玉米自 交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的雜交第一代植株。
6. 根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特徵在於：所述著絲粒特異組蛋白突變體 的編碼基因通過核苷酸是SEQ ID No. 2的表達載體導入所述玉米自交系HillA和玉米自交 系HiIIB的雜交第一代植株。
7. 根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特徵在於：所述BC2F1代連續自交至少5代 中，從所述BC2F1代開始，每一代從群體中按照染色體有螢光信號且對作為母本的玉米的 單倍體誘導率由高到低的順序選擇單株進行自交。
8. 根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於：所述作為母本的玉米為鄭單958。
9. 根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特徵在於：所述母本為鄭單958。
【文檔編號】C07K19/00GK104335889SQ201310314371
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月24日 優先權日:2013年7月24日
【發明者】金危危, 陳紹江, 孫佔勇, 朱奇琳, 徐小煒, 趙鑫, 徐麗 申請人:中國農業大學, 北京德農種業有限公司