L－胺基酸的製備方法

2023-08-06 22:27:26 1

專利名稱：L－胺基酸的製備方法
技術領域：
本發明涉及製備L-胺基酸的製備方法。尤其是，本發明涉及的是需求急劇增長的胺基酸的製備方法，諸如那些用作增甜劑天冬苯丙二肽酯的原料(L-苯丙氨酸)、飼料添加劑(L-色氨酸，L-蘇氨酸)、以及藥品原料如輸注液(L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸)。
背景技術：
已知很多利用微生物製備胺基酸的方法。
例如，L-苯丙氨酸的製備方法，包括那些利用大腸桿菌重組體的，公開於特公平2-4276號，特表平4-501813號，特公開5-244956號，和國際公開WO87/00202的方法。
另外L-苯丙氨酸或L-酪氨酸的製備方法，包括那些利用棒狀桿菌屬的突變株的，公開在特開昭61-128897號，和利用棒狀桿菌的重組體，公布在特開昭60-34197號、61-260892號、和61-124375號上的方法。
L-色氨酸的製備方法已有報導，包括那些利用了大腸桿菌重組體的，公開在特開昭57-71397號和美國專利4371614號，那些利用了枯草芽孢桿菌突變株的，公開於特公昭53-39517號和62-34399號，那些利用了枯草芽孢桿菌重組體的，公布於特開昭61-104790號、特公開1-67179號，那些利用短桿菌屬突變株的，公開於特開昭57-174096號，和那些利用短桿菌屬重組體的，公開於特開昭62-51980號。
已報導的L-蘇氨酸的製備方法，包括那些利用大腸桿菌屬的突變株的，公開於特公開5-304969號，那些利用大腸桿菌重組體的，公開於特公平1-29559號，特公開2-109985號和特開昭56-15696號，以及特表平3-501682號。另外，報導了那些利用棒狀桿菌屬的突變株的公開於特開昭62-23996號，和那些利用棒狀桿菌屬的重組體的，公開於特開昭61-195695號。
L-異亮氨酸的製備方法已有報導，包括利用大腸桿菌的，公開於特公開5-130882號，那些利用大腸桿菌重組體的，公開於特公平第2-458號。另外，還報導了利用棒狀桿菌屬突變株的，公開於特公開第3-62395號，和那些利用棒狀桿菌屬重組體的，公開在特公平5-47196號。
上述用在胺基酸製備方法中的微生物的培養主要基於在各種胺基酸的共同路徑和個別胺基酸的固有路徑催化反應中的酶促作用，或者基於最終產物等調控作用的迴避(反饋抑制和抑制)。特別是，那些用於培育的，包括例如，賦予微生物營養需求性，賦於微生物藥物抗性，關於生物合成系統酶基因的擴增以及基於重組DNA技術以調控脫敏為目的突變的導入。
在芳環胺基酸生物合成共同路徑中負責第一步反應的酶是3-脫氧-D-阿拉伯糖基-庚糖醛酸-7-磷酸酯(DAHP)合成酶(DS)。大腸桿菌的DS包括三種類型的同工酶，這三種同工酶分別由名為aroF、aroG和aroH的基因編碼，並且分別受L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸反饋抑制。關於這些基因，已知一種芳環胺基酸增產的技術，它以將一個基因組合和一個色氨酸操縱子導入大腸桿菌為基礎，這個基因組合編碼起源於含有高酶活性的aroF和aroG的脫敏感型酶(酶基本上不受反饋抑制)，這個色氨酸操縱子含有一個編碼在L-色氨酸生物合成固有系統的脫敏感型鄰氨基苯甲酸合成酶(AS)的基因。
磷酸烯醇丙酮酸(以後出現用「PEP」表示)和D-赤蘚糖4-磷酸(E4P)在DAHP合成反應中作底物。PEP也在L-天冬氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸等的生物合成中作為前體。上述底物從一個碳源供給諸如葡萄糖通過糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑。然而，至今也不知道能夠供給上述底物從而提高胺基酸產量的胺基酸生產株的培育。
磷酸烯醇丙酮酸合成酶(以後出現用「PPS」表示)廣泛存在於微生物中。在糖元異生作用中從丙酮酸供給PEP。這種酶起了重要作用。大腸桿菌是大腸桿菌屬的細菌，用來進行克隆編碼pps的基因(pps)，基因核苷酸序列的測定和酶的功能分析。另外，據報導接近理論產率的值製備DAHP，DAHP的生產是通過在脫氫奎尼酸合成酶缺陷株中pps基因和轉酮醇酶基因的同步擴增方式實現的(Patnaik，R.等，《應用環境微生物學)》60卷，11期，3903-3908(1994))。然而，尚未知道pps基因擴增增加芳環胺基酸和其它胺基酸的產量。

發明內容
本發明的主題是提供一種以芳環胺基酸為代表的廉價而高產地製備各式各樣胺基酸的方法。
本發明人發現增加具有L-胺基酸生產能力的微生物細胞產生磷酸烯醇丙酮酸的能力，就能提高L-胺基酸的產量，從而，完成了本發明。
即，本發明涉及生產胺基酸的方法，包括在培養基中培養有產生L-胺基酸能力的微生物、在培養基中生產和積累L-胺基酸，以及收集L-胺基酸的步驟，其中提高了微生物產生磷酸烯醇丙酮酸的能力。
優選地由上述生產方法製備的胺基酸包括L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸。
具有產生L-胺基酸能力的微生物以大腸桿菌屬的細菌和棒形細菌為例。棒形細菌這兒指的是包括從前分類到短桿菌屬而目前統一到棒狀桿菌屬中的細菌。(《國際系統細菌學雜誌》，41期，225頁(1991))。而且，棒形細菌在這兒指屬於短桿菌屬而與棒狀桿菌屬非常靠近的細菌。
增強微生物產生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法，例如，增強微生物細胞中PPS的活性。增強微生物細胞中PPS的活性的方法，例如，一個方法就是增加微生物細胞中pps基因的表達量，也可以是將編碼具有高特異活性的pps的基因導入到細胞中。
尤其是，增加在微生物細胞中pps基因的表達量的方法包括，例如，增加微生物細胞中pps基因拷貝數目的方法，也可是增加pps基因啟動子的轉錄活性的方法。
以下，將詳細說明本發明。
本發明優選地使用的微生物沒有特別地限制，它包括，例如，屬於大腸桿菌屬，短桿菌屬，棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬和假單孢菌屬的微生物，前提是微生物獲得含有一個質粒的複製起點的DNA片段，pps基因在微生物中起作用，pps基因的拷貝數能在微生物中增加，並且微生物有產生L-胺基酸的能力(例如，對L-苯丙氨酸來說，通過賦予它們對，例如，L-苯丙氨酸類似物的抗性而獲得L-苯丙氨酯的生產能力)。它們當中，那些優選地使用的細菌是屬於大腸桿菌屬的和棒形細菌的細菌。
特別是，那些優選地用於L-色氨酸的細菌包括，例如，大腸桿菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263]和AGX6(pGX50)aroP[NRRLB-12264](見美國專利4371614號)，和黃色短桿菌AJ11667(見特開昭第57-174096號)。
優選地用於L-苯丙氨酸的細菌包括，例如，大腸桿菌AJ12604(FERM BP-3579)(見歐洲專利公開第488424號)，和乳發酵短桿菌AJ12637(FERMBP-4160)(見法國專利公開第2686898號)。
優選地用於L-酪氨酸的細菌包括，例如，穀氨酸棒桿菌AJ11655(FERMP-5836)(見特公平第2-651 7號)和乳發酵短桿菌AJ-12081(FERM P-7249)(見特開昭第60-70093)。
優選地用於L-蘇氨酸的細菌包括，例如，大腸桿菌VKPM B-3996(RIA 1867)(見美國專利公開第5175107號)和嗜乙醯棒桿菌AJ12318(FERM BP-1172)(見美國專利公開第5188949號)。
優選地用於L-異亮氨酸的細菌包括，例如，大腸桿菌KX141(VKPM B-4781)(見歐洲專利公開第519113號)，和黃色短桿菌AJ12149(FERM BP-759)(見美國專利第4656135號)。
上述增強微生物產生PEP能力的方法包括在微生物細胞中增強PPS的活性。
增強PPS活性的方法包括pps基因在微生物細胞中表達量的增加。一種增強PPS活性的方法是修飾pps基因以產生高活性的pps。
增加pps基因在微生物細胞中表達量的方法包括在微生物中pps基因拷貝數的增加，為了增加pps基因拷貝數，必須獲得含有相同基因的DNA片段。pps基因在大腸桿菌屬細菌大腸桿菌中克隆，它的核苷酸序列已測定(《分子和普通遺傳學》231，332(1992))。根據上述文獻公開的方法，含有相同基因DNA片段的製品就可獲得。期望的DNA片段可通利用合成DNA探針基礎上的DNA雜交方法獲得，合成DNA探針根據上述核苷酸序列製備，或基於利用合成DNA引物的PCR(聚合酶鏈式反應)方法獲得，合成DNA引物根據相同的核苷酸序列製備。pps基因拷貝數可通過連接在靶微生物中含有pps基因的DNA片段和導入獲得的重組DNA片段到相同的微生中獲得，含有pps基因的DNA片段在可自主複製的載體DNA上。
用PCR方法克隆來自大腸桿菌屬細菌的pps基因的DNA引物可依據一定基礎被適當製備，例如，大腸桿菌已知序列(《分子和普通遺傳學》231，332(1992))。尤其是，兩個引物(序列號1)。
5′-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3′(SEQ ID NO1)，和5′-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3′(SEQ ID N02)，是較合適的，這兩個引物使擴增含有pps基因的約3.3kb區域成為可能。這些引物使擴增兩末端均有SalI切割末端的pps基因成為可能。當限制性內切酶酶切末端導入到PCR產物的末端時，擴增的DNA片段就可被相應的限制性內切酶方便地克隆，並且該DNA片段可方便地轉移到其他的載體DNA上。DNA的引物是能合成的，例如，利用亞磷醯胺方法，用Applied Biosystems生產的DNA合成儀380B型(見《四面體通訊》，22，1859(1981))。運用PCR反應，例如，利用由寶酒造株式會社生產的DNA熱循環儀PJ2000型和根據供應商指定的方法利用Taq DNA聚合酶生產。
含有pps基因的DNA片段也可從大腸桿菌屬之外的微生物中獲得。獲得DNA片段的方法包括基於合成DNA探針的利用，合成DNA探針根據上述文獻公開的核苷酸序列製備(《分子和普通遺傳學》231，332，(1992))，或基於利用合成DNA引物的PCR方法，合成DNA引物可根據相同的核苷酸序列製備。用於雜交方法的DNA探針也能通過基於已知序列與用於PCR方法的DNA引物相同的方法適當製備。據認為基因核苷酸序列的不同依賴於各自的微生物。因此，有希望製備合成DNA，其與每種微生物pps保守部分配對。
當按PCR方法擴增的pps基因導入到大腸桿菌屬的細菌中之後，接著在大腸桿菌屬的細菌中它與能自主複製的載體DNA連接，因此獲得的重組DNA就被導入到了大腸桿菌屬細菌的細胞中。
當獲得的含有pps基因的DNA片段被導入到大腸桿菌屬之外的微生物中時，在微生物細胞中，DNA片段與能自主複製的載體DNA連接而將DNA片段導入到其中，因此獲得的重組DNA被導入到細胞中。
在本發明中優選地使用質粒載體DNA。當被導入基因的微生物是大腸桿菌時，那些適宜使用的載體DNA包括，例如，pTWV228、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399，和RSF1010。另外，包括噬菌體DNA的載體也可利用。為了獲得pps的有效表達，也優選地使用在微生物中起作用的啟動子，如lac，trp和PL。為了增加pps基因的拷貝數，也優選地按基於利用轉座子(Berg，D.E.和Berg.C.M.，生物技術，1，417(1983))，Mu噬菌體(特公開第2-109985號)，或同源重組(分子遺傳學實驗，冷泉港實驗室(1972))的方法將含有pps基因的DNA摻入到染色體中。
至於本發明使用的載體DNA，當基因導入的微生物是棒形細菌，那些適宜使用的載體DNA包括，例如，在棒形細菌中能自主複製的質粒載體，如pAM330(見特公平第1-11280號)和pHM1519(見特開昭第58-77895號)。
大腸桿菌可由重組載體轉化，重組載體通過將本發明的DNA序列插入到上述的載體中而獲得。通過運用例如常用於大腸桿菌轉化的方法來實現，諸如用氯化鈣處理細胞增加DNA通透性的方法(Mandel，M.和Higa A.，分子生物學雜誌，53，159(1997))。
轉化芽孢桿菌屬的細菌的方法包括在細胞能摻入DNA的特殊生長期進行摻入的方法(Duncan，C.H.等報導了枯草芽孢桿菌)。另外，DNA通過形成作為DNA受體的原生質體或原生質球就能摻入到細菌細胞中，這樣的DNA受體易於摻入質粒DNA。這些方法在枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母中已知(Chang，S.等，《分子和普通遺傳學》168，111(1979)；Bibb等，《自然》，274，398(1978)；Hinnen，A.等，《美國國立科學院院刊》，75，1929(1978))。
電穿孔的方法也在廣泛範圍的微生物細胞有效，這種方法通過藉助高壓電脈衝瞬間形成穿過細胞壁的孔，因此DNA能摻入(Hanahan，D.等，大腸桿菌和其他細菌的質粒轉化，《酶學方法》204，63(1991))。另外，對棒形細菌基於電穿孔方法的轉化方法在特公平第2-207791號公開。
為了從有導入pps基因可能性的候選載體中，選擇實際導入pps基因的載體，例如，可以用PPS缺陷株做補充性測試。PPS缺陷株不能在只有丙酮酸做唯一碳源的基本培養基中生長。因此，能在這種培養基中生長的轉化子就被選出。大腸桿菌的PPS缺陷株包括AT2572-1菌株(見細菌學雜誌，96，2185(1968))，AT2572-1菌株可從大腸桿菌遺傳儲藏中心獲得(株號CGSC5242，郵政信箱6666，美國，康乃狄克，紐哈芬06511-7444，耶魯大學生物系奧斯博恩懷念實驗室)。
為了從有可能增加PPS活性的候選菌株選擇實際能增強PPS活性的菌株，例如，可找到一種方法，它已用公知的方法證實能增加PPS酶活性(Cooper，R.A.和H.L.Kornberg，《酶學方法》，13，309(1969))。
本發明優選地使用的微生物包括那些初始有產生L-胺基酸能力，通過增強產生PEP能力獲得的微生物，和那些通過增強產生PEP能力之後而另外增加了產生L-胺基酸能力而獲得的微生物。另外，就初始有L-胺基酸產生能力微生物來說，L-胺基酸生產能力在某些情況下仍能進一步提高，通過增加在相應胺基酸生物合成固有路徑負責的酶基因來實現，或通過導入編碼脫敏感型(抑制脫敏感型)酶的操縱子或基因來實現，否則的話該酶應受反饋抑制。
舉例說明上述的基因或操縱子那些用於L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的，包括，例如，脫敏感型「分枝酸變位酶-預苯酸脫水酶(CM-PDT)基因(見特公開5-23694號、特開昭62-130693號)和脫敏感型DS(3-脫氧-D-阿拉伯糖基-庚糖醛酸-7-磷酸合成酶)基因(見特公開第5-236947號和特開昭第61-124375號)。」那些用於L-色氨酸的，包括，例如，含有編碼脫敏感型鄰氨基苯甲酸合成酶基因的色氨酸操縱子(見特開昭第57-71397號和第62-244381號，以及美國專利第4371614號)。
那些用於L-蘇氨酸的，包括，例如，蘇氨酸操縱子，它含有編碼對L-蘇氨酸反饋抑制已脫敏的天冬氨酸激酶的基因(特公平1-29559號)，還含有編碼高絲氨酸脫氫酶的基因(特開昭60-012995號)以及編碼高絲氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的基因(特開昭61-195695號)。
那些用於L-異亮氨酸的，包括，例如，上述的蘇氨酸操縱子和編碼對L-蘇氨酸反饋抑制脫敏感的蘇氨酸脫氨酶的基因(特公平第2-458號)。
至於芳環胺基酸(L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸)，期望產量還能，除pps之外，通過增強轉酮醇酶(TK)的生產能力來進一步提高。這種增強微生物TK生產能力的方法包括微生物細胞中TK活性的增強。增強的TK活性方法包括微生物細胞內轉酮醇酶基因(tkt)表達量的增加。方法之一是增強TK的活性包括對tkt基因修飾以生產有高活性的TK。
增加在微生物細胞中tkt基因表達量的方法包括增加微生物細胞中tkt基因的拷貝數。為了增加tkt基因的拷貝數，必須獲得含有相同基因的DNA片段。tkt基因在大腸桿菌屬的大腸桿菌中已被克隆，它的核苷酸序列已被測定(生物化學生物物理學報，1216，307(1993))。因此，含有相同基因的DNA片段製品按上述文獻公開的方法得到。期望的DNA片段能夠獲得是利用基於使用合成DNA探針的雜交方法，合成DNA探針根據上述核苷酸序列製備，或利用基於使用合成DNA引物的PCR(聚合酶鏈反應)的方法，合成DNA引物根據相同核苷酸序列製備。轉酮醇酶基因拷貝數可通過連接在靶微生物中含有tkt基因的DNA片段和導入獲得的重組DNA片段到相同的微生物中而實現，含有tkt基因的DNA片段在可自主複製的載體DNA上。
用PCR方法克隆來自大腸桿菌屬細菌的轉酮醇酶基因的DNA引物可依據一定基礎適當製備，例如，大腸桿菌已知序列(生物化學生物物理學報；1216，307(1993))。尤其是，兩個引物5′-AGAGGATCCAGAGATTTCTGAAGC-3′(SEQ ID NO3)，和5′-TCTGGATCCGCAAACGGACATTATCA-3′(SEQ ID NO4)是較合適的，這兩引物使擴增含有tkt基因的約2.2kb區域成為可能。這些引物使擴增兩個末端均有BamHI切割末端的tkt基因成為可能。當限制性內切酶酶切末端導入到PCR產物的末端時，擴增的DNA片段就用相應的限制性內切酶方便地克隆，並且該DNA片段可方便地轉移到其他的載體DNA上。DNA的引物是能合成的，例如，根據亞磷醯胺方法，用Applied Biosystems生產的DNA合成儀380B型合成(見《四面體通訊》22，1859(1981))。運用PCR反應，例如，根據供應商指出的方法，用寶酒造株式會社生產的DNA熱循環儀PJ2000型和用Taq DNA聚合酶合成。
含有tkt基因的DNA片段也可從大腸桿菌屬細菌之外的微生物獲得。獲得DNA片段的方法包括基於利用合成DNA探針的雜交方法，合成DNA探針根據上述文獻公開的核苷酸序列製備(生物化學生物物理學報，1216，367(1993))，或基於利用合成DNA引物的PCR方法，合成DNA引物根據相同核苷酸序列製備。用於雜交方法的DNA探針也能基於已知序列通過與用於PCR方法的DNA引物相同的方法適當製備。人們認為基因核苷酸序列的不同依賴於各自的微生物。因此，有希望製備合成的DNA，其與每種微生物TK保守部分配對。
當上述不同的基因導入到微生物中，每種基因可存在於宿主的染色體上，或它可存在於同一質粒上，其方式與在pps基因中相同，即，不同的基因可存在於不同的質粒中。
生產目的胺基酸可通過，培養由帶有pps的重組DNA轉化的微生物，重組DNA根據上述方法獲得，在培養液中產生和積累目的胺基酸，以及收集目的胺基酸。
培養用的培養基通常是含有碳源，氮源，無機離子和任選的其它有機成份的普通培養基。
可做碳源使用的包括，例如，糖諸如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，蔗糖和澱粉水解物；醇類諸如甘油和山梨醇；有機酸如延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸。
可做氮源使用的包括，例如，無機銨鹽如硫酸銨、氨化銨和磷酸銨；有機氮如大豆水解物，氨氣和氨水。
期望做有機微量營養源使用的，要求物質含有合適的量，如維生素B1和維生素B6，如有必要，還可以是酵母提取物等。
另外，如有必要，加入少量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子和錳離子。
培養微生物要在合適的條件下進行。特別是，優選培養在有氧條件下進行16-72小時，培養溫度控制在30℃-45℃，pH控制在5-7。有可能用於pH調節的目的，例如，無機或有機酸性或鹼性物質，也可是氨氣。
從發酵液中收集L-胺基酸可採用已知的如普通離子交換樹脂法、沉澱法和其他方法的組合方法。
附圖簡述

圖1 構建質粒pHSGSK的方法圖2 構建質粒pdGM1的方法圖3 構建質粒pMWGMA2的方法圖4 構建質粒pMWD5的方法實現發明的最佳方法本發明將在下面根據實例進一步詳細說明。
實施例1製備大腸桿菌pps基因按齊藤和三浦的方法，從來源於大腸桿菌K-12的W3110株提取染色體DNA(生物化學生理物理學報，72，619(1963))。另一方面，基於已知pps基因的核苷酸序列，按PCR方法，合成用於擴增染色體DNA的pps基因的寡聚核苷酸引物。(《分子和普通遺傳學》231，332(1992))。(1)5′-CCCGTCGACGGATCCAGTTTCATCTCTTG-3′(SEQ ID NO1)(2)5′-CCCGTCGACGATCATGCGCTTATGTCGTG-3′(SEQ ID NO2)上面提及的引物含有分別與位於pps基因的上遊和下遊位置的序列同源或互補的序列，它們含有SalI識別序列使PCR產品較易克隆。
按Erlich的方法，用上述的染色體DNA和引物進行PCR反應(PCR技術，Stockton出版社(1989))。一個循環反應條件包括93℃熱變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃聚合酶反應3分鐘，循環反應重複30次。
用PCR方法得到3.3kbp的DNA片段用限制性內切酶SalI消化，然後用DNA連接酶連接到質粒載體pTWV228(氨苄青黴素抗性(Apr)，由寶酒選株式會社生產)的SalI位點上。大腸桿菌PPS缺陷株(見細菌學雜誌96，2185(1968)，從大腸桿菌遺傳儲藏中心得到(地址見前面))用連接反應混合物轉化。轉化體塗敷到有氨苄青黴素的平板上選擇生長，能在用丙酮酸做碳源的基本培養基上生長的抗氨苄青黴素菌株就被選出。從該菌株提取質粒DNA，得到的質粒命名為pTWV-pps。
對上述插有DNA片段的pTWV-pps限制性內切酶酶切圖譜分析，和對轉化體的PPS活性測量，對照分析和測量的結果，證實DNA片段含有pps基因。
實施例2製備L-苯丙氨酸1產L-苯丙氨酸細菌的創製含有L-苯丙氨酸生物合成固有系統的脫敏感型分枝酸變位酶-預苯酸脫水酶(CM-PDT)基因的DNA片段插入到質粒載體pACYC184(Cmr)，的BamHI，HindIII切割位點從而獲得質粒pACMAB(抗氯黴素(Cmr)，見特公開第5-236974號)。質粒pACMAB用SalI消化。用DNA連接酶將獲得的DNA片段與用SalI從pTWV-pps切割下來的pps基因片段連接，得到pACMAB-pps(8.9)kb。
另一方面，含有脫敏感型DS(3-脫氧-D-阿拉伯糖基-庚糖醛酸-7-磷酸合成酶)基因(aroG4)的DNA片段被插入到質粒載體pBR322的EcoRI，HindIII切割位點從而獲得質粒pBR-aroG4(Apr，見特公平第5-236947)，質粒pBR-aroG4轉化大腸桿菌W3110(tyrA)菌株。pACMAB-pps導入到獲得的重組體菌株以選出呈抗氨苄青黴素和抗氯黴素的重組體，從而獲得W3110(tyrA)/pACMAB-pps，pBR-aroG4。
由pBR-aroG4和pACMAB轉化的大腸桿菌tyrA缺陷株W3110(tyrA)(命名為AJ12604)於1991年1月28日由通商產業省工業技術院國立生命科學和人體技術研究所(郵編305，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)保藏，登記號為FERMP-11975，1991年9月26日，基於布達佩斯條約轉移到國際保藏，登記號為FERM BP-3579。根據通常的方法，可從該菌株獲得pBR-aroG4和pACMAB。2L-苯丙氨酸產力評估按上述方法得到的大腸桿菌W3110(tyrA)/pACMAB-pps，pBR-aorG4在用來產生L-苯丙氨酸的培基中37℃培養40小時(培養基含葡萄糖20g，磷酸氫二鈉29.4g、磷酸二氫鉀6g，氯化鈉1g、氯化銨2g，檸檬酸鈉1g，穀氨酸鈉0.4g，七水硫酸鎂3g、氯化鈣0.23g，維生素B12mg、L-酪氨酸100mg，混於1升水中，pH為7.0)。W3110(tyrA)/pACMAB，pBR-aroG4株也按上述方法培養。用高效液相色譜定量測定培養基中L-苯丙氨酸的含量。結果見表1。
表1菌株 L-苯丙氨酸產量(g/L)W3110(tyrA)/pACMAB，pBR-aroG4 3.8W3110(tyrA)/pACMAB-pps，pBR-aroG4 4.1實施例3製備L-色氨酸1產色氨酸細菌的創製含有脫敏感型基因(aroG4)和抗卡那黴素基因的DNA片段插入通過把質粒pACYC177XhoI位點改變的EcoRI位點而得到的質粒pACYC177E中，從而獲得質粒pACKG4(抗氨苄青黴素和拉卡那黴素(Apr，Kmr)6.4kb，見特公開第5-236947號)，將其用HindIII部分消化和用DNA聚合酶Klenow片段平滑末端化。同時，實施例1中獲得的含有pps基因的長3.3kbp的SalI片段用上述方法平滑末端化。大腸桿菌PPS缺陷株用連接反應溶液轉化以便選擇呈現Apr、Kmr和pps+的轉化體。這種質粒就從轉化體中提取，命名為pACKG4-pps(9.4kb)。
從細菌株，即，有L-苯丙氨酸和L-酪氨酸缺陷型大腸桿菌AGX17(pGX44)株(宿主AGX17株本身是L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-色氨酸缺陷型)缺失質粒pAX44從而獲得AGX17。另一方面，pGX50從含有運載色氨酸操縱子的質粒的大腸桿菌K-12的AGX6(pGX50)(aroP)株中提取pGX50(由美國專利第4371614號描述，從1981年1月31日保藏在農業研究機構保藏中心(NRRL)登記號，NRRL-B-12264(美國伊利諾斯61604 Peoria北方大學街1815號))，並將它導入AGX17株，用Apr和Trp+作標記選出轉化子。pACKG4-pps進一步導入到轉化體中，用Apr和Kmr為標記選出轉化子，轉化子命名為AGX17/pGX50，pACKG4-pps。
另一方面，用Apr、Trp+和Kmr為指標，將pGX50和pACKG4導入AGX17，從而獲得AGX17/pGX50，pACKG4。
2L-色氨酸產力評估用製備L-色氨酸的培養基在31℃培養AGX17/pGX50，pACKG4-pps48小時(培養基含葡萄糖40g、硫酸銨16g、磷酸二氫鉀1g，七水硫酸鎂1g，七水硫酸亞鐵0.01g，四水氯化錳0.01g，酵母提取物2g，碳酸鈣40g，L-苯丙氨酸100mg和L-酪氨酸100mg，混於1升水中，pH7.0)。AGX17/pGX 50，pACKG4用上述同樣方法培養，用高效液相色譜儀定量測定培養基中L-色氨酸含量。結果見表2表2細菌株 L-色氨酸產量(g/L)AGX17/pGX50，pACKG4 2.1AGX17/pGX50，pACKG4-pps 2.5實施例4製備L-蘇氨酸1產L-蘇氨酸細菌的創製實施例1中得到pTWV-pps導入到產生L-蘇氨酸的菌株，大腸桿菌VKPMB-3996株(美國專利第5175107描述，從1987年11月19日由全蘇抗生素科學中心(VNIIA)保藏在登記號RIA1867下(俄羅斯，莫斯科113105，Nagatinskaya大街3-a))。根據Smr和Apr選出轉化體獲得B3996/pTWV-pps。VKPMB-3996含有質粒pVIC40(抗鏈黴素(Smr))，質粒含有蘇氨酸操縱子，操縱子有一個編碼天冬氨酸激酶的基因，其中L-蘇氨酸的反饋抑制被脫敏。
2L-蘇氨酸產力評估B-3996菌株和B-3996/pTWV-pps，在生產L-蘇氨酸的培養基37℃培養24小時(培養基含葡萄糖40g，磷酸銨16g、磷酸二氫鉀1g，七水硫酸亞鐵0.01g，七水硫酸鎂1g，四水氯化錳0.01g，酵母提取物2g，碳酸鈣40g混合於1升水，pH7.0)。培養基中L-蘇氨酸的含量用高效液相色譜定量測定，結果見表3。
表3菌株 L-蘇氨酸產量(g/L)B-399614.5B-3996/pTWV-pps 15.5實施例5製備L-異亮氨酸1產L-異亮氨酸菌的創製(1)含有蘇氨酸操縱子和pps基因的質粒構建質粒pVIC40含有蘇氨酸操縱子，操縱子有一個編碼對L-蘇氨酸反饋抑制脫敏感的天冬氨酸激酶的基因(美國專利第5175107號描述)，該質粒pVIC40用BamHI消化，所獲得片段用Klenow片段平滑末端化。同時，實施例1中獲得的含有pps基因的長3.3kbp SalI片段用上述同樣方法平滑末端化，且與上述pVIC40連接。連接反應液用來轉化大腸桿菌PPS缺陷株以選擇有Smr和pps+的重組體。從重組體中選出的重組質粒，命名為pVIC40-pps(17.9kb)。(2)含有ilv GMEDA操縱子質粒的構建染色體DNA由大腸桿菌MI162株提取，用限制性內切酶HindIII消化。已證明含有ilvGM基因的HindIII-HindIII DNA片段長約4.9kb。因此，長度接近4.9kb的HindIII-HindIII DNA片段與由用於HindIII消化質粒載體pBR322(購於寶酒造株式會社)得到的DNA片段連接。
獲得的DNA連接反應混合物導入到羥乙酸合成酶缺陷株大腸桿菌MI262(CGSC5769)。增加了羥乙酸合成酶缺陷特徵的轉化株就可選出。菌株中質粒是隔離的。質粒結構分析結果，含有ilvGM基因和ilvE基因5′末端一部分的長4.8kb DNA片端已插入pBR322的HindIII位點，所得質粒命名為pBRGM7。
根據《基因》97，21(1991)、《美國國立科學院院刊》78，922(1981)和《細菌學雜誌》149，294(1982)報導的ilvGM基因核苷酸序列合成在序列表中SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的合成寡核苷酸序列。含有啟動子，衰減子和ilvGM基因核苷酸序列的ilvGM基因編碼區的序列與編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO5中描述。這兩個寡核苷酸序列做引物，用MI162菌株染色體DNA做模板，用PCR方法擴增DNA。還用來擴增的DNA片段有一個序列是序列表中SEQ ID NO5中25位至952位核苷酸。這個片段命名為「片段(A)」。
序列表中SEQ ID NO8和SEQ ID NO9描述的合成寡核苷酸序列，根據《基因》97，21(1991)，《美國國家科學院院刊》78，922(1981)和《細菌學雜誌》149，294(1982)報導核苷酸序列，用上述同樣方法合成。用這兩個寡核苷酸作引物，MZ162株染色體DNA做模板，用PCR方法擴增DNA。被擴增的DNA片段含有序列表中SEQ ID NO5描述的從1561位到2421位的核苷酸的序列。這個片段命名為「片段(B)」。
用SmaI消化片段(A)得到大片段連接到用SmaI消化過的載體pUC18(寶酒造株式會社)得到的DNA片段上來製備質粒pUCA。用KpnI消化片段B得到的大片段連接到用HincI和KpnI消化pHSG399(寶酒造株式會社)得到的大片段上來製備質粒pHSGB。
質粒pUCA用KpnI消化，消化末端用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)平滑末端化，然後用PstI消化，最終分離含片段(A)的DNA片段。質粒pHSGB用HindIII消化，消化末端用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)平頭末端化，接著用pstI消化，最終分離含有片段(B)的DNA片段。這兩個片段相互連接從而製備到了pHSGSK質粒。
SmaI-KpnI片段由pHSGSK運載且來源於片段(A)和(B)，命名為「片段(C)」。片段「C」相當於一個由用SmaI和KpnI消化含有ilvGM基因的長4.8kb的HindIII-HindIII片段的片段，含有啟動子，SD序列和ilvG基因上遊區，但缺少由先導序列到衰減子區長約0.2kb的序列，上述構建pHSGSK的方法小結在圖1中。
用SmaI和KpnI消化質粒pHSGSK得到片段(C)。用SmaI和KpnI消化質粒pBRGM7得到大的DNA片段。這兩個片端連接在一起。獲得的質粒命名為pUGM1。長4.6kb HindIII-HindIII片段含有ilvGM基因，它由pdGM1運載，並缺少必須的衰減作用區。在本實施例和附圖中，缺少必須的衰減作用的ilvGM基因表示為「ΔattGM」。上述構建pdGM1的方法小結在圖2中。
特公開2-458號描述的質粒pDRIA4在大腸桿菌屬的細菌中自主複製。質粒pDRIA4通過在短桿菌屬的細菌能自主複製穿梭載體pDR1120與BamHI-BamHI片段連接而製備。BamHI-BamHI片段含有編碼起源於大腸桿菌K-12蘇氨酸脫氨酶的基因ilvA和ilvD基因3′末端側的一部分。在特公開2-458號中描述BamHI-BamHI片段長2.3kb。然而，目前，BamHI-BamHI片段長2.75kb。質粒pDRIA4存在於黃色短桿菌AJ12358(FERMP-9764)或黃色短桿菌AJ12359(FERMP-9765)的染色體DNA之外。可按常規方法從這些菌株中製備質粒pDRIA4。
含編碼蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因的HindIII-BamHI片段製備自質粒pDRIA4的2.75kb的BamHI-BamHI片段，其中蘇氨酸脫氨酶基本上對L-異亮氨酸的抑制脫敏感。HindIII-BamHI連接到用HindIII和BamHI消化載體pMW119(由日本基因生產)得到的DNA片段上，從而製備的質粒命名為pMWA1。
將用HindIII消化質粒pMWA1獲得的DNA片段與用HindIII消化質粒pdGM1獲得含有ilvGM基因的DNA片段連接。在質粒中的ilvGM基因的轉錄路徑與ilvA基因轉錄路徑相同，這樣的質粒通過分析存在於質粒中限制性內切酶識別位點的位置而選出。得到的質粒命名為pMWGMA2。pMWGMA2含有沒有衰減子的ilvGM基因，ilvE基因5′-末端側的一部分和ilvD基因3′-末端側的一部分。上述pMWGMA2構建的過程在圖3中小結。
用SalI和PstI消化製得的大腸桿菌MI162株的染色體DNA來製備DNA的混合物。同時，用SalI和PstI消化載體pUC19(寶酒造株式會社)製備DNA片段。DNA片段混合物與消化pUC19得的DNA片段連接從而獲得DNA混合物。該DNA混合物導入到轉氨酶B缺陷AB2070株中(細菌學雜誌，109，703(1972)，來自大腸桿菌遺傳貯藏中心，CGSC2070)以選出恢復分枝胺基酸缺陷型的轉化的菌株。當從這菌株製備質粒時，將用SalI和PstI消化質粒pUC19獲得的DNA片段與含有ilvE基因SalI-PstI DNA片段連接。這個質粒命名pUCE1。pUCE1包括ilvM基因3′-末端側的一部分，ilvE基因和ilvD基因5′-末端側的一部分。
pMWGMA2由HindIII部分消化以製備DNA片段混合物，同時，用HindIII消化pUCE1來製備含有ilvE基因的一部分和ilvD基因5′-末端側的一部分長1.7kb的HindIII-HindIII DNA片段。兩者彼此連接獲得的DNA混合物用於轉化二羥酸脫水酶(ilvD基因產物)-缺陷株，即，AB1280株。從轉化的菌株中選出分支胺基酸缺陷消失的轉化株。當從所獲得的轉化株製備質粒時，將由只在ΔattGM和ilvA之間的HindIII位點消化pMWGMA2而得到的DNA片段與1.7kb的HindIII-HindIII DNA片段連接，該1.7kb片段採自pUCE1並含有ilvE基因的一部分和ilvD基因的一部分，其中ilvGMEDA操縱子被再生的質粒命名為pMWD5。上述pMWD5的構建過程小結在圖4中。
上述質粒pMWD5(Apr)是基於載體pMW119的利用，其中載體pMW119帶有其中對衰減作用必須的區域已被去除的ilvGMEDA操縱子。(3)產L-異亮氨酸菌的創製pVIC40-pps被導入大腸桿菌VNIIGenetika TDH-6(TDH-6對應的宿主細菌是通過上述大腸桿菌VKPMB-3996株缺失質粒PVIC40得到的)以用Smr作指示選出轉化體。另外，pMWD5被導入以獲得顯示Smr和Apr的轉化體TDH-6/pVIC40-pps，pMWD5。pVIC40和pMWD5導入上述的TDH-6，用Smr和Apr作指示得到TDH-6/pVIC40，pMWD5。2L-異亮氨酸產力評估TDH-6/pVIC40-pps，用生產L-異亮氨酸的培養基37℃培養24小時(培養基含有葡萄糖40g，硫酸胺16g，硫酸二氫鉀1g，七水硫酸鎂1g，七水硫酸亞鐵0.01g，四水氯化錳0.01g，酵母提取物2g，和碳酸鈣40g混於1升水中，pH7.0)TDH-6/pVIC40，pMWD5按上述方法條件培養。培養基中含的L-異亮氨酸用高效液色譜定量測定。結果見表4。
表4菌株 L-異亮胺基酸產量(g/L)TDH-6/pVIC40，pMWD5 10.0TDH-6/pVIC40.pps，pMWD5 11.5產業應用性根據本發明，可能生產高產量的，以芳環胺基酸為代表的各種胺基酸，尤其是L-苯丙氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸。通過將這些L-胺基酸高產力的微生物應用於本發明，這些L-胺基酸的生產力能進一步被增強。
序列表(1)總信息(i)申請人AJINOMOTO CO.，LTD.
(ii)發明標題L-胺基酸的製備方法(iii)序列數9(iv)通信地址(A)地址(B)街道(C)城市(E)國家(F)郵編(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Fast SEQ Version 1.5(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日期(C)分類(viii)代理人/事務所信息(A)姓名(B)註冊號(ix)電信信息(A)電話(B)電報(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度29個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」(iii)假設否(iv)反義否(xi)序列說明SEQ ID NO1CCCGTCGACG GATCCAGTTT CATCTCTTG 29(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度29個殘基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO2CCCGTCGACG ATCATGCGCT TATGTCGTG 29(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度24個殘基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO3AGAGGATCCA GAGATTTCTG AAGC24
(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度26個殘基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO4TCTGGATCCG CAAACGGACA TTATCA26(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度2841個殘基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)起源(A)生物體大腸桿菌(B)株MI162(ix)特點A名稱/鍵CDS(B)位置957…1055(ix)特點(A)名稱/鍵CDS(B)位置1081…1104(ix)特點(A)名稱/鍵CDS(B)位置1195…2841(ix)特點(A)名稱/鍵切割位點(SmaI)(B)位置52…57
(ix)特徵(A)名稱/鍵切割位點(KpnI)(xi)序列說明SEQ ID NO5CTCGCTTTCC TTGTTCCTGA CCGATAACAT CACTGAGATC ATGTTGTAGC GCCCGGGATA 60CTGCATCAGT TGGTTTCGGG CGTTCGAGAG CGTGCTTACC TTCCAGAAAC GCACAGACAG120CTTGCAGATG ATCGGCTATC AGGCATCCTT CACCGTTAAT TAGCCCCACT TCATCTTCGT180TATCTTTCGC GACGATAATT TTTCTGCCCG ACTTAATAGC TTCAGTTGCA CTGGAGATTG240CGCCGGGAAC GCCACGCAGA GCGCCTGTAA GCGCCAGTTC TCCGACTAAT TCATATTCAT300CTAACTTATT GGCTGTAAGC TGTTCTGAGG CCGCCAGCAA CGCAATGGCG ATAGGTAAAT360CATATCGTCC CCCTTCTTTT GGCAGATCAG CTGGAGCCAG GTTGATGGTG ATTTTTTTCG420CCGGATATTC ATATCCGCTA TTGATAATGG CGCTGCGCAC GCGATCGCGA GCTTCTTTTA480CCGTTGTTTC TGGTAAGCCC ACCATCGTTA AGCCGGGTAG ACCTTTACTG ATATGTACCT540CAACAGTGAT CGGGGGCGCA TTTACTCCCA GGGCTGCGCG GGTATGAACA ATTGACAGTG600ACATAAGCCC TCCTTGAGTC ACCATTATGT GCATAAGATA TCGCTGCTGT AGCCCGCTAA660TTCGTGAATT TTAGTGGCTC ATTCCTGTTT ATTTGTGCAA GTGAAGTTGA GTTGTTCTGG720CGGTGGAATG ATGCTCGCAA AAATGCAGCG GACAAAGGAT GAACTACGAG GAAGGGAACA780ACATTCATAC TGAAATTGAA TTTTTTTCAC TCACTATTTT ATTTTTAAAA AACAACAATT840TATATTGAAA TTATTAAACG CATCATAAAA ATCGGCCAAA AAATATCTTG TACTATTTAC900AAAACCTATG GTAACTCTTT AGGCATTCCT TCGAACAAGA TGCAAGAAAA GACAAA956ATG ACA GCC CTT CTA CGA GTG ATT AGC CTG GTC GTG ATT AGC GTG GTG 1004Met Thr Ala Leu Leu Arg Val Ile Ser Leu Val Val Ile Ser Val Val1 5 10 15GTG ATT ATT ATC CCA CCG TGC GGG GCT GCA CTT GGA CGA GGA AAG GCT 1052Val Ile Ile Ile Pro Pro Cys Gly Ala Ala Leu Gly Arg Gly Lys Ala20 25 30TAGAGATCAA GCCTTAACGA ACTAAGACCC CCGCACCGAA AGGTCCGGGG GTTTTTTTTG 1112ACCTTAAAAA CATAACCGAG GAGCAGACAA TGAATAACAG CACAAAATTC TGTTTCTCAA 1172GATTCAGGAC GGGGAACTAA CT ATG AAT GGC GCA CAG TGG GTG GTA CAT GCG1224Met Asn Gly Ala Gln Trp Val Val His Ala1 5 10TTG CGG GCA CAG GGT GTG AAC ACC GTT TTC GGT TAT CCG GGT GGC GCA 1272Leu Arg Ala Gln Gly Val Asn Thr Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala15 20 25ATT ATG CCG GTT TAC GAT GCA TTG TAT GAC GGC GGC GTG GAG CAC TTG 1320Ile Met Pro Val Tyr Asp Ala Leu Tyr Asp Gly Gly Val Glu His Leu30 35 40CTA TGC CGA CAT GAG CAG GGT GCG GCA ATG GCG 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GAA AAT TTC 2376Gln Met Trp Ala Ala Gln His Ile Ala His Thr Arg Pro Glu Asn Phe380 385 390ATC ACC TCC AGC GGT TTA GGT ACC ATG GGT TTT GGT TTA CCG GCG GCG 2424Ile Thr Ser Ser Gly Leu Gly Thr Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala395 400 405 410GTT GGC GCA CAA GTC GCG CGA CCG AAC GAT ACC GTT GTC TGT ATC TCC 2472Val Gly Ala Gln Val Ala Arg Pro Asn Asp Thr Val Val Cys Ile Ser415 420425GGT GAC GGC TCT TTC ATG ATG AAT GTG CAA GAG CTG GGC ACC GTA AAA 2520Gly Asp Gly Ser Phe Met Met Asn Val Gln Glu Leu Gly Thr Val Lys430 435 440CGC AAG CAG TTA CCG TTG AAA ATC GTC TTA CTC GAT AAC CAA CGG TTA 2568Arg Lys Gln Leu Pro Leu Lys Ile Val Leu Leu Asp Asn Gln Arg Leu445 450 455GGG ATG GTT CGA CAA TGG CAG CAA CTG TTT TTT CAG GAA CGA TAC AGC 2616Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Gln Leu Phe Phe Gln Glu Arg Tyr Ser460 465 470GAA ACC ACC CTT ACT GAT AAC CCC GAT TTC CTC ATG TTA GCC AGC GCC 2664Glu Thr Thr Leu Thr Asp Asn Pro Asp Phe Leu Met Leu Ala Ser Ala475 480 485 490TTC GGC ATC CAT GGC CAA CAC ATC ACC CGG AAA GAC CAG GTT GAA GCG 2712Phe Gly Ile His Gly Gln His Ile Thr Arg Lys Asp Gln Val Glu Ala495 500 505GCA CTC GAC ACC ATG CTG AAC AGT GAT GGG CCA TAC CTG CTT CAT GTC 2760Ala Leu Asp Thr Met Leu Asn Ser Asp Gly Pro Tyr Lau Leu His Val510 515 520TCA ATC GAC GAA CTT GAG AAC GTC TGG CCG CTG GTG CCG CCT GGC GCC 2808Ser Ile Asp Glu Leu Glu Asn Val Trp Pro Leu Val Pro Pro Gly Ala525 530 535AGT AAT TCA GAA ATG TTG GAG AAA TTA TCA TGA 2841Ser Asn Ser Glu Met Leu Glu Lys Leu Ser540 545(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度22個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」(iii)假設否(iv)反義否(xi)序列說明SEQ ID NO6TAACATCACT GAGATCATGT TG 22(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵
(A)長度21個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO7TCTTTTCTTG CATCTTGTTC G 21(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度22個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」(iii)假設否(iv)反義否(xi)序列說明SEQ ID NO8TCTGTTTCTC AAGATTCAGG AC 22(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度19個鹼基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「合成DNA」
(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO9CGCCGGTAAA CCAAAACCC 19
權利要求
1.一種製備L-胺基酸的方法，包括在培養基中培養有生產L-胺基酸能力的微生物，在培養基中產生和積累L-胺基酸以及收集L-胺基酸的步驟，其中上述微生物生產磷酸烯醇丙酮酸的能力比較野生株來說強強了。
2.根據權利要求1的L-胺基酸的製備方法，其中上述胺基酸選自L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸。
3.根據權利要求1或2的L-胺基酸製備方法，其中微生物是大腸桿菌屬的細菌。
4.根據權利要求1或2L-胺基酸的製備，其中微生物是棒形細菌。
5.根據權利要求1至4任一項的L-胺基酸的製備方法，其中增強微生物產生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法是增強細菌細胞中磷酸烯醇丙酮酸合成酶的活性。
6.根據權利要求1至4任一項的L-胺基酸的製備方法，其中增強微生物產生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法是增加細菌細胞中磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因的表達量。
7.根據權利要求1至4任一項的L-胺基酸的製備方法，其中增強微生物產生磷酸烯醇丙酮酸能力的方法是增加細菌細胞中磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因的拷貝數。
全文摘要
製備L－胺基酸的方法,包括在培養基中培養具有產生L－胺基酸,尤其是,L－苯丙氨酸,L－色氨酸,L－酪氨酸,L－蘇氨酸或L－異亮氨酸的能力和具有增強的磷酸烯醇式丙酮酸生產力的微生物,並回收在培養基中產生和積累的胺基酸。
文檔編號C12P13/00GK1200150SQ9619771
公開日1998年11月25日 申請日期1996年8月27日 優先權日1995年8月30日
發明者岸野浩子, 泉井正子, 小野由紀子, 伊藤久生, 倉橋修 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (3),