一種構建測序文庫的方法

2023-08-05 14:07:21 1

一種構建測序文庫的方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程及分子生物學領域，提供了一種構建測序文庫的方法。包括以下步驟：A.片段化處理源核酸，得片段化產物；B.步驟A的產物與第一接頭連接，得第一連接產物；所述第一接頭為互補的雙鏈核酸分子；所述雙鏈核酸分子中只有一條鏈上含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷；所述P-S鍵為硫代磷酸酯鍵；C.特異性切割試劑切割第一連接產物，除去被切下的小核酸片段；所述特異性切割試劑用於特異性的切割尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷；D.聚合酶延伸步驟C的產物，得聚合酶延伸產物。本發明的方法能夠避免構建的測序文庫中摻入接頭自連的產物。
【專利說明】一種構建測序文庫的方法
[0001] 本案為2012年10月25日申請的，申請號為201210411938. 3,發明名稱為《一種 接頭和構建測序文庫的方法》的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及基因工程及分子生物學領域，更具體地說，涉及一種構建測序文庫的 方法。

【背景技術】
[0003] 在現階段，用於高通量基因測序的DNA片段都會首先製備成測序文庫。測序文庫 的製備包括以下幾個步驟，首先隨機切割樣品基因組，獲得大量DNA片段，然後在DNA片段 兩端接上不同的接頭，最後對連接產物進行擴增反應得測序文庫。在構建文庫過程當中，最 大問題在於連接接頭時很容易出現相同接頭自連以及不同接頭自身相互連接的現象，從而 導致構建的測序文庫中混有接頭自連的產物，進而幹擾後續的測序反應，這在構建短標籤 的測序文庫時尤其嚴重。此外，接頭自連現象的發生也會降低接頭和DNA片段的有效利用 率。例如，CN200810044118. 9中公開了一種有利於高通量基因序列標籤測序的DNA粘端接 頭，是一種末端突出的DNA接頭，帶有可識別序列Xn、Yn，其序列式為序列（I )和序列（II )， 見圖1，其中，X表示A、T、C、G四種鹼基中的任意一種，η為4至10之間的任意整數，任意 兩個相鄰的X不能是相同的鹼基，Y是與X -一對應的互補鹼基，dm是末端突出標誌，d表 示A、T、C、G四種鹼基中的任意一種，m為1至4之間的任意整數。上述DNA接頭含有兩個 突出末端，分別是CCAT和dm，因為d表示A、T、C、G四種鹼基中的任意一種，m為1至4之 間的任意整數，所以上述DNA接頭的兩個突出末端可能完全互補或部分互補，然後在接頭 連接過程中發生接頭自連的現象，從而導致構建的測序文庫中可能混有接頭自連的產物， 進而幹擾後續的測序反應。
[0004] 因此需要一種新的接頭及構建測序文庫的方法，能夠避免構建的測序文庫中摻入 接頭自連的產物。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於提供一種接頭和構建測序文庫的方法，旨在解決現有技術在構 建測序文庫的過程中摻入接頭自連的產物的問題。
[0006] 為了實現發明目的，本發明提供了一種接頭，所述接頭為互補的雙鏈核酸分子；所 述雙鏈核酸分子中只有一條鏈上含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷；所述P-S 鍵為硫代憐Ife醋鍵。
[0007] 其中，所述尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷將其所在核酸鏈分隔成至少兩個核酸 片段，且所述核酸片段均小於15bp。
[0008] 其中，所述雙鏈核酸分子為單突出末端雙鏈核酸分子或雙突出末端雙鏈核酸分子 或平末端雙鏈核酸分子。
[0009] 其中，所述單突出末端雙鏈核酸分子的突出末端為（dN) a ;所述雙突出末端雙鏈核 酸分子的突出末端分別為（dN) b和（dN)。，所述（dN) b和（dN)。中至少有一個位於其所在鏈 的3'端，所述dN為A或G或C或T，所述a、b和c均為正整數。
[0010] 進一步的，所述（dN)a為T，位於含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷的 鏈的互補鏈的3'端；當所述（dN) b和（dN)。均位於其所在鏈的3'端時，（dN) b為T，（dN) c 的3'末端為G或C或T，（dN)。自身之間不能互補配對；當（dN)b和（(1幻。分別位於同一鏈 的3'端和5'端時，（dN) b為T，（dN)。自身之間不能互補配對。
[0011] 上述任一方案中，所述雙鏈核酸分子的兩條核酸鏈的5'末端的核苷酸均不含磷酸 分子。
[0012] 上述任一方案中，所述雙鏈核酸分子含有至少一個II S型限制性內切酶酶切識別 位點。
[0013] 進一步的，所述II S型限制性內切酶的酶切位點不在接頭上。
[0014] 上述任一方案中，所述雙鏈核酸分子含有生物素標記。
[0015] 進一步的，所述生物素標記位於雙鏈核酸分子中含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S 鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的5'端。
[0016] 為了更好的實現本發明的目的，本發明還提出了一種構建測序文庫的方法，包括 以下步驟： A. 片段化處理源核酸，得片段化產物； B. 步驟A的產物與第一接頭連接，得第一連接產物； C. 特異性切割試劑切割第一連接產物，除去被切下的小核酸片段；所述特異性切割試 劑用於特異性的切割尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷； D. 聚合酶延伸步驟C的產物，得聚合酶延伸產物。
[0017] 所述第一接頭為本發明的接頭中的任一種。
[0018] 其中，在片段化處理之後，所述步驟A還包括對片段化產物的分離純化及末端修 飾步驟。所述末端修飾包括但不限於：磷酸化、3'末端加 A。
[0019] 其中，步驟B中所述的第一接頭為單突出末端雙鏈核酸分子或雙突出末端雙鏈核 酸分子或平末端雙鏈核酸分子。
[0020] 進一步的，所述單突出末端雙鏈核酸分子的突出末端為（dN)a;所述雙突出末端雙 鏈核酸分子的突出末端分別為（dN) b和（dN)。，所述（dN) b和（dN)。中至少有一個位於其所 在鏈的3'端，所述dN為A或G或C或T，所述a、b和c均為正整數。
[0021] 更進一步的，所述（dN)aST，位於含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷 的鏈的互補鏈的3'端；當所述（dN) b和（(1幻。均位於其所在鏈的3'端時，（dN)b為T，（dN) c的3'末端為6或(：或1'，（(^)。自身之間不能互補配對；當（(^)13和（(^)。分別位於同一 鏈的3'端和5'端時，（dN) b為T，（dN)。自身之間不能互補配對。
[0022] 上述任一方案中，所述第一接頭的兩條核酸鏈的5'末端的核苷酸均不含磷酸分 子。
[0023] 上述任一方案中，所述第一接頭含有生物素標記。
[0024] 進一步的，步驟B中所述的第一接頭在與步驟A的產物連接之前被固定在含有鏈 酶親和素標記的磁珠上。
[0025] 進一步的，所述生物素標記位於雙鏈核酸分子中含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S 鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的5'端。
[0026] 其中，所述第一接頭含有至少一個II s型限制性內切酶酶切識別位點，且該II s型 限制性內切酶的酶切位點不在第一接頭上。
[0027] 進一步的，所述方法還包括以下步驟： E. II s型限制性內切酶酶切聚合酶延伸產物，回收含第一接頭的酶切產物； F. 步驟E的產物與第二接頭連接，得兩端分別是第一接頭和第二接頭的雙鏈核酸分 子；所述第二接頭為互補的雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子的一端與步驟E的產物中的酶 切末端互補配對。
[0028] 由上可知，本發明的接頭為互補的雙鏈核酸分子，所述雙鏈核酸分子中只有一條 鏈上含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷；在構建測序文庫的過程中，可將含有 接頭的連接產物上的尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷切開，此時接頭自連產物被切成多個 小核酸片段，正確連接的產物同樣能夠被切下小核酸片段，但是正確連接的產物的其餘部 分較上述的小核酸片段大很多；即，通過切割步驟，可放大接頭自連產物與正確連接的產物 之間的大小差異，從而實現正確連接的產物與接頭自連產物的分離，進而實現對接頭自連 產物的徹底清除。此外，正確連接的產物上被切下的小核酸片段能夠通過後續的聚合酶延 伸步驟補上，進而實現無接頭自連產物的測序文庫的構建。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1是【背景技術】中的有利於高通量基因序列標籤測序的DNA粘端接頭的結構示意 圖； 圖2是本發明的第一典型實施例中硫代磷酸酯鍵的結構示意圖； 圖3是本發明的第二和第四典型實施例的接頭在具體使用過程中的方法示意圖； 圖4是本發明的第一具體實施例和第一對比實驗構建的測序文庫的PCR驗證結果圖。

【具體實施方式】
[0030] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。
[0031] 本發明提出第一典型實施例，一種接頭，所述接頭為互補的雙鏈核酸分子；所述雙 鏈核酸分子中只有一條鏈上含有至少一個用於切割的特異性切割位點；所述特異性切割位 點為尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷；所述P-S鍵為硫代磷酸酯鍵。
[0032] 本方案的接頭適於與任意長度的核酸片段連接，尤其適用於與接頭長度相差不大 的核酸片段，例如：核酸片段與接頭的大小比值在6 :1至1 :4之間，更優選在4 :1至3 :8之 間，更優選在2 :1至1 :2之間。因為在構建測序文庫時，接頭往往是與片段化的產物連接， 而片段化的產物的往往是一定長度範圍內的核酸片段的集合，所以，當用於與接頭連接的 核酸片段與接頭的大小相差不大時，易導致接頭與核酸片段的連接產物的大小和接頭自連 產物的大小相近，而不易分離，從而導致測序文庫中摻入接頭自連的產物，進而幹擾後續的 測序反應。而本方案的接頭為互補的雙鏈核酸分子，且只有一條鏈上含有至少一個特異性 切割位點；因此，在構建測序文庫的過程中，可將含有接頭的連接產物上的特異性切割位點 切開，此時接頭自連產物被切出多個小核酸片段，正確連接的產物同樣能夠被切下小核酸 片段，但是正確連接的產物的其餘部分（目標切割產物）較接頭自連產物的切割產物和正確 連接的產物上切下的小核酸片段大很多；即，通過切割步驟，可加大接頭自連產物與正確連 接的產物之間的大小差異，從而有利於正確連接的產物與接頭自連產物的分離，進而實現 對接頭自連產物的徹底清除。
[0033] 需要說明的是：所述尿嘧啶核苷酸能夠被USER酶或UDG酶特異性切割；所述脫氧 肌苷能夠被大腸桿菌核酸內切酶V或大腸桿菌核酸內切酶V同源物或DNA糖基化酶特異 性切割；所述硫代磷酸酯鍵能夠被含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd原子的切割劑特異性切割。 [0034] 所述硫代磷酸酯鍵是指磷酸二酯鍵的橋接氧原子之一被硫原子取代。硫代磷酸脂 鍵可以是圖2中A所示的5' -S-硫代磷酸酯連接（3' -0-P-S-5'），也可以是圖2中B所示 的3' -S-硫代磷酸酯連接（3' -S-P-0-5'）。
[0035] 可用各種含金屬的物質切割硫代磷酸酯鍵。所述金屬可以是Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或 Cd。優選的，該物質是提供Ag+、Hg++、Cu2+、Mn2+、Zn +或Cd+離子的可溶於水的鹽(也可採用提 供其它氧化狀態的離子的鹽)。特別優選含銀鹽如硝酸銀(AgNO 3)或其它提供Ag+離子的鹽。 切割的條件包括例如50 mM AgNO3，約22?37°C，10分鐘或更長時間如30分鐘。優選的， pH為4.0?10.0,更優選5.0?9.0,如約6.0?8.0,如約7.0。參見Mag, M.等，Nucleic AcidsRes.，19(7): 1437-1441，1991。
[0036] 如上所述，特異性切割位點為P-S鍵的接頭與特異性切割位點為尿嘧啶核苷酸或 脫氧肌苷的接頭相比，所需的特異性切割試劑的成本更低，完成切割的速度更快，操作也更 為簡便，構建測序文庫的成本更低；但其對環境造成的汙染較大。相應的，特異性切割位點 為尿嘧啶核苷酸或脫氧肌苷的接頭能夠避免環境汙染的問題。
[0037] 優選的，所述特異性切割位點均為尿嘧啶核苷酸。因為尿嘧啶核苷酸被特異性切 割的速度較脫氧肌苷被特異性切割的速度更快，即本方案的接頭能夠提高構建測序文庫的 效率。
[0038] 本方案中，所述小核酸片段是指從接頭與核酸片段的連接反應的產物(可包括正 確連接產物和接頭自連產物）上被特異性切割試劑切割下的核酸片段。
[0039] 基於第一典型實施例，本發明提出第二典型實施例，本實施例中對特異性切割位 點，即尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷在核酸鏈上的分布做了進一步的限定。所述特異性 切割位點將其所在核酸鏈分隔成至少兩個核酸片段，且所述核酸片段均小於15bp。
[0040] 如圖3所示，本方案的接頭在構建測序文庫的過程中，在經特異性切割試劑切割 之後，所得的小核酸片段均小於15bp，這降低了這些小核酸片段與其互補鏈之間的結合能 力，更容易形成單鏈分子，保證目標切割產物與接頭自連產物的切割產物和正確連接的產 物上切下的小核酸片段之間的大小差異處於易於分離的範圍，即，通過切割步驟更有利於 正確連接的產物與接頭自連產物的分離，進而實現對接頭自連產物的徹底清除。S卩，第二典 型實施例的接頭能夠更好的避免構建的測序文庫中摻入接頭自連的產物。
[0041] 優選的，所述特異性切割位點將其所在核酸鏈分隔成至少兩個核酸片段，且所述 核酸片段均小於l〇bp。
[0042] 更優選的，所述特異性切割位點將其所在核酸鏈分隔成至少兩個核酸片段，且所 述核酸片段均小於8bp或7bp或6bp或5bp。本方案中的接頭，通過對特異性切割位點之間 的位置的進一步限定，在構建測序文庫的過程中，在經特異性切割試劑切割之後，斷裂形成 的核酸片段在常溫下即可與特異性切割位點所在鏈的互補鏈分離，即形成單鏈分子，從而 在常溫下即可實現對接頭自連產物的徹底清除，這降低了分離實驗對實驗條件的要求，可 更快的實現正確連接產物的分離純化。
[0043] 基於第二典型實施例，本發明提出第三典型實施例，本實施例在上述對特異性切 割位點在核酸鏈上的分布的各種限定的基礎上，還可有以下進一步限定：所述接頭的用於 與核酸片段連接的一端與距該端最近的特異性切割位點之間的距離小於等於l〇bp。
[0044] 本方案能夠進一步保證本發明的接頭在構建測序文庫的過程中，經特異性切割之 後，接頭自連產物被切割後的不含特異性切割位點的兩條鏈相互之間能夠互補配對的鹼基 數小於等於20bp，該兩條鏈能夠較容易的被解鏈，保證接頭自連產物的切割產物與目標切 割產物之間的大小差異處於能被更容易的分離的範圍，即，更有利於正確連接的產物與接 頭自連產物的分離，進而實現對接頭自連產物的徹底清除。所以，本方案的接頭能夠更好的 避免構建的測序文庫中摻入接頭自連的產物。
[0045] 更進一步的，所述接頭的用於與核酸片段連接的一端與距該端最近的特異性切割 位點之間的距離小於等於8bp、7bp、6bp、5bp或4bp。本方案中的接頭,通過對接頭的用於與 核酸片段連接的一端與距該端最近的特異性切割位點之間距離的進一步限定，在利用本方 案的接頭構建文庫時，可保證接頭自連產物經特異性切割後形成的所有核酸片段在常溫下 均為單鏈形式，即，可在常溫下實現對接頭自連產物的徹底清除，即降低了分離實驗對實驗 條件的要求，可更快的實現正確連接產物的分離純化。
[0046] 上述任一技術方案中的接頭可以是單關出末糹而接頭、雙關出末糹而接頭或平末糹而接 頭。即，所述接頭為互補的雙鏈核酸分子；所述雙鏈核酸分子中只有一條鏈上含有至少一個 尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷；所述P-S鍵為硫代磷酸酯鍵。所述雙鏈核酸分子為單突 出末端雙鏈核酸分子、雙突出末端雙鏈核酸分子或平末端雙鏈核酸分子。
[0047] 其中，所述單突出末端雙鏈核酸分子的突出末端為（dN)a，所述dN為A或G或C或 T，所述a為正整數。
[0048] 進一步的，所述（dN)a自身之間不能互補配對。本方案的接頭避免了接頭之間的 互補配對連接，使得基於本方案的接頭構建測序文庫時，進一步避免了構建的測序文庫中 摻入接頭自連的產物的現象的出現，提高了接頭的利用率。
[0049] 更進一步的，所述（dN)aST，即dN為T，a等於1 ;所述（dN)a位於含有至少一個 尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的3'端。本方案的接頭能利用其單突出的 T末端與3'端為單突出A尾的核酸片段高效連接，進而提高用於構建測序文庫的核酸片段 和接頭的利用率，並提1?測序文庫的構建效率。
[0050] 其中，所述雙突出末端雙鏈核酸分子的突出末端分別為（dN) b和（dN)。，所述（dN) b和（dN)。中至少有一個位於其所在鏈的3'端，所述dN為A或G或C或T，所述b和c均為 正整數。
[0051] 進一步的，所述（dN)b自身之間不能互補配對，所述（dN)。自身之間不能互補配對， 所述之間不能互補配對。本方案的接頭避免了接頭之間的互補配對連接， 使得基於本方案的接頭構建測序文庫時，進一步避免了構建的測序文庫中摻入接頭自連的 產物的現象的出現，提高了接頭的利用率。
[0052] 應當說明的是，本發明所述的（dN)a自身之間不能互補配對，是指每一個確定序列 的（dN) a與其本身之間不能互補配對；同樣的，（dN) b之間不能互補配對，是指每一個確定 序列的（dN)b與其本身之間不能互補配對；（dN)。之間不能互補配對，是指每一個確定序列 的（dN)。與其本身之間不能互補配對。
[0053] 更進一步的，當所述（dN) b和（dN)。均位於其所在鏈的3'端時，（dN) b為T，即dN 為T，b等於1。本方案的接頭能利用其T末端與3'端為單突出A尾的核酸片段高效連接， 進而提高用於構建測序文庫的核酸片段和接頭的利用率，並提高測序文庫的構建效率。
[0054] 更進一步的，所述（dN)。的3'末端為G或C或T。本方案的接頭徹底避免了（dN) b和（dN)。之間的互補配對連接。
[0055] 上述任一方案中，所述雙鏈核酸分子的兩條核酸鏈的5'末端的核苷酸均不含磷酸 分子。本方案的接頭徹底避免了接頭之間的自連現象的出現。
[0056] 上述任一方案中，所述雙鏈核酸分子含有至少一個II s型限制性內切酶酶切識別 位點。
[0057] 需要說明的是，所述的II s型限制性內切酶為切割位點在識別序列之外的限制性 內切酶，包括但不限於：Acu I、Alw I、Bbs I、BbV I、Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、 Bmr I、Bpm I、BpuE I、Bsa I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、 BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、EcoP15 I、Fau I、Fok I、Hga I、Hph I、HpyAV、 Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、NmeAIII、Ple I、Sap I、SfaN I 和 TspDT I ,優選為 Acu I、 Bsg I、EcoP15 I 或 Mme I。
[0058] 進一步的，所述II s型限制性內切酶酶切識別位點與接頭上用於和核酸片段連接 的一端之間的距離為d，所述II S型限制性內切酶酶切識別位點與II S型限制性內切酶切割 位點之間的距離為e，d和e均為自然數，d小於e，8卩，II s型限制性內切酶的酶切位點不在 接頭上。
[0059] 本方案的接頭可用於構建含有相同序列長度的待測序片段的測序文庫，進而使得 測序文庫在後續的擴增和測序過程中均一性更佳。
[0060] 上述任一方案中，所述雙鏈核酸分子含有標記物。所述標記物為生物素、抗原、抗 體、受體、配體、多聚組氨酸中的至少一種。利用含有與所述標記物特異性結合的配合物的 固相載體，可對本方案的接頭的連接產物進行快速的分離純化，提高測序文庫的構建效率。
[0061] 進一步的，所述標記物為生物素標記。所述生物素標記能夠與含有鏈酶親和素或 親和素標記的固相載體特異性結合，從而實現對連接產物的快速分離純化。
[0062] 更進一步的，所述生物素標記位於雙鏈核酸分子中含有至少一個尿嘧啶核苷酸、 P-S鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的5'端。含有本方案的接頭的連接產物(正確連接的產物 和可能存在的接頭自連產物的混合物）在被特異性切割試劑切割後，含有鏈酶親和素或親 和素標記的固相載體可快速的將目標切割產物與小核酸片段分離，進而實現正確連接的產 物與接頭自連產物的分離。本方案的接頭能夠進一步提高測序文庫的構建效率。
[0063] 上述任一方案中，所述接頭的大小無特殊限制。優選的，所述接頭的大小在20至 80bp之間。更優選的，所述接頭的大小在25至60bp之間。
[0064] 本發明提出第四典型實施例，一種構建測序文庫的方法，包括以下步驟： A.片段化處理源核酸，得片段化產物； B. 步驟A的產物與第一接頭連接，得第一連接產物； C. 特異性切割試劑切割第一連接產物，除去被切下的小核酸片段；所述特異性切割試 劑用於特異性的切割尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷； D. 聚合酶延伸步驟C的產物，得聚合酶延伸產物。
[0065] 所述第一接頭為本發明的接頭中的任一種。
[0066] 圖3示出了本典型實施例中的部分流程。本方案利用第一接頭上的一條鏈含有的 尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷，利用特異性切割試劑進行切割，此時第一接頭自連產物 被切出多個小核酸片段，正確連接的產物同樣能夠被切下小核酸片段，但是正確連接的產 物的其餘部分（目標切割產物）較接頭自連產物的切割產物和正確連接的產物上切下的小 核酸片段大很多；即，通過切割步驟，可加大第一接頭自連產物與正確連接的產物之間的大 小差異，從而有利於正確連接的產物與第一接頭自連產物的分離，進而實現對第一接頭自 連產物的徹底清除；然後再通過步驟D，聚合酶延伸步驟C的產物（目標切割產物)，將正確 連接的產物補上，最終實現無接頭自連產物的測序文庫的構建。
[0067] 需要說明的是，步驟A中所述源核酸是雙鏈核酸分子，可以是基因組中的任意片 段，包括但不限於基因、基因的一部分、調控序列、內含子或內含子的一部分；也可以是基因 組DNA、cDNA或DNA與RNA的雜合分子；還可以是基因組DNA、cDNA、RNA (包括但不限於 mRNA和rRNA)上特定區域的擴增片段。源核酸的大小無特殊限制，優選的，源核酸大於等於 150bp，更優選的，源核酸大於等於200bp。
[0068] 所述片段化源核酸的方法有多種，包括但不限於：超聲法、噴霧法、化學剪切法和 酶切法。可根據實際情況，採用相適應的方法進行實驗。上述方法均為本領域的常規技術， 在此不再贅述。
[0069] 根據後續建庫步驟對核酸長度的需要，還可對片段化得到的核酸片段進行分離純 化，分離方法可以採用常用方法，如凝膠電泳、蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降、柱層析分離等。 本方案尤其適用於分離純化得到的片段化產物與第一接頭的大小比值在6 :1至1 :4之間 的情況，更適用於上述比值在4 :1至3 :8之間的情況，更適用於上述比值在2 :1至1 :2之 間的情況。
[0070] 優選的，分離純化得到的片段化產物在20bp至200bp之間；更優選的，分離純化得 到的片段化產物在25bp至IOObp之間。
[0071] 另外，根據所使用的片段化方法以及後續第一接頭連接的需要，還可對所得的多 核苷酸片段進行進一步的末端修飾，包括但不限於：磷酸化或去磷酸化、末端補平和末端加 A，等等；以便於後續的步驟中與連接組件的連接。
[0072] 所述步驟B中，第一接頭與步驟A產物的連接反應可只發生在步驟A產物的一端， 也可發生在步驟A產物的兩端。
[0073] 所述第一連接產物為第一接頭與步驟A產物完成連接反應後得到的產物。
[0074] 若第一接頭與步驟A產物之間的連接反應被設計成只發生在步驟A產物的一端， 則步驟B所得的第一連接產物可包括僅在一端含有已知序列(第一接頭)的雙鏈核酸分子和 第一接頭自連的產物，步驟D所得的聚合酶延伸產物只在一端含有已知序列(第一接頭)，為 了成功構建測序文庫，可在聚合酶延伸產物的另一端接上接頭。
[0075] 若第一接頭與步驟A產物之間的連接反應被設計成可發生在步驟A產物的兩端， 則步驟B所得的第一連接產物可包括在兩端均含有已知序列(第一接頭)的雙鏈核酸分子和 第一接頭自連的產物，步驟D所得的聚合酶延伸產物就是在兩端均含有已知序列（第一接 頭)，可直接作為測序文庫，也可通過進一步的處理，從而得到符合特殊要求的測序文庫。
[0076] 步驟C中所述特異性切割試劑為USER酶、UDG酶、大腸桿菌核酸內切酶V、大腸杆 菌核酸內切酶V同源物、DNA糖基化酶或含有Ag、Hg、Cu、Mn、Zn或Cd原子的切割劑，它們 能夠分別特異性的切割尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷。
[0077] 步驟C中所述被切下的小核酸片段的除去方式有多種，包括但不限於：在較高溫 度條件下對切割產物進行柱分離純化，此時的溫度需既低於目標連接產物的退火溫度，又 高於步驟C中被切下的小核酸片段與其互補片段的退火溫度。上述溫度的選擇，為本領域 技術人員的常規技術手段，在此不再詳述。步驟C中所述的被切下的小核酸片段的除去方 法還可以採用凝膠電泳、蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降等。優選採用柱分離純化，通過柱分離 純化的步驟更少，效率更高，成本更低。
[0078] 所述小核酸片段是指在步驟C中，被特異性切割試劑從第一連接產物上切下的核 酸片段。
[0079] 所述目標切割產物是指被切去小核酸片段後的第一連接產物。
[0080] 基於第四典型實施例，本發明提出第五典型實施例，在本實施例中，步驟B中所述 的第一接頭含有生物素標記；所述生物素標記位於雙鏈核酸分子中含有至少一個尿嘧啶核 苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的5'端。
[0081] 本方案中，為了便於步驟B的連接產物的分離純化，至少可以有以下兩種實施方 案。
[0082] 第一種實施方案如下：步驟B中所述的第一接頭在與步驟A的產物連接之前被固 定在含有鏈酶親和素標記的磁珠上。本方案中，步驟B的連接反應是發生在磁珠上的，連接 反應完成後，通過磁鐵的吸附作用，連接產物和未連接的第一接頭能夠簡便的與未連接的 步驟A的產物分離。
[0083] 第二種實施方案如下：步驟B中所述的第一接頭先與步驟A的產物進行連接反應， 連接反應完成之後用含有鏈酶親和素標記的磁珠捕獲連接產物。本方案同樣能夠通過磁鐵 的吸附作用，使連接產物和未連接的第一接頭與未連接的步驟A的產物分離。與上一實施 方案相比，本方案能夠避免在連接反應過程中，因為磁珠的沉降而導致的第一接頭集中在 連接反應體系的底部而導致的連接反應效率的降低。當然，上一實施方案也可以通過在連 接反應的過程中使連接反應體系周期性振蕩來避免這一問題的發生。
[0084] 此外，利用含有鏈酶親和素標記的磁珠進行捕獲的步驟還可以發生在步驟C的特 異性切割之後，也可以發生在步驟D的聚合酶延伸之後。優選發生在步驟D的聚合酶延伸 之後，這樣步驟B的連接反應、步驟C酶切反應、步驟D的聚合酶延伸反應過程中，相應的第 一接頭、連接產物、特異性切割產物均不會因磁珠的沉降作用而集中在反應體系的底部，從 而避免了連接反應效率的降低、切割效率的降低和聚合酶延伸效率的降低。
[0085] 更進一步的，步驟C的切割反應和步驟D的聚合酶延伸反應均能夠發生在磁珠上。 在步驟C中的切割反應完成之後，利用磁鐵的吸附作用，可快速的將步驟C中切割下的小核 酸片段除去；而在步驟D中的聚合酶延伸反應之後，利用磁鐵的吸附作用，可快速的將步驟 D所得聚合酶延伸產物分離純化出來。
[0086] 上述任一方案中，步驟B中所述的第一接頭上的特異性切割位點將其所在核酸鏈 分隔成至少兩個核酸片段，且所述核酸片段均小於15bp。
[0087] 更優選的，所述特異性切割位點將其所在核酸鏈分隔成至少兩個核酸片段，且所 述核酸片段均小於8bp或7bp或6bp或5bp。
[0088] 更進一步的，所述第一接頭的用於與片段化產物連接的一端與距該端最近的特異 性切割位點之間的距離小於等於l〇bp。
[0089] 本方案能夠進一步保證第一接頭在構建測序文庫的過程中，經特異性切割之後， 第一接頭自連產物被切割後的不含特異性切割位點的兩條鏈相互之間能夠互補配對的鹼 基數小於等於20bp，該兩條鏈能夠較容易的被解鏈，保證接頭自連產物的切割產物與目標 切割產物之間的大小差異處於能被更容易的分離的範圍，即，更有利於正確連接的產物與 第一接頭自連產物的分離，進而實現對第一接頭自連產物的徹底清除。即，本方案能夠更好 的避免構建的測序文庫中摻入接頭自連的產物。
[0090] 更進一步的，所述第一接頭用於與片段化產物連接的一端與距該端最近的特異性 切割位點之間的距離小於等於8bp、7bp、6bp、5bp或4bp。本方案中的第一接頭，通過對第一 接頭的用於與片段化產物連接的一端與距該端最近的特異性切割位點之間距離的進一步 限定，在利用本方案的第一接頭構建文庫時，可保證第一接頭自連產物經特異性切割後形 成的所有核酸片段在常溫下均為單鏈形式，即，可在常溫下實現對第一接頭自連產物的徹 底清除，這降低了分離實驗對實驗條件的要求，可更快的實現正確連接產物的分離純化。
[0091] 上述任一方案中，步驟B中所述的弟一接頭可以是單關出末糹而接頭、雙關出末立而 接頭或平末端接頭。即，所述第一接頭為互補的雙鏈核酸分子；所述雙鏈核酸分子中只有一 條鏈上含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷；所述P-S鍵為硫代磷酸酯鍵；所述 雙鏈核酸分子為單突出末端雙鏈核酸分子、雙突出末端雙鏈核酸分子或平末端雙鏈核酸分 子。
[0092] 其中，所述單突出末端雙鏈核酸分子的突出末端為（dN)a，所述dN為A或G或C或 T，所述a為正整數。
[0093] 進一步的，所述（dN)a自身之間不能互補配對。本方案中的第一接頭能夠避免第 一接頭之間的互補配對連接，從而進一步避免了構建的測序文庫中摻入第一接頭自連的產 物的現象的出現，提高了第一接頭的利用率。
[0094] 更進一步的，所述（dN)aST，即dN為T，a等於1 ;所述（dN)a位於含有至少一個 尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的3'端。本方案的第一接頭能利用其單突 出的T末端與3'端為單突出A尾的核酸片段高效連接，進而提高用於構建測序文庫的核酸 片段和第一接頭的利用率，並提高測序文庫的構建效率。
[0095] 其中，所述雙突出末端雙鏈核酸分子的突出末端分別為（dN) b和（dN)。，所述（dN) b和（dN)。中至少有一個位於其所在鏈的3'端，所述dN為A或G或C或T，所述b和c均為 正整數。
[0096] 進一步的，所述（dN)b自身之間不能互補配對，所述（dN)。自身之間不能互補配對， 所述（dN) b和（dN)。之間不能互補配對。本方案的第一接頭避免了第一接頭之間的互補配 對連接，使得本方案進一步避免了構建的測序文庫中摻入第一接頭自連的產物的現象的出 現，提高了第一接頭的利用率。
[0097] 更進一步的，當所述（dN) b和（dN)。均位於其所在鏈的3'端時，（dN) b為T，即dN 為T，b等於1。本方案的第一接頭能利用其T末端與3'端為單突出A尾的核酸片段高效 連接，進而提高用於構建測序文庫的核酸片段和第一接頭的利用率，並提高測序文庫的構 建效率。
[0098] 更進一步的，所述（dN)。的3'末端為G或C或T。本方案的第一接頭徹底避免了 (dN) b和（dN)。之間的互補配對連接。
[0099] 上述任一方案中，所述第一接頭的兩條核酸鏈的5'末端的核苷酸均不含磷酸分 子。本方案徹底避免了第一接頭自連現象的出現。
[0100] 基於上述任一方案，本發明提出第六典型實施例，所述第一接頭含有至少一個π S 型限制性內切酶酶切識別位點；所述方法還包括以下步驟： E. II s型限制性內切酶酶切聚合酶延伸產物，回收含第一接頭的酶切產物； F. 步驟E的產物與第二接頭連接，得兩端分別是第一接頭和第二接頭的雙鏈核酸分 子；所述第二接頭為互補的雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子的一端與步驟E的產物中的酶 切末端互補配對。
[0101] 需要說明的是，所述的II s型限制性內切酶為切割位點在識別序列之外的限制性 內切酶，包括但不限於：Acu I、Alw I、Bbs I、BbV I、Bcc I、BceA I、BciV I、BfuA I、 Bmr I、Bpm I、BpuE I、Bsa I、BseM II、BseR I、Bsg I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspCN I、 BspM I、BspQ I、BtgZ I、Ear I、Eci I、EcoP15 I、Fau I、Fok I、Hga I、Hph I、HpyAV、 Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、NmeAIII、Ple I、Sap I、SfaN I 和 TspDT I ,優選為 Acu I、 Bsg I、EcoP15 I 或 Mme I。
[0102] 進一步的，所述II S型限制性內切酶酶切識別位點與第一接頭上用於和核酸片段 連接的一端之間的距離為d，所述II S型限制性內切酶酶切識別位點與II S型限制性內切酶 切割位點之間的距離為e，d和e均為自然數，d小於e，S卩，該II s型限制性內切酶的酶切位 點不在第一接頭上。
[0103] 本方案構建的測序文庫中的文庫分子含有相同序列長度的待測序片段，這使得測 序文庫在後續的擴增和測序過程中均一性更佳。
[0104] 以下將通過兩個具體實施例對本發明進行進一步的詳細說明。
[0105] 第一具體實施例以一正常人的全血基因組DNA為源核酸，第一接頭由SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2退火而成，其中，SEQ ID N0:1的5'端含雙生物素標記，第一接頭上含有 Acu I酶切識別位點。
[0106] 一、片段化全血基因組DNA。
[0107] UDnase I酶切片段化。
[0108] 按以下配比在冰上配置片段化反應體系：基因組DNA，6y g ;500mM Tris-HCl， 8 μ L ； IOOmM MnCl2,8 μ L ；lmg/mL BSA,8 μ L ；Dnase I (Fermentas, #ΕΝ0521, lu/ μ L),6 μ L ； CldH2O，補至 80 μ L。
[0109] 反應條件如下：37°C酶切 20min，然後加入 1 μ L 0· 5mol/L 的 EDTA (Fermentas, #R1021，pH 8· 0)終止反應。
[0110] 2、柱回收。
[0111] 利用 QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen，Cat. nos. 28304)回收片段化 產物，具體操作如下：往酶切產物中加入500 μ L Buffer PNI ;將QIAquick離心柱置入對應 的2ml收集管，將上述需要純化的DNA產物移入Quick離心柱，6000rpm離心1分鐘；棄離 心過柱的液體，加入750 μ L Buffer PE，6000rpm離心1分鐘，棄離心過柱的液體，重複此步 驟一次；將QIAquick離心柱再次放回收集管，13000rpm離心1分鐘，然後將QIAquick離心 柱轉至一個新的1.5mL EP管內；向QIAquick離心柱內底部中心加入50 μ L Buffer EB，靜 置2分鐘，13000rpm離心1分鐘，離心所得液體即為過柱純化得到的DNA。
[0112] 二、DNA片段末端修復。
[0113] 按以下配比在冰上配置DNA片段末端修復反應體系：5XReaction Buffer， 40 μ L ;dNTP (各 2mM，Fermentas，#R0241 )，4 μ L ;步驟一產物，4 μ g ;T4 DNA Polymerase (Fermentas，#ΕΡ0061，5u/ μ L)，0· 8 μ L ;ddH20,補至 200 μ L。
[0114] 反應條件：11°C孵育20min ;然後加熱至75°C，處理lOmin，以終止反應。
[0115] 參考步驟一中2、柱回收步驟，對上述反應的產物進行柱純化。
[0116] 三、末端加 A反應。
[0117] 1、按以下配比在冰上配置末端加 A反應體系：10XNEBuffer2，12yL;10mM dATP， 2· 4μ L ;Klenow Fragment (3, 一 5' exo -，NEB，#M0212L，5u/y L)，2. 4μ L ;步驟二產物， 3μ g ;ddH20，補至 120μ L。
[0118] 反應條件：37°C孵育30min ;然後加熱至75°C，處理20min，以終止反應。
[0119] 2、對步驟1的產物進行切膠純化，使用12%PAGE膠，180V電泳20min ;然後在紫外 線照射的條件下切取30bp至SObp間的DNA片段；將切下的凝膠轉移至2mL的EP管中，搗 碎凝膠，然後加入PAGE凝膠回收液（0. 5M醋酸氨，IOmM醋酸鎂，ImM EDTA，0. 1%SDS)，PAGE 凝膠回收液至少需要沒過凝膠，37°C孵育2h ;將凝膠及凝膠液轉移至3S柱中，12000rpm離 心2min，將離心下的液體轉移至新的1.5mL EP管中。然後參考步驟一中2、柱回收步驟對 離心下的液體進行柱純化。
[0120] 四、與第一接頭連接。
[0121] 按以下配比在冰上配置連接反應體系：步驟三產物，200ng ;第一接頭，600ng ; 10XT4 DNA Ligase Buffer, 8 μ L ；50%PEG 4000,8 μ L ；T4 DNA Ligase (Fermentas, #EL0011，5u/y L)，4y L ;ddH20，補至 80μ L。
[0122] 反應條件：16 °C連接過夜。
[0123] 然後參考步驟一中2、柱回收步驟，對連接反應的產物進行柱純化。
[0124] 五、USER酶酶切。
[0125] 按以下配比在冰上配置USER酶酶切體系：步驟四產物，200ng ;10XUSER Buffer， 10 μ L ;USER (NEB, #M5505, lu/ μ L)，10 μ L ;ddH20，補至 100 μ L。
[0126] 反應條件：37 °C孵育Ih。
[0127] 利用 QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen，Cat. nos. 28304)回收 USER 酶 酶切產物，具體操作如下：往酶切產物中加入500 μ L Buffer PNI，55°C孵育5min，使得被 USER酶切下的小核酸片段、第一接頭自連產物被切割後的不含尿嘧啶核苷酸的兩條鏈均被 變性成單鏈；將QIAquick離心柱置入對應的2ml收集管，將55°C孵育後的溶液移入Quick 離心柱，6000rpm離心1分鐘；棄離心過柱的液體，加入750μ L Buffer PE，6000rpm離心1 分鐘，棄離心過柱的液體，重複此步驟一次；將QIAquick離心柱再次放回收集管，13000rpm 離心1分鐘，然後將QIAquick離心柱轉至一個新的I. 5mL EP管內；向QIAquick離心柱內 底部中心加入50 μ L Buffer EB，靜置2分鐘，13000rpm離心1分鐘，離心所得液體即為過 柱純化後得到的USER酶酶切後的目標產物。
[0128] 六、聚合酶修復。
[0129] 按以下配比在冰上配置聚合酶延伸體系：步驟五產物，120ng ;10XPyrobest Buffer II,15uL;dNTPs (各 2.5mM),4uL;Pyrobest DNA Polymerase (Takara,DR005A， 5u/ μ L)，0· 75 μ L ;ddH20，補至 150 μ L。
[0130] 反應條件：60°C孵育40min。
[0131] 參考步驟一中2、柱回收步驟，對聚合酶延伸的產物進行柱純化。
[0132] 七、Acu I 酶切。
[0133] 按以下配比在冰上配置Acu I酶切反應體系：步驟六產物，2μ g ;10XNEBuffer4， 4 μ L ;Acu I (NEB, #R0641L，5u/ μ L)，1 μ L ;400 μ M SAM, 4 μ L ;ddH20，補至 40 μ L。
[0134] 反應條件：37°C孵育 1.5h，然後加入 IyL 0.5mol/L 的EDTA(Fermentas，#R1021， pH 8.0)終止反應。
[0135] 八、磁珠捕獲。
[0136] 利用鏈黴親和素標記的磁珠 M280 (invitrogen，Dynabeads * MyOneTM Streptavidin Cl)捕獲步驟七的產物。
[0137] 具體操作如下： 1) 取8 μ L M280,用磁鐵吸附磁珠，然後用移液器吸去上清； 2) 加入16yL TE (IOmM Tris-HCl，lmM EDTA，pH7.5)洗滌，用磁鐵吸附磁珠，然後用 移液器吸去上清；重複三次； 3) 加入40μLBindingBuf?er(20mMTris-HCl，l·0MLiCl，2mMEDTA，pH7·5)懸浮 磁珠，然後加入40 μ L步驟七的產物，混勻後至旋轉轉盤上低速轉動，室溫結合2h，每10至 15min輕彈管壁或短暫渦旋混勻磁珠，使步驟七產物中含生物素標記的分子充分結合到磁 珠上； 4) 用磁鐵吸附磁珠，小心除去上清，然後用20 μ L TE清洗磁珠2次； 5) 用磁鐵吸附磁珠，小心除去上清，然後加入20 μ L TE重懸磁珠。
[0138] 九、與弟-接頭連接。
[0139] 第二接頭由 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 退火而成，其中，SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4的5'末端的均不含磷酸分子，SEQ ID N0:4上的N為通用鹼基，可以是A、G、C或T。
[0140] 按以下配比配置連接反應體系：步驟八產物，20yL;第二接頭，600ng;10XT4 DNA Ligase Buffer,8 μ L ；50%PEG 4000,8 μ L ；T4 DNA Ligase (Fermentas,#EL0011,5u/μ L), 4μ L ;ddH20，補至 80μ L。
[0141] 反應條件：22°C連接2h，每10至15min輕彈管壁或短暫渦旋混勻磁珠，以避免磁 珠沉降進而導致的連接效率較低。
[0142] 用磁鐵吸附磁珠,然後用移液器吸去上清,再用20 μ L TE清洗磁珠3次，最後重懸 於20 μ L TE中，此時固定在磁珠上的核酸片段即為測序文庫。
[0143] 十、PCR驗證測序文庫。
[0144] 分別以步驟九所得產物(實驗組1)、步驟九所得產物的10倍稀釋液(實驗組2)和 100被稀釋液（實驗組3)為模板，F-primer(SEQIDN0:5)和R-primer(SEQIDN0:6)為 上下遊引物進行PCR擴增，以驗證測序文庫構建是否成功，並確定擴增所得測序文庫的最 佳模版稀釋度。同時設一空白對照和陽性對照，空白對照的模板為CldH 2O ;陽性對照的模板 由SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8退火形成的20ng/μ L的水溶液。
[0145] 按以下配比在冰上配置PCR反應體系：模板，lyL;10XTaq Buffer，2.5yL; dNTPs (各 2·5ηιΜ)，0·5μ?;10μΜ F-primer，lyL;10yM R-primer，lyL;Taq 酶 (Fermentas，#EP0401，5u/ μ L)，0· 25 μ L ;ddH20,補至 25 μ L。
[0146] 反應條件： 94°C 變性，2min ; 94°C變性，30s ;57°C退火，30s ;72°C延伸，30s ;重複15個循環； 72°C 延伸，5min。
[0147] 本發明的發明人還設計了一個第一對比實驗，該對比實驗與第一具體實施例相 t匕，採用第三接頭替代第一接頭，該第三接頭與第一接頭相比，只是將第一接頭上的U鹼基 用T鹼基替換；另外，在第一對比試驗中無步驟五的USER酶酶切步驟、步驟六的聚合酶修復 步驟，最後同樣以F-primer (SEQ ID N0:5)和R-primer (SEQ ID N0:6)為上下遊引物進 行PCR擴增驗證。
[0148] 第一對比實驗的PCR擴增產物與第一具體實施例的擴增產物同時進行PAGE電泳 檢測，PAGE凝膠濃度為12%，電壓180V，點用時間50min。
[0149] 結果如圖4所示，其中M為20bp Marker (TaKaRa，D521A);實驗組1 (1)、實驗組 2 (2)、實驗組3 (3)和陽性對照組（陽）均能得到預計大小的單一目標條帶（IlObp左右)， 而空白對照組(空）則無條帶出現，說明測序文庫構建成功；實驗組3的目標條帶與實驗組 2的目標條帶大小相差不大，所以從節約模板的角度來說，擴增所得測序文庫的最佳模版稀 釋度為100倍稀釋。而對1 (第一對比試驗，PCR擴增模板為與第二接頭連接後的原液）在 目標條帶下方明顯出現雜帶，且該雜帶的大小與第二接頭和第三接頭之和（IOObp左右）大 致相同，後經進一步的測序證實，且確實是第二接頭和第三接頭自連的產物；對2 (對比試 驗，PCR擴增模板為與第二接頭連接後的10被稀釋液）在目標條帶下方的同一位置隱約出 現雜帶。
[0150] 應當說明的是，第一具體實施例中的片段化的方法可用超聲法、噴霧法或化學剪 切法代替，相關方法的具體實現方法為本領域的常規技術，在此不再贅述。第一具體實施例 中柱回收方法可採用其他類似的柱純化試劑盒替代也可採用凝膠電泳純化方法替代。
[0151] 另外，如果不需要構建含有相同長度的待測片段的話，步驟六的產物即可作為測 序文庫，而無需進行後續的步驟，且如果需要對測序文庫進行擴增，可採用F-primer引物 作為上遊引物和下遊引物進行擴增。
[0152] 當然，第一具體實施例中的第一接頭僅是本具體實施例所採用的一種具體的雙鏈 核酸分子，符合本發明的精神的第一接頭均可應用到本具體實施例中；第一具體實施例中 的第二接頭也僅是本具體實施例所採用的一種具體的雙鏈核酸分子，符合本發明的精神的 第二接頭均可應用到本具體實施例中；例如可採用具有更短的序列長度的單突出末端雙鏈 核酸分子，該單突出末端位於其所在核酸鏈的3'端，突出鹼基數為2,突出的鹼基為兩個通 用鹼基N，N為A、G、C或T。
[0153] 還有，第一具體實施例中，可將步驟八的磁珠捕獲步驟提前至步驟四中，替代步驟 四的柱回收步驟，並使得後續的步驟中均可採用磁鐵吸附磁珠的方式替代柱回收步驟，這 樣可以大大提到文庫構建的效率，降低文庫構建的成本。同樣的，步驟八的磁珠捕獲步驟也 可置於步驟五、步驟六、步驟七或步驟九中。
[0154] 第二具體實施例以Lambda噬菌體DNA ( λ DNA)的擴增產物作為源核酸。
[0155] -、源核酸的製備。
[0156] ADNA的PCR擴增反應體系如下：上遊引物（10yM，SEQ ID N0:9)，2yL;下遊引物 (ΙΟμΜ，SEQ ID N0:10)，2yL;ADNA，50ng;10XEx Taq Buffer，5yL;Ex Taq (5U/yL)， 0· 5 μ L ;dNTP (各 2· 5mM)，4 μ L ;ddH20,力口至 50 μ L。
[0157] PCR反應條件如下： 95 °C 3min ； 94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s;重複 25 個循環； 72 °C 7min〇
[0158] 對反應產物進行PCR產物清潔回收，得源核酸。
[0159] 二、超聲片段化。
[0160] 在冰浴條件下，利用超聲破碎方式對步驟一所得源核酸進行片段化處理。具體操 作為：將擴增產物（10 Ug左右）放入100 μ L TE buffer溶液中，430W功率條件下超聲4s， 間隔5s，重複12次。超聲破碎後的產物利用PAGE膠電泳分離，回收25bp~100bp的DNA片 段。
[0161] 三、DNA片段末端修復。
[0162] 按以下配比在冰上配置DNA片段末端修復反應體系：5XReaction Buffer, 40 μ L ;dNTP (各 2mM，Fermentas，#R0241 )，4 μ L ;步驟一產物，4 μ g ;T4 DNA Polymerase (Fermentas，#ΕΡ0061，5u/ μ L)，0· 8 μ L ;ddH20,補至 200 μ L。
[0163] 反應條件：11°C孵育20min ;然後加熱至75°C，處理lOmin，以終止反應。
[0164] 參考第一具體實施例中的步驟一中2、柱回收步驟，對上述反應的產物進行柱純 化。
[0165] 四、連接第四接頭。
[0166] 第四接頭由SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12退火而成，其中SEQ ID NO: 11的5' 端不含磷酸基團。
[0167] 按以下配比在冰上配置連接反應體系：步驟三產物，200ng ;第四接頭，600ng ; 10XT4 DNA Ligase Buffer, 8 μ L ；50%PEG 4000,8 μ L ；T4 DNA Ligase (Fermentas, #EL0011，5u/y L)，4y L ;ddH20，補至 80μ L。
[0168] 反應條件：16 °C連接過夜。
[0169] 然後參考第一具體實施例中的步驟一中2、柱回收步驟，對連接反應的產物進行柱 純化。
[0170] 五、USER酶酶切。
[0171] 按以下配比在冰上配置USER酶酶切體系：步驟四產物，200ng ;10XUSER Buffer， 10 μ L ;USER (NEB, #M5505, lu/ μ L)，10 μ L ;ddH20，補至 100 μ L。
[0172] 反應條件：37 °C孵育Ih。
[0173] 利用 QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen，Cat. nos. 28304)回收 USER 酶 酶切產物，具體操作如下：往酶切產物中加入500 μ L Buffer PNI，55°C孵育5min，使得被 USER酶切下的小核酸片段、第四接頭自連產物被切割後的不含尿嘧啶核苷酸的兩條鏈均被 變性成單鏈；將QIAquick離心柱置入對應的2ml收集管，將55°C孵育後的溶液移入Quick 離心柱，6000rpm離心1分鐘；棄離心過柱的液體，加入750μ L Buffer PE，6000rpm離心1 分鐘，棄離心過柱的液體，重複此步驟一次；將QIAquick離心柱再次放回收集管，13000rpm 離心1分鐘，然後將QIAquick離心柱轉至一個新的I. 5mL EP管內；向QIAquick離心柱內 底部中心加入50 μ L Buffer EB，靜置2分鐘，13000rpm離心1分鐘，離心所得液體即為過 柱純化後得到的USER酶酶切後的目標產物。
[0174] 六、聚合酶修復。
[0175] 按以下配比在冰上配置聚合酶延伸體系：步驟五產物，120ng ;10XPyrobest Buffer II,15uL;dNTPs (各 2.5mM),4uL;Pyrobest DNA Polymerase (Takara,DR005A， 5u/ μ L)，0· 75 μ L ;ddH20，補至 150 μ L。
[0176] 反應條件：60°C孵育40min。
[0177] 參考第一具體實施例中的步驟一中2、柱回收步驟，對聚合酶延伸的產物進行柱純 化。
[0178] 七、高通量測序驗證。
[0179] 以步驟六所得產物為測序文庫進行高通量測序，對測序結果中得到的所有reads (即）進行分析，未發現有第四接頭自連片段的序列，將這些reads進行處理、拼接得基因序 列SEQ ID NO: 13,經比對證實該基因序列為Lambda噬菌體DNA的一部分，可由SEQ ID NO: 9 和SEQ ID NO: 10擴增而得。
[0180] 本發明的發明人還設計了一個第二對比實驗，該對比實驗與第二具體實施例相 t匕，採用第五接頭替代第四接頭，該第五接頭與第四接頭相比，只是將第一接頭上的U鹼基 用T鹼基替換；另外，在第二對比試驗中無步驟五的USER酶酶切步驟、步驟六的聚合酶修復 步驟，並將步驟四的產物同樣進行高通量測序。對其測序結果中得到的所有reads (S卩）進 行分析，發現有第四接頭自連片段的序列（SEQ ID N0:14)，將這些reads進行處理、拼接得 同樣能夠得到基因序列SEQ ID NO: 13。
[0181] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1. 一種構建測序文庫的方法，其特徵在於，包括以下步驟： A. 片段化處理源核酸，得片段化產物； B. 步驟A的產物與第一接頭連接，得第一連接產物；所述第一接頭為互補的雙鏈核酸 分子；所述雙鏈核酸分子中只有一條鏈上含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷； 所述P-S鍵為硫代磷酸酯鍵； C. 特異性切割試劑切割第一連接產物，除去被切下的小核酸片段；所述特異性切割試 劑用於特異性的切割尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷； D. 聚合酶延伸步驟C的產物，得聚合酶延伸產物。
2. 根據權利要求1所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述第一接頭上的尿嘧 啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷將其所在核酸鏈分隔成至少兩個核酸片段，且所述核酸片段均 小於15bp〇
3. 根據權利要求1所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述雙鏈核酸分子為單 突出末端雙鏈核酸分子、雙突出末端雙鏈核酸分子或平末端雙鏈核酸分子。
4. 根據權利要求3所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述單突出末端雙鏈核 酸分子的突出末端為（dN)a ;所述雙突出末端雙鏈核酸分子的突出末端分別為（dN)b和（dN) 。，所述（dN) b和（dN)。中至少有一個位於其所在鏈的3'端，所述dN為A或G或C或T，所 述a、b和c均為正整數。
5. 根據權利要求4所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述（dN) a為T，位於含 有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的3'端；當所述（dN)b和（(^)。 均位於其所在鏈的3'端時，（dN)bST，（dN)。的3'末端為G或C或T，（dN)。自身之間不 能互補配對；當（dN)j^[I(dN)。分別位於同一鏈的3'端和5'端時，（dN)b為T，（dN)。自身 之間不能互補配對。
6. 根據權利要求1至5中任一項所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述第一接 頭的兩條核酸鏈的5'末端的核苷酸均不含磷酸分子。
7. 根據權利要求1至5中任一項所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述第一接 頭含有生物素標記。
8. 根據權利要求7所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述生物素標記位於雙 鏈核酸分子中含有至少一個尿嘧啶核苷酸、P-S鍵或脫氧肌苷的鏈的互補鏈的5'端。
9. 根據權利要求1至5中任一項所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述第一接 頭含有至少一個II s型限制性內切酶酶切識別位點，且該II s型限制性內切酶的酶切位點 不在第一接頭上。
10. 根據權利要求9所述的構建測序文庫的方法，其特徵在於，所述方法還包括以下步 驟： E. II s型限制性內切酶酶切聚合酶延伸產物，回收含第一接頭的酶切產物； F. 步驟E的產物與第二接頭連接，得兩端分別是第一接頭和第二接頭的雙鏈核酸分 子；所述第二接頭為互補的雙鏈核酸分子，該雙鏈核酸分子的一端與步驟E的產物中的酶 切末端互補配對。
【文檔編號】C40B50/06GK104372414SQ201410699623
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2012年10月25日 優先權日:2012年10月25日
【發明者】盛司潼 申請人:盛司潼