使用TGF－β抑制劑治療神經膠質瘤的製作方法
2023-08-09 06:13:26 2
專利名稱：使用TGF－β抑制劑治療神經膠質瘤的製作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及使用轉化生長因子β(TGF-β)抑制劑治療與TGF-β信號通路有關的成膠質細胞瘤(glioblastomas)和其它神經膠質瘤(gliomas)的方法。優選地，本發明涉及通過給予特異地與1型TGF-β受體(TGFβ-R1)結合的TGF-β抑制劑來治療這類疾病和相關病況的方法。
相關技術描述轉化生長因子β(TGF-β)表示一個蛋白家族，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，它們是細胞的生長和分化、胚胎和骨質發育、細胞外基質生成、血紅細胞形成、免疫和炎症應答的多效的調整劑(Roberts and Sporn Handbook ofExperimental Pharmacolosy(1990)95419-58；Massague等人。Ann Rev CellBiol(1990)6597-646)。這個大家族的其它成員還包括活化素、抑制素、骨形態發生蛋白和米勒抑制素(Mullerian inhibiting substance)。TGF-β引發細胞內信號通路，最終導致基因表達，該基因的表達調節細胞周期、控制增殖反應，或者該基因的表達與介導從外到內細胞信號傳遞、細胞粘著、遷移、和細胞間通信的細胞外基質蛋白相關。TGF-β在癌症的初期作為一種腫瘤抑制劑，然而在後期它助長了惡性結果(Cui等人，Cell(1996)86531-542)。
TGF-β通過一種包含類型1和類型2的單跨膜TGF-β受體(也適用於受體亞單元)和細胞內的絲氨酸-蘇氨酸激酶區域的受體系統發揮它的生物學活性，信號穿過轉錄子調節劑的Smad家族。將TGF-β結合到II型受體的胞外域包括通過II型受體(TGFβ-R2)的I型受體(TGFβ-R1)的磷酸化和活化。被活化的TGFβ-R1使與受體關聯的共轉錄因子Smad2/Smad3磷酸化，從而活化它們，其在細胞質中與Smad4結合。所述的Smad複合物轉移進入細胞核，與DNA-結合輔助因子如Fast-1聯合，結合特定基因的增強和阻抑區，以及調節轉錄。這些基因的表達導致控制增殖反應或細胞外基質蛋白的細胞周期調節器的合成，該細胞外基質蛋白介導從外到內細胞信號傳遞、細胞粘著、遷移、和細胞內通信。其它信號通路如MAP激酶-ERK級聯也被TGF-β信號激活。為了回顧，參見例如Whitman，Genes Dev.122445-62(1998)；和Miyazono等人，Adv.Immunol.(2000)75111-57，在此清楚地引入作為參考。更多的有關TGF-β信號通路的信息能在例如以下的出版物中被找到Attisano等人，「TGF-β大家族的信號轉導」Science 2961646-7(2002)；Bottinger和Bitzer，「在腎臟疾病中的TGF-β信號傳遞」Am.Soc.Nephrol.132600-2610(2002)；Topper，J.N.，「TGF-β在心血管系統中前後關係特定的生長因子的分子機制」Trends Cardiovasc.Med.10132-7(2000)，評論；Itoh等人，「轉移生長因子-β家族的信號傳遞」Eur.J.Biochem.2676954-67(2000)，評論。
在外科手術、放射治療、和亞硝基脲類化學治療的標準治療手段下，人成膠質細胞瘤病人經歷平均為一年多一點的存活(Glioma Meta-analysisTrialists(GTM)Group。成人高級別神經膠質瘤的化學治療由12個隨機試驗得到的單個病人數據進行系統的評價(systematic review)和薈萃分析(meta-analysis)。Lancet，3591011-1018(2002))。多年以來免疫療法被探索作為一種可替換的治療這些腫瘤的方法，因為在體外的細胞免疫應答方面人神經膠質瘤病人顯示出特殊的缺乏(Roszman等人，Immunol.Today，12370-384(1991))，並且因為人神經膠質瘤細胞對於癌細胞在表達免疫抑制分子方面的特性是模範性的。這些包含可溶的因子(soluble factors)如TGF-β(Fontana等人，J.Immunol，1321837-1844(1984))；前列腺素(Fontana等人，J.Immunol.，1292413-2419(1982))；IL-10(Hishii等人，Neurosurgery，371160-1166(1995))，和細胞表面分子如CD70(Wischhusen等人，Cancer Res.，622592-2599(2002))或者HLA-G(Wiendl等人，J.Immunol.，1684772-4780(2002))。TGF-β在惡性神經膠質瘤中不合需要的作用不僅僅局限於在宿主中對於免疫抑制的誘導，而且包含TGF-β在遷移和侵襲中的關鍵角色(Wick等人，J Neurosci.，213360-3368(2001))。
考慮到成膠質細胞瘤的嚴重性，以及缺少令人滿意的、能提供長期存活的治療選擇，對於治療這種破壞性疾病的新方法有著巨大的需求。
發明內容
本發明涉及一種新的治療惡性神經膠質瘤包括成膠質細胞瘤的方法。特別是，本發明涉及用TGF-β信號通路成員的抑制劑治療神經膠質瘤。本發明尤其包含通過使用特異地與TGF-β激酶受體如1型TGF-β受體(TGFβ-R1)結合的抑制劑治療神經膠質瘤、包括成膠質細胞瘤的方法。
一方面，本發明涉及通過向哺乳動物受試者給予有效量的抑制TGFβ激酶受體的分子(molecule)治療神經膠質瘤的方法。
在一種具體的實施方案中，此治療方法使用的分子是式(1)的化合物和其可藥用鹽或前藥形式， 其中R3是無幹擾取代基(noninterfering substituent)；每個Z為CR2或N，其中A環中Z位置為N的情況不超過兩個，並且其中A環中兩個相鄰的Z位置不能為N；每個R2獨立地是無幹擾取代基；L是連接基(linker)；n為0或1；以及Ar』是任選地被1-3個無幹擾取代基取代的環脂肪族或環雜脂肪族、芳香族或雜芳香族的基團，或其可藥用鹽或前藥形式。
在另一種實施方案中，本發明的治療中使用的分子為式(2)的化合物或其可藥用鹽或前藥形式，
其中，Y1為苯基或萘基，任選地被一個或多個取代基所取代，這些取代基選自滷素、烷氧基(1-6C)、烷硫基(1-6C)、烷基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、-O-(CH2)m-Ph、-S-(CH2)m-Ph、氰基、苯基和CO2R，其中R為氫或烷基(1-6C)，並且m是0-3；或者Y1是與5-或7-員芳香環或非芳香環稠合的苯基，其中所述環包含最多3個雜原子，該雜原子獨立地選自N、O和S；Y2、Y3、Y4和Y5獨立地代表氫、烷基(1-6C)、烷氧基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、滷素、NH2、NH-烷基(1-6C)或者NH(CH2)n-Ph，其中n為0-3；或者Y2、Y3、Y4和Y5的鄰近一對形成任選包含最多2個氮原子的稠合的6-員芳環，該環任選地被一個或多個取代基所取代，這些取代基獨立地選自烷基(1-6C)、烷氧基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、滷素、NH2、NH-烷基(1-6C)或者NH(CH2)n-Ph，其中n為0-3；Y2、Y3、Y4、Y5的剩餘者代表氫、烷基(1-6C)、烷氧基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、滷素、NH2、NH-烷基(1-6C)或者NH(CH2)n-Ph，其中n為0-3；並且X1和X2中的一個為N，另一個為NR6，其中R6是氫或烷基(1-6C)。
在另一種實施方案中，本發明的治療方法中使用的分子為式(3)的化合物或其可藥用鹽或前藥形式，
其中，Y1為萘基、蒽基或苯基，任選地被一個或多個選自滷素、烷氧基(1-6C)、烷硫基(1-6C)、烷基(1-6C)、-O-(CH2)-Ph、-S-(CH2)n-Ph、氰基、苯基和CO2R的基團所取代，其中R是氫或烷基(1-6C)，n是0、1、2或3；或者Y1代表與5-7員芳香的或非芳香的環稠合的苯基，其中所述環任選地包含最多兩個雜原子，該雜原子獨立地選自N、O和S；Y2為H、NH(CH2)n-Ph或NH-烷基(1-6C)，其中n為0、1、2或3；Y3為CO2H、CONH2、CN、NO2、烷硫基(1-6C)，-SO2-烷基(C1-6)，烷氧基(C1-6)，SONH2、CONHOH、NH2、CHO、CH2NH2或CO2R，其中R是氫或烷基(1-6C)；X1和X2之一為N或CR』，另一個為NR』或CHR』，其中R』為氫、OH、烷基(C-16)、或環烷基(C3-7)；或者是，當X1或X2其中之一為N或CR』，那麼另一種可為S或O。
在另一種實施方案中，本發明的治療方法中使用的分子是下式的化合物(4)或其可藥用鹽或前藥形式， 其中，Ar代表包含5-12員的任選取代的芳基或任選取代的雜芳基，其中所述雜芳基包含一個或多個O、S和/或N，其條件是，任選取代的Ar不是 其中R5是氫、烷基(1-6C)、鏈烯基(2-6C)、炔基(2-6C)，或芳基或雜芳基，該芳基或雜芳基包含5-11個環成員；X為NR1、O或S；
R1為H、烷基(1-8C)、鏈烯基(2-8C)、或炔基(2-8C)；Z代表N或CR4；每個R3或R4獨立地為H或是無幹擾取代基；每個R2獨立地為無幹擾取代基；以及n為0、1、2、3、4或5。在一種實施方案中，如果n＞2，並且R2是相鄰的，它們能連在一起形成5至7員的非芳香的、雜芳香的或芳香的環，該環包含1至3個雜原子，其中每個雜原子可以獨立地是O、N或S。
在另一種實施方案中，本發明的治療方法中使用的分子是式(5)的化合物或其可藥用鹽或前藥形式， 其中，每個Z5、Z6、Z7和Z8為N或CH，其中Z5、Z6、Z7和Z8中的一個或兩個是N，以及其中兩個相鄰的Z位置不能為N；每個m和n獨立地為0-3；R1為滷素、烷基、烷氧基或滷代烷基，其中兩個相鄰的R1基團可以連接起來形成5-6員的脂肪族雜環；R2是無幹擾取代基；R3為H或CH3。
另一方面，本發明涉及用於逆轉TGF-β-介導的對於與惡性神經膠質瘤相關基因的效果的方法，包括使包含這類基因的細胞與在細胞中特異性結合TGF-β-R1受體激酶的TGF-β的非肽小分子抑制劑相接觸。在優選的實施方案中，所述的小分子抑制劑是式(1)-(5)的化合物。
圖1.通過TGF-β抑制劑防止重組體和神經膠質瘤衍生的TGF-b1和TGF-b2的生長抑制效果(表2中的79號化合物)。A.CCL64細胞在不斷增加濃度的79號化合物存在或不存在的情況下暴露於人TGF-b1重組體(填充的符號)或TGF-b2(空白的符號)(10ng/ml)72小時。B.CCL64細胞在79號化合物存在或不存在的情況下在含有熱活性的神經膠質瘤細胞SN(1∶1)的無血清培養基中培養72小時。生長通過結晶紫測試法測定(平均數和SD，n＝3)圖2.通過79號化合物的在神經膠質瘤細胞中自分泌TGF-β信號的廢除。A.細胞以104細胞/孔接種於96孔板並在79號化合物存在或不存在的情況下在無血清培養基中培養48小時。生長通過[甲基-3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入在48小時測定(*p＜0.05，t-檢驗)。B.從未處理的神經膠質瘤細胞的溶胞產物、或先暴露於79號化合物(1μM)24小時或暴露於TGF-b2(5ng/ml)1小時或者兩種的細胞的溶胞產物，測定p-Smad2或總Smad2/3的水平。注意所述的抗體分別地對p-Smad2以及總Smad2和3特異。
圖3.79號化合物對異源的抗神經膠質瘤免疫反應的調節涉及TGF-β拮抗作用。A.在79號化合物(1μM)存在(填充的符號)或不存在(空白的符號)的情況下，對抗與被照射的LN-308細胞一起預培養的PBL(正方形的)或純化的T細胞(三角形的)的LN-308靶的溶胞活性，是通過51Cr釋放測定法測定。B-D.PBL在被照射的LN-308細胞存在(右)或不存在(左)的情況下培養5天。該培養物包含79號化合物(1μM)(填充條)或沒有包含(空白條)。接著這些效應細胞在79號化合物不存在的情況下與新鮮的未被照射的LN-308細胞共培養24小時。IFN-γ(B)、IFN-α(C)或IL-10(D)的釋放通過Elispot測定法測定。數據表示為每5×105個效應細胞的產生細胞因子的細胞(n＝3，*p＜0.05，**p＜0.01，t-檢驗，79號化合物的效果)。E、F.將多克隆NK細胞培養物暴露於TGF-β1(5ng/ml)(E)或稀釋的(1∶4)神經膠質瘤細胞SN(F)中，有或沒有79號化合物(1μM)，培養48小時，接著在使用LN-308細胞作為靶細胞的51Cr釋放測定法中作為效應器使用。單獨的79號化合物或單獨的TGF-β抗體在這些測試中對NK細胞活性沒有作用(數據沒有列出)。
圖4.79號化合物在體內抑制同源的SMA-560實驗性的神經膠質瘤並促進免疫活化。A.對VM/DK小鼠進行顱內的5×103個SMA-560細胞的注射。三天之後開始了使用79號化合物的治療，存活率被提高了。B.將動物像A一樣處理，但是在第10天處死得到脾細胞。於24小時通過Elispot檢測IFN-γ的釋放。數據表示為每106個效應細胞的產生細胞因子的細胞。C.該脾細胞用IL-2刺激10天從而產生LAK細胞。溶胞活性採用使用SMA-560作為靶細胞的51Cr釋放法測定(載體，虛線；79號化合物，實線)(*p＜0.05，t-檢驗)。優選實施方案的詳細描述A.定義除非另外限定，這裡使用的技術和科學術語，與本發明所屬的本領域的普通技術人員通常理解的意思一樣。Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第二版；J.Wiley，Sons(紐約，NY 1994)和March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第四版；J.Wiley和Sons(紐約，NY 1992)，針對本發明中使用的許多術語為本領域的技術人員提供了一種普遍的指引。
這裡使用的術語「惡性神經膠質瘤」是使用它最廣泛的意思，指的是從腦部神經膠質細胞或支持性的細胞開始的腦瘤。此術語非限制性地具體包括星形細胞瘤(astrocytomas)、腦室管膜細胞瘤(ependymomas)、少突神經膠質細胞瘤(oligodendroglionas)、混合性神經膠質瘤(mixed gliomas)、少突神經膠質細胞瘤(oligodendrogliomas)和視神經膠質瘤(potic nerve gliomas)。
所述的術語「成膠質細胞瘤」、「多形性成膠質細胞瘤」和「IV級星形細胞瘤」，在這裡是可以互換使用的並是最廣泛的意思，以描述腦瘤最普遍形式神經膠質瘤的侵佔形式(aggressive form)，也包含特徵相似或與這類腫瘤有關的情形。因此，成膠質細胞瘤如高度細胞性的星形細胞瘤的典型特徵在於細胞核的和細胞的多型現象、高血管增生、高有絲分裂形態、任選地伴隨壞死、顯微鏡浸潤性損傷、高標記的指數或其它這類診斷標準。
正如這裡使用的，任何涉及對惡性神經膠質瘤如成膠質細胞瘤的「逆轉TGF-β-介導的作用」，意味著部分的或完全地逆轉TGF-β對神經膠質瘤細胞系、對體內的神經膠質瘤、或與惡性神經膠質瘤(例如成膠質細胞瘤)相關的基因或蛋白表達方面中任何一種的作用，其中所述惡性神經膠質瘤是與星形細胞或少突膠質神經細胞系中的中樞神經系統細胞的正常樣本(normalsample)有關的。需要強調的是，儘管完全的逆轉(例如完全回到正常表達水平)在本定義下是有益的，但是不是必要的。
「治療」是以阻止疾病的發展或改變疾病的病狀為目的的幹涉。因此，「治療」指的是治療性的治療、預防性的(prophylactic)或預防性的(preventative)方法。那些需要治療的包括已經得病的和要預防疾病的。在腫瘤(例如神經膠質瘤或成膠質細胞瘤)治療中，治療劑可以直接減輕腫瘤細胞的病狀，或者使腫瘤細胞對其它治療劑例如放射和/或化學治療的治療更敏感。因此，治療非限制性地包括(1)在某種程度上腫瘤生長的抑制，包括減慢生長速度和完全的生長停滯；(2)減少腫瘤細胞的數量；(3)減小腫瘤的大小；(4)抑制(即減少、減慢或者完全阻止)腫瘤細胞滲透進入臨近周圍的的器官和/或組織；(5)抑制(即減少、減慢或者完全阻止)轉移；(6)增強抗腫瘤免疫反應，這將可以但不一定導致腫瘤的退化或者排斥；(7)在某種程度上，緩解腫瘤引起的一個或多個症狀；緩解由於循環的TGF-β的腫瘤引起的全身的免疫抑制；(8)增加治療之後的存活長度；和/或(9)在一個給定的時間點上降低治療之後的死亡率。
包括惡性神經膠質瘤如成膠質細胞瘤的癌症的「病狀」，包含包括病人的健康在內的所有現象。這非限制性地包括，異常的不受控制的細胞生長、腫瘤轉移、對鄰近細胞正常功能的的幹擾、細胞因子(如TGF-β)或其它分泌產物的異常水平的釋放、炎症的或免疫應答的抑制或惡化、瘤初形成期、瘤惡化前期、惡性腫瘤期、對周圍或較遠的組織或器官的侵襲。
「治療有效量的」，是關於治療成膠質細胞瘤，例如，當使用本發明的抑制劑時，指的是能產生一個或多個上面定義的「治療」中列出的效果。
所述的術語「特異性的結合」(specifically binding)、「結合特異的」(bindsspecifically)、「專門的結合」(specific binding)或其它與它們語法上相當的術語，在1型TGF-β受體的情況下使用時，是指與1型TGF-β受體結合比與其它包括TGFβ-R2和p38的多肽結合有更強的親和力。典型地，特異性結合指的是與TGFβ-R1上的唯一抗原表位結合。這種結合必須在通過TGFβ-R1而有效抑制TGF-β信號轉導的親和力。類似的定義也適用於「特異性結合」其它目標物。
所述的術語「多聚核苷酸」(polynucleotide)，當單獨或幾個使用時，通常代表任何多聚核糖核苷酸(polyribonucleotide)或多聚脫氧核糖核苷酸(polydeoxribonucleotide)，指的是未修飾的RNA或DNA、或者修飾的RNA或DNA。因此，例如，這裡定義的多聚核苷酸非限制性地包含，單鏈和雙鏈DNA，包含單股或雙股區域的DNA，單鏈或雙鏈RNA，包含單鏈或雙鏈區域的RNA，包括DNA和RNA的雜交分子，所述DNA和RNA可以為單鏈的、或更典型的雙鏈的、或者包含單鏈或雙鏈區域的。此外，所述的術語「多聚核苷酸」在這裡使用時指的是包含RNA、DNA、或RNA與DNA兩者的三鏈區域。在這些區域中所述的鏈可能來自同一個分子或來自不同的分子。所述的區域包含一個或多個分子的全部，但是更典型地是包括一些分子的僅一種區域。三螺旋狀區域的分子之一通常是寡聚核苷酸。所述的術語「多聚核苷酸」尤其包括包含一個或多個修飾鹼基的DNA和RNA。因此，為了穩定性或其它原因修飾過主鏈的DNA和RNA就是這裡預期使用的術語「多聚核苷酸」。而且，DNA和RNA包含稀有鹼基，如次黃嘌呤核苷，或者修飾鹼基，如氚化了的鹼基，都包含在這裡定義的術語「多聚核苷酸」裡。通常，所述的術語「多聚核苷酸」包括所有化學的、酶化的和/或代謝的未修飾多聚核苷酸的修飾形式，也包括病毒和細胞的DNA和RNA特徵的化學形態，所述細胞包含簡單細胞和複雜細胞。
所述的術語「寡聚核苷酸」(oligonucleotide)指的是相對短的多聚核苷酸，其非限制性地包括單鏈脫氧核糖核苷酸、單鏈或雙鏈核糖核苷酸、RNADNA雜交的和雙鏈DNA。寡聚核苷酸，如單鏈DNA探針寡聚核苷酸，通常通過化學方法合成，例如使用商業上已有的自動化寡核苷酸合成儀。然而，寡聚核苷酸可以通過許多種其它的方法製備，包括體外重組體DNA介導的技術，和通過細胞和器官中的DNA的表達。
所述的術語「差別表達的基因」(diffrentially expressed gene)、「差別的基因表達」(differential gene expression)和它們類似的詞，可以互換使用，指的是相對於在正常或對照的樣本中的表達，在測試樣本中基因的表達被刺激到更高的或更低的水平。為了本發明的目的，「差別的基因表達」被認為是在正常樣本和測試樣本中的基因表達，呈現出至少2.5倍、優選的至少約4倍、更優選的至少約6倍、最優選的至少約10倍的差別。
這裡使用的術語「抑制劑」指的是分子如非肽小分子，其特異性地結合具有抑制天然TGF-β分子生物學功能能力的TGFβ-R1受體。因此，所述的術語「抑制劑」，是在TGF-β和其受體的生物學角色的情況下被定義的。
這裡使用的術語「優先地抑制」，意思是在目標物上的抑制作用比在其它任何目標物上的抑制作用要明顯的大。因此，在TGF-β-R1激酶相對p38激酶有優先的抑制作用的情況下，此術語的意思是抑制劑通過TGF-β-R1激酶介導而抑制生物學活性比通過p38激酶介導而抑制生物學活性要顯著得多，所述生物學活性如腫瘤的轉移活性、腫瘤的增殖、壞死。對於優先地被抑制受體的抑制程度的差別可能會改變，但是通常至少是約2倍，更優選的至少是約5倍，再更優選的至少是約10倍。
所述的為了治療目的的術語「哺乳動物」，指的是任何被指定為哺乳動物的動物，包括人類、高等靈長類、馴養的和農場的動物、動物園動物、運動動物、或寵物動物，如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔子等。優選地，哺乳動物是人。
「顱內的」意思是在頭蓋骨之內或在或靠近脊髓的背部末端，其包括髓質、腦幹、腦橋、小腦和大腦。
「組合」給予一個或多個進一步的治療處理，如外科手術或放射或其它治療劑，包含同時發生的(並發的)和連續發生的以任何順序的給予。一種優選的順序是先外科手術，接著放射，之後化學療法。化學療法包括合併化學治療；單因子細胞毒素的化學療如靜脈內的環己亞硝脲或鉑類，口服亞硝基脲氮芥(Carmustine)、亞硝基脲；亞硝基脲氮芥(bischloroethylnitrosourea，BCNU)；替莫唑胺或丙卡巴肼，氯乙環己亞硝脲、長春新鹼(PCV)；放射敏化藥。放射治療包括再放射和/或外科手術後的放射，使用伽瑪刀或線性加速器的放射外科術，低劑量率的持久接種(permanent-seed)近距離放射療法，高劑量率的立體靜止(stereostatic)近距離放射療法。
在本發明的具體方法中，本發明的TGF-β-R1激酶抑制劑可能會與其它包含TGF-β的抑制劑結合，例如，反義戰略(Fakhrai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美國，932909-2914(1996))，弗林家族蛋白酶的TGF-β-加工蛋白酶的抑制劑，和其它藥如transilast(Platten等人，Int.J Cancer，9353-61(2001))。本發明還進一步包含用本發明的TGFβ-R1抑制劑與其它包括酪氨酸激酶、法呢基醯基轉移酶、和基質金屬蛋白酶(matrix metallopreteinases)的酶的抑制劑的聯合治療。
正如這裡使用的，「無幹擾取代基」是使這裡提供的通式裡描述的化合物對TGF-β活性的抑制能力質量上完好無損。因此，所述的取代基可能會改變抑制程度。然而，只要所述的化合物保留著抑制TGF-β活性的能力，該取代基就會被劃分為「無幹擾取代基」。優選地，「無幹擾取代基」是其存在基本上沒有破壞化合物對TGF-β的抑制能力的取代基。
正如這裡使用的，「烴基殘基」指的是只包含碳和氫的殘基。該殘基可為脂肪族的或是芳香族的、直鏈的、環狀的、有分支的、飽和的或不飽和的。當使用烴基殘基時，其可能包含除該取代基殘基的碳和氫成員之外的雜原子。因此，當明確地註明包含這類雜原子的時候，所述的烴基殘基可能同樣會包含羰基、氨基、羥基等，或在烴基殘基的「主鏈」中包含雜原子。
正如這裡使用的，所述的術語「烷基」、「鏈烯基」和「炔基」包括直鏈的、有分支的和環狀的一價取代基。實施例包括甲基、乙基、異丁基、環己基、環戊基乙基、2-丙烯基、3-丁烯基等。典型地，烷基、鏈烯基和炔基取代基包括1-10C(烷基)或2-10C(鏈烯基或炔基)。優選地，它們包含1-6C(烷基)或2-6C(鏈烯基或炔基)。雜烷基、雜烯基和雜炔基類似地被定義，但是它們可能在殘基的主鏈中包含1-2個O、S或N雜原子或它們的組合物。
正如這裡使用的，「醯基」包含烷基、鏈烯基、炔基和相關含雜原子形式(hetero-forms)的定義，這些基團兩兩通過羰基組成另外的殘基。
「芳香族的」基團或「芳基的」基團指的是單環的或是稠合的二環的基團，如苯或萘；「雜芳香族的」也指的是單環的或是稠合的二環的且包含一個或多個選自O、S和N雜原子的環體系。對於雜原子的包含允許5-員環和6-員環的包含。因此，典型的芳香族的體系包括吡啶基、嘧啶基、吲哚基、苯並咪唑基、苯並三唑基、異喹啉基、喹啉基、苯並噻唑基、苯並呋喃基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、噁唑基、咪唑基等。任何有著由於電子在整個環體系分布而造成的芳香性特徵的單環的或稠合的二環體系都包含在這個定義中。典型地，所述的環體系包含5-12個環成員原子。
類似地，「芳基烷基」和「雜烷基」指的是通過碳鏈與另一個殘基連接的芳香的和雜芳香的體系，包括取代的或未取代的、飽和的或未飽和的碳鏈，典型地有1-6個C或1-8個C，或其含雜原子形式。這些碳鏈也可能包括羰基，這樣使它們能夠提供作為醯基或雜醯基的取代基。
B.實現本發明的方法本發明所述的抑制劑的特徵在於，抑制與成膠質細胞瘤和其它惡性神經膠質瘤的發展、生長或蔓延有關的TGF-β通路的一個或多個成員的生物學活性。在一種優選的實施方案中，本發明所述的抑制劑抑制TGF-β受體介導的生物學反應。在另一種優選的實施方案中，本發明所述的抑制劑選擇性地抑制1型TGF-β受體介導的生物學反應，在特別的基質產物中，不影響2型TGF-β受體介導的細胞增殖。
在另一種同樣優選的實施方案中，本發明所述的化合物相對p38激酶優選地抑制TGF-βR1激酶。
本發明的化合物本發明的至少一部分是根據以下發現為根據，所述發現是神經膠質瘤、包括成膠質細胞瘤可通過抑制TGF-β信號通路的一個或多個成員的生物學功能來治療。本發明的抑制劑非限制性地包括，小有機分子、肽、多肽(包括抗體和抗體片斷)、反義多聚核苷酸、寡聚核苷酸誘餌分子等。在具體的實施方案中，本發明所述的抑制劑是小有機分子(非-肽小分子)，通常分子量小於約1000道爾頓。優選的非肽小分子分子量小於約750道爾頓，更優選的分子量小於約500道爾頓，還更優選的分子量小於約300道爾頓。
在優選實施方案中，化合物是下式或其可藥用鹽， 其中R3是無幹擾取代基；每個Z為CR2或N，其中A環中Z位置為N的情況不超過兩個，以及其中A環兩個相鄰的Z位置不能為N；每個R2獨立地為無幹擾取代基；L是連接基；n為0或1；以及Ar』任選地是被1-3個無幹擾取代基取代的脂肪環族、雜脂肪環族、芳香族或雜芳香族的基團。
在更優選的實施方案中，這裡所述的小有機分子是喹唑啉和相關化合物的衍生物，該相關化合物的衍生物包含在相應喹唑啉的2-和4-位置上的強制性的取代基。儘管本發明範圍內的可選方案也在下面有圖解說明，通常喹唑啉核是優選的。Z3的優選實施方案為N和CH；Z5-Z8的優選實施方案為CR2。但是，每個Z5-Z8也可以為N，其條件如上所述。因此，關於基本喹唑啉類型的環體系，優選的實施方案包括喹唑啉本身，以及所有的Z5-Z8和Z3或者為N或者為CH的實施方案。下述實施方案也是優選的，在所述實施方案中Z3是N，Z5或Z8是N、或者Z5和Z8都是N，並且Z6和Z7是CH或CR2。其中R2不是H，優選地CR2出現在6和/或7位置。因此，例如，本發明範圍內的喹唑啉衍生物包括下述化合物，其包含喹唑啉核、連接在2位置作為無幹擾取代基(R3)的芳環，所述芳環可以被進一步取代。
就喹唑啉的4-位置的取代基LAr』而言，L是存在的或不存在的，且它是以2-8、優選的2-6、更優選的2-4的距離隔開取代基Ar』和B環的連接基。這個距離是從一個價L連接的B環的環碳到該連接基另一個價連接的Ar』環的原子測出的。Ar』也可以直接與B環連接(即，當n為0)。典型的，但是非限制性地，L的實施方案是下式的S(CR22)m、-NR1SO2(CR22)1、NR1(CR22)m、NR1CO(CR22)1、O(CR22)m、OCO(CR22)1，以及 其中Z為N或CH，並且，分別地m為0-4，1為0-3、優選地1-3和1-2。L優選地使-NR1-直接地與環B相連。R1的優選實施方案為H，但是R1也可為醯基、烷基、芳基醯基或芳基烷基，其中芳基可能被1-3個基團取代，該取代基如烷基、鏈烯基、炔基、醯基、芳基、烷基芳基、芳醯基、N-芳基、NH-烷基芳基、NH-芳醯基、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-NRSOR、-NRSO2R、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、-RCO、-COOR、-SO3R、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3和NO2，其中每個R獨立地是H或烷基(1-4C)，優選地該取代基為烷基(1-6C)、OR、SR或NR2，其中R為H或低級烷基(1-4C)。更優選地，R1為H或烷基(1-6C)。任何包含在所述的取代基中的芳基可進一步被例如烷基、炔基、鏈烯基、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、-RCO、-COOR、SO2R、NRSOR、NRSO2R、-SO3R、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3或NO2所取代，其中每個R獨立地為H或烷基(1-4C)。
Ar』為芳基、雜芳基，包含6-5稠合的雜芳基、環脂肪族或環雜脂肪族基團。優選地，Ar』為苯基、2-，3-或4-吡啶基、吲哚基、2-或4-嘧啶基、苯並咪唑基、吲哚基，優選地每個任選被選自任選被取代的烷基、鏈烯基、炔基、芳基、N-芳基、NH-芳醯基、滷素、OR、NR2、SR、-OOCR、-NROCR、-RCO、-COOR、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3和NO2的基團所取代，其中每個R獨立地為H或烷基(1-4C)；Ar』更優選地為吲哚基、6-嘧啶基、3-或4-吡啶基、或任選取代的苯基。
在Ar』為任選取代的苯基的實施方案中，取代基非限制性地包括烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、芳醯基、N-芳基、NH-烷基芳基、NH-芳醯基、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、RCO、-COOR、-SO3R、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3和NO2，其中每個R獨立地為H或烷基(1-4C)。優選的取代基包括滷素、OR、SR和NR2，其中R為H或甲基或乙基。這些取代基會佔據苯環的所有五個位置，優選地1-2位置，優選地一個位置。Ar』的實施方案包括取代的或未取代的苯基，2-，3-，或4-吡啶基、2-，4-或6-嘧啶基、吲哚基、異喹啉基、喹啉基、苯並咪唑基、苯並三唑基、苯並噻唑基、苯並呋喃基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、噁唑基、咪唑基和嗎啉基。尤其優選地作為Ar』的實施方案的是3-或4-吡啶，特別是4-吡啶的未被取代的形式。
任何芳基，尤其苯基，可能也包括兩個取代基，當合併一起的時候，形成5-7員的碳環的或雜環的脂肪環。
因此，相當於喹唑啉4-位置的、環B所述位置的取代基優選的實施方案包含2-(4-吡啶)乙胺基；4-吡啶基氨基；3-吡啶基氨基；2-吡啶基氨基；4-吲哚基氨基；5-吲哚基氨基；3-甲氧基苯胺基；2-(2，5-二氟苯基)乙胺-等。
R3通常為烴基殘基(1-20C)，包含0-5個選自O、S和N的雜原子。優選地R3為烷基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜芳基或雜芳基烷基，每個為未取代的或被1-3個取代基所取代。取代基獨立地選自滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、RCO、-COOR、-SO3R、NRSOR、NRSO2R、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3和NO2，其中每個R獨立地為H或烷基(1-4C)，以及就任何芳基或雜芳基而論，所述的基團進一步包含烷基(1-6C)、鏈烯基或炔基。R3(所在位置相當於喹唑啉2-位置的取代基)的優選的實施方案包括任選地被1-2個取代基取代的苯基，該取代基優選地為滷素、烷基(1-6C)、OR、NR2和SR，其中R如上定義。因此，優選的喹唑啉2-位置的取代基包括苯基、2-滷代苯基，例如，2-溴苯基、2-氯苯基、2-氟苯基；2-烷基苯基，如2-甲基苯基、2-乙基苯基；4-滷代苯基，例如，4-溴苯基、4-氯苯基、4-氟苯基；5-滷代苯基，例如，5-溴苯基、5-氯苯基、5-氟苯基；2，4-或2，5-滷代苯基，其中不同位置的滷素取代基可能為同樣的或不同的，例如，2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、2-氟-5-氯苯基、2-氯-5-氟苯基等。R3其它優選的實施方案包括環戊基或環己基。
如上記載的，R2是以前定義的無幹擾取代基。
每個R2也獨立地是烴基殘基(1-20C)，其包含0-5個選自O、S和N的雜原子。優選地，R2獨立地為H、烷基、鏈烯基、炔基、醯基或它們的含雜原子形式，或是芳基、芳基烷基、雜烷基、雜芳基或雜芳基烷基，每個基團未被取代或由被獨立選自烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基芳基、芳醯基、N-芳基、NH-烷基芳基、NH-芳醯基、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、NRSOR、NRSO2R、-OCONR2、RCO、-COOR、-SO3R、NRSOR、NRSO2R、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3和NO2中的1～3個基團所取代，其中每個R獨立地為H或烷基(1-4C)。所述取代基的芳基或芳醯基基團可能會進一步被取代，取代基為例如，烷基、鏈烯基、炔基、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、RCO、-COOR、-SO3R、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3和NO2，其中每個R獨立地為H或烷基(1-4C)。更優選地，R2上的取代基選自R4、滷素、OR4、NR42、SR4、-OOCR4、-NROCR4、-COOR4、R4CO、-CONR42、-SO2NR42、CN、CF3和NO2，其中每個R4獨立地為H、或任選取代的烷基(1-6C)、或任選取代的芳基烷基(7-12C)，其中兩個R4或兩個所述烷基或芳基烷基的取代基合在一起形成5-7員的稠合脂肪環。
R2本身也可以選自滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、NRSOR、NRSO2R、-OCONR2、RCO、-COOR、-SO3R、NRSOR、NRSO2R、-CONR2、SO2NR2、CN、CF3和NO2，其中每個R獨立地為H或烷基(1-4C)。
由R2表示的更優選的取代基是，那些在包含於上述Ar』或R3中的苯基基團。兩個相鄰的CR2結合在一起可以形成5-7個原子的碳環或雜環的稠合脂肪環。優選的R2取代基為下式的R4、-OR4、SR4或R4NH-，特別是R4NH-，其中R4如上定義。尤其優選地其中R4為取代的芳基烷基的情況。式(1)所述的化合物的具體代表物顯示在下表1-3。表1列出的所有化合物具有喹唑啉環體系(Z3為N)，其中A環是未被取代的(Z5-Z8代表CH)。B環的取代基列在表中。
*R1＝2-丙基R1＝4-甲氧基苯基R1＝4-甲氧基苯基表2中的化合物包含如下所示的喹唑啉核的修飾物。所有表2中的化合物是式(1)的實施方案，其中Z3為N，Z6和Z7代表CH。在所有示例中，連接基L是存在的且為NH。
製備其它化合物，其中環A在Z6或Z7為CR2，其中R2不為H。這些都是喹唑啉衍生物的化合物，其中L為NH並且Ar』為4-吡啶基，如表3所示。
本發明所述的化合物(1)的進一步有代表性的結構如下表4所示。
表4
如上面公開顯而易見的，儘管式(1)的許多對本發明方法有用的化合物是喹唑啉的衍生物，但是本發明包括式(1)的有著非喹唑啉結構的化合物的使用，例如像前面對喹唑啉衍生物進行討論的具有吡啶、嘧啶核的取代基。式(1)的化合物也在2003年3月9日出版的PCT出版物號WO 00/12497中公開，整個公開在此明確地引入作為參考。
本發明方法中使用的另一種化合物的基團由下式(2)或其可藥用鹽或前藥形式表示； 其中Y1為苯基或萘基，任選地被一個或多個取代基所取代，這些取代基選自滷素、烷氧基(1-6C)、烷硫基(1-6C)、烷基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、-O-(CH2)m-Ph，-S-(CH2)m-Ph，氰基、苯基和CO2R，其中R為氫或烷基(1-6C)，m是0-3；或者Y1代表與5-或7-員的芳香或非芳香的環稠合在一起的苯基，其中所述環包含最多3個獨立地選自N、O和S的雜原子。
Y2、Y3、Y4和Y5獨立地代表氫、烷基(1-6C)、烷氧基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、滷素、NH2、NH-烷基(1-6C)或者NH(CH2)n-Ph，其中n為0-3；或者Y2、Y3、Y4和Y5的相鄰一對任選地形成包含最多2個氮原子的稠合6-員芳環，該環任選地被一個或多個取代基所取代，這些取代基獨立地選自烷基(1-6C)、烷氧基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、滷素、NH2、NH-烷基(1-6C)或者NH(CH2)n-Ph，其中n為0-3，Y2、Y3、Y4、Y5的剩餘者代表氫、烷基(1-6C)、烷氧基(1-6C)、滷代烷基(1-6C)、滷素、NH2、NH-烷基(1-6C)或者NH(CH2)n-Ph，其中n為0-3；並且X1和X2中的一個為N另一個為NR6，其中R6是氫或烷基(1-6C)。
如式(2)中使用的，虛線標明的雙鍵代表化合物可能的互變的環形式。更多有關式(2)的化合物的信息和它們的製備在2002年5月23日出版的WO02/40468中被公開，整個公開在此明確地引入作為參考。
然而應用在本發明方法中的化合物的另一種基團由下式(3)或其可藥用鹽或前藥形式表示 其中Y1為萘基、蒽基或苯基，其任選地被一個或多個選自滷素、烷氧基(1-6C)、烷硫基(1-6C)、烷基(1-6C)、-O-(CH2)-Ph、-S-(CH2)n-Ph、氰基、苯基和CO2R的取代基所取代，其中R是氫或烷基(1-6C)，n是0、1、2或3；或者Y1代表與5-7員芳香或非芳香環稠合的苯基，其中所述環任選地包含最多兩個雜原子，該雜原子獨立地選自N、O和S。
Y2為H、NH(CH2)n-Ph或NH-烷基(1-6C)，其中n為0、1、2或3；Y3為CO2H、CONH2、CN、NO2、烷硫基(1-6C)，-SO2-烷基(1-6C)，烷氧基(1-6C)，SONH2、CONHOH、NH2、CHO、CH2NH2或CO2R，其中R是氫或烷基(1-6C)；X1和X2之一為N或CR』，另一個為NR』或CHR』，其中R』為氫、OH、烷基(1-6C)、或環烷基(3-7C)；或者是，當X1或X2其中之一為N或CR』，那麼另一種可以是S或O。
式(3)化合物的更多細節以及它們製備的方法在2000年10月19日出版的WO 00/61576中被公開，整個公開在此明確地引入作為參考。
在進一步的實施方案中，本發明所述的TGF-β抑制劑由下式(4)或其可藥用鹽或前藥形式所表示
其中，Ar代表包含5-12員的任選取代的芳基或任選取代的雜芳基，其中所述的雜芳基包含一個或多個O、S和/或N，其條件是任選取代的Ar不是其中R5是氫、烷基(1-6C)、鏈烯基(2-6C)、炔基(2-6C)，或包含5 -11員的芳基或雜芳基；X為NR1、O或S；R1為H、烷基(1-8C)、鏈烯基(2-8C)、或炔基(2-8C)；Z代表N或CR4；每個R3或R4獨立地為H或是無幹擾取代基；每個R2獨立地為無幹擾取代基；以及n為0、1、2、3、4或5。在一種實施方案中，如果n＞2，並且R2是相鄰的，它們能連在一起形成5至7員的非芳香的、雜芳香的或芳香的環，該環包含1至3個雜原子，其中每個雜原子可以獨立地是O、N或S。
在優選的實施方案中，Ar代表包含5-9員的任選取代的芳基或任選取代的雜芳基，其中所述的雜芳基包含一個或多個N；或者R1為H、烷基(1-8C)、鏈烯基(2-8C)或炔基(2-8C)；或者Z代表N或CR4；其中，R4為H、烷基(1-10C)、鏈烯基(2-10C)或炔基(2-10C)、醯基(1-10C)、芳基、烷基芳基、芳醯基、O-芳基、O-烷基芳基、O-芳醯基、NR-芳基、NR-烷基芳基、NR-芳醯基、或者任何前述的基團的含雜原子形式、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-NRSOR、-NRSO2R、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、-COOR、-SO3R、-CONR2、-SO2NR2、-CN、-CF3或-NO2，其中每個R獨立地為H或烷基(1-10C)或者所述烷基的滷代的或包含雜原子的形式，每個R可被任選地取代。優選地R4為H、烷基(1-10C)、OR、SR或NR2，其中R為H或烷基(1-10C)或為O-芳基；或者R3與R4以同樣的方式定義，其優選的形式是類似的，但是R3被獨立地體現；或者每個R2獨立地為烷基(1-8C)、鏈烯基(2-8C)、炔基(2-8C)、醯基(1-8C)、芳基、烷基芳基、芳醯基、O-芳基、O-烷基芳基、O-芳醯基、NR-芳基、NR-烷基芳基、NR-芳醯基、或者任何前述的基團的含雜原子形式、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-NRSOR、-NRSO2R、-NRSO2R2、-SO2R、-OCOR、-OSO3R、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、-COOR、-SO3R、-CONR2、SO2NR2、-CN、-CF3或-NO2，其中每個R獨立地為H或低級烷基(1-4C)。優選地R2為滷素、烷基(1-6C)、OR、SR或NR2，其中R為H或低級烷基(1-4C)，更優選地為滷素；或者n為0-3。
Ar代表的芳基或雜芳基上的任選取代基包括烷基(1-10C)、鏈烯基(2-10C)、炔基(2-10C)、醯基(1-10C)、芳基、烷基芳基、芳醯基、O-芳基、O-烷基芳基、O-芳醯基、NR-芳基、NR-烷基芳基、NR-芳醯基、或者任何前述的基團的含雜原子形式、滷素、OR、NR2、SR、-SOR、-NRSOR、-NRSO2R、-NRSO2R2、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、-COOR、-SO3R、-CONR2、-SO2NR2、-CN、-CF3和/或-NO2，其中每個R獨立地為H或低級烷基(1-4C)。優選的取代基包括烷基、OR、NR2、O-烷基芳基和NH-烷基芳基。
通常，任何包含在取代基中的烷基、鏈烯基、炔基、醯基或芳基自身會任選地被另外的取代基取代。這些取代基的這種特性是與關於基本取代基它們本身的那些敘述相似的。
式(4)的代表性的化合物列舉在下表5中。
表5
本發明方法中應用的更進一步的TGF-β抑制劑由式(5)所表示 其中每個Z5、Z6、Z7和Z8為N或CH，其中Z5、Z6、Z7和Z8中的一個或兩個是N，兩個相鄰的Z位置不能是N；
每個m和n獨立地為0-3；R1為滷素、烷基、烷氧基或滷代烷基，其中兩個相鄰的R1基團可能會連接起來形成5-6員的脂肪族雜環；R2為無幹擾取代基；以及R3是H或CH3，式(5)的化合物是在對應喹唑啉的2-和4-位置上含有強制性取代基的喹唑啉和相關化合物的衍生物。優選地，式(5)的化合物包含蝶啶或吡啶並嘧啶的核。蝶啶和8-plb啶並嘧啶的核是優選的。因此，在一種實施方案中Z5和Z8為N，Z6和Z7為CH。然而在所有的情況下，至少Z5-Z8中的一個必須為N。R1優選的實施方案為滷素，優選地為F、Cl、I或Br，最優選的為Cl或F、NR2、OH或CF3。
所述的對應喹唑啉2-位的位置包含強制性的苯基取代基。
所述的對應喹唑啉4-位的位置包含任選含有0-4個無幹擾取代基即(R2)n的強制性-NR3-4』-吡啶基取代基，其中n為0-4。優選地，吡啶基為未取代的，即n為O。當被取代時，所述的吡啶基優選地被烷基如甲基、乙基或滷素優選地為溴或碘所取代，每個基團優選地在相對吡啶與喹唑啉衍生物核連接的鄰位取代。在另一種實施方案中，n為1，以及R3為甲基，優選地在1』或2』位置。
所述的R1取代基優選地最低限度地包含龐大基團，如滷素、低級烷基、低級烷氧基、和低級滷代烷基。優選地這些基團包含一個或多個滷素，如Cl、F、Br和I，當多於兩個滷素基團存在時它們可能一樣或不同；滷代烷基包含1-3個滷原子，優選地滷代甲烷或者更優選地三氟甲烷；OH；R為低級烷基，優選地C1-6，更優選地C1-3烷基，還更優選地，甲基、乙基、丙基或異丙基，最優選地甲基；OR，R如上定義，OR優選地為甲氧基、乙氧基、異丙氧基、甲基苯氧基。兩個相鄰的R基團可能會連接在一起形成與2一苯基稠合的脂肪的或雜脂肪的環。優選地，如果稠合環存在，它含有5個或6個成員，優選地為5個成員，以及包含1個或多個雜原子如N、S或O，優選地為O。優選地，稠合環為1、3二氧戊環與苯基在苯環4和5位的稠合。
所述的R1基團或與2-苯基連接的基團可能與苯環的任何可用位置連接。優選地，R1基團連接在相對苯基在喹唑啉衍生物核連接點的間位。類似地，在優選的實施方案中，當苯基被兩個基團所取代時，所述的基團連接在相對苯基在喹唑啉衍生物核連接點的鄰位和間位，更優選地，在非-相鄰的鄰位和間位。其它實施方案包括這些基團在鄰位或對位。如果存在兩個基團，苯基在可以預期間位或相鄰的鄰位以及間位取代。或者，兩個基團可能會形成稠合環，優選地在相對苯基在喹唑啉衍生物連接點的間位和對位連接。苯基也可以未被取代。
對於包含以吡啶並嘧啶作為核的化合物，當它的6-或7-異構體存在時，例如，氮在吡啶並嘧啶的6或7位置，苯基優選地是未取代的，或者優選地包含一個滷素取代基，優選氯，以及優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的間位連接。
在式(5)的化合物中，優選地，苯基是被取代的，優選地為滷素，更優選地一個或兩個滷素，還優選地為氯在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的間位或對位，或者二氯在兩個間位；或者更優選地被氟取代，優選地二氟，優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的鄰位和間位；或者更優選地溴，優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的間位；或者更優選地碘，優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的間位。
在包含8-吡啶並嘧啶化合物的另一種優選的實施方案中，苯基被兩種或更多不同的滷素取代基取代，優選地二取代，以及優選地包含氟和氯，更優選二取代在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的非-相鄰的鄰位和間位，更優選地其中氟在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的鄰位，氯在它的間位；或者優選地被氟和溴二取代，優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的非-相鄰的鄰位和間位，更優選地其中氟在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的鄰位，溴在間位。
在包含8-吡啶並嘧啶化合物的另一種優選的實施方案中，苯基被取代，優選地在一個或兩個位置，優選地被烷氧基或芳基芳基氧取代，優選地甲氧基、乙氧基、異丙氧基或苯氧基，以及優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的鄰位或間位。
在包含8-吡啶並嘧啶化合物的另一種優選的實施方案中，苯基優選地被烷基所取代，優選地為甲基，以及優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的間位。
在包含8-吡啶並嘧啶化合物的另一種優選的實施方案中，兩個或更多取代基可以連接形成稠合環。優選地，稠合環為二氧戊環，更優選地為1，3-二氧戊環，與苯環在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的間位和對位稠合。
在包含8-吡啶並嘧啶化合物的另一種優選的實施方案中，苯基被兩種或更多不同的取代基取代，優選地二取代，以及優選地為氯和甲氧基，優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的非-相鄰的鄰位和間位二取代，更優選地其中甲氧基在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的鄰位，氯在間位；或者優選地被氟和甲氧基二取代，優選地在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的相鄰的鄰位和間位，更優選地其中氟在相對苯基在吡啶並嘧啶基連接點的鄰位，甲氧基在間位。
此外，式(5)的化合物包含碟啶核，在相對苯基在碟啶基連接點的鄰位、間位或對位，苯基優選地包含至少一個滷素取代基。在一種更優選的實施方案中，苯基在相對苯基在碟啶基連接點的鄰位或間位包含一個氯基團；一個氟基團在相對苯基在碟啶基連接點的鄰位、間位或對位；或者一個溴或碘在相對苯基在碟啶基連接點的間位。在另一種優選的實施方案中，苯基包含兩個滷素基團，優選地二氟，優選地在相對苯基在碟啶基連接點的非-相鄰的鄰位和間位二取代；優選地二氯，優選地在相對苯基在碟啶基連接點的相鄰的鄰位和間位二取代；優選地氟和氯，優選地在相對苯基在碟啶基連接點的相鄰的或非相鄰的鄰位和間位二取代，優選地，其中氟在鄰位，氯在任一間位，更優選地其中氯在非-相鄰的間位；或者優選地氟和溴優選地在相對苯基在碟啶基連接點的非-相鄰的鄰位和間位，優選地其中氟在鄰位，溴在非-相鄰的間位。
在包含碟啶化合物的另一種優選的實施方案中，苯基被取代，優選地在一個或多個位置，優選地在一個位置，更優選地被烷氧基取代，還優選地被甲氧基取代，以及優選地在相對苯基在碟啶基連接點的鄰位或間位。在包含碟啶化合物的另一種實施方案中，苯基優選地被滷代烷基，優選地三氟甲基，以及優選地在相對苯基在碟啶基連接點的間位。
在包含碟啶的式(5)的化合物的另一種優選的實施方案中，苯基被兩種或更多不同的取代基取代，優選地兩種取代基，優選地被滷素和滷代烷基取代，更優選地為氟和三氟甲基，優選地在相對苯基在碟啶基連接點的非-相鄰的鄰位和間位二取代，更優選地其中氟在相對苯基在碟啶基連接點的鄰位，三氟甲基在間位。
根據以上定義，R2為無幹擾取代基。優選地，R2獨立地為H、滷素、烷基、鏈烯基、炔基、醯基或它們的含雜原子形式。更優選地，R2為低級烷基(1-3C)，滷素如Br、I、Cl或F。還優選地，R2為甲基、乙基、溴、碘或CONHR。最優選地，R2為H。
下面的條件適用於式(5)的化合物當Z5-Z7為CH，以及Z8為N時，R1不是2-氟代的、2-氯代的或者苯基不是未被取代的；當Z5和Z8為N，Z6和Z7為CH時，苯基不是未被取代的；以及當Z5為N，Z6-Z8為CH時，苯基不是未被取代的。
式(5)的有代表性的化合物在下表6中列出。
表6
在這裡的TGF-β抑制劑也可以以能被設計成給藥以後釋放出所述化合物的「前體藥物」的形式被提供。生成前體藥物的設計在本領域中是熟知的，並且取決於包含在化合物中的取代基。例如，取代基包括巰基可以結合到載體上，致使化合物生物學不活潑，直到被內源性的酶除掉，或者，例如，通過酶結合到具體受體或受實驗者的部位。
在前述化合物的取代基如其中一些包含手性中心的情況下，實際上，所述的化合物包含它的所有立體異構形式，如分離出的立體異構體和這些立體異構體形式的混合物。
式(1)-(5)的化合物，可以以它們可藥用酸式鹽的形式提供，包括無機酸如鹽酸、硫酸、氫溴酸或磷酸的鹽，或者有機酸如乙酸、酒石酸、琥珀酸、苯甲酸、水楊酸的鹽等。如果在式(1)-(5)的化合物中存在羰基，該化合物也能以含有可藥用陽離子的鹽的形式提供。
式(1)-(5)的化合物可以以能被設計成給藥以後釋放出所述化合物的「前體藥物」的形式被提供。生成前體藥物的設計在本領域中是熟知的，並且依賴於包含在式(1)-(5)化合物中的取代基。例如，取代基包括巰基可以結合到載體上，致使化合物生物學不活潑，直到被內源性的酶除掉，或者，例如，通過酶結合到具體受體或受實驗者的部位。
在式(1)-(5)化合物的取代基如其中一些包含手性中心的情況下，實際上，所述的化合物包含它的所有立體異構形式，如分離出的立體異構體和這些立體異構體形式的混合物。
本發明所述化合物的合成本發明所述化合物的合成方法，在本領域中是熟知的。因此，式(1)的化合物可按在2003年3月9日出版的WO 00/12497中描述的來合成。式(2)的化合物的合成方法在2002年5月23日出版的WO 02/40468中公開。式(3)的化合物可被合成，例如，在2000年10月19日出版的WO 00/61576中被描述。式(4)的化合物的合成，例如，在PCT申請號PCT/US03/28590中被描述。式(5)的化合物可按描述被合成，例如，在美國申請號60/507,910。此外，本發明範圍內的有代表性的化合物在美國申請號60/458,982中進一步被描述。在此部分引用的所有文件的整個公開特此被明確地引入作為參考。化合物的活性本發明方法中有用的化合物可通過它們抑制TGF-B的能力來鑑別。鑑別有用化合物的方法可以，例如按照如下進行化合物稀釋物和試劑每天新鮮地製備。化合物用DMSO儲備溶液稀釋到兩倍於所需的實驗濃度，保持實驗中最終的DMS0濃度小於或等於1％。TGFβ-R1在+DTT緩衝液中稀釋到4倍於所需的實驗濃度。ATP可在4倍反應緩衝液中稀釋，可以按照60μCi/mL加入伽馬33P-ATP。
所述的實驗可按照下述進行，例如，通過把1Oμl的酶加入到20μl化合物溶液中。在某可能的實驗設計中，反應通過加入10μl ATP混合物而開始。最終實驗條件包括10μM ATP、170nM TGFp．R1，以及在20mM MOPS中的1M DTT，pH為7。反應在室溫培養20分鐘。反應通過將23μl反應混合物轉移到事先每孔用15μl 0.25M H3PO4潤溼的磷酸纖維素96一孔濾板上而停止。5分鐘之後，孔用75mM H3PO4洗4次以及95％乙醇洗一次。將板乾燥，每孔加入閃爍混合劑(scintillation cocktail)，孔用Packard TopCount微量培養板閃爍計數器來計數。
或者，化合物可以通過測量它們對基質酪蛋白磷酸化的抑制能力來鑑定。測定可按照下述進行化合物稀釋物和試劑每天新鮮地製備。化合物用DMSO儲備溶液稀釋到兩倍於所需的實驗濃度，保持實驗中最終的DMSO濃度小於或等於l％。TGFp-R1激酶在+DTT緩衝液中稀釋到4倍於所需的實驗濃度。ATP和酪蛋白可在4倍反應緩衝液中稀釋，可以按照50μCi/mL加入伽馬33p-ATP。
根據某可能的實驗設計，所述的實驗可通過把10μl的酶加入到20μl化合物溶液中來進行。反應通過加入10μl酪蛋白/ATP混合物而開始。最終實驗條件包括2.5μM ATP、100μM 酪蛋白、6.4nM TGFβ-R1激酶，以及在20mMTris緩衝液中的1M DTT，pH為7.5。反應在室溫培養45分鐘。反應通過將23μl反應混合物轉移到事先每孔用15μl 0.25M H3PO4潤溼的磷酸纖維素96一孔濾板上而停止。5分鐘之後，孔用75mM H3PO4洗4次以及95％乙醇洗一次。將板乾燥，每孔加入閃爍混合劑，孔用Packard TopCount微量培養板閃爍計數器來計數。化合物抑制酶的能力通過比較化合物存在的情況下與陽性對照(化合物不存在)和陰性對照(酶不存在)得到的計數來確定。
治療方法可以根據本發明治療的惡性神經膠質瘤非限制性地包括，星形細胞瘤、室管膜細胞瘤、少突神經膠質瘤以及混合性惡性膠質瘤，在成人和兒童都可。
最普遍的惡性膠質瘤，星形細胞瘤從腦細胞中開始出現，稱為星形細胞，儘管它們是大腦中最常發現的，但可以在腦的大部分地方發生(偶爾在脊髓中)。星形細胞瘤可以在成人和兒童中發展，但是在成人中更普遍。以腦為基礎的星形細胞瘤在兒童或青年中更普遍。成膠質細胞瘤是星型細胞瘤的特殊地有侵佔形式，也被稱為IV型星型細胞瘤。
室管膜細胞瘤是在室管膜開始出現的腦瘤，細胞順著腦中的通路排列腦脊液在此製備和儲存。它是稀有類型的惡性膠質瘤，能在任何腦的或脊柱的部分發現，但是在大腦中最常發現。室管膜細胞瘤會通過腦脊液從腦蔓延到脊髓。所有年齡的人，包括兒童，能發展室管膜細胞瘤。
少突神經膠質瘤從腦細胞中開始出現，稱為少突神經膠質細胞，它們為傳輸神經衝動的細胞提供支持和營養。這種類型的腫瘤在大腦中正常地被發現，在成人和兒童中都能發展。
混合性惡性膠質瘤是超過一種腦細胞的腦瘤，包括星形細胞、室管膜細胞和/或少突神經膠質細胞。最普遍的對於混合性惡性膠質瘤的位點是大腦，但是，像其它惡性膠質瘤一樣，它們可以蔓延到腦的其它部分。這種類型的腫瘤可以在成人和兒童中發生。
少突神經膠質瘤是相對稀少的、從稱為少突神經膠質細胞的神經膠質細胞發展的的腦瘤。存在少突神經膠質瘤的惡性形式和混合的惡性星形細胞瘤-少突神經膠質細胞瘤，它們的治療都與治療多形性成膠質細胞瘤很相似。
視神經膠質瘤在或靠近眼睛和腦視覺中樞穿梭的神經的地方被發現。它在患有神經纖維瘤病的病人中尤其普遍。
本發明化合物和它們的相關化合物的給藥方式、配製和使用劑量將依賴要治療的惡性膠質瘤的類型和嚴重程度(等級)、要治療的特殊的被治療者、以及專業醫生的判斷；配製將依賴給藥方式。
目前治療成膠質細胞瘤的方法包括外科手術，接著是放射和/或化學治療。
本發明的化合物通過方便的口服給藥，通過把它們和合適的藥物輔料混合以便提供片劑、膠囊、糖漿劑等。用於口服的合適製劑也可能包含次要成分例如緩衝劑、調味劑等。典型地，製劑中活性成分的量會在大約總製劑的5％-95％的範圍，但取決於載體廣泛變化是允許的。合適的載體包括蔗糖、果膠、硬脂酸鎂、乳糖、花生油、橄欖油、水等。
所述的化合物也可以通過注射給藥，包括靜脈的、肌內的、皮下的、關節內的、腹膜內的或顱內的注射。對應這種應用的典型的製劑為等滲載體的液體製劑如Hank’s溶液或Ringer’s溶液。
通常，任何合適的製劑都可使用。在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中發現了本領域熟知製劑的一覽表。在本領域中參考這個手冊是常規的。
本發明化合物的劑量將依賴根據病人不同而改變的許多因素。然而，可以相信的是，通常每天的內服量為0.001-100mg/kg總體重，優選地從0.01-50mg/kg，更優選地大約0.01mg/kg-10mg/kg體重。可是，所述的給藥方案會改變，依賴於要治療的特殊腫瘤、年齡、性別和病人的總體情況、以及專業醫生的判斷。
應當指出，對本發明有用的化合物可作為單獨的活性成分或者是與幾種不同化合物的混合物的形式進行給藥。此外，所述的TGF-β抑制劑可作為單治療劑或與其它治療劑結合。可以與這些化合物有用地結合的藥物包括天然的或合成的皮質激素類，特別是潑尼松和它的衍生物，與神經膠質瘤的發展或前進有關的免疫系統或基因的單克隆抗體靶細胞，以及細胞分裂、蛋白合成、或mRNA轉錄或翻譯的小分子抑制劑，或者免疫細胞分化或激活的抑制劑。
特別是，本發明的化合物能作為治療方案的一部分進行給藥，治療分案包括放射療法、給予其它化學療法的藥劑、免疫療法或甾類激素治療、骨髓移植術、以及其它治療手段，以何種組合和順序由醫師決定。
正如上面的暗示，儘管本發明的化合物可在人類中使用，它們同樣在獸醫治療非人類的哺乳動物時有效。
本發明的更多細節將會在以下非限制性的實施例中顯現。
實施例用TGF-β抑制劑在體內和體外抑制神經膠質瘤的生長在鼠SMA-560和人LN-308神經膠質瘤細胞的生長和免疫原性方面，以及在體內的同源VM/DK小鼠顱內的SMA-560神經膠質瘤的生長和免疫應答方面，研究了TGFβ-R1激酶抑制劑的效果，具體為表II中79號化合物所示的抑制劑的效果。
材料和方法細胞系和試劑79號化合物為由Scios Inc開發的TGFβ-R1激酶抑制劑。植物凝血素(PHA)從Biochrom(柏林，德國)得到。[甲基-3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷從Amersham(Braunschweig，德國)得到。51Cr買自New England Nuclear(波士頓，麻薩諸塞州)。人類重組TGF-β1和TGF-β2從Peprotech(倫敦，英國)得到。鼠IL-2從Peprotech(倫敦，英國)得到。中和全-抗-TGF-β抗體買自RD(Wiesbaden，德國)。人惡性神經膠質瘤細胞系LN-308由N.deTribolet(Centre Hospitalier Universitaire Vaudois，洛桑，瑞士)友情提供。鼠神經膠質瘤細胞系SMA-560是D.D.Bigner(杜克大學醫學中心，達勒姆，北卡羅來納州)作為禮物友情贈送。CCL64水貂肺上皮細胞從美國標準培養收集所(American Type Culture Collection)(Rockville，馬裡蘭州)得到。
細胞培養將神經膠質瘤細胞和CCL64細胞在補充了2mM L-穀氨醯胺(Gibco LifeTechnologies，佩斯利，英國)、10％FCS(Biochrom KG，柏林，德國)和青黴素(100IU/ml)/鏈黴素(100μg/ml)(Gibco)的DMEM中培養。神經膠質瘤細胞的生長和生活力通過結晶紫、LDH釋放(Roche，曼海姆，德國)以及臺盼藍排斥測定法檢測。為了評價集落生成，將500SMA-560細胞接種於6孔板中(9.4cm2)。在明顯可見的細胞群形成之後，集落＞20細胞被計數。
將人PBMC通過密度梯度離心法(Biocoll，Biochrom KG)從健康的供體分離出來。以單核細胞因粘附作用和差速離心作用而減少得到外周血淋巴細胞(PBL)。為得到純化的T細胞，該PBMC細胞用LymphoKwik TTM試劑(OneLambdaInc.，Canoga Park，加利福尼亞)去除B細胞和單核細胞。該種群(population)的純度通過流式細胞儀(Becton Dickinson，海德堡，德國)使用抗人的CD3-PE抗體來檢驗，純度要大於97％。人多克隆NK細胞種群通過在被照射的RPMI8866飼養細胞上將PBL培養10天來得到(Valiante等人，Cel.Immunol.，145187-198(1992))。鼠NK細胞是通過使用DX5單克隆抗體-連接的磁珠和相應的柱系統來正向選擇VM/Dk小鼠的脾細胞製得的(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德國)，此細胞在使用前要用鼠IL-2(5000U/ml)培養至少10天。人多克隆NK細胞、人PBL、人T細胞和鼠NK細胞在補充了15％FCS、2mM L-穀氨醯胺、1mM丙酮酸鈉、50μMβ-巰基乙醇和青黴素(100IU/ml)/鏈黴素(100μg/ml)的RPMI 1640中生長。
TGF-β生物測定生物活性的TGF-β的水平用CCL64生物測定法確定。簡言之，將104CCL64細胞粘附在96孔板上24小時，所有培養基換成無血清培養基，該細胞暴露於用無血清培養基稀釋的TGF-β1/2重組體或神經膠質瘤細胞培養上清液72小時。生長通過在72小時的時候用結晶紫染色來評定。惡性膠質瘤細胞上清液從匯合的培養物中收集，此培養物在無血清培養基中保養48小時並經過加熱處理(5分鐘，85℃)來激活潛伏的TGF-β(Leitlein等人，J.Immunol.，1667238-7243(2001))。
免疫印跡分析磷酸化的Smad2(p-Smad2)蛋白水平通過在12％丙稀醯胺凝膠上每泳道使用20μg蛋白的免疫印跡法來分析。在轉到PVDF膜(Amersham，不倫瑞克，德國)上之後，印記在含有5％脫脂乳和0.05％吐溫20的PBS中阻斷，並加入p-Smad2(2μg/ml)抗體在4℃下培養過夜。蛋白帶的顯像通過使用辣根過氧化物酶-連接的二抗(Sigma)和增強的化學發光(Amersham)來完成。總的Smad2/3水平通過特定的Smad2/3抗體(Becton-Dickinson)來評定。
溶胞作用測定
HLA-A2-錯配的PBL或T細胞(107/25cm2瓶)與106照射的(30Gy)神經膠質瘤細胞共培養5天。神經膠質瘤靶細胞用51Cr(50μCi，90分鐘)標記並與從共培養物中收集的效應物PBL一起以效應物靶細胞(E∶T)100∶1到3∶1的比率共培養(104/孔)。最大的51Cr釋放通過加入NP40(1％)來確定。4小時之後上清液轉移到Luma-PlateTM-96(Packard，Dreieich，德國)並測量。51Cr釋放的百分比通過以下計算100×([實驗性的釋放-自發的釋放]/[最大釋放-自發的釋放])。
細胞因子釋放免疫效應細胞釋放的IL-10、TNF-α和IFN-γ通過Elispot測定法在包被相應的抗人捕獲抗體(Becton Dickinson)的重篩選-HA 96孔板(Millipore，Eschborn，德國)上測定。簡言之，5×104神經膠質瘤細胞與105、2.5×105或5×105 HLA-A2-錯配的、預刺激(5天)的PBL共培養24小時。該細胞用雙蒸水移開，捕獲的細胞因子通過使用生物素化的抗體和鏈親和素-鹼性磷酸酶(Becton Dickinson)來顯像。印記在Elispot讀數系統(AID，Stralβberg，德國)上讀數。類似地，為了測定IFN-γ的釋放，在體外實驗中使用抗鼠捕獲IFN-γ抗體和相應的生物素化的二抗(Becton Dickinson)測定新鮮分離出的脾細胞。
流式細胞術粘附的神經膠質瘤細胞通過使用細胞解離液(Sigma)非酶化的分離。細胞周期的分析通過使用固定的和透化處理的神經膠質瘤細胞(70％乙醇)來進行。RNA用RNase A(Life Technologies，Inc.)消化。DNA用碘化丙錠(50μg/ml)染色。
動物實驗VM/Dk小鼠買自TSE研究中心(伯克郡，英國)。所有實驗使用6-12周齡的小鼠。該實驗根據德國動物保護法執行。7-8隻小鼠的組在所有顱內的操作之前都被麻醉並放在立體定向固定裝置(Stoelting，Wood Dale，IL)上。鑽孔鑽在前囟點側邊2mm的顱骨內。漢密爾頓注射器(漢密爾頓，達姆施塔特，德國)的針頭插入3mm深。重懸浮在2μl體積的PBS中的五×103SMA-560細胞(Serano等人，Acta Neuropathol.，5153-64(1980))被注射到正確的層中。三天之後，允許小鼠飲用以1mg/ml溶解在去離子水中的79號化合物。每天小鼠觀察，在存活的實驗中，當產生神經症狀時處死，或者如其它實驗中的指示處死。
體外免疫效應測定具有神經膠質瘤的小鼠在注射瘤細胞10天後處死。脾細胞被分離出並在24小時之內進行上述的IFN-γElispot測定。之後，這些細胞用IL-2(5000U/ml)刺激10天來產生在51Cr釋放測定中對抗SMA-560神經膠質瘤細胞的LAK細胞作為靶細胞。
統計學分析本實驗通常至少進行3遍，得到類似的結果。顯著性通過Student’s t-檢驗。P值衍生自雙側的t-檢驗。
結果79號化合物是體外的TGF-β1和TGF-β2的抑制劑CCL64水貂肺上皮細胞對人TGF-β1和TGF-β2的生長抑制效應在EC50濃度0.5ng/ml時敏感。TGF-β重組體和包含TGF-β的惡性膠質瘤細胞上清液的抑制效應被特定的TGF-β抗體消除(Leitlein等人，J.Immunol.1667238-7243(2001)，數據沒有列出)。在這裡使用CCL64生物測定來證實79號化合物拮抗TGF-β的屬性。79號化合物以濃度依賴的方式拯救了TGF-β1或TGF-β2(10ng/ml)介導的生長抑制，EC50濃度在0.03μM範圍內(圖1A)。類似地，稀釋的無血清SMA-560或LN-308神經膠質瘤細胞上清液介導的生長抑制作用被同樣濃度的79號化合物消除了(圖1B)。
79號化合物消除了惡性膠質瘤細胞中的TGF-β依賴的信號轉導然後，在體外檢測79號化合物對鼠和人神經膠質瘤細胞的生物學效應。在CCL64生物測定中阻斷TGF-β介導的生長抑制作用需要的濃度對任何細胞系的增殖都沒有作用。然而，達到1μM的較高濃度則適度地抑制了兩種細胞系的生長(圖2A)。生長的抑制與受損的增殖有關，但是不是實際的細胞死亡，因為LDH釋放和臺盼蘭染料排斥測定都沒顯示出濃度達到1μM的79號化合物作用72小時對惡性膠質瘤細胞的細胞毒性效應。以0.01、0.1或1μM與79號化合物接觸48小時後進行的流式細胞周期分析在兩個細胞系中都沒顯示出特別的細胞周期停滯(數據沒有列出)。而且，79號化合物沒有調節去除血清之後神經膠質瘤細胞的生活力(數據沒有列出)。可是，內源的或外源的TGF-β信號轉導的抑制則通過證明79號化合物幹擾了Smad2磷酸化而沒有改變總細胞Smad2/3的水平被證實(圖2B)。注意的是，在未處理的神經膠質瘤細胞中pSmad的磷酸化幾乎不能被探測到，但是這種信號也被79號化合物消除了。
79號化合物增強了對體外神經膠質瘤細胞異源性免疫反應以下系列的實驗設計是為了檢測79號化合物是否恢復了對培養的人神經膠質瘤細胞的異源性免疫反應。當HLA-A2-錯配的PBL或純化的T細胞與照射的神經膠質瘤細胞在79號化合物存在或不存在的情況下共培養，在4小時後的51Cr釋放測定中它們的溶胞活性因為預接觸79號化合物而明顯地增強了(圖3A)。在使用中和TGF-β抗體時得到同樣的效果(10μg/ml，每隔兩天加入)(數據沒有列出)。當在惡性膠質瘤細胞存在的情況下進行處理(priming)時，由HLA-錯配的PBL導致的IFN-γ釋放被強烈地抑制。79號化合物使IFN-γ的釋放恢復到與在沒有LN-308細胞時PBL預培養的水平相當(圖3B)。對於TNF-α也得到類似的結果(圖3C)。相反的，在與LN-308細胞共培養後刺激了IL-10的釋放，並且79號化合物通過從未受刺激的和神經膠質瘤細胞-預處理的(primed)培養物產生的免疫效應細胞減少了IL-10的釋放(圖3D)。
對抗多克隆NK細胞LN-308靶點的溶胞活性被外源性TGF-β強烈地抑制了，而且TGF-β介導的抑制被79號化合物減輕(圖3E)。類似地，LN-308細胞上清液抑制NK細胞活性，這種抑制同樣被79號化合物(圖3F)或中和TGF-β抗體(數據沒有列出)阻斷。
79號化合物延長了顱內實驗中具有神經膠質瘤的同源SMA-560小鼠的存活時間通過喝水給藥(1mg/ml)的79號化合物的療效在同源SMA-560小鼠神經膠質瘤模型中測定(Friese等，2003)。在79號化合物處理的小鼠中，神經學上病症發展被延遲了(數據沒有列出)，與載體處理的(vehicle-treated)動物的18.6±2.1天(中值18)相比較，平均存活時間延長到25.1±6.5天(中值23)(圖4)(p＝0.004，t-檢驗)。30天時79號化合物處理的動物的存活率為29％，而對照動物為0％。
79號化合物在體內對SMA-560神經膠質瘤細胞的免疫反應的調節用於檢測IFN-γ釋放的Elispot測定法顯示，其中IFN-γ釋放是由在開始用79號化合物治療的第7天收集的脾細胞釋放的，在79號化合物處理的動物中有超過五分之三背景值(backgound)的增長，而在對照動物中只有五分之一(圖4B)。而且，產生自79號化合物處理動物脾細胞的LAK細胞顯示出增強的對抗SMA-560目標的溶胞活性(圖4C)。
討論拮抗TGF-β的生物學效應已經成為對抗不同類型癌症包括神經膠質瘤的主要策略之一。目前對於抗TGF-β的策略理論包括它在遷移和侵襲(Wick等人，J.Neurosci.213360-3368(2001))、轉移(Yang等人，J.Clin.Invest.，1091607-1615(2002))以及腫瘤有關的免疫抑制(Weller和Fontana，Brain Res.Rev.，21128-151(1995)；Gorelik和Flavelli，Nat.Rev.Immunol.，246-53(2002))中的公認的角色。到目前為止，在實驗性的惡性膠質瘤中評估的所有基於TGF-β的治療方法，當將它們應用到臨床時都顯示出局限性。反義寡核苷酸當被傳遞到所需的作用部位就引起嚴重的問題。同樣問題發生在基因治療策略例如核心蛋白聚糖基因的應用中(Stnder等人，Gene Ther.，51187-1194(1998))。針對限制TGF-β生物活性的弗林蛋白酶類(furin-like)蛋白酶以TGF-β加工水平的抑制作用(Leitlein等人，J.Immunol.1667238-7243(2001))目前可能不會達到可接受的特異性，因為很多不同種類的分子需要通過這些酶來加工(Thomas，G.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.3753-766(2002))。更大的特異性會由使用可溶的TGF-β受體碎片而產生，該TGF-β受體碎片在到達靶細胞群之前的作用是清除生物活性的TGF-β(Yang等人，上述的；Muraoka等人，J.Clin.Invest.1091551-1559(2002))。在理論中這種效果應該通過特殊小分子而被模擬，該小分子是被設計為以細胞內信號轉導的水平保護細胞免於TGF-β作用的小分子。
一類這樣候選藥劑79號化合物的活性的特徵為，在體內和體外對抗鼠和人神經膠質瘤細胞。選擇人LN-308細胞的原因在於它們是顯著合成TGF-β的模範(Fontana等人，上述的；Leitlein等人，上述的)。從同源的VM/Dk小鼠移植的SMA-560細胞對齧齒動物神經膠質瘤的免疫治療是最好的模型(Serano等人，Acta Neuropathol.，5153-64(1980))。實驗證明了79號化合物在CCL64水貂肺上皮細胞實驗中是有效的TGF-β1和TGF-β2的拮抗劑(圖1A)以及消除了神經膠質瘤細胞SN對這些細胞生長的抑制作用(圖1B)。79號化合物對惡性膠質瘤細胞不是細胞毒素，只是在較高濃度適度地抑制增殖(圖2A)。在這點上，對於SMA-560細胞的TGF-β負增長的調節效果還沒有被證實(Ashley等人，Cancer Res.，15302-309(1998))。Smad2的磷酸化按照對79號化合物敏感的方式被TGF-β迅速誘導(圖2B)，表明在神經膠質瘤細胞中TGF-β信號傳遞沒有被真正地廢除，但是在調節神經膠質瘤細胞增殖方面可能不會起作用了。而且，對79號化合物處理的神經膠質瘤細胞中的TGF-β分泌的自分泌和旁分泌的拮抗作用，預示79號化合物類似的因子也可能是神經膠質瘤細胞遷移和侵襲的有效抑制劑(Wick等人，J.Neurosci.，213360-3368(2001))。
然後該工作集中在79號化合物的所需要的免疫調節作用，這種作用能導致增強的神經膠質瘤細胞的免疫原性，最終導致減少TGF-β生物活性。當在79號化合物存在下用神經膠質瘤細胞先刺激時，人PBL和純化的T細胞發展出增強的對LN-308神經膠質瘤靶細胞的溶胞活性(圖3A)。這與在79號化合物處理的細胞中增強了促炎症反應細胞因子如IFN-γ和IFN-α的釋放和減少了免疫抑制細胞因子IL-10的釋放是類似的(圖3B-D)。類似地，79號化合物恢復了多克隆NK細胞培養物與TGF-β1或LN-308SN共培養的溶胞活性(圖3E-F)。
79號化合物顯著地延長了SMA-560具神經膠質瘤小鼠的生存中值(圖4A)。沒有達到劑量限制性毒性，但是由於相對低的溶解度而不能通過飲水給予更高的劑量因為79號化合物，暗示著79號化合物或相關因子在此惡性膠質瘤模型中的治療效果可能還會被促進。在不受到特殊理論或機理限制的情況下，79號化合物的治療效果可能通過抑制神經膠質瘤細胞遷移和侵襲(Wick等人，上述的)或促進抗惡性膠質瘤免疫反應來介導(Weller和Fontana，上述的)。為支持後面，由79號化合物處理的、經受惡性膠質瘤的小鼠得到的脾細胞的體外分析顯示出了在培養10天之後都不消失的增強的IFN-γ釋放和增強的LAK活性(圖4B，C)。
本數據有力的提出79號化合物或相關分子在治療惡性膠質瘤中的角色。這樣使用TGF-βR1拮抗劑的影響全身的治療與當地的治療方法結合將會很好的限制TGF-β如TGF-β反義寡核苷酸的生物利用度。
貫串說明書的所有引用的參考在此明確地引入作為參考。儘管本發明已經根據它的特別實施方案描述了，但是它應該被本領域技術人員所理解，可以有各種改變且等價物可以被代替只要不違背本發明的真正實質和範圍。此外，可以進行許多修改來適應特殊的情形、物質、各種事情、處理過程等。所有這類修改都在關於這個權利要求的範圍之內。
權利要求
1.一種在哺乳動物受試者中治療惡性神經膠質瘤的方法，包含向該受試者給予治療有效量的特異性地與TGFβ-R1激酶受體結合的分子。
2.權利要求1的方法，其中所述的神經膠質瘤選自星形細胞瘤、室管膜瘤、少突神經膠質瘤、混合性惡性膠質瘤、少突神經膠質瘤和視神經膠質瘤。
3.權利要求2的方法，其中所述的神經膠質瘤為星形細胞瘤。
4.權利要求3的方法，其中所述的神經細胞瘤為神經膠質成肌細胞瘤。
5.權利要求1的方法，其中所述的哺乳動物為人。
6.權利要求5的方法，其中所述的人為成人。
7.權利要求6的方法，其中所述的人為兒童。
8.權利要求1的方法，其中所述的分子為非肽小分子。
9.權利要求1的方法，其中所述的分子還抑制p38激酶介導的生物學活性。
10.權利要求1的方法，其中所述的分子優選地抑制與p38激酶介導的生物學活性有關的TGF-β-R1激酶介導的生物學活性。及其可藥用鹽和前藥形式， 其中R3為無幹擾取代基；每個Z為CR2或N，其中環A中不超過兩個Z位置為N，以及其中環A中兩個相鄰的Z位置不能為N；每個R2獨立地為無幹擾取代基；L為連接基；n為0或1；以及Ar為任選地被1-3個無幹擾取代基取代的環脂肪族、環雜脂肪族、芳香或雜芳香的基團，或其可藥用鹽或前藥形式。
12.權利要求11的方法，其中所述的化合物為喹唑啉衍生物。
13.權利要求11的方法，其中Z3為N；以及Z5-Z8為CR2。
14.權利要求11的方法，其中Z3為N；以及Z5-Z8中至少一個為氮。
15.權利要求11的方法，其中R3為任選取代的苯基。
16.權利要求11的方法，其中R3選自2-、4-、5-、2，4-和2，5-取代的苯基。烷氧基(1-6C)或滷素。
18.權利要求11的方法，其中所述式(1)化合物為[4-(3-甲基)-吡啶基]-6-氯代-2-氟苯基-吡啶，或其可藥用鹽或前藥形式。
19.權利要求1的方法，其中所述分子為式(4)的化合物或者其可藥用鹽或前藥形式， 其中，Ar代表含有5-12員的任選取代的芳基或任選取代的雜芳基，其中雜芳基包含一個或多個O、S和/或N，並且其條件是所述任選取代的Ar不為 其中R5為H、烷基(1-6C)，鏈烯基(2-6C)、炔基(2-6)和含有5-11員的芳香或雜芳香的基團；X為NR1、O、或S；R1為H、烷基(1-8C)，鏈烯基(2-8C)、或炔基(2-8C)；Z代表N或CR4；每個R2獨立地為無幹擾取代基；以及n為0、1、2、3、4或5。
20.權利要求19的方法，其中如果n＞2，並且R2是相鄰的，它們可以連在一起形成5至7員的非芳香的、雜芳香的或芳香的環，該環包含1至3個雜原子，其中每個雜原子可以獨立地是O、N或S。
21.權利要求1的方法，其中所述分子為式(5)的化合物或者其可藥用鹽或前藥形式 其中，每個Z5、Z6、Z7和Z8為N或CH，以及其中Z5、Z6、Z7和Z8中的一個或兩個是N，兩個相鄰的Z位置不能是N；m和n獨立地是0-3；R1為滷素、烷基、烷氧基或滷代烷基，其中兩個相鄰的R1基團可以連接起來形成5-6員的雜環；R2是無幹擾取代基；R3是H或CH3。惡性神經膠質瘤，包括使包含所述基因的細胞與TGF-β的非肽小分子抑制劑相接觸，該抑制劑特異性地與該細胞中存在的TGFβ-R1受體激酶結合。
23.權利要求22的方法，其中所述的細胞與成膠質細胞瘤有關。
24.權利要求22的方法，其中所述的基因在該細胞中過表達。
25.權利要求22的方法，其中所述的基因在該細胞中表達不足。
26.權利要求22的方法，其中所述的抑制劑逆轉了TGF-β介導的對兩種或更多種基因表達的作用。
27.權利要求22的方法，其中所述抑制劑逆轉了TGF-β介導的對與成膠質細胞瘤有關的多種基因表達的作用。
28.權利要求22的方法，其中所述的基因選自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βRI、TGF-βRII、Smad2、Smad3、Smad4、IL-10、CD95、IL-6、I1-1、IGF-1、VEGF、MMP、COX-2、TIPM、PAI-1、TNFa、IL-11、EG和FGF。
29.權利要求22的方法，其中所述的抑制劑還阻斷了Smad蛋白、p38和TAK1介導的生物學活性。
全文摘要
本發明涉及通過在TGF－β信號通路給予TGF－β抑制劑治療惡性神經膠質瘤的方法，包含優選地與I型TGF－β受體(TGFβ－R1)結合的分子。優選地，所述抑制劑是非肽小分子，包括喹唑啉衍生物。本發明也涉及逆轉TGF－β－介導的對膠質瘤細胞的作用效果，使它們對信號和其它免疫細胞折射更小，包括使體內或體外的膠質瘤細胞或組織與TGF－β抑制劑相接觸。
文檔編號A61K31/519GK1921864SQ200480042094
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月22日 優先權日2003年12月24日
發明者麥可·韋勒, 桑迪普·達加, 琳達·S·希金斯, 戴維·Y·劉, 喬治·F·施賴納, 薩瓦吉特·查克拉瓦蒂 申請人:西奧斯公司