傳輸物質穿過血腦屏障的人工低密度脂蛋白載體的製作方法

2023-08-08 20:58:16

專利名稱：：傳輸物質穿過血腦屏障的人工低密度脂蛋白載體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及人工低密度脂蛋白(LDL)顆粒有效地耙向並傳遞物質穿過血腦屏障(BBB)的用途。本發明進一步提供用於預防和治療各種腦疾病的人工LDL顆粒組合物，方法和試劑盒。
背景技術：
：血腦屏障(BBB)能有效保護腦免受循環毒素的影響，但是也在諸如阿爾茨酶默病，帕金森氏病和腦癌和腦疾病的藥理治療中產生許多困難。大部分帶電分子和大部分超過700道爾頓的分子不能穿過屏障，而較小的分子可在肝中結合。這些因素在腦和中樞神經系統(CNS)疾病如阿爾茨海默病、帕金森氏病、細菌和病毒感染與癌症的藥理治療中產生許多困難。治療腦和CNS疾病和障礙的許多治療劑的親水性足以阻礙直接傳輸穿過BBB。而且，這些藥物和試劑易於在血液和周圍組織中降解，必須增加劑量以達到治療有效血清濃度。本發明提供的方法是通過將治療劑封裝在人工低密度脂蛋白顆粒(LDL)中，傳遞治療劑到BBB。本發明的LDL有助於通過胞吞轉運用傳輸治療劑穿過BBB。由於大部分太親水性而無法穿過BBB的藥物和治療劑也太親水性而無法摻入LDL顆粒中，本發明提供產生治療劑與LDL組分的共軛物的方法，促使其摻入LDL顆粒中，傳輸穿過BBB並隨後將治療劑釋放在細胞中。傳送藥物穿過BBB的先有方法一般包括三種(1)基於脂質體的方法，其中治療劑被封裝在載體內；(2)基於合成聚合物的方法，其中顆粒是使用合成聚合物形成的，以獲得精確限定的尺寸特徵；和(3)使載體與藥物直接結合，其中治療劑與載體如胰島素共價結合。A.脂質體脂質體是在水溶液中超聲處理磷脂時自發形成的小顆粒，由成形為包圍水相環境的中空球的對稱脂雙層組成。以此作為傳輸水溶性藥物通過細胞膜的方法是有吸引力的，因為磷脂可以在質膜中吸收，能將脂質體的內含物自動釋放入細胞液中。該技術更成功的變化包括使用陽離子脂質，能在膜中協同形成納米孔。陽離子脂質廣泛用於細胞培養，在實驗培養細胞中引入水溶性物質如DNA分子。因為脂質體的承載力大，所以對於傳輸藥物穿過BBB是有吸引力的。但是脂質體通常太大而無法有效地通過BBB，本來是不穩定的，其構成的脂質會被血漿中的脂結合蛋白質吸收而逐漸損失。比如，在一些研究中，所用大尺寸脂質體產生給出腦攝取的假像的微型栓塞。在一些研究中，與Polysorbate80共注射的脂質體作為穩定劑，Polysorbate80是能破壞BBB的清潔劑。在這些研究中，Polysorbate80對BBB的破壞作用是任何觀察到傳輸穿過BBB的原因。因此，脂質體作為傳輸藥物穿過BBB的載體具有變化多端的歷史。多次試圖將脂質體導向特定細胞目標。使用BBB的靶內源性受體的肽模擬物單克隆抗體(mAb)將加入聚乙二醇的免疫脂質體靶向各種BBB受體，目的是獲得受體介導的攝取。但是，這種方法還需要單克隆抗體昂貴的生產、測試成本，和政府的批准。因為mAb通常是在小鼠中產生的，易於降解，引入肽模擬物單克隆抗體不僅面臨顯著的管理障礙，而且證明難以用於病人環境。例如，免疫脂質體的構建過程中涉及將單克隆抗體(mAb)共價附著於脂質體表面上。由於這些免疫脂質體立刻被血漿蛋白質包被，觸發被網狀內皮系統(RES)攝取，該系統迅速破壞單克隆抗體(mAb)-共軛的脂質體，已經在稱為加入聚乙二醇的過程中用聚乙二醇(PEG)處理免疫脂質體。不幸的是，PEG分子幹擾mAb，由於空間幹擾而使其非特異性。Huwyler等(1996)Proc.Nat'1.Acad.SciUSA93:14164-14169通過形成在PEG尾端具有馬來醯亞胺部分的免疫脂質體避免了這個問題，該免疫脂質體可以與硫醇鹽化mAb共軛。製備的這些加入聚乙二醇的0X26免疫脂質體內部具有柔紅黴素，顯示在血漿中比游離治療劑或簡單、未加入聚乙二醇的脂質體更穩定。但是共焦顯微鏡方法表明，雖然脂質體被胞吞入鼠腦毛細管中，但是它們並未到達腦細胞，且仍附著於內皮細胞。因此，加入聚乙二醇的和馬來醯亞胺處理的脂質體作為藥物傳遞載體似乎相對無效。1997年，Dehouck等人發現，結合ApoE的LDL受體參與LDL的胞吞轉運穿過BBB。在一系列的三篇出版物中，Versluis等人描述了ApoE富集的脂質體用來傳遞柔紅黴素至小鼠中的癌細胞。選擇ApoE作為LDL-受體靶向蛋白質是基於以下發現，即腫瘤細胞在其膜上表達高水平的LDL受體。Versluis等(1998)也提出使用天然LDL，但是並未對此進行試驗，隨後的論文只是集中於ApoE富集的脂質體上。Versluis等(1999)研究了柔紅黴素的組織分布，但是沒有有關腦攝取的數據，表明並未設想將此方法作為傳輸道柔紅素穿過BBB的途徑。另外，Versluis等人使用的共軛化學不同於本發明。為了將藥物固定在脂質體膜上，作者使3a-0-(油醯基)-4(5-膽甾烷酸(石膽酸的酯)與四肽Ala-Leu-Ala-Leu偶聯，然後與親水性抗腫瘤劑柔紅黴素共價連接。從而用共軛的非游離柔紅黴素治療腫瘤。雖然石膽酸是已經含有可激活酸基的類固醇，但是酸基位於類固醇側鏈而非3-0H部位，導致反應產物的性質不夠理想。游離柔紅黴素可以只在被強酸性溶酶體中的蛋白酶儲備裂解之後產生，會使共軛部分或試劑暴露在蛋白酶，酸和其他水解酶的降解作用中。然後治療劑會釋放入溶酶體內空間中，在那裡可發生進一步降解並被排出細胞中排出。相反，本發明的共軛化學優選通過酯鍵結合治療劑，酯鍵容易在細胞液中切割，從而避免了Versluis等人的方法所需要的苛刻溶酶體條件。因此，本發明的共軛治療劑更可能保持流動到其靶，在靶處以有效方式釋放。也比脂質體更可能被傳輸穿過BBB。Versluis等人的方法也需要大量固相肽化學步驟來合成四肽，以及若干附加步驟使其與FM0C共軛並使共軛物與石膽酸反應，最終與藥物反應。本發明使用少得多的步驟，每個步驟都產生幾乎定量的產率。因此本發明還提供改進的效率並降低成本。目前的臨床應用中以阿黴素的其他脂質體製劑作為癌症的可能治療；但是並沒有推廣使用LDL的產品。Deneule等人發現黑素轉鐵蛋白(p97)通過胞吞轉動被傳輸穿過BBB，可得出涉及LDL受體的結論，建議使用該蛋白質作為藥物傳遞體系。B.合成聚合物還嘗試過塗有Polysorbate80的合成聚合物如聚(氰基丙烯酸丁酯)或聚丙烯醯胺。這些聚合物是有吸引力的，因為顆粒的親水性足以使其變得水溶性，但又能長時間保持其結構形態，從而保護治療劑免於攝取入肝和腎中，在那裡發生自然解毒過程。在兩種情況下，通常假設攝取是由通過細胞膜的被動擴散發生的，或者被塗布有網格蛋白的囊泡防禦性攝取。在前一種情況下，治療劑然後被截留在內皮細胞中，不比以前更接近耙，而在後一種情況下，治療劑被傳輸至溶酶體，這是細胞中的強酸性區室，其中含有蛋白酶和類似於胃內容物的其他消化酶。因此，在後一種情況中，治療劑必須能在更極端的條件下保持穩定。在這兩種情況下，所載藥物都沒有穿過細胞並注入腦實質中，這不是理想的結果。因此，不覺驚奇的是，這兩種方法都沒有獲得多大的臨床應用。研究人員們嘗試了上述方法的各種改進，以提高穿過BBB的載體攝取，但成功甚微。例如，Kreuter等(2002)J.DrugTarget10(4):317-25設計了使含有多種載脂蛋白的合成顆粒結合位於BBB上的載脂蛋白受體。他們證明了與聚(氰基丙烯酸丁酯)納米粒結鍵合的藥物傳輸，並用Polysorbate80塗布。攝取要求用Polysorbate80，ApoE或ApoB塗布。載脂蛋白AII，CII和J塗層不起作用。但是由於這些納米粒不是天然產生的，所以它們可具有不利的副作用。丙烯酸酯聚合物對於引發自身免疫反應是特別眾所周知的；通常使用化學相關的聚合物聚(丙烯醯胺)作為助劑。Alyaudin等(2001)J.DrugTarget9(3):209-21用夕卜塗有Polysorbate80的聚(氰基丙烯酸丁酯)納米粒傳送[3H]-dalargin穿過BBB，估計該過程是胞吞之一，接著可能是胞吞轉運。這種聚合物也具有免疫併發症。C.治療劑共軛物還嘗試了藥劑與可傳送穿過BBB的物質如胰島素的直接共軛。已知胰島素和胰島素樣生長因子通過專門的促進擴散體系穿過血腦屏障(Reinhard等(1994)Endocrinology135(5):1753-1761)。胰島素通過由內皮胰島素受體介導的胞吞轉動被攝取(Pardridge等(1986)Ann.Intern.Med.105(1):82-95)。葡萄糖和大胺基酸如色氨酸也存在特異性轉動。但是，已經證明胰島素轉動子的特異性太高，無法允許藥劑與胰島素共價結合而穿入腦中。用葡萄糖和胺基酸共軛物也得到類似結果，觀察到攝取遵守與其他低分子量物質相同的一般原則，只有低於700Da的未帶電分子才能明顯地進入腦中。不方便設計化學合成生物分子的共軛形式，產生出乎意料的毒性效應的危險，以及完全新穎化合物可能需要獲得FDA的批准，這減弱了對這種方法的熱情。傳輸載體，如陽離子化的白蛋白，或運鐵蛋白受體的0X26單克隆抗體分別發生通過BBB的吸收性介導和受體介導的胞吞轉動。已用來傳輸少量藥物。這種方法具有高開支和難以產生單克隆抗體與陽離子化白蛋白的缺點，不適用於其他類型的分子。同樣地，陽離子化蛋白質由於其免疫原性和形成沉積在腎中的免疫複合物，而顯示出毒性。Wu等(2002)J.DrugTarget10(3):239-45證明了使用由鏈毒抗生物素蛋白(SA)和大運鼠鐵蛋白受體的鼠0X26單克隆抗體的共軛物，以及與載體(稱為bio-bFGF/0X26-SA)結合的生物素醯化bFGF(bio-bFGF)的共軛物組成的藥物傳遞載體，將一種蛋白質神經保護劑-人鹼性成纖細胞生長因子(bFGF)傳輸穿過BBB。雖然他們證明[125I]標記的bio-bFGF被大量攝取入周圍器官中，但是每克腦只攝取0.01%的注射劑量。而且，此方法需要藥物的共價修飾，可能只對有限種類的藥物有用。載體還包括作為一種組分的小鼠單克隆抗體，會在病人中引起免疫反應。Kang等(2000)J.DrugTarget8(6):425-34還使用抗生物素蛋白-生物素連接的嵌合肽來傳輸肽穿過BBB，但是只達到每克組織攝取0.12%注射劑量。Kang和Pardridge(Pharm.Res.il:1257-1264)將陽離子化人血清白蛋白與中性輕抗生物素蛋白共軛，然後使其與放射性標記的生物素結合。生物素/cHSA/NLA複合體在血液中穩定達24小時，但是共軛物在腦中選擇性地降解，以釋放游離生物素。如上所述，已顯示陽離子化蛋白質因為其免疫原性而具有毒性。還已使用陽離子化的單克隆抗體(mAb)。Pardridge(J.Neurochem.70:1781-2)用共焦顯微鏡證明只有在蛋白質陽離子化之後，天然人源化的4D5MAb才通過吸收性介導的胞吞轉運穿過BBB。但是，此方法具有生產和化學修飾單克隆抗體的高開支的缺點，且不適用於其他類型的分子。Witt等(2000)J.Pharmacol.Exp.Ther.295(3):972-8用胰島素傳輸S-阿片樣受體選擇性肽D-青黴胺(DPDPE)穿過BBB，這是一種蛋氨酸-腦腓肽類似物。但是胰島素產生許多危害，從而限制其用作一種治療對策。而且，其他研究者發現胰島素受體是非常選擇性的。因此，除了生產嵌合的困難之外，這種方法局限於狹窄的藥劑種類。其他研究者試圖使藥物與葡萄糖共軛，例如使用糖肽。但是證明通過BBBGlutl糖載體蛋白轉運子不能明顯傳輸任何糖肽。使試圖用載體介導的轉運子如Glutl葡萄糖轉運子，膽鹼轉過子或LAT1大胺基酸轉運子的等高傳輸率失敗的問題是，載體轉運子的選擇性太高不能接受共軛的基質。問題還在於，作為多藥抗性基因一員的P-糖蛋白迅速作用以主動地從腦中除去許多小分子，包括設法穿過屏障的藥物。除了LDL受體之外，BBB還包含結合具有高親和性的LDL的II型清除受體(SR)。清除受體與LDL的修飾形式如乙醯化LDL特別有效。與SR的結合僅導致胞吞，而不是理想的胞吞轉動。Rigotti等(1995)J.Biol.Chem.270:16221-4發現乙醯化LDL不傳輸穿過BBB，而陽離子化牛IgG更有效，如Bickel等(1993)Adv.Drug.Del.Rev.10:205-245中所述。證明乙醯化LDL胞吞噬轉動的失敗阻止許多研究者對LDL實驗作進一步嘗試。Protter等(WO87/02061)描述了一種藥物傳遞體系，使用來源於載脂蛋白如ApoE和ApoB，與藥劑或含試劑的載體共價結合。但是，使用分子共軛物只局限於少量藥物種類，且產生許多與上述相同的問題。Mller等(美國專利6288040)描述了與ApoE分子共價結合的合成聚(氰基丙烯酸丁酯)顆粒的用途。通過表面活性劑或者共價結合親水性聚合物進一步修飾顆粒表面。如上所述，因為這些顆粒不是天然產生的，所以它們具有各種不利的副作用。Samain等(WO92/21330)描述了合成顆粒載體的用途，載體含與固態親水性核共價結合的脂質，還含有ApoB，用於傳遞物質至腫瘤或巨噬細胞。但是他們並沒有公開將這種載體用於傳遞藥物穿過BBB的任何實用性。發明概述本發明涉及人工低密度脂蛋白(LDL)顆粒靶向和傳遞物質穿過血腦屏障進入腦中的用途。本發明的另一個目的是合成結構穩定，非免疫原性，能防止多種藥物發生降解、滅活、水解、共軛和被攝入非靶組織的LDL載體。本發明提供了用作治療劑載體的LDL顆粒，以及將這種藥物和試劑傳遞穿過BBB的的改進方法，如與前述方法相比。例如與脂質體不同的是，LDL顆粒是固態顆粒，因此具有大於脂質體的結構穩定性。本發明進一步的目的是提供預防和治療多種腦疾病的包含LDL載體的組合物、方法和試劑盒。本發明提供的方法是，使親水性治療劑與膽甾醇共軛，以促進共軛的治療劑摻入本發明的人工LDL顆粒中。在優選實施例中，本發明提供了膽甾醇-共軛的阿黴素和四環素。這些過程和製得的膽甾醇共軛物以及這種共軛物的組合物用於提供能通過胞吞轉動傳送治療劑穿過血腦屏障的LDL顆粒，這是一種受體介導的過程，在腦毛細管內皮細胞中操作，作為向腦中輸入膽甾醇和必需脂肪酸的途徑，便於並改善治療腦和CNS的各種疾病與障礙。另外，本發明的膽甾醇共軛物用於傳遞相應的治療劑穿過BBB，無需將共軛物摻入本發明的LDL顆粒中。在優選實施例中，本發明的膽甾醇共軛物通過酯鍵結合，通過普遍存在的內源酯酶的作用，從共軛物中釋放治療劑。將本發明的膽留醇共軛物摻雜入本發明的LD顆粒中能保護膽甾醇共軛物免受這些酯酶的水解。本發明進一步提供了包含蛋黃磷脂醯膽鹼(EYPC)，油酸膽甾醇酯和載脂蛋白E3(ApoE3)的人工LDL顆粒。形成固態顆粒的組成脂類包含三個層由膽甾醇，膽甾醇酯和活性劑組成的固態脂質核心；由磷脂醯膽鹼的脂肪酸鏈的混合物組成的中間界面層；和由磷脂頭基和ApoE3組成的表面層。本發明的LDL顆粒顯著提高活性劑靶向毛細管內皮細胞並通過胞吞轉動便於傳輸穿過血腦連接。包圍治療劑的蛋白質和磷脂組分還起到保護治療劑免受降解和攝入非靶細胞中的作用。本發明還涉及根據人工LDL顆粒輔助的試劑傳輸治療疾病和症狀的方法。例如，本發明為治療各種腦疾病提供藥物組合物和方法，包括使用本發明的人工LDL顆粒將特定試劑耙向腦組織。本發明提供的人工LDL顆粒包含外部磷脂單層和固態脂質核心，其特徵在於外部磷脂單層包含至少一種載脂蛋白，固態脂質核心包含至少一種治療劑。在實施例中，至少一種載脂蛋白選自ApoA，ApoB，ApoC，ApoD或ApoE，或一種載脂蛋白的異構體，或脂蛋白和/或異構體的組合。在優選實施例中，至少一種載脂蛋白是ApoE。在更優選的實施例中，至少一種載脂蛋白選自ApoE2，ApoE3和ApoE4。本發明還涉及進一步包含其他耙向分子或試劑的人工LDL顆粒，這些其他靶向分子或試劑能增強LDL複合物向腦組織的靶向傳遞。在最優選的實施例中，至少一種載脂蛋白是ApoE3，單獨使用或者與一種或多種氧甾醇和/或其他選自ApoB和ApoE4的載脂蛋白聯合使用。本發明提供的人工LDL顆粒用於傳輸治療劑穿過血腦屏障。在優選實施例中，至少一種治療劑選自胺基酸，肽，蛋白質，碳水化合物和脂類。在另一個實施例中，至少一種治療劑是膽甾醇與選自胺基酸，肽，蛋白質，碳水化合物和脂類的試劑之間形成的共軛物。在優選實施例中，至少一種治療劑選自神經營養因子，生長因子，酶，神經遞質，神經調質，抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑和化學治療劑。人工LDL顆粒的外部磷脂單層可包含任何磷脂或磷脂的組合，包括但並不限於磷脂酸，磷脂醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯丙三醇等。在優選實施例中，外部磷脂單層包含磷脂醯膽鹼和至少一種載脂蛋白。本發明的人工LDL顆粒優選具有約15到50納米的直徑。在更優選的實施例中，人工LDL顆粒具有約20到30納米的直徑。本發明人工LDL顆粒優選具有約1.00到1.07克/毫升的密度。在更優選的實施例中，人工LDL顆粒具有約1.02到1.06克/毫升的密度。而且，本發明的人工LDL顆粒具有至少2小時的血清穩定性。本發明提供的人工LDL顆粒能通過胞吞轉運用傳輸穿過BBB。在優選實施例中，腦對本發明顆粒的攝取專一性至少比肝大3倍。本發明人工LDL顆粒的固態脂質核心可包含一種或多種脂類，包括但並不限於三醯甘油，膽甾醇，膽甾醇酯，脂肪醯酯等。在優選實施例中，固態脂質核心包含膽甾醇酯，其中膽甾醇被飽和脂肪酸酯化，包括但並不限於豆蔻酸酯，棕櫚酸酯，硬脂酸酯，花生酸酯，木蠟酸酯等，或不飽和脂肪酸，包括但並不限於棕櫚油酸酯，油酸酯，異油酸酯，亞油酸酯，亞麻酸酯，花生四烯酸酯等。在更優選的實施例中，固態脂質核心包含膽甾醇酯，油酸膽甾醇酯。在優選實施例中，本發明人工LDL顆粒的固態脂質核心包含至少一種治療劑，是膽甾醇和阿黴素或四環素之間形成的共軛物。在優選實施例中，共軛物的膽甾醇和治療劑通過酯鍵連接。本發明還提供了用於傳遞治療劑穿過血腦屏障的組合物，該組合物包含本發明的人工LDL顆粒和藥學上可接受載體。本發明還提供了一種共軛物，它包含與選自胺基酸，肽，蛋白質，碳水化合物和脂類的治療劑連接的膽甾醇。在優選實施例中，治療劑選自神經營養因子，生長因子，酶，神經遞質，神經調質，抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑和化學治療劑。在更優選的實施例中，本發明共軛物的治療劑是阿黴素或四環素。在最優選的實施例中，本發明共軛物的膽甾醇和治療劑通過酯鍵連接。本發明的每種共軛物可以與上述藥學上可接受載體混合，用於本發明藥物傳遞的任何方法。本發明還提供了生產本發明人工LDL顆粒的方法，包括以下步驟1)將含有共軛或非共軛治療劑的磷脂懸浮在緩衝溶液中；2)超聲處理溶液，形成外部磷脂單層和固態脂質核心；和3)添加包含至少一種載脂蛋白的溶液，該載脂蛋白摻入外部磷脂單層中。在優選實施例中，由本發明方法製備的人工LDL顆粒具有10到50納米的直徑。本發明還提供了傳遞物質穿過血腦屏障的方法，所述方法包括給予需要的哺乳動物施用有效量的任何本發明的組合物。本發明還提供了傳遞物質穿過血腦屏障的試劑盒，所述試劑盒包括含有本發明任何組合物的容器和使用說明書。本發明還提供了共軛物、人工LDL顆粒和本發明組合物用於生產治療腦和中樞神經系統(CNS)疾病的藥物，這些話病症如阿爾茨黑默疾、帕金森氏病、細菌和病毒感染和癌症。附圖簡要說明圖1:放射性標記的脂類和LDL的溴化鉀密度梯度分布。圖2:腦(左)和肝(右)中LDL和脂類的攝取。圖3:(左)腦和肝中LDL與脂質顆粒的攝取比。(右)LDL和脂質顆粒的腦攝取比。圖4:14C標記的LDL顆粒的血漿濃度的時間過程。圖5:通過酞酸酯與膽甾醇連接的親水性分子的化學結構。顯示特定親水性分子是阿黴素。不發生共軛時，單獨的阿黴素太親水性不能摻入LDL顆粒中。圖6:通過硫醚酯與膽甾醇連接的親水性分子的化學結構。顯示特定親水性分子是四環素。不發生共軛時，單獨的四環素太親水性太大不能摻入LDL顆粒中。發明詳述定義這裡所用術語"人工LDL顆粒"是指包括球形磷脂單層和固態脂質核心的結構。這裡所用術語"脂質體"是指包括球形脂質雙層和含水核心的結構。這裡所用術語"攝取專一性"是指腦和肝臟中人工LDL顆粒對脂質顆粒(與人工LDL顆粒相同，除在外部磷脂單層中不包含脫輔蛋白質以外)的攝取比。注射入Sprague-Dawley鼠之後2小時，在腦和肝臟中測量人工LDL顆粒和脂質顆粒的攝取。用腦中人工LDL顆粒攝取對脂質顆粒攝取的比值除以肝臟中人工LDL顆粒攝取對脂質顆粒攝取的比值，計算攝取專一性。這裡所用術語"血清穩定性"是指血漿中保留至少75%注射的人工LDL顆粒的時間長度。這裡所用術語"載脂蛋白"和"脫輔蛋白質"是指與脂蛋白的磷脂單層相關的蛋白質，包括但並不限於ApoA;ApoB;ApoC;ApoD;ApoE;及其所有異構體。這裡所用術語"ApoE"是指ApoE的一種或多種異構體，包括但並不限於ApoE2，ApoE3禾口ApoE4。這裡所用術語"ApoB"是指ApoB的一種或多種異構體，包括但並不限於ApoB48禾口ApoB-100。這裡所用術語"外部磷脂單層"是指包括至少一種磷脂的單層，其中磷脂的磷酸酯頭基朝向外側，脂肪醯鏈朝向內側的固態脂質核心。磷脂包括但並不限於磷脂酸，磷脂醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯甘油等。這裡所用術語"固態核心"是指被球形磷脂單層包封的人工LDL顆粒部分。固態核心可包含一種或多種脂類，包括但並不限於三醯甘油，膽甾醇，膽甾醇酯，脂肪醯酯等。這裡所用術語"膽甾醇酯"是指被飽和脂肪酸酯化的膽甾醇，包括但並不限於肉豆蔻酸酯，棕櫚酸酯，硬脂酸酯，花生酸酯，木蠟酸酯等，或不飽和脂肪酸，包括但並不限於棕櫚油酸酯，油酸酯，異油酸酯，亞油酸酯，亞麻酸酯，花生四烯酸酯。這裡所用術語"治療劑"是指治療有用的胺基酸，肽，蛋白質，核酸，包括但並不限於多核苷酸，寡核苷酸，基因等，碳水化合物和脂類。本發明的治療劑包括神經營養因子，生長因子，酶，抗體，神經遞質，神經調質，抗生素，抗病毒素，抗真菌劑和化學治療劑等。本發明的治療劑包括藥物，前體藥物和當治療劑傳遞至耙組織時可激活的前體。這裡所用術語"藥學上可接受載體"是指一種化學組合物或化合物與活性組分混合，混合後可用來將活性組分施用給受試者。這裡所用術語"生理學上可接受的"酯或鹽是指活性組分的酯或鹽形式，能與藥物組合物的任何其他組分相容，對施用該組合物的受試者沒有害處。這裡所用術語"藥物學上可接受載體"還包括但並不限於以下一種或多種物質賦形劑；表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；成粒和崩解劑；粘合劑；潤滑劑；甜味劑；增香劑；著色劑；防腐劑；生理學上可降解的組合物，如明膠；含水載體和溶劑；油性載體和溶劑；懸浮劑；分散或潤溼劑；乳化劑；緩和劑；緩衝劑；鹽；增稠劑；填充劑；乳化劑；抗氧化劑；穩定劑；和藥學上可接受的聚合或疏水物質。本發明藥物組合物中可以包括其他"附加組分"是本領域中己知的，如Genaro編著，1985，《雷明登藥物禾鬥學》(Remington'sPharmaceuticalSciences)'MackPublishingCo.，Easton，Pa納入作為參考。這裡所用術語"有效量"是指足以產生治療反應的量。LDL顆粒和脫輔蛋白質的性質本發明涉及發現人工LDL顆粒能通過稱為胞吞轉運的主動受體介導的過程有效地靶向和傳遞物質穿過血腦屏障。胞吞轉運在腦毛細管內皮細胞中自然發生，作為將膽甾醇和必需脂肪酸輸入腦中的途徑。因此本發明的人工LDL載體系統提供了有效靶向和傳送藥物至腦中的方法，其中BBB或其他不利副作用的破壞最小。天然LDL顆粒的平均直徑大約為22納米。內核由大約150-200個甘油三酯分子和1500-2000個膽甾醇酯分子構成。顆粒表面包含由大約450個磷脂分子，185個神經鞘磷脂分子和l個脫輔蛋白質分子，通常是ApoB-100構成的單層(Hevonoja等(2000)BiochimBi叩hysActa1488(3):189-210)。天然LDL顆粒還可以包含大約600個未酯化的膽甾醇分子和較少量的溶血磷脂醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺，二醯甘油，神經醯胺和磷脂醯肌醇，以及痕量的其他生物脂類(Hevonoja等(2000)BiochimBiophysActa1488(3):189-210)。其他脫輔蛋白質，包括ApoE，在LDL，VLVL和HDL中發現，但是具有不同的受體結合特性(Bradly等(1984)J.Biol.Chem.259(23):14728-35)。因此，LDL顆粒的表面是非均勻地覆蓋著脫輔蛋白質，但由具有不同物理性質的不同區域組成。脫輔蛋白質分子負責保持顆粒的結構完整性，與肝，腎和血腦屏障上的脂蛋白受體結合。脫輔蛋白質根據脂質組分的狀態發生結構變化(Mims等(1990)Biochemistry29(28):6639-47)。脫輔蛋白質E(ApoE)是參與全身中膽甾醇傳輸和血漿脂蛋白代謝的蛋白質。在周圍細胞中，ApoE通過導向其傳輸而影響膽甾醇的細胞濃度。在神經元中，膽甾醇濃度的變化影響在阿爾茨海默病中改變的相同位置處微管相關蛋白質tau的磷酸化狀態。ApoE具有三種主要異構體ApoE4，ApoE3和ApoE2，其區別在於單胺基酸取代。ApoE3是正常異構體，而ApoE4和ApoE2是功能異常的。ApoE2與III型高脂蛋白血症相關。ApoE4與動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病的風險增加，認知功能減低和神經突贅疣的減少相關。除了年齡之外，ApoE4是散發性阿爾茨海默病的最重要風險因素。ApoE4具有取決於鈣的毒性作用(Veinbergs等(2002)J.Neurosci.Res.67(3):379-87)，但是其主要效應似乎是削弱ApoE3對(5-澱粉樣蛋白的清除率(Holtzman等(2001)J.Mol.Neurosci.17(2):147-55)。發現這些作用在血腦屏障中發生(Shibata等(2000)J.Clin.Invest.106(12):1489-99)，因此可以是重要的治療應用。人工LDL顆粒製備在優選實施例中，本發明的人工LDL顆粒包含蛋黃磷脂醯膽鹼(EYPC)，油酸膽甾醇酯和ApoE3的混合物。形成固態顆粒的脂類組分由三個層構成(Hevonoja等(2000)Biochim.Bi叩hys.Acta1488:189-210):含有膽甾醇，膽甾醇酯和活性藥劑的固態脂質核心，活性藥劑可以與膽甾醇共軛或者非共軛；含有磷脂醯膽鹼的脂肪酸鏈混合物的中間界面層；以及含有磷脂頭基和ApoE3的表面層。固態核心和ApoE3的存在，區分了本發明的LDL顆粒和脂質體，後者由包圍含水核心的球形脂質雙層構成，是不穩定的。此外，LDL顆粒是由天然非免疫原性組分製成的，這一點區分了天然LDL顆粒與人造納米粒，分子或化學共軛物，或膠體懸浮液。ApoE3通過胞吞轉運的主動細胞介導過程與毛細管內皮細胞上的特異受體結合，傳輸整個顆粒穿過連接處。一旦在腦內，隨著膽甾醇和磷脂逐漸被腦同化和利用，治療劑從LDL顆粒中自然釋放。雖然上述脂質組分是優選的，但是本發明考慮其他脂類，例如不同脂類組成的LDL顆粒，包括化學改性的脂類，或者其他自然形成的親脂性分子的混合物，這些脂類也能同樣發揮作用。本領域技術人員會理解可以對其進行改進，使LDL載體系統適合於特定治療劑或治療應用。優選由人工LDL和克隆ApoE3製備LDL顆粒。這能大大促進治療劑有效和穩定地摻入LDL的脂質中心，並避免因為可能的翻譯後修改，變異，或從人供體純化的不純ApoE3蛋白質的純化而出現的抗原性問題。還能避免ApoE3或脂類被血源性疾病如HIV或其他病毒無意的汙染。這種汙染一直是使用人源物質的嚴重缺點。在優選實施例中，本發明涉及製備人工LDL顆粒的改進微乳劑方法，包括以下步驟將含有共軛或非共軛藥物的脂類懸浮在磷酸酯緩衝的鹽水(PBS)溶液中，並在54'C氮氣氣氛下使用至少約25瓦的超聲波儀(探針振幅18微米，22千赫)對該溶液進行1小時的超聲處理。這種功率水平對產生適當尺寸的LDL顆粒以促進傳輸穿過BBB是重要的，優選直徑小於50納米，更優選直徑小於30納米。利用水夾套的超聲室，將含有LDL顆粒的樣品保持在恆溫下，優選在大約53和56'C之間。超聲處理之後，脂質類溶液與ApoE—起溫育，以285000，在溴化鉀(KBr)分布梯度中超離心分離產生的脂蛋白顆粒。然後對PBS透析除無KBr。可以在4"C保存顆粒以備後用，優選保存達2周。本領域技術人員會認識到可以對該方法的各個方面進行替換。例如，可以替換其他合適的密度梯度，如氯化銫或蔗糖。在替換實施例中，可以用尺寸排阻層析，電泳或其他方法代替離心分離本發明的LDL顆粒。這裡所述方法產生含藥物的LDL顆粒具有能穿過BBB的適當尺寸，並保持不穩定的共摻入分子的活性和結構穩定性。對於傳遞到腦而言，LDL顆粒尺寸通常應小於50納米，優選直徑是20到30納米。在另一個優選實施例中，本發明的LDL顆粒包括EYPC，油酸膽甾醇酯和ApoE3的混合物，以每克脂質體0.02到0.2克比例存在，能有效摻入藥劑和胞吞噬轉運穿過BBB。在更優選的實施例中，範圍是每克脂質體O.08到0.12克。更優選EYPC對油酸膽甾醇酯和ApoE3的摩爾比是23:2.2(以重量為基礎)。在本發明進一步的實施例中，基於LDL的載體體系可以包含另外的靶向分子共摻入在表面層上，以進一步便於將試劑傳輸和傳遞至腦中。例如，膽甾醇的氧化衍生物(氧甾醇)，包括膽甾醇氫過氧化物，膽甾醇環氧化物和羥基膽甾醇衍生物也可用來提高攝取。LDL顆粒還可以摻入其他脫輔蛋白質，如ApoB或ApoE4。本發明還涉及摻入一種或多種物質，包括治療劑，以治療各種腦疾病或障礙。LDL載體體系的優點之一是能安全和自然地傳遞多種藥物，包括那些化學不穩定，高度反應活性，或容易在水溶液中水解的藥物。可能的試劑包括但並不限於神經營養因子，如NGF或從澱粉樣蛋白前體蛋白質產生的神經營養片段，用於治療腦損傷和神經變性疾病；酶，如苯丙氨酸羥化酶，用於代替通過遺傳缺損而造成的喪失；酶，如酪氨酸羥化酶和D0PA脫羧酶，用於再生帕金森氏病中喪失的多巴胺；酶激活劑或抑制劑以恢復失去的生物合成功能抗生素，如四環素，用於治療傳染病；神經遞質和神經調節物質，用於治療疼痛，或包括運動，認知和行為異常的疾病；化學治療劑和抗-AIDS藥物，如依託泊甙，三唑核苷，或抗組胺劑，如洛羅塔丁，非索非那定，或西替利嗪(Zyrtec)，與系統地給予可耐受劑量時足量不能到達腦中的試劑一起用於治療腦腫瘤或其他疾病；診斷劑，包括造影劑，如釓衍生物，碘海醇，或碘克酸鹽，或者因為系統施用時對腦的滲透差而目前不使用的試劑；治療或診斷蛋白質，如抗體，改造和天然的；和編碼基因或蛋白質的治療序列，或其部分，由DNA，RNA，或可非侵入性地引入穿過BBB的胺基酸。存在於LDL載體中的治療劑的量很不同，取決於分子的類型。LDL載體中的最佳摻入，治療劑量應小於0.1摩爾/摩爾膽甾醇。預計較高水平可使LDL顆粒不穩定。本發明進一步考慮可以在相同顆粒中可存在多種藥物或其他試劑。在實施例中，要求活性物質的非共價修飾摻入本發明LDL顆粒中，條件是該物質的疏水性足以保持具有膽甾醇的微乳液。對於大多數中性和適度帶電分子同樣如此。在另一個實施例中，如果治療劑是高度帶電的，像DNA或肽，或者為了防止擴散，該試劑可以與膽甾醇共價連接。在優選實施例中，連接是通過酯鍵完成的，腦組織中發現普遍存在的酯酶能釋放試劑(Yordanov等，(2000)J.Med.Chem.45(11):2283-8;Yang等(1995)Pharm.Res.12(3):329-36)。或者，本領域技術人員能夠選擇其他結合方式起同樣作用，它們可與磷脂醯膽鹼，一些其他親脂性化合物，或ApoE本身共價結合。如上所述，本發明的LDL顆粒與加入聚乙二醇的脂質體，納米粒和類似的人造物質相比，具有若干優點。本發明的LDL顆粒是由血漿的正常組分製成的，與其天然受體結合，作為腦對外源必需脂肪酸的自然需要的一部分，通過正常途徑傳輸至細胞中。因此，其毒性明顯低於聚合物基載體和破壞細胞膜完整性的試劑。目前用於傳遞藥物至腦中的方法是用甘露醇滲透性破壞BBB。但是破壞BBB是嚴重缺點，事實是它允許毒素和甚至細菌與具有嚴重間接效應的所需治療劑一起進入腦中。本發明的人工LDL載體體系還提供在血漿中保持高濃度至少2小時的優點(附圖4)。這對維持足夠有效的血漿濃度(通常被稱為"血漿濃度曲線下的面積"或AUC)，使物質充分攝入和傳遞到腦中是重要的。通過特定地耙向腦組織，如實施例3中所示，本發明的人工LDL顆粒顯著提高藥物的治療效果，因為藥物被肝臟吸收，被解毒途徑滅活，包括被肝酶如P450滅活的可能性小得多。包含人工LDL顆粒的組合物可以用各種方法配製本發明的LDL顆粒，取決於待治療的腦疾病類型。因此本發明的藥物組合物中包括配製至少一種含藥物的LDL顆粒複合體用於人或獸醫。這種組合物可以與藥學上可接受載體或賦形劑，任選與輔助藥劑一起使用。常規載體也能與本發明一起使用。可接受載體包括但並不限於葡萄糖，鹽水和磷酸鹽緩衝鹽水。處理除去游離的治療劑或其他非摻入分子之後，使藥學上可接受載體中的LDL顆粒懸浮液達到所需濃度施用給病人。因為LDL顆粒太大不能在腸道外有效地吸收，設計這些組合物供靜脈使用，但也可以設想肌肉內或動脈內施用，或甚至胃腸外給藥或口服產生適當的改進。因此，本發明提供的組合物耙向施用到BBB，其中包括在LDL顆粒中包含的選擇的活性試劑溶液和藥學上可接受載體，優選是含水載體。製得的組合物可以消毒並包裝在試劑盒中使用，或者在無菌條件下過濾並凍幹。用於靜脈給藥的試劑盒(含凍幹的製劑)還可包括消毒水溶液，用於施用前混合。根據接近的生理條件的需要，組合物中可以包含藥學上可接受的輔助物質，如pH調節劑和緩衝劑，滲透性調節劑等，如乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣等。這些製劑中LDL顆粒的濃度可以很大不同，即從小於約0.5%，通常等於或至少約1%，到多達5到10重量％。製備可靜脈內施用LDL顆粒製劑的其他方法是本領域技術人員已知的。這些方法如Goodman和Gilman，《治療學的藥理基礎》(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)JoelG.Hardman(編輯)，LeeE.LimbirdMcGraw-HillProfessional;ISBN:0071354697;第10版(2001年8月13日)中所述。使用人工LDL載體的治療方法在進一步的實施例中，人工LDL顆粒可以給予需要治療的哺乳動物宿主，有效地傳遞試劑穿過BBB到腦中。對於治療應用，可以採用任何方式給予受試者有效量的含藥物LDL顆粒，使毛細管內皮細胞攝取LDL顆粒。在臨床應用中，LDL顆粒傳遞體系顯著提高了藥物的療效，例如用於治療阿爾茨默病，帕金森氏病和腦癌。例如，可以在LDL顆粒中慘入神經營養因子如神經生長因子，使肽能攝入腦中。這會引起新神經的生長過程，有利於一些神經變性疾病。如本文所述，本領域技術人員會認識到使用本發明的LDL載體體系具有各種可供選擇的臨床應用。膽甾醇治療劑的共軛物膽甾醇是相對化學不活躍的分子。因此，必須在膽甾醇與含胺的治療劑反應之前活化膽甾醇。例如，可以通過與環酸酐和酞酸酐或琥珀酸酐反應，產生含有羧基的酞酸酯或琥珀酸酯來活化膽甾醇。然後通過與五氟苯酚反應和然後與二異丙基碳化二亞胺反應，產生與含胺治療劑的醯胺鍵合來活化羧基。製得的產物是膽甾醇-治療劑共軛物，其中治療劑通過酯鍵合與膽甾醇共軛。膽甾醇-治療劑共軛物的親脂性足以允許摻入本發明的人工LDL顆粒中。同樣，由於優選的鍵合是酯鍵，所以治療劑可以通過與普遍存在的內源酯酶作用而從膽甾醇部分中釋放出來。因此，治療劑從共軛物中的釋放並不取決於苛刻條件和溶酶體中發現的非特異性肽酶的作用。雖然膽甾醇和治療劑之間的優選鍵合是酯鍵，但是本發明考慮其他鍵合，包括但並不限於醚，醯胺和肽鍵。或者，可以通過硫代膽甾醇，治療劑和雙官能交聯劑的反應使含胺或含羥基的治療劑與硫代膽甾醇共軛，雙官能交聯劑包括但並不限於PMPI。製得的共軛物是膽甾醇和治療劑通過硫醚鍵連接的共軛物。如果治療劑含有一個氨基，則能利用一種市售雙官能交聯劑與硫代膽留醇共軛，這些市售雙官能交聯劑包括但並不限於琥珀醯亞胺-4-[N-馬來醯亞胺甲基]環己烷-l-羧酸酯。一旦形成，膽甾醇-治療劑共軛物可與未共軛的油酸膽甾醇酯，磷脂，脂蛋白混合，如本文所述，從而產生本發明的人工LDL顆粒。上述引用的各參考文獻都完整納入本文作為參考。實施例以下實施例用於進一步說明本發明，不應認為以任何方式對本發明範圍的限制。實施例1:純化全長度脫輔蛋白質E(ApoE)將從AantiPolarLipids,Inc.獲得的DMPC(1，2-二豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)以100毫克/毫升的濃度懸浮在玻璃管內的苯中，用臺式超聲波儀超聲處理。將腿PC懸浮液是殼冷凍的，並凍幹過夜，然後再懸浮於30毫升標準緩衝液(10毫摩爾Tris-HC1.pH7.6，0.15摩爾NaCl，1毫摩爾EDTA，0.0005%NaN3)中，形成10-20毫克/毫升DMPC，並轉移至50毫升塑料錐形管中。將管置於水浴中，用超聲波儀和微型尖管超聲處理4個IO分鐘間隔，2-3分鐘交替冷卻。重複超聲處理，直到溶液變得幾乎透明。然後將超聲處理的DMPC以2000轉/分的速度離心20分鐘，除去在超聲處理過程中脫落的任何鈦。離心收集表達克隆ApoE的細菌細胞，並在具有大尖管的Branson超聲波儀中在冰上進行超聲處理，使用4個周期30秒的高強度超聲處理，通過2分鐘冷卻間隔分離。在4'C以39.000xg離心超聲處理的懸浮液20分鐘，除去細胞碎片，在100毫克/升原始培養基中將懸浮液與DMPC混合。混合物在24"C(這是DMPC的轉換溫度)水浴中溫育過夜。然後添加固態KBr，使DMPC-ApoE混合物的密度升到1.21克/毫升，以55000轉/分的速度在15°。，在60TiBeckraan固定角轉頭中以分步梯度(1.21，1.10和1.006克/毫升)離心過夜。丟棄靠近管頂含有游離DMPC的白色帶狀物，並取出其下方的ApoE-畫PC複合體，以密度1.009克/毫升漂清的。用凝膠電泳證實ApoE的存在。然後在4。C用0.1摩爾NH4HC03和0.0005%NaN3對適當組分透析，三次更換緩衝液。然後用凝血酶消化蛋白質，除去由載體留下的聚組氨酸標記。以1:500凝血酶ApoE重量比將活化的凝血酶與蛋白質混合，在37卩溫育至少1小時，用凝膠電泳分析等分試樣，以確保蛋白質完全切割。因為存在兩個切割位點，所以不完全的切割會導致分子量較高的第二個帶狀物。一旦證明完全切割，添加P-巰基乙醇至1%最終濃度，停止反應。然後在50毫升經酸洗的管中將ApoE起殼冷凍，並凍幹過夜。用30毫升冷的氯仿/甲醇(2:lv/v)洗滌ApoE，並用J6Beckman離心機在4°C以1500轉/分的速度離心10分鐘收集。將顆粒再懸浮於小體積的冷甲醇中並渦動，然後用冷甲醇灌滿管並離心。這個步驟除去了任何殘餘的氯仿。倒出甲醇，在管中留下少量，進行渦動，從顆粒形成糊。添加5毫升含有6摩爾胍-HC1，0.1摩爾TrisHCl，pH7.4，0.01%EDTA，巰基乙醇，和0.005%疊氮化鈉的溶液，將溶液裝在S印hacrylS-300柱上，該分離柱用4摩爾胍-HCl，0,1摩爾Tris-HCl，pH7.4，0.巰基乙醇和0.0005%NaN3平衡。用含有0.巰基乙醇和0.0005%疊氮化鈉的4摩爾胍緩衝液洗脫蛋白質。用0.1摩爾NH4HC03和0.0005%NaN3透析組分，緩衝液更換4次。用YM10AmiconCentripr印濃縮器(Milllipore)濃縮純化的ApoE至1-2毫克/毫升的最終濃度，在-2(TC儲存。實施例2:LDL-脂質體的ApoE富集1.製備脂質餅狀物將蛋黃磷脂醯膽鹼(25毫克)和油酸膽甾醇酯(2毫克)溶解(比例是25:1)在甲醇/氯仿(2:3)中。在氮氣下4"C蒸發溶劑。2.製備脂質體在12毫升10毫摩爾Tris-HCl緩衝液中水合脂質餅狀物，緩衝液pH8.0，含有O.l摩爾預先在氮氣下鼓泡的氯化鉀。在氮氣流下54T:對混合物超聲處理1小時，以18微米輸出，並離心除去在超聲處理過程中產生的任何鈦顆粒。3.製備人工LDL:將步驟2中製備的脂質體與ApoE蛋白質以1/10(w/w)蛋白質/脂質的比在37。C溫育30分鐘。然後利用密度是1.064，1.019和1.006克/立方釐米的三層KC1分步梯度在4°C以285000xg進行18小時的密度梯度超離心，純化並濃縮脂質體。向脂質體溶液中添加KBr，提高其密度至1.21，應用於離心管底部。0ptiseal管(Beckraan)適用於超離心步驟。離心之後，看到的脂質體是距離管頂部大約1/4的乳白色窄層。取出該層並在4。C對含有1毫摩爾EDTA的PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)滲析過夜。LDL懸浮液穩定至少為7，能在氬氣或氮氣下-2(TC儲存。實施例3:人工LDL顆粒在腦中的攝取將含有大約1毫克脂質的PBS中的LDL懸浮液注射入Sprague-Dawley大鼠(150克)的尾靜脈中。以不同的間隔，用含EGTA的注射器通過心臟穿刺獲取血樣。在水中勻化血漿，RBC和組織，在閃爍計數器中測量"C。附圖2顯示腦(左)和肝(右)中LDL和脂類攝取的結果。用含有'4C-膽甾醇的LDL或脂質顆粒對雄性Sprague-Dawley大鼠進行靜脈內注射，2小時之後測量腦和肝中的放射性。與除了存在ApoE之外相同組成的脂質顆粒相比，腦和肝分別從LDL中攝取19.8和4.7倍的標記物。這表明攝取是由通過LDL受體(p(〉T)=0.00055)介導的胞吞轉動引起的。圖3(左)顯示腦和肝中LDL對脂質顆粒攝取的比值。與肝(pOT)-0.0003)相比，腦摻入的LDL百分比大於脂質顆粒，表明與肝相比，靶器官具有〉4倍的LDL專一性。圖3(右)顯示LDL和脂質顆粒的腦攝取對肝攝取的比值。腦肝比是對器官專一性的另一種測量，LDL的腦肝比大於脂質顆粒(p(〉T)=0.0003)。換言之，肝攝取的脂質顆粒比腦多5.88倍，而肝攝取的LDL顆粒僅比腦(p(〉T)=0.034)多1.36倍。圖4顯示"C-標記LDL顆粒的血漿濃度的時間過程。注射LDL之後，血液Mc保持恆定至少2小時，表明標記沒有被其他器官從循環中除去。實施例4:伯胺與't膽甾醇的共軛製備膽甾醇-酞酸酯用氮氣蒸發膽甾醇(l毫克)並凍幹除去乙醇。將固體溶解在最小體積的THF中，轉移至玻璃反應瓶中。添加固態酞酸酐(1-2毫克，〉4當量)，接著是50Et3N。在10(TC加熱混合物5分鐘，添加"20微升吡啶，使懸浮液變透明。在IO(TC加熱混合物30分鐘，直到溶液是紅色，在TLC(Silica/UV254板)上用EtOH/甲苯(2:1)純化。從板上刮下最暗的UV條帶(RP=0.74)，並用THF洗脫產物(產率98=100%)。用五氟苯酚活化羧基向酞酸膽甾醇酯中添加THF中的10毫克五氟苯酚(PFP)，接著是5微升DIIC(二異丙基碳化二亞胺)。室溫下在反應瓶中使溶液反應1小時，用TLC(CHC13/CH30H30:5)純化活化的膽甾醇-酞酸酯-PFP，並用THF洗脫(產率100%)。生產活化醯胺將THF中的活化膽甾醇-酞酸酯-PFP蒸發至IO微升，添加溶解在畫F中的2當量伯胺。DMF可導致副反應，但是如果存在過量胺則不是問題。添加甲醇或乙醇會大大降低產率。添加3微升DIIC，使溶液在室溫下反應過夜，並用TCL(CHC13/CH30H30:5)純化(產率98%)。重要的是，只能使用SilicaGelG-25UV254板(Alltech809021)進行純化。矽膠60板產生損害純化的模糊不清條帶。實施例5:合成阿黴素-膽甾醇(1)將THF中的活化膽甾醇-酞酸酯-PFP蒸發至10微升。添加溶解在DMF中的2當量阿黴素。使用過量胺減少與DMF的副反應。添加甲醇或乙醇會大大降低產率。添加3微升DIIC，在室溫下使溶液反應過夜，用TLC(CHC13/CH30H30:5)純化(產率95%)。此條帶含有阿黴素-DIIC共軛物和產物。用100%CH3OH中的C18-反相位HPLC可分離膽甾醇-阿黴素共軛物(流速=0.5毫升/分，檢測=A471)。4.7分鐘時，大約膽甾醇和阿黴素之間的一半距離，洗脫產物。總產率95%。阿黴素-膽甾醇共軛物(I)的結構如圖5所示。實施例6:含羥基化合物與"C膽甾醇的共軛將N-[對-馬來醯亞胺苯基]異氰酸酯(PMPI)(5毫克)與200微升DMSO中的1當量含羥基化合物混合，在室溫下反應30分鐘。添加硫代膽甾醇(6.4毫克)。在室溫下溫育混合物120分鐘，用預先塗布0,1摩爾EDTApH8.0的矽膠GUV254板通過薄層色譜法分離產物，使用EtOH/H201:1作為溶劑。實施例7:合成四環素-膽甾醇(II)凍幹四環素除去任何溶劑，將200微升DMS0中的2.2毫克四環素與5毫克PMPI混合，並在室溫下反應30分鐘。添加硫代膽甾醇(6.4毫克)。在室溫下溫育混合物120分鐘，使用預先塗布0.1摩爾EDTApH8.0的矽膠GUV254板通過薄層色譜法分離產物，使用EtOH/H20作為溶劑。四環素-膽甾醇共軛物(II)的結構如附圖6所示。參考文獻下列各參考文獻整體納入本文作為參考。1.Alyaudtinetal.(2001)Interactionofpoly(butylcyanoacrylate)nanoparticleswiththeblood-brainbarrierinvivoandinvitro.J".DrugTarget9(3):209-21.(體內和體外中聚(丁基氰丙烯酸酯)納米粒與血腦屏障的相互作用)2.Bickeletal.(1993)Deliveryofpeptidesandproteinsthroughthebloodbrainbarrier.AdvDrug.Del.Rev.10:205-245.(傳遞肽禾口蛋白質穿過血腦屏障)3.Bradleyetal.(1984)Low-densitylipoproteinreceptorbindingdeterminantsswitchfromapoproteinEtoapoproteinBduringconversionofhypertriglyceridemicvery-low—densitylipoproteintolow—densitylipoproteins.JBiolChem259(23):14728-35.(在高甘油三酯血症極低密度脂蛋白向低密度脂蛋白轉變期間，低密度脂蛋白受體結合決定子從脫輔蛋白質E轉到脫輔蛋白質B。)4.Goodman&Gilman，ThePharmacologicalBasisofTherapeuticsbyJ"oelG.Hardman(Editor),LeeE.LimbirdMcGraw-HillProfessional;ISBN:0071354697;10thedition(August13,2001).(治療學和藥理基礎)5.Hevonojaetal.(2000)Structureoflowdensitylipoprotein(LDUparticles:basisforunderstandingmolecularchangesinmodifiedLDL.BiochimBi叩hysActa1488(3):189-210,(低密度脂蛋白(LDL)顆粒的結構了解修飾的LDL中分子變化的基礎)6.Holtzman(2001)RoleofApoE/AbetainteractionsinthepathogenesisofAlzheimer'sdiseaseandcerebralamyloidangiopathy,JmolNeurosci17(2):147-55.(阿爾茨海默病和大腦澱粉樣血管病的發病機制中ApoE/Abeta相互的作用功用)7.Huwyleretal.(1996)Braindrugdeliveryofsmallmoleculesusingimmunoliposomes.Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA93:4164-14169.(使用免疫脂質體傳遞小分子腦用藥物)8.Kangetal.Braindelieveyofbiotinboundtoaconjugateofneutralavidinandcationizedhumanalbumin.Pharm.Res.11，1257-1264.(與神經抗生物素蛋白和陽離子化人白蛋白共軛物結合的生物素腦部傳遞)9.Kangetal.(2000)Stabilityofthedisulfidebondin肌avidin-biotinlinkedchimericpeptideduringinvivotranscytosisthroughbrainendothelialcells.J"drugTarget8(6):425-34).(體內胞吞轉運穿過腦內皮細胞過程中，抗生物素蛋白-生物素連接的嵌合肽中二硫鍵的穩定性)10.Kreuteretal.(2002)Apolipoprotein-mediatedtransportofnanoparticle-bounddrugsacrosstheblood-brainbarrier._JdrugTarget10(4):317-25.(納米粒結合藥物穿過血腦屏障的載脂蛋白介導的傳輸)11.Mimsetal.(1990)EffectofparticlesizeandtemperatureontheconformationandphysiologicalbehaviorofapolipoproteinEboundtomodellipoproteinparticles.Biochemistry29(28):6639-47.(粒徑禾口溫度對與模型脂蛋白顆粒結合的載脂蛋白E構型和生理行為的影響)12.Pardrideg(1990)CNSdrugdesignbasedonprinciplesofblood-brainbarriertransport.J.Neurochem70:1781-2.(基於血腦屏障傳輸原理的CNS藥物設計)13.Pardridegetal.(1986)Blood-brainbarrier:interfacebetweeninternalmedicineandthebrain.AnnInternMed105(1):82-95.(血腦屏障內科醫學和腦之間的界面)14.Reinhardetal.(1994)Insulin-likegrowthfactorscrosstheblood-brainbarrier.Endocrinology135(5):1735-1761.(胰島素樣生長因子穿過血腦屏障)15.Rigottietal.(1995)TheclassBscavergerreceptorsSR-BIandCD36arereceptorsforanionicphospholipids.J.Biol.Chein.270，16221—4.(B型清除受體SR-BI和CD36是陰離子磷脂的受體)16.Shibataetal.(2000)ClearanceofAlzheimer'samyloid-ss(1-40)peptidefrombrainbyLDLreceptor-relatedprotein-lattheblood-brainbarrier.J.Clin.Invest.106(12):1489-99.(通過血月畝屏障上的LDL受體相關蛋白質-1從腦中清除阿爾茨海默澱粉樣蛋白-ss(1-40)肽)17，Veinbergsetal,(2002)NeurotoxiceffectsofapolipoproteinE4aremediatedviadysregulationofcalciumhomeostasis.J"neurosciRes67(3):379-89.(通過鈣穩態的調節障礙介導載脂蛋白E4的神經毒性作用)18.Wittetal.(2000)Insulinenhancementofopioidpeptidetransportacrosstheblood—brainbarrierandassessmentofanalgesiceffect.PharmacolExpTher295(3):972-8.(胰島素增強阿片樣肽傳輸穿過血腦屏障和鎮痛效果的評估)19.Wuetal.(2002)Pharmacokineticsandbrainuptakeofbiotinylatedbasicfibroblastgrowthfactorconjugatedtoablood—brainbarrierdrugdeliverysystem.JdrugTarget10(3):329-45.(與血腦屏障藥物傳遞體系共軛的生物素化的鹼性成纖維細胞生長因子的藥物動力學和腦攝取)20.Yangetal.(1995)Softdrugs.XX.Design,synthesis,andevaluationofultrashortactingbeta-blockers.PharmRes12(3):329-36.(軟藥.XX.超短作用的P-阻斷劑的設計，合成和評價)21.Yordanovetal.(2002)Acyl-protectedhydroxylaminesasspinlabelgeneratorsforEPRbrainimaging.J".Med.Chem.45(11):2283-8.(醯基保護的羥胺作為EPR腦成像的自旋標記發生劑)22.Dehoucketal，(1977)AnewfunctionfortheLDLreceptor;transcytosisofLDLacrosstheblood-brainbarrier.J.Cell.Biol.138(4):877-89.(LDL受體的新功能穿過血腦屏障的LDL胞吞噬轉運)23.Versluisetetl.(1998)Synthesisofalipophilicdaimorubicinderivative肌ditsincorporationintolipidiccarriersdevelopedforLDLreceptor-mediatedtumortherapy.Pharm.Res.15(4):531-537.(為LDL受體-介導的腫瘤治療開發的親脂性柔紅黴素衍生物合成及其摻入脂的載體)24.Versluisetal.(1998)Low-densitylipoproteinreceptor-mediateddeliveryofalipophilicdaunorubicinderivativetoB16tumorsinmiceusingapolipoproteinE-enrichedliposomes.B.r.J.Cancer78(12):1607-14.(使用載脂蛋白E富集的脂質體將親脂性柔紅黴素衍生物通過低密度脂蛋白受體介導傳遞至小鼠的B16腫瘤處)25.Versluisetal.(1999)StableincorporationofalipophilicdaunorubicinprodrugintoapolipoproteinE-exposingliposomesinducesuptakeofprodrugvialow-densitylipoproteinreceptorinvivo.J.Pharmacol.Exp.Ther.289(1):1-7.(親脂性柔紅黴素前藥穩地摻入載脂蛋白E-暴露的脂質體中，通過體內低密度脂蛋白受體引發前藥的攝取)26.Annunziatoetal.(1993)p-Maleimidophenylisocyanate:anovelheterobifunctionallikerforhydroxyltothiolcoupling.BioconjugateChem.4:212-218.(對-馬來醯亞胺苯基異氰酸酯用於羥基與硫醇偶聯的新穎異雙官能結合劑)27.Demeuleetal.(2002)Hightranscytosisofmalanotransferrin(P97)acrosstheblood-brainbarrier.J.Neurochem83(4):924-33.(穿過血腦屏障的黑素轉鐵蛋白(P97)的高胞吞轉運)。權利要求1.一種共軛物，包含膽甾醇和阿黴素。2.如權利要求1所述的共軛物，膽甾醇和阿黴素是通過酯鍵連接的。3.—種共軛物，包含膽甾醇和四環素。4.如權利要求3所述的共軛物，膽甾醇和四環素是通過酯鍵連接的。5.—種組合物，包含權利要求l所述的共軛物和藥學上可接受的載體。6.—種組合物，包含權利要求2所述的共軛物和藥學上可接受的載體。7.—種組合物，包含權利要求3所述的共軛物和藥學上可接受的載體。8.—種組合物，包含權利要求4所述的共軛物和藥學上可接受的載體。全文摘要本發明涉及用於靶向傳遞治療劑穿過血腦屏障(BBB)的高效人工低密度脂蛋白(LDL)載體體系。本發明尤其涉及含有三種脂質成分的人工LDL顆粒磷脂醯膽鹼，脂醯膽甾醇酯和至少一種載脂蛋白。本發明進一步涉及能使藥物靶向並穿過BBB用於預防和治療腦疾病的包含人工LDL顆粒的組合物、方法和試劑盒。文檔編號A61K9/127GK101284136SQ20081008660公開日2008年10月15日申請日期2003年12月2日優先權日2002年12月3日發明者A·夸特特朗,D·L·阿爾康,T·J·尼爾森申請人:布朗歇特洛克菲勒神經科學研究所