表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒及其應用的製作方法
2023-08-09 08:04:51 2
專利名稱：表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明利用基因重組技術，構建可以表達傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或新城疫病毒F基因、傳染性支氣管炎病毒S1基因的重組雞痘病毒作為疫苗，用於預防以上禽病。
背景技術：
雞傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的雞的一種急性接觸性呼吸道傳染病。該病以呼吸困難、喘氣、咳出血樣分泌物、受侵害的氣管黏膜細胞腫脹和水腫、出血並導致糜爛為特徵，該病在急性暴發時發病率為100％，死亡率可高達70％，平均死亡率一般為10％-40％，導致雞死亡和產蛋量下降，是危害養禽業的重要疫病之一。該病在世界範圍內均有流行，我國在二十世紀50年代發現本病，1988-1990年曾在許多省份流行，1992年以後在我國一些地區又呈地方性流行。
1925年，美國的May首先報導在美國洛島發現本病，當時稱為「喉頭-氣管炎」。該病曾以不同的名稱命名，如「傳染性支氣管炎」、「禽白喉」等。「喉氣管炎」這一術語早在1930年就被使用，1931年，雞傳染性喉氣管炎這一病名被美國獸醫協會禽病專門委員會所採納。Beaudette首次證明喉氣管炎的病原是一種濾過性病原，即雞傳染性喉氣管炎病毒，它屬於α-皰疹病毒亞科，又稱其為禽皰疹病毒I型。
雞傳染性喉氣管炎是第一個被有效疫苗控制的禽病毒性疾病。起初，人們用強毒通過洩殖腔接種來使敏感雞獲得免疫，但是免疫雞還能排毒，而成為傳染源。目前國內外主要採用弱毒疫苗來防制本病，儘管該弱毒疫苗具有良好的免疫效力，也比強毒疫苗安全，但尚存在以下幾方面的不足(1)現用的ILTV弱毒疫苗的毒力普遍偏強，接種後反應大。因為它的免疫原性與其毒力呈正相關，如果毒力通過體外傳代進一步降低，那麼其免疫效力也隨之下降。(2)與ILTV強毒株一樣ILTV弱毒疫苗也能導致潛伏感染，並且ILTV弱毒疫苗株在雞群的傳播過程中，可引起毒力返強，當它與非免疫雞群接觸時成為潛在的傳染源，所以該弱毒疫苗僅限於本病流行地區使用，但非免疫雞群一旦傳入本病將導致重大損失。(3)ILTV強弱毒尚無鑑別診斷方法。由於現用ILTV弱毒疫苗存在的問題，使ILT的完全控制仍然是養禽業的一大難題。傳統的方法已經不能解決現有雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗存在的問題，所以需要開發研製一種具有與ILT弱毒疫苗同等免疫效力又能克服弱毒疫苗上述不足的新型安全有效的ILT疫苗。
發明內容
本發明的目的是提供一種將ILTV的主要免疫原糖蛋白gB基因，新城疫病毒F基因，傳染性支氣管炎病毒S1基因等分別插入FPV轉移載體中，然後再用該質粒轉染FPV感染的雞胚成纖維細胞(CEF)，以獲得抗兩種或多種禽病毒病的重組雞痘病毒活載體疫苗。
上述的目的通過以下的技術方案實現
表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，是一種抗傳染性喉氣管炎和其它禽病毒病的重組雞痘病毒活載體疫苗，將雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保護性抗原基因插入雞痘病毒弱毒基因組中構建重組雞痘病毒活載體疫苗。
上述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因全部編碼框(ORF)，該ORF含有2619個鹼基，編碼873個胺基酸；上述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因的上遊有雞痘病毒早晚期啟動子(LP2EP2)。
上述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因；上述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的上遊分別連有雞痘病毒早晚期啟動子(LP2EP2)；上述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，含有傳染性支氣管炎病毒S1基因病上述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，插入的傳染性支氣管炎病毒S1基因的上遊連有雞痘病毒早晚期啟動子(LP2EP2)；上述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，將傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒主要保護性抗原基因插入到雞痘病毒基因組一1.7Kb的EcoRI片段中。
一種表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒在預防雞痘及本發明的效果是1、新生成的重組雞痘病毒的鑑定為了分離雞痘病毒的DNA，用0.1PFU/Cell的劑量感染單層雞胚成纖維細胞，放在37℃溫箱中培養4-6天，待CPE達到100％時，刮細胞到培養基中，3000g離心5分鐘收集100％病變的雞痘病毒感染的雞胚成纖維細胞培養物，棄上清，將細胞沉澱重懸於1.0ml的PBS中，反覆凍融二次，在最後一次融化後用超聲波打兩次，30秒中間間隔45秒的冰浴冷卻，然後3000g離心5分鐘，將上清在15000g離心20分鐘後，沉澱重懸於10mmol/L Tris(pH7.5)，此即為粗提的雞痘病毒。在上述粗提的病毒中加入10％SDS至終濃度0.4％，蛋白酶K至終濃度140μg/ml，37℃消化3-4小時，分別用等體積的飽和酚，等體積的飽和酚/氯仿各抽提一次，於水相中加入2倍體積的100％冷乙醇和1/10體積的3mol/LNaAc(pH4.8)，混勻，-20℃冰箱過夜，12000g離心4℃離心20分鐘，棄上清，用70％冷乙醇洗滌沉澱，真空乾燥，沉澱用滅菌的TE(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)置於-20℃冰箱中備用。參照前面的PCR步驟，可以檢測到2.7kb的目的片段。
2.發明的外源基因(gB)表達的檢測將重組FPV(rFPV)和S-FPV-017感染CEF細胞，待細胞出現100％病變後，倒掉培養液，用PBS(pH7.4)洗細胞二次。加入適量的加熱到85℃的2×SDS凝膠電泳加樣緩衝液裂解細胞，用細胞刮棒把粘稠狀的細胞裂解物收集於一個微量離心管中，將樣品置於沸水中加熱10分鐘，即為被檢樣品。分別配製10％分離膠，5％的濃縮膠，按分子克隆上所述方法進行灌制。待其聚合後，用微量加樣器加樣，同時加蛋白分子量作為對照，在BIO-RAD垂直電泳槽上180V電泳，待染料移至底部時停止電泳，將蛋白分子量切下用0.25％考馬斯亮藍中(0.25％R250，40％甲醇，10％冰乙醇)染色2小時，用脫色液(40％甲醇，10％乙酸)脫色，餘下的凝膠置於轉印裝置，用於Western blot印跡。
將6張Whatman濾紙、NC膜剪成與凝膠同樣大小，在轉移液中浸泡3-5分鐘(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS)。將3塊3MM濾紙對齊依次放置纖維素膜、凝膠，再依次放置另三張濾紙，放置每一層時均要除去它們之間的氣泡，然後在TRANS-BLOT SD(Semi-dry Transfer Cell，BIO-RID)轉印裝置中22V電轉45分鐘(纖維素膜側靠正極，膠側靠負極)。轉印完畢，取出NC膜用鉛筆在膜上作好標記。夾於兩層濾紙之間，室溫乾燥30分鐘。將NC膜放在一個平皿中，加封閉液(0.2％疊氮鈉，1％(W/V)BSA溶於PBS)，浸過膜即可，室溫下輕振2~3小時。然後用PBS洗3次，加ILTV多克隆血清(1∶100稀釋)37℃作用2小時，再用PBS洗3次，Buffer I(150mmol/L NaCl，50mmol/L，Tris.HCl pH7.5)洗10分鐘，加入鹼性磷酸酶標記的兔抗雞IgG(用含1％BSABuffer I作1∶10000稀釋)37℃作用1小時。用Buffer I洗3次，Buffer II(10mmol/L TrisHCl pH7.5，150mmol/L NaCl)洗一次，吸淨餘液，置於顯色液中。顯色完畢，加0.5mmol EDTA(pH8.0)終止顯色。
3.重組病毒免疫效力將表達雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因重組雞痘病毒(rFPV-ILTV gB)經翅皮下注射接種(5×105PFU/羽)六周齡的SPF雞，免疫後四周以致死劑量雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強毒株進行喉內接種攻毒。結果該重組雞痘病毒免疫的雞與雞傳染性喉氣管炎病毒弱毒疫苗免疫的雞一樣，對於ILTV王崗強毒株的攻擊都獲得了100％對死亡的保護和70％對發病的保護。ELISA方法檢測結果表明，該重組病毒不僅能在機體內穩定繁殖子代病毒，而且也能穩定地表達插入重組病毒中的外源糖蛋白gB基因，從而刺激機體產生針對雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB和雞痘病毒的抗體。ILTV王崗強毒株攻擊後的雞的ILTV病毒分離和PCR檢測結果都表明，該重組病毒不僅能誘導機體產生抗體，而且也能誘導機體產生針對ILTV的細胞介導的保護性免疫應答，從而保護該重組病毒免疫雞抵抗ILTV強毒的攻擊。
用重組病毒(rFPV-ILTV gB)(5×105PFU/羽)經翅皮下注射接種六周齡的商品雞。接種後4周以致死劑量的雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強毒株進行喉內接種攻毒。攻毒後的死亡保護率為，重組雞痘病毒免疫組100％，ILTV弱毒疫苗免疫組85％，雞痘病毒疫苗S-FPV-017免疫組70％，非免疫對照組40％。本實驗結果表明該重組雞痘病毒疫苗對商品雞的免疫保護效果比現用的ILTV弱毒疫苗更好。
將重組病毒添加保護劑製備疫苗，進一步檢測疫苗的安全性，在最小免疫劑量免疫的疫苗中，在免疫持續期內，可以保護雞抵抗強毒的攻擊。
表達ILTV gB基因重組禽痘病毒的構建，可以直接進行疫苗的開發工作，而且為進一步構建多價載體疫苗提供了重要的實驗材料。例如①在此基礎上，可以進一步插入新城疫病毒的F基因，或傳染性支氣管炎病毒的S1基因等製備多價載體疫苗。②根據這些重組病毒的特點均可建立疫苗免疫和病毒自然感染動物的鑑別診斷方法。
ILTVgB基因與單純皰疹病毒I型(HSV-1)病毒gB基因是同源基因，與HSV-1糖蛋白gB一樣，ILTV糖蛋白gB也是一種跨膜糖蛋白，是病毒感染所必需的，在病毒接觸和進入宿主細胞時起關鍵作用。HSV糖蛋白gB已經被證明能夠引起體液抗體和細胞介導的免疫應答，使免疫小鼠能夠抵抗HSV強毒的致死性攻擊；由痘苗病毒、腺病毒、杆狀病毒表達的HSV糖蛋白gB能保護小鼠抵抗HSV病毒的致死性攻擊。ILTV糖蛋白gB基因能編碼205ku的糖蛋白複合物，由ILTV糖蛋白gB製備的亞單位疫苗能保護雞100％抵抗臨床發病和83％抑制強毒複製。所有這些都表明，ILTVgB糖蛋白是主要保護性抗原，可作為研製亞單位疫苗、病毒活載體疫苗和DNA疫苗的候選抗原，以ILTVgB基因製備的DNA疫苗可以有效的保護SPF雞抵抗ILTV強毒的攻擊。
雞痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)表達載體系統是繼痘苗病毒(VacciniaVirus，VV)以後發展起來的又一種動物病毒載體。FPV作為活病毒載體有如下優勢其基因組結構龐大，比VV長約1/3，能容納較大的外源基因而不喪失其感染性；被表達的外源蛋白能真實的被表達，如糖基化、羧基化等，可誘導機體產生較長時間的細胞免疫和體液免疫；其嚴格的細胞漿繁殖特性，避免了病毒基因重組導入宿主細胞染色體而導致細胞特性改變之憂，消除了重組病毒應用對人畜的潛在威脅；重組FPV作為疫苗免疫方法簡單，生產疫苗的成本低；非常穩定，反覆凍融並不引起病毒改變和失活。人們已經研製了表達幾種禽病原的重組雞痘病毒和鴿痘病毒疫苗，它們包括禽流感的HA基因(Beard et al，1991；1992；Boyle et al，1986；Taylor et al，1988；Tripathy et al，1991)、新城疫的F和HN基因(Boursnell et al，1990；Iritani et al，1991；Letellieret al，1991；Ogawa，1990；Taylor et al，1990)、馬立克氏病的gB基因(Nazerianet al，1992)、傳染性法氏囊的VP2(Bayliss et al，199l；Heine et al，1993)基因等。與痘苗病毒不同，FPV感染範圍很窄，僅感染禽類，其宿主特異性使重組FPV(Recombinant FPV，rFPV)接種哺乳動物後僅產生一過性感染(也即流產性感染)(Taylor et al，1988)，但仍然可在較廣範圍的動物中正確表達外源基因，在細胞膜表面產生構象正確的抗原，從而誘發機體產生保護性免疫，並且安全、有效，尤其是對免疫缺陷和免疫低下的動物更是理想的載體。所以，FPV不僅可以用於研製禽類的活病毒載體疫苗，而且也可以作為非複製型載體，研製哺乳動物的活病毒載體疫苗。
圖1，pSY538質粒圖譜圖2，pSY681質粒圖譜圖3，pSC11質粒圖譜圖4.表達雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因禽痘病毒轉移載體構建圖譜圖5.表達雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因禽痘病毒轉移載體構建圖譜圖6.表達傳染性支氣管炎病毒S1基因載體構建示意圖本發明的
具體實施例方式實施例1表達傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組雞痘病毒的構建如下1.ILTVgB基因的克隆以ILTV王崗株DNA為模板，利用合成的引物(上遊引物5』-GGAGGATCCATGGCTAGCTTGAAA-3』，位於起始密碼子之前；下遊引物5』-TACTGTGAATTCTAATGTCA TTTTA-3』，位於終止子之後，兩引物間包含完整的gB基因閱讀框架，在上下遊引物的5』端引入EcoRI酶切位點)進行PCR擴增，反應條件為95℃/5分鐘，94℃/1分鐘，54℃/50秒，72℃/3分鐘，35個循環，72℃延伸5分鐘。反應體系為50μl反應體系中加5μl 10×buffer、2U TaqDNA聚合酶、2μl引物(10pmol/μl)、4μl dNTPs(200umol/L)、1μlILTV DNA、35μl滅菌去離子水。反應完畢後取5μl擴增產物，以0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增的ILTV gB基因大小為2.7kb。
將擴增的片段用EcoRI酶切後，連接到pUC119質粒載體上，形成重組質粒pUC119gB，測序結果表明ILTV王崗株gB基因的閱讀框架長2619bp，編碼873個胺基酸。gB基因的編碼蛋白在其氨基端含有21個胺基酸的信號肽序列，在羧基端從690到761位胺基酸中有一段為嵌膜序列，其胞外區有8個糖基化位點，而從762位到873位的正電荷區是一個胞內區，因此該蛋白為一跨膜蛋白。2.含gB基因的雞痘病毒轉移載體的構建重組質粒pUC119gB中2.7kb的gB基因通過EcoRI位點亞克隆到pSY538質粒雞痘病毒早晚期啟動子EP2LP2下遊處，EcoRI酶切，可切出3.2kb的pSY538載體帶和2.7kb的gB基因條帶，BglII酶切該重組子，可以切出0.687kb和5.1kb的兩條帶，將其命名為pSY638；然後，將來自pSC11質粒的痘苗病毒啟動子Pl1控制下的大腸桿菌LacZ基因用PstI，XbaI雙酶切，Klenow補平，通過平端連接克隆到pSY638質粒的SmaI位點，NotI酶切得到6kb的LacZ+gB片段帶和3.2kb的pSY538載體帶，將載體命名為pSY738，再將含LP2EP2-gB基因和Pl1-LacZ基因的NotI片段從pSY738質粒中切下，接著我們再將pSY738中含gB基因和LacZ基因的NotI片段克隆到pSY681的NotI位點中，通過用NotI酶切該重組子，可以切成6kb的LacZ+gB片段帶和5.8kb pSY681載體帶，將所獲得的雞痘病毒轉移質粒命名為pSY781。3.雞胚成纖維細胞(CEF)的製備取10日齡的SPF雞胚，先後用碘酒棉和酒精棉消毒氣室部位，無菌取出雞胚，用Hank’s液洗滌胚體，去頭、四肢和內臟，剪成2mm大小的組織塊，用0.25％胰酶溶液(4ml/胚)在37℃水浴中消化12分鐘左右，然後倒掉胰酶，用Hank’s液洗滌2~3次後，再加入適量的營養液(DMEM)，吹打分散細胞，用6層紗布過濾，製成每毫升含活細胞數106-107個的細胞懸液，分裝為5ml/60mm平皿，製成CEF單層細胞。4.雞痘弱毒(S-FPV-017)種毒的製備雞痘病毒是通過以0.01PFU/Cell的劑量感染雞胚成纖維細胞。感染前，用Hank’s液洗滌細胞儘量除去培養液中殘餘的牛血清，然後在37℃溫箱中讓病毒液在細胞上吸附2小時，並且每半小時搖動病毒液一次讓其充分吸附，2小時後倒去感染液，加入含5％胎牛血清的DMEM培養液，放在37℃溫箱中培養3-4天。待第4天細胞病變(CPE)達100％時將培養基和細胞一起收穫，凍融三次後儲存於-70℃，即為雞痘病毒種毒，其滴度為106PFU/ml。5.轉染和重組雞痘病毒的篩選含ILTV糖蛋白gB基因的重組雞痘病毒轉移載體質粒pSY781的純化，參照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System說明書。將用上述方法製備80％單層的CEF細胞，用Hank’s液洗滌，然後用S-FPV-017疫苗株(3PFU/cell)感染該細胞，在37℃感作2小時，其間每20分鐘搖動病毒感作液一次，然後倒掉感染液，洗滌細胞；轉染方法按TfxTM-50脂質體轉染試劑盒說明書進行，將5μg(1μg/μl)純化重組轉移質粒(pSY781)加入50μl到150mmol/L NaCl溶液中，充分混勻，製成溶液A；同時，取10μl TransfectionReagent加到150mmol/L NaCl溶液中，充分混勻，製成溶液B。立即將溶液A、B充分混合均勻，室溫靜置10分鐘後，加到已經被S-FPV-017疫苗株感染的CEF細胞上，37℃感作1小時，倒掉轉染液，加入含5％牛血清的DMEM培養液，37℃培養至72小時出現典型的細胞病變，收取該細胞培養物反覆凍融3次作為轉染種毒。
將上述轉染種毒按10-1、10-2、10-3稀釋度接種CEF單層細胞，37℃感作2小時，感染之後倒掉感染液，加入含1％低熔點瓊脂糖的DMEM營養瓊脂，37℃培養72小時，待出現典型的細胞病變，再用含X-gal(250μg/ml)DMEM營養瓊脂進行染色，37℃培養，待出現藍色蝕斑，挑取該藍斑，放入1ml DMEM液中，凍融3次進行新一輪的蝕斑純化，共進行6輪蝕斑純化。
將ILTV王崗株的gB基因通過PCR方法擴增出來克隆到雞痘病毒轉移載體中，將此載體和雞痘病毒弱毒疫苗病毒共同感染CEF細胞，通過藍斑篩選獲得含gB基因的重組雞痘病毒。
將表達雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因重組雞痘病毒(rFPV-ILTV gB)經翅皮下注射接種(5×105PFU/羽)六周齡的SPF雞，免疫後四周以致死劑量雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強毒株進行喉內接種攻毒。結果該重組雞痘病毒免疫的雞與雞傳染性喉氣管炎病毒弱毒疫苗免疫的雞一樣，對於ILTV王崗強毒株的攻擊都獲得了100％對死亡的保護和70％對發病的保護。ELISA方法檢測結果表明，該重組病毒不僅能在機體內穩定繁殖子代病毒，而且也能穩定地表達插入重組病毒中的外源糖蛋白gB基因，從而刺激機體產生針對雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB和雞痘病毒的抗體。ILTV王崗強毒株攻擊後的雞的ILTV病毒分離和PCR檢測結果都表明，該重組病毒不僅能誘導機體產生抗體，而且也能誘導機體產生針對ILTV的細胞介導的保護性免疫應答，從而保護該重組病毒免疫雞抵抗ILTV強毒的攻擊。
用重組病毒(rFPV-ILTV gB)(5×105PFU/羽)經翅皮下注射接種六周齡的商品雞。接種後4周以致死劑量的雞傳染性喉氣管炎病毒王崗強毒株進行喉內接種攻毒。攻毒後的死亡保護率為，重組雞痘病毒免疫組100％，ILTV弱毒疫苗免疫組85％，雞痘病毒疫苗S-FPV-017免疫組70％，非免疫對照組40％。本實驗結果表明該重組雞痘病毒疫苗對商品雞的免疫保護效果比現用的ILTV弱毒疫苗更好。
將重組病毒添加保護劑製備疫苗，進一步檢測疫苗的安全性，在最小免疫劑量免疫的疫苗中，在免疫持續期內，可以保護雞抵抗強毒的攻擊。
取純化病毒液200ul，加Trizol試劑400ul，劇烈震蕩，室溫靜置10min後；加400ul三氯甲烷，震蕩搖勻後，室溫靜置10min 12500rpm離心10min；取上清移入另一EP管加入兩倍體積異戊醇混勻後，室溫靜置20min，12500rpm離心10min沉澱核酸，真空抽乾，重溶於25.5ul DEPC水中。
將RT-PCR擴增的1.7kb大小的S1基因片段用BamHI酶切後，連接到pUC19質粒載體上，進行序列測序，IBV S1基因的閱讀框架長1700bp，編碼510個胺基酸。2.重組病毒的構建將重組質粒pUC119S1中1.7kb的S1基因通過BamHII位點亞克隆到pSY538質粒中的雞痘病毒早晚期啟動子LP2EP2下遊處，鑑定方向後將其命名為pSY638；然後，將來自pSC11質粒的痘苗病毒啟動子P11控制下的大腸桿菌LacZ基因用PstI，XbaI雙酶切，之後用Klenow補平，通過平端連接克隆到pSY638質粒的SmaI位點，將載體命名為pSY738，再將含LP2EP2-S1基因和P11-LacZ基因的NotI片段從pSY738質粒中切下，克隆到pSY681的NotI位點中，所獲得的雞痘病毒轉移質粒命名為pSY781。該載體含有痘苗病毒啟動子P11控制下的大腸桿菌LacZ基因和LP2EP2控制下的S1基因。
參照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System說明書對質粒進行純化。製備雞胚成纖維細胞，待細胞達到80％單層時進行轉染，先用S-FPV-017疫苗株(3PFU/cell)感染該細胞，在37℃感作2小時，其間每20分鐘搖動病毒感作液一次，然後倒掉感染液，洗滌細胞；之後加入配製好的轉染液，37℃感作1小時，倒掉轉染液，加入含5％牛血清的DMEM培養液，37℃培養至72小時出現典型的細胞病變，收取該細胞培養物反覆凍融3次作為轉染種毒。
將上述轉染種毒按10-1、10-2、10-3稀釋度接種CEF單層細胞，37℃感作2小時，感染之後倒掉感染液，加入含1％低熔點瓊脂糖的DMEM營養瓊脂，37℃培養72小時，待出現典型的細胞病變，再用含X-gal(250μg/ml)DMEM營養瓊脂進行染色，37℃培養，待出現藍色蝕斑，挑取該藍斑，放入1ml DMEM液中，凍融3次進行新一輪的蝕斑純化，共進行6輪蝕斑純化。3.重組雞痘病毒的鑑定為了分離雞痘病毒的DNA，用0.1PFU/Cell的劑量感染單層雞胚成纖維細胞，放在37℃溫箱中培養4-6天，待CPE達到100％時，刮細胞到培養基中加入PBS後，補充10％SDS至終濃度0.4％，蛋白酶K至終濃度140μg/ml，37℃消化3-4小時，分別用等體積的飽和酚，等體積的飽和酚/氯仿(1∶1)，等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，於水相中加入2倍體積的100％冷乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc(pH4.8)，混勻，-20℃冰箱過夜，12000g離心4℃離心20分鐘，棄上清，用70％冷乙醇洗滌沉澱，真空乾燥，沉澱用滅菌的TE(10mmol/LTris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA)置於-20℃冰箱中備用。PCR試驗所使用的上遊引物為PS1 5』TTT TAT AAT TTA ACA GTT AGC GTA 3』(430-453)；下遊引物為PS2 5』TAA CAA CAC GTT GCC TTA CCA CTA 3』(1072-1095)。兩引物擴增的DNA片段長度為689bp；反應條件為95℃/5分鐘，94℃/30秒，50℃/30秒，72℃/1分鐘，30個循環；最後72℃延伸10分。在0.8％的瓊脂糖凝膠上檢測表達產物。2.2 Western blot檢測糖蛋白gB的表達用rFPV-S1和S-FPV-017感染雞胚成纖維細胞，待產生細胞病變達100％後，倒掉培養液，用PBS(pH7.4)洗細胞二次。加入等體積的2倍SDS凝膠電泳加樣緩衝液，將樣品置於沸水中煮5min裂解細胞，準備上樣。分別配製10％分離膠，5％的濃縮膠，待其聚合後，上樣電泳，同時加蛋白Marker作為對照，在BIO-RAD垂直電泳槽上80V電泳，待染料移至底部時停止電泳，用於Westernblot印跡。
將6張濾紙、一張醋酸纖維素膜(NC)剪成與凝膠同樣大小，在轉移緩衝液(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS)中浸泡3-5min。將3張3MM濾紙對齊依次放置NC、凝膠，再依次放置另三張濾紙，放置每一層時均要除去它們之間的氣泡，然後在TRANS-BLOT SD(Semi-dry Transfer Cell，BIO-RID)轉印裝置中22V電轉印45min(NC膜側靠正極，膠側靠負極)。將NC膜蛋白Marker切下用0.25％考馬斯亮藍(0.25％R250，40％甲醇，10％冰乙醇)速染5sec，之後用脫色液(40％甲醇，10％乙酸)脫色，待蛋白Marker顯示後，終止脫色。
將NC膜置於平皿內，加入封閉液(5％脫脂乳溶於PBS中，0.02％疊氮鈉，0.02％Tween-20)室溫下作用2h。將NC膜放入封閉液稀釋的一抗中(傳染性支氣管炎陽性血清，1∶100稀釋)作用1h。用PBS洗膜三次，每次10min；再將NC膜轉入洗滌液(150mmol/L NaCl，50mmol/LTris-HCl pH7.5)中室溫洗10min，將NC膜放入稀釋的酶標兔抗雞IgG(稀釋液1％BSA，150mmol/LNaCl，50mmol/LTris-Cl pH7.5)酶標兔抗雞IgG(1∶10000稀釋)室溫下輕輕振蕩作用1h。取出NC膜於洗滌液中衝洗3次，每次10min，將NC膜浸入10ml鹼性磷酸酶緩衝液中避光顯色5-15min，待檢測的目的片段顯示後，可以看到有特異的片段出現後，終止反應。
經過PCR和Western-Blot分析證明重組雞痘病毒中含有IBV的S1基因，並獲得了表達。
ILTV gB基因核苷酸序列ATGGCTAGCTTGAAAATGCTGATCTGCGTGTGCGTGGCAATCCTGATCCCATCTACCCTATCTCAAGATTCACACGGAATTGCTGGAATAATAGACCCTCATGATACAGCCAGCATGGATGTTGGAAAAATCTCTTTCTCCGAAGCCATTGGGTCGGGGGCACCGAAAGAACCCCAGATTAGAAACAGAATTTTTGCGTGCTCATCTCCAACTGGCGCCAGTGTTGCGAGGCTTGCCCAGCCACGACATTGTCACCGACATGCCGATTCGACTAACATGACTGAAGGAATTGCCGTAGTCTTCAAGCAAAACATTGCCCCGTACGTCTTTAATGTGACTCTATACTATAAACATATAACCACAGTTACTACGTGGGCATTATTCTCAAGACCCCAAATAACAAATGAGTACGTGACCAGGGTTCCAATAGACTATCATGAAATTGTCAGGATTGATCGATCGGGAGAATGCTCATCCAAAGCAACGTATCATAAAAATTTCATGTTTTTTGAAGCTTACGACAATGATGAAGCAGAAAAAAAATTGCCCCTGGTTCCATCACTGTTAAGATCAACTGTCTCCAAGGCGTTTCATACAACTAACTTTACTAAGCGACATCAAACCCTGGGATACCGAACGTCTACATCGGTCGACTGTGTTGTGGAATATCTACAGGCTAGATCTGTATACCCGTATGATTACTTTGGAATGGCGACAGGTGATACAGTAGAAATTTCTCCTTTTTATACCAAAAACACGACCGGACCAAGGCGTCACAGTGTCTACAGAGACTATAGATTTCTCGAAATCGCAAATTATCAAGTCAGGGATTTGGAAACCGGACAAATAAGACCCCCTAAAAAAAGAAACTTTCTAACAGATGAACAATTCACTATAGGCTGGGATGCAATGGAAGAAAAGGAATCTGTATGTACTCTCAGTAAATGGATTGAAGTCCCGGAAGCAGTTCGTGTTTCGTACAAAAACAGTTACCACTTTTCACTTAAAGATATGACTATGACGTTCTCGTCCGGAAAACAACCTTTTAACATCAGCAGGCTTCATTTGGCTGAATGCGTTCCTACCATAGCCTCGGAGGCCATAGATGGCATCTTTGCCAGAAAGTATAGTTCGACTCATGTCCGTTCTGGGGACATCGAATACTATCTCGGTAGTGGCGGATTTCTGATCGCATTTCAGAAACTCATGAGCCATGGCTTGGCTGAAATGTACCTAGAAGAGGCACAAAGACAAAATCATCTCCCGAGAGGGAGAGAGCGTCGCCAAGCCGCAGGTCGCCGCACGGCGTCGCTGCAGTCTGGACCTCAGGGTGATAGAATTACTACCCACAGTTCTGCAACATTTGCCATGTTACAATTTGCATACGACAAAATCCAAGCCCATGTTAACGAGCTTATCGGAAATTTGTTGGAAGCGTGGTGTGAGCTTCAGAACCGCCAACTGATTGTATGGCACGAGATGAAGAAACTAAACCCGAACTCACTGATGACATCTTTGTTCGGACAACCTGTAAGCGCCAGGCTATTGGGAGACATCGTAGCGGTATCAAAATGTATAGAAATTCCAATCGAAAATATTAGGATGCAGGATTCCATGCGCGTGCCAGGGGACCCAACCATGTGCTATACCAGACCAGTACTTATTTTCAGGTATTCGTCCTCCCCTGAGTCACAGTTTTCTGCGAACTCAACAGAAAACCACAATCTTGACATATTAGGCCAACTCGGAGAACATAATGAAATTTTACAAGGGCGGAATTTGATAGAACCATGCATGATCAATCACAGACGGTACTTTCTGTTGGGAGAAAACTACCTTCTTTACGAAGACTATACATTTGTTAGACAAGTAAATGCTTCCGAGATCGAAGAAGTGAGCACATTCATCAACTTGAACGCCACTATACTAGAAGATTTGGACTTTGTGCCCGTCGAAGTATACACTCGCGAGGAACTCAGAGATACTGGGACTTTAAACTATGATGATGTGGTCAGATATCAAAATATITATAACAAAAGGTTCAGAGACATTGACACTGTAATACGTGGAGATAGGGGAGATGCAATCTTTAGAGCAATAGCAGATTTTTTTGGCAACACTCTTGGAGAAGTAGGAAAGGCATTGGGAACTGTAGTGATGACAGCCGCGGCAGCAGTAATTTCTACAGTATCTGGCATCGCCTCATTTCTTTCTAACCCGTTCGCCGCACTCGGAATTGGGATAGCGGTGGTGGTGAGCATTATTTTAGGACTGCTGGCGTTCAAATATGTAATGAACCTGAAATCAAACCCAGTTCAGGTTCTGTTCCCAGGCGCAGTTCCCCCGGCCGGAACTCCTCCACGACCCTCTAGACGTTACTACAAGGATGAGGAGGAGGTTGAGGAGGATAGTGATGAGGACGACAGGATACTTGCCACCAGAGTTCTGAAAGGCCTTGAGCTTCTACACAAGGATGAACAGAAAGCTCGAAGACAGAAAGCGCGGTTTTCTGCTTTTGCTAAAAATATGAGAAACCTATTTCGCAGAAAACCCCGAACCAAGGAAGATGACTACCCCCTGCTCGAATACCCTTCGTGGGCAGAAGAAAGCGAAGACGAATAAILTV gB基因編碼胺基酸序列MASLKMLICVCVAILIPSTLSQDSHGIAGIIDPHDTASMDVGKISFSEAIGSGAPKEPQIRNRIFACSSPTGASVARLAQPRHCHRHADSTNMTEGIAVVFKQNIAPYVFNVTLYYKHITTVTTWALFSRPQITNEYVTRVPIDYHEIVRIDRSGECSSKATYHKNFMFFEAYDNDEAEKKLPLVPSLLRSTVSKAFHTTNFTKRHQTLGYRTSTSVDCVVEYLQARSVYPYDYFGMATGDTVEISPFYTKNTTGPRRHSVYRDYRFLEIANYQVRDLETGQIRPPKKRNFLTDEQFTIGWDAMEEKESVCTLSKWIEVPEAVRVSYKNSYHFSLKDMTMTFSSGKQPFNISRLHLAECVPTIASEAIDGIFARKYSSTHVRSGDIEYYLGSGGFLIAFQKLMSHGLAEMYLEEAQRQNHLPRGRERRQAAGRRTASLQSGPQGDRITTHSSATFAMLQFAYDKIQAHVNELIGNLLEAWCELQNRQLIVWHEMKKLNPNSLMTSLFGQPVSARLLGDIVAVSKCIEIPIENIRMQDSMRVPGDPTMCYTRPVLIFRYSSSPESQFSANSTENHNLDILGQLGEHNEILQGRNLIEPCMINHRRYFLLGENYLLYEDYTFVRQVNASEIEEVSTFINLNATILEDLDFVPVEVYTREELRDTGTLNYDDVVRYQNIYNKRFRDIDTVIRGDRGDAIFRAIADFFGNTLGEVGKALGTVVMTAAAAVISTVSGIASFLSNPFAALGIGIAVVVSIILGLLAFKYVMNLKSNPVQVLFPGAVPPAGTPPRPSRRYYKDEEEVEEDSDEDDRILATRVLKGLELLHKDEQKARRQKARFSAFAKNMRNLFRRKPRTKEDDYPLLEYPSWAEESEDE新城疫病毒F基因核苷酸序列圖CTGGCACTGAGCTGTGTCCGTCTGACAAATTCTCTCGATGGAAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTAGTAACGGGAGACAAAGCAGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATAATAGTCAAGTTACTCCCAAATATGCCTAAGGATAAAGAGGCGTGTGCAAAAGCCCCGTTGGAGGCATACAACAGGACACTGACTGCTTTGCTCACCCCCCTTGGTGATTCTATCCGCAGGATACAAGAGTCTGCGACTACGTCCGGAGGAAGGAGGCAGAGACGCTTTATAGGTGCCATTATCGGCAGTGTAGCTCTTGGGGTTGCCACAGCTGCCCAGATAACAGCAGCCTCAGCTCTGATACAAGCCAACCAGAATGCTGCCAACATCCTCCGGCTTAAAGAGAGCATTGCTGCAACTAATGAAGCTGTACATGAAGTCACTGACGGATTATCGCAACTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTTAATGACCAGTTTAATAACACAGCTCAGGAATTGGACTGTATAAAAATTACACAGCAGGTTGGTGTAGAACTCAACCTGTACCTAACTGAATTGACTACAGTATTCGGGCCACAAATCACTTCCCCTGCCTTAACTCAGCTGACTATCCAGGCGCTTTACAATCTAGCTGGTGGTAAGATGGATTATTTGTTGACTAAGTTAGGTGTTGGGAACAACCAACTCAGCTCATTAATCGGTAGCGGCTTGATCACCGGTAACCCTATTCTGTACGATTCACAGACTCAACTCTTAGGTATACAGGTAACTTTACCCTCAGTCGGTAACCTAAATAATATGCGTGCTACCTACTTGGAGACCTTGTCTGTAAGCACAACCAAGGGATTTGCCTCAGCACTTGTCCCAAAAGTGGTGACACAGGTCGGGTCTGTGATAGAGGAACTTGACACCTCATACTGTGTAGAGACCGATTTGGATTTATATTGTACAAGAATAGTGACATTCCCTATGTCTCCTGGTATTTATTCCTGTCTGAGCGGTAATACATCAGCTTGCATGTATTCAAAGACTGAAGGTGCACTTACTACGCCATATATGACTATCAAGGGCTCAGTTATTGCCAATTGCAAGATAACAACATGCAGATGTGCAGACCCTCCGGGTATCATATCGCAAAATTATGGAGAAGCTGTGTCTCTAATAGATAGGCACTCATGCAATGTCTTATCCTTAGACGGGATAACTTTGAGGCTCAGTGGAGAATTTGACGTAACTTATCAAAAGAATATCTCAATATTAGATTCTCAGGTAATAGTGACAGGCAATCTCAATATCTCAACTGAACTTGGGAATGTCAACAACTCGATAAGTAATGCTTTGGATAAGTTAGAGGAAAGCAATAGCAAACTTGACAAAGTCAATGTCAAGCTGACCGGCACGTCTGCTCTCATTACCTATATAGTTTTAACTATCATATCTCTTGTTTGTGGTATACTTAGCCTGGTTCTAGCATGCTATCTGATGTATAAGCAAAAGGCGCAACAAAAGACCTTATTATGGCTTGGGAATAATACCCTAAATCAGATGAGGGCCACTACAAGAATCTGA根據新城疫病毒F基因核苷酸序列推導的胺基酸序列圖LALSCVRLTNSLDGRPLAAAGIVVTGDKAVNIYTSSQTGSIIVKLLPNMPKDKEACAKAPLEAYNRTLTALLTPLGDSIRRIQESATTSGGRRQRRFIGAIIGSVALGVATAAQITAASALIQANQNAANILRLKESIAATNEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQFNNTAQELDCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGGKMDYLLTKLGVGNNQLSSLIGSGLITGNPILYDSQTQLLGIQVTLPSVGNLNNMRATYLETLSVSTTKGFASALVPKVVTQVGSVIEELDTSYCVETDLDLYCTRIVTFPMSPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGALTTPYMTIKGSVIANCKITTCRCADPPGIISQNYGEAVSLIDRHSCNVLSLDGITLRLSGEFDVTYQKNISILDSQVIVTGNLNISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTGTSALITYIVLTIISLVCGILSLVLACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLNQMRATTRI.傳染性支氣管炎病毒S1基因核苷酸序列圖ATGTTGGGGAAGTCACTGTTTTTAGTGACCATTTTGTGTGCACTATGTAGTGCAAATTTGTTCGATCCTGCCAATTATGTGTACTACTACCAAAGTGCCTTTAGGCCTTCAAATGGGTGGCATTTGCAAGGGGGTGCTTATGCAGTAGTGAATTCTTCTAATTATGCTAATAATGCAGGTTCTGCATCTGAGTGCACTGTTGGTGTTATTAAGGATGTCTATAATCAAAGTGCGGCTTCCATAGCTATGACAGCACCTCTTCAGGGTATGGCTTGGTCTAAGTCACAATTTTGTAGTGCACACTGTGACTTTTCTGAAATTACAGTTTTTGTCACACATTGTTATAGTAGTGGATCAGGGTCTTGTCCTATAACAGGCATGATTGCACGTGGTCATATTCGTATTTCTGCAATGAAAAATGGTTCTTTATTTTATAATTTAACAGTTAGCGTATCTAAATACCCTAATTTTAAATCTTTTCAATGTGTTAACAACTTCACATCTGTTTATTTAAATGGTGATCTTGTTTTTACTTCCAACAAAACTACTGATGTTACGTCAGCAGGTGTCTATTTTAAAGCAGGTGGACCTGTAAATTATAGTATTATGAAAGAATTTAAGGTTCTTGCTTACTTTGTTAATGGTACAGCACAAGATGTAATTTTGTGTGATAACTCCCCCAAGGGTTTGCTAGCTTGTCAATATAACACTGGCAATTTTTCAGATGGCTTTTATCCTTTTACTAATAGTACTTTAGTTAGGGAAAAGTTCATTGTCTATCGTGAAAGTAGTGTTAATACTACTTTGGCGTTAACTAATTTCACTTTTACTAATGTAAGTAATGCACAGCCTAATAGTGGCGGTGTTCATACTTTTCATTTATATCAAACACAAACAGCTCAGAGTGGTTATTATAATTTTAATTTGTCATTTCTGAGTCAGTTTGTGTATAAGGCAAGTGATTATATGTATGGGTCTTACCACCCTATTTGTGCTTTTAGACCAGAAACCATTAATAGTGGTTTGTGGTTTAATTCCTTGTCAGTTTCTCTTACTTATGGACCCCTACAGGGAGGGTATAAGCAATCTGTTTTTAGTGGTAAGGCAACGTGTTGTTATGCCTACTCTTATAATGGCCCAAGGGCATGTAAAGGTGTTTATTCAGGTGAATTAAGCAGGGATTTTGAATGTGGATTGCTGGTTTATGTTACTAAGAGTGATGGCTCTCGTATACAGACTAGAACGGAGCCCTTAGTATTAACGCAACACAATTATAATAATATTACTTTAGATAAGTGTGTTGCCTATAATATATATGGCAGAGTAGGCCAAGGTTTTATTACTAATGTGACTGATTCTGTTGCTAATTTTAGTTATTTAGCAGATGGTGGGTTAGCTATTTTAGATACGTCGGGTGCCATAGATGTTTTTGTTGTACAGGGCAGCTATGGTCTTAATTATTACAAGGTTAATCCTTGTGAAGATGTTAACCAACAGTTTGTAGTGTCTGGTGGCAATATAGTTGGCATT傳染性支氣管炎病毒S1蛋白胺基酸序列圖MLGKSLFLVTILCALCSANLFDPANYVYYYQSAFRPSNGWHLQGGAYAVVNSSNYANNAGSASECTVGVIKDVYNQSAASIAMTAPLQGMAWSKSQFCSAHCDFSEITVFVTHCYSSGSGSCPITGMIARGHIRISAMKNGSLFYNLTVSVSKYPNFKSFQCVNNFTSVYLNGDLVFTSNKTTDVTSAGVYFKAGGPVNYSIMKEFKVLAYFVNGTAQDVILCDNSPKGLLACQYNTGNFSDGFYPFTNSTLVREKFIVYRESSVNTTLALTNFTFTNVSNAQPNSGGVHTFHLYQTQTAQSGYYNFNLSFLSQFVYKASDYMYGSYHPICAFRPETINSGLWFNSLSVSLTYGPLQGGYKQSVFSGKATCCYAYSYNGPRACKGVYSGELSRDFECGLLVYVTKSDGSRIQTRTEPLVLTQHNYNNITLDKCVAYNIYGRVGQGFITNVTDSVANFSYLADGGLAILDTSGAIDVFVVQGSYGLNYYKVNPCEDVNQQFVVSGGNIVGI
權利要求
1，一種表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，是一種抗傳染性喉氣管炎和其它禽病毒病的重組雞痘病毒活載體疫苗，其特徵是將雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保護性抗原基因插入雞痘病毒弱毒基因組中構建重組雞痘病毒活載體疫苗。
2，根據權利要求1所述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特徵是含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因全部編碼框(ORF)，該ORF含有2619個鹼基，編碼873個胺基酸；
3，根據權利要求2所述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特徵是插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因的上遊有雞痘病毒早晚期啟動子(LP2EP2)。
4，根據權利要求1所述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特徵是含有傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因；
5，根據權利要求4所述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特徵是插入的傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的上遊分別連有雞痘病毒早晚期啟動子(LP2EP2)；
6，根據權利要求1所述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特徵是含有傳染性支氣管炎病毒S1基因病
7，根據權利要求6所述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特徵是插入的傳染性支氣管炎病毒S1基因的上遊連有雞痘病毒早晚期啟動子(LP2EP2)；
8，根據權利要求1所述的表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒，其特徵是將傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒主要保護性抗原基因插入到雞痘病毒基因組一1.7Kb的EcoRI片段中。
9，一種表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒在預防雞痘及傳染性喉氣管炎和/或其它禽病毒病方面的應用。
全文摘要
表達喉氣管炎或其它禽病毒基因重組禽痘病毒及其應用，剛出殼的雛雞個體很小，但面臨的病毒性疾病很多，多種疫苗同時注射常常不堪重負。本發明的內容包括將雞傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白gB基因和/或其它禽病毒主要保護性抗原基因插入雞痘病毒弱毒基因組中構建重組雞痘病毒活載體疫苗，它利用雞痘病毒弱毒作為載體構建可以表達傳染性喉氣管炎病毒gB基因和/或其它禽病毒病主要保護性抗原基因的重組禽痘病毒活載體疫苗，外源病毒基因在禽痘病毒早晚期啟動子LP
文檔編號C12P21/02GK1472315SQ0313245
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月19日 優先權日2003年6月19日
發明者童光志, 王雲峰, 張紹傑, 智海東, 劉勝旺, 仇華吉, 王玫 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所