生產丁二酸的重組大腸桿菌及其應用的製作方法

2023-08-01 14:14:21 2

生產丁二酸的重組大腸桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及通過大腸桿菌發酵生產丁二酸的領域。具體而言，本發明提供了一種用於生產丁二酸的經工程化的重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有如下的一或多種修飾：a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因的活性增強，b)sthA基因的活性增強,和c)突變的lpdA基因。本發明還涉及使用所述經工程化的重組大腸桿菌用於生產丁二酸的用途，以及使用所述經工程化的重組大腸桿菌生產丁二酸的方法。
【專利說明】生產丁二酸的重組大腸桿菌及其應用發明領域
[0001]本發明涉及通過大腸桿菌發酵生產丁二酸的領域。具體而言，本發明提供了一種用於生產丁二酸的經工程化的重組大腸桿菌。本發明還涉及使用所述經工程化的重組大腸桿菌用於生產丁二酸的用途，及使用所述經工程化的重組大腸桿菌生產丁二酸的方法。
發明背景
[0002]丁二酸又稱作琥珀酸，是一種優秀的平臺化合物，在化工、材料、醫藥、食品領域有著廣泛的用途，被美國能源部列為未來12種最有價值的平臺化合物之一(McKinlay etal.2007, Appl Microb1l B1technol76:727-740)。丁二酸目前主要應用於酯化溶劑、除冰裝置、發動機冷卻劑、食品香精、水處理化學品等。丁二酸還可以用於生產很多下遊產品，如1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內酯、N-甲基吡咯烷酮、2-吡喏烷酮。另外，丁二酸和1，4-丁二醇聚合能得到PBS (聚丁二酸丁二醇酯)塑料，其是一種性能優良的生物全降解塑料。據估計丁二酸未來的市場潛力每年將超過270萬噸。大約有250種可以用苯為原料生產的化工產品都可以通過丁二酸為原料生產(McKinlay et al.2007, Appl Microb1lB1technoI76:727-740)。
[0003]目前丁二酸的生產主要是基於順酐為原料的石油化工路線。石油價格近年來波動很大，這嚴重製約了丁二酸生產的可持續性和價格穩定。另一方面，化學合成法工藝複雜且常需高溫高壓，這大大增加了生產所需的能耗物耗；同時化學合成還會造成嚴重的環境汙染。開發丁二酸的高效生物製造技術能從根本上解決石油化工路線的弊端:保證丁二酸價格穩定不受制於石油價格波動，降低PBS塑料的製造成本，促進其進一步的推廣應用；實現綠色可持續生產、簡化生產工藝、節能減排、減少環境汙染。另外，丁二酸的生物製造過程中還可以吸收二氧化碳，對實現低碳經濟具有很好的促進作用。丁二酸生物製造技術的核心就是能夠將生物質原料高效轉化為丁二酸的微生物菌株。
[0004]目前丁二酸發酵菌種主要有兩大類。第一類是天然產丁二酸菌，主要有產丁二酸放線桿菌(Actinobacillus succinogens) (Guettler et al.1996, US PatentN0.5504004)> 產丁二酸厭氧螺菌(Anaerob1spirillum succiniciproducens)(Glassner and Dattal992, US Patent N0.5143834)、產丁二酸曼海姆菌(Mannheimiasucciniciproducens) (Lee et al.2002, Appl Microb1l B1technol58:663-668)和巴斯夫玻拍菌(Basfia succiniciproducens) (Scholten et al.2009, B1technolLett31:1947-1951)。另一類是通過代謝工程改造的工程菌，主要是大腸桿菌。
[0005]天然產丁二酸菌雖然能夠高產丁二酸，但其自有很多缺陷。發酵過程中，糖酸轉化率低，有相當一部分碳源流入到其他有機酸的合成。另外，天然產丁二酸菌發酵過程中需要豐富培養基，提高了生產成本和下遊分離純化成本，限制了其大規模工業化生產。大腸桿菌在糖發酵過程中雖然只積累少量的丁二酸，但由於其生理遺傳背景都很清晰，易於改造，因此很多研究單位都選取大腸桿菌作為出發菌種，將其改造成高產丁二酸的工程菌。
[0006]磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是丁二酸合成途徑的關鍵前體。將PEP羧化成草醯乙酸(OAA)是丁二酸合成途徑的關鍵步驟。Millard等人通過過表達大腸桿菌的PEP羧化酶基因 ppc,將丁二酸的產量提高了 3.5 倍(Millard et al., 1996, Appl EnvironMicrob1l62:1808-1810)。Kim等人發現在野生型大腸桿菌中過表達PEP羧化激酶基因pck,對丁二酸生產沒有影響，但在敲除了 ppc基因的大腸桿菌中過表達pck基因，能將丁二酸的產量提高 6.5 倍(Kim et al.，2004，Appl Environ Microb1l70:1238-1241)。韓國Kwon等人進一步發現當發酵液中含有高濃度碳酸氫根離子時，在野生型大腸桿菌中過表達pck基因，能將丁二酸的產量提高2.2倍(Kwon et al., 2006, J Microb1lB1technoll6:1448 - 1452)。
[0007]Chatterjee等人通過在大腸桿菌中敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和乳酸脫氫酶基因ldhA，構建了工程菌NZN111。該菌株不能以葡萄糖為碳源發酵生長，但可以以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等為碳源發酵生成丁二酸、乙酸和乙醇。在此基礎上篩選出能夠重新利用葡萄糖為碳源發酵生長的突變菌株AFPlll (Chatterjeeet al.，2001，Appl Environ Microb1167:148-154;Donnelly et al.，1998，ApplB1chem B1technol70_72:187-198)。Vemuri 等人通過在 AFPlll 中高表達埃特裡根瘤菌(Rhizobium etli)的丙酮酸羧化酶基因pyc,進一步提高了丁二酸的產量。在兩步法培養(先好氧培養，然後厭氧發酵產酸)條件下，丁二酸的最終濃度可達到99.2g/L (841mM),糖酸轉化率為 1.lg/g (1.68mol/mol) (Vemuri et al., 2002, J Ind Microb1lB1technol28:325-332)。
[0008]Sanchez等人通過敲除醇脫氫酶基因adhE、IdhA、乙酸激酶基因ackA、磷酸乙醯轉移酶基因pta、異檸檬酸裂解酶調控蛋白基因iclR，構建出工程菌SBS550MG。在兩步法培養(先好氧培養，然後厭氧發酵產酸)條件下，可以生產40g/L(339mM)的丁二酸，糖酸轉化率達到 1.06g/g (1.61mol/mol) (Sanchez et al., 2005, Metab Eng7:229-239)。
[0009] Vemuri等人和Sanchez等人構建出的重組大腸桿菌雖然能生產高濃度的丁二酸，但仍有一些缺陷。發酵過程採用的是兩步發酵，即先採用好氧過程將細胞培養生產起來，再轉變為厭氧過程進行發酵。這種工藝操作複雜，而且好氧工藝會大大提高設備的構建和運行成本。這些重組大腸桿菌都需要使用豐富培養基，這將極大地提高發酵的原料成本，並導致計算的轉化率偏高。
[0010]Jantama等人通過敲除ldhA、adhE、甲酸轉運蛋白基因focA、pflB、ackA、甲基乙二醛合成酶基因mgsA、丙酮酸氧化酶基因poxB，並經過進化代謝，構建出重組大腸桿菌KJ073。使用無機鹽培養基，在厭氧條件下可以生產79g/L(668mM)的丁二酸，糖酸轉化率達到 0.79g/g (1.2mol/mol) (Jantama et al., PCT/US2008/057439; Jantama etal., 2008a, B1technol B1eng99:1140-1153)。進一步敲除丙酸激酶基因 tdcD、2_ 酮基丁酸甲酸裂解酶/丙酮酸甲酸裂解酶基因tdcE、天冬氨酸氨基轉移酶基因aspC、蘋果酸酶基因sfcA，並經過進化代謝，構建出重組大腸桿菌KJ122。使用無機鹽培養基，在厭氧條件下可以生產 80g/L(680mM)的丁二酸,糖酸轉化率達到 0.89g/g(l.36mol/mol) (Jantamaetal., PCT/US2008/057439; Jantama et al., 2008b, B1technol B1englOl: 881-893)。上述的兩個重組大腸桿菌都是經過進化代謝提高了丁二酸的生產能力。Zhang等人還通過敲除PEP-糖磷酸轉移酶的酶I基因ptsl、pflB基因，並增強PEP羧化激酶(PCK)的活性，構建出重組大腸桿菌XZ721。使用無機鹽培養基，在厭氧條件下可以生產39g/L(327mM)的丁二酸，糖酸轉化率達到 0.82g/g(l.25mol/mol) (Zhang et al., PCT/US2010/029728; Zhang etal.,2009b, Appl Environ Microb1l75:7807-7813)。
[0011]為了提高大腸桿菌生產丁二酸的產量和/或轉化率，需要進一步對大腸桿菌的代謝途徑進行改造。
發明概述
[0012]一方面，本發明提供了一種用於生產丁二酸的重組大腸桿菌。
[0013]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，所述大腸桿菌中含有如下修飾:(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)中所涉及的基因表達的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的抑制，⑵PflB和/或adhE基因表達的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制，(3)ldhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制，和(4)galP基因和/或外源gif基因表達的增強、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質活性的增強；其中所述大腸桿菌還含有如下的一或多種修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達的增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(b) SthA基因表達的增強、和/或SthA基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0014]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)所涉及的基因表達的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的抑制，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統酶I的基因ptsl、編碼PTS系統酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統酶IIAele的基因err和編碼PTS系統酶IICBae的基因ptsG。
[0015]在另一個實施方案中，本發明的大腸桿菌的磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質的活性增強，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼轉酮醇酶的基因tktA、編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因zwf、編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的基因pgl、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd、編碼5-磷酸核糖異構酶的基因rp1、編碼5-磷酸核酮糖差向異構酶的基因rpe和編碼轉醛醇酶的基因talB。
[0016]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中SthA基因和tktA基因的表達增強、和/或SthA基因和tktA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0017]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQ ID N0.:1所示胺基酸序列的如下位置的位置上含有修飾:T81、P275和A358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於T81的位置上的修飾是用I置換T，在對應於P275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於A358的位置上的修飾是用V置換A。 在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0018]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，並且所述突變的IpdA基因位於染色體中或者質粒中。
[0019]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達的增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(b) SthA基因表達的增強、和/或SthA基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(c)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQIDN0.:1所示胺基酸序列的如下位置的位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對應於Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0020]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(5) ackA和pta基因表達的抑制、和/或ackA和pta基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(6) aceBA基因簇表達的增強、和/或aceBA基因簇所編碼的蛋白質活性的增強；(7)dcuC基因表達的增強、和/或dcuC基因簇所編碼的蛋白質活性的增強；和(8)mgsA基因表達的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質活性的抑制。
[0021]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下修飾:(9)pck基因表達的增強、和/或PCk基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0022]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下修飾:(10) adhE基因表達的抑制、和/或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制；和(11) tdcDE基因簇表達的抑制、和/或tdcDE基因簇所編碼的蛋白質活性的抑制。
[0023]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(12)aceEF基因簇表達的增強、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質活性的增強。
[0024]在第二方面，本發明提供了一種生產丁二酸的方法，其中包括培養本發明的大腸桿菌的步驟。
[0025]在第三方面，本發明涉及本發明的大腸桿菌在生產丁二酸中的用途。
附圖簡述
[0026]圖1:改造大腸桿菌獲得重組菌株NZ-037的示意圖。X代表基因敲除，包括ldhA、pflB、ptsl、ackA-pta基因。四角星代表基因表達的增強,包括galP、pck、aceBA、dcuC基因。
[0027]圖2:NZ-037經過1080代進化獲得菌株HX021。
[0028]圖3:HX023經過360代進化獲得菌株HX024。
[0029]圖4:HX024在5L發酵罐水平發酵生產丁二酸。
[0030]圖5:HX027經過650代進化獲得菌株HX028。
[0031]圖6:HX028在5L發酵罐水平發酵生產丁二酸。
[0032]圖7:HX024的轉錄組分析。灰色方框和白色方框中的數字代表HX024基因表達強度和野生型大腸桿菌ATCC8739的相對值；縮寫詞:GLC:葡萄糖；G6P:6_磷酸葡萄糖；F6P:6-磷酸果糖；FBP:1，6-二磷酸果糖；GAP:3_磷酸甘油醛；DHAP:磷酸二羥基丙酮；GBP:1，3- 二磷酸甘油酸；G3P:3-磷酸甘油酸；PEP:磷酸烯醇式丙酮酸；0ΑΑ:草醯乙酸；MAL:蘋果酸；FUM:富馬酸；SUC:丁二酸；6PGCL:6_磷酸葡萄糖酸內酯；6PGC:6_磷酸葡萄糖酸；RL5P:5_磷酸核酮糖；X5P:5-磷酸核糖；R5P:5_磷酸木糖；S7P -J-磷酸景天庚酮糖；E4P:4-磷酸赤鮮糖；PYR:丙酮酸；ACA:醯基輔酶A;ACP:醯基磷酸；ACE:乙酸；CIT:檸檬酸；ICIT:異檸檬酸；GLO:乙醛酸；DLAC:D-乳酸;FOR:甲酸;ETH ;乙醇；NAD+:氧化型尼克煙醯胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH:還原型尼克煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；NADH:還原型尼克煙醯胺腺嘌呤二核苷酸；NADP+:氧化型尼克煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。galP:半乳糖透型酶基因；glk:葡萄糖激酶基因；gapA:3-磷酸甘油脫氫酶基因；pfkA:6磷酸果糖激酶基因；pck:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；mdh:蘋果酸脫氫酶基因；fumA:富馬酸水合酶酶I基因；frdAB⑶:富馬酸還原酶基因；zwf:6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因；pgl:6_磷酸葡萄糖酸內酯酶基因；gnd:6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因；rpe:5_磷酸核酮糖差向異構酶基因；rpiAB:
5-磷酸核糖差向異構酶基因；tktA:轉酮醇酶基因；tktB:轉酮醇酶基因；talB:轉醛醇酶基因；pykF:丙酮酸激酶基因；pdh:丙酮酸脫氫酶基因；pta:磷酸乙醯轉移酶基因；ackA:乙酸激酶基因；gltA:檸檬酸合成酶基因；acn:順烏頭酸酶基因；aceB:蘋果酸合成酶基因；aceA:異檸檬酸裂解酶基因；sthA:嘧啶核苷酸轉氫酶基因；maeB:NADPH依賴蘋果酸酶基因；dcuB:厭氧C4雙羧酸轉運蛋白基因；dcuC:C4雙羧酸轉運蛋白基因；dctA:好養C4雙羧酸轉運蛋白基因。
[0033]圖8: (A)野生型IpdA基因以及突變的IpdA基因(IpdA*)的核苷酸序列比對；(B)野生型以及突變的IpdA基因(IpdA*)所編碼的多肽的胺基酸序列比對。
[0034]發明詳述
[0035]除非另有說明，所有技術和科學術語都具有本領域所知的常見含義。所有專利、專利申請、公開出版物、序列、以及其他公開材料均援引加入本文，除非另有說明。
[0036]一方面，本發明提供了一種用於生產丁二酸的經工程化改造的重組大腸桿菌。在本發明的大腸桿菌中，通過調節代謝途徑中所涉及的一些酶的活性，從而改善了大腸桿菌丁二酸的產量和/或轉化率。
[0037]如本文所用，術語「經工程化改造的重組大腸桿菌」、「工程化的大腸桿菌」和「重組大腸桿菌」可互換使用，均是指經過修飾的大腸桿菌，其中所述的修飾可以是，例如，基因表達的增強、基因表達的抑制、引入新的基因、引入突變的基因或者對基因進行突變等，其中可以通過本領域常規的技術手段實現基因表達的增強或基因表達的抑制，例如基因的敲除、改變基因的拷貝數、引入質粒、改變基因的啟動子(例如使用強啟動子或弱啟動子)等。
[0038]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下的一或多種修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(b)sthA基因的表達增強、和/或SthA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0039]如本文所用，術語「磷酸戍糖途徑(pentose-phosphate pathway) 」具有本領域內熟知的含義。磷酸戊糖途徑是在動物、植物和微生物中普遍存在的一條糖的分解代謝途徑，其特徵在於葡萄糖被直接氧化脫氫和脫羧，而不經過糖酵解，脫氫酶的輔酶不是NAD+而是NADP+,產生的NADPH作為還原力以供生物合成用，而不是傳遞給O2。
[0040]在一些實施方案中，本發明的大腸桿菌的磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達增強、或者磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質的活性增強，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼轉酮醇酶的基因tktA、編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因zwf、編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的基因pgl、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd、編碼5-磷酸核糖異構酶的基因rp1、編碼5-磷酸核酮糖差向異構酶的基因rpe和編碼轉醒醇酶的基因talB。
[0041]在本發明中，tktA基因(Genbank No:ACA76448.1)所編碼的蛋白質的是轉酮醇酶(ECNo: 2.2.1.l)，zwf基因(Genbank No:ACA77430.1)所編碼的蛋白質的是6-磷酸葡萄糖脫氫酶(EC No: 1.1.1.49) ;pgl基因(Genbank No:ACA78522.1)所編碼的蛋白質的是6-磷酸葡糖酸內酯酶(EC No:3.1.1.31) ;gnd基因(Genbank No:ACA76645.1)所編碼的蛋白質的是6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(EC No: 1.1.1.44) ;rpi基因(Genbank No:ACA76468.1)所編碼的蛋白質的是5_憐酸核糖異構酶(EC No:5.3.1.6) ;rpe基因(Genbank No:ACA76005.1)所編碼的蛋白質的是5-磷酸核酮糖差向異構酶(EC No:5.1.3.1) ;talB基因(GenbankNo:ACA79258.1)所編碼的蛋白質的是轉醛醇酶(EC No:2.2.1.2)。
[0042]sthA 基因(Genbank No: ACA79653.1)編碼一種可溶性轉氧酶(EC No: 1.6.1.1)。在一個實施方案中，本發明的sthA基因的序列如SEQ ID N0.:5所示。在一個實施方案中，本發明的sthA基因的序列與SEQ ID N0.: 5所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列相同性。
[0043]在一個實施方案中，本發明的tktA基因的序列如SEQ ID N0.: 6所示。在一個實施方案中，本發明的tktA基因的序列與SEQ ID N0.:6所示的核苷酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的序列相同性
[0044]如本文所用，術語「基因表達增強」，其具有本領域內熟知的含義，是指基因表達強度的增強，並導致基因轉錄後產生的mRNA數量的增加。基因表達增強可以通過如下方式實現，例如但不限於:在基因前引入強啟動子、增加基因的拷貝數、或者增強mRNA的穩定性等。如本文所用，術語「基因所編碼的蛋白活性增強」具有本領域內熟知的含義，是指基因轉錄翻譯後產生的蛋白活性的增加。其可以例如通過基因表達強度的增強、增加酶在細胞中的含量、胺基酸位點的突變來實現。實現「基因的表達增強」以及「基因所編碼的蛋白質的活性增強」的各種技術手段是本領域技術人員熟知的。
[0045]在本發明中，基因表達增強可以例如通過引入強啟動子來實現。在本發明的一些實施方案中，使用的強啟動子例如是:Ppck*(SEQ ID N0.: 108) (Zhang etal.,2009b,ApplEnviron Microb1l75:7807-7813)、M1_37(SEQ ID N0.:109)、或Ml-93 (SEQID N0.:110) (Lu et al., 2012, Appl Microb1l B1technol93:2455-2426)。
[0046]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下的一或多種修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質的活性增強；(b)sthA基因的表達增強、和/或sthA基因所編碼的蛋白質的活性增強；和(C)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQ ID N0.:1所示胺基酸序列的如下位置的一個或多個位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對應於Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0047]術語「突變」具有本領域內常用的含義，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多個核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多個胺基酸。
[0048]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，並且所述突變的IpdA基因位於質粒中或者染色體中。
[0049]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，並且所述突變的IpdA基因位於染色體中。
[0050]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，並且所述突變的IpdA基因位於質粒中。
[0051]如本文所用，術語「質粒」具有本領域熟知的定義，其是以附加體形式存在於細胞中的非染色體DNA並且能夠自主複製的DNA分子。本發明中可以使用的質粒例如有:pEASY-Blunt、pACYC184、pTrc99A、pTrc99A_M、pTrc99A-M_Kan、pKD4 和 pKD46 等。
[0052]如本文所用，術語「染色體」具有本領域熟知的定義。在一些實施方案中，本發明所涉及的經修飾的基因位於染色體中。將經修飾的基因整合至染色體的技術是本領域技術人員熟知的，例如可以參見Michael R.Green和 Joseph Sambrook的〃Molecular Cloning:ALaboratory Manual〃(Fourth Edit1n)。
[0053]IpdA基因(Genbank No:ACA79157.1)是編碼硫辛醯胺脫氫酶(EC No: 1.8.1.4)的基因。在本發明的一個實施方案中，所使用的初始大腸桿菌菌株中的野生型IpdA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.: 2所示，其所編碼的多肽的胺基酸序列如SEQ ID N0.:1所示，而本發明的大腸桿菌中所引入的突變的IpdA基因則含有如下的一或多種突變:C242T、C823T、和C1073T ;而所述突變的IpdA基因所編碼的多肽具有如下的一或多種胺基酸置換:T811、P275S、和 A358V(參見圖 8)。
[0054]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQ ID N0.:1所示胺基酸序列的如下位置的一個或多個位置上含有修飾:T81、P275和A358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於T81的位置上的修飾是用I置換T，在對應於P275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於A358的位置上的修飾是用V置換A。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0055]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，所述突變的IpdA基因在對應於SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列的如下位置的一個或多個位置上含有突變:C242、C823和C1073，對應的位置是通過與SEQ ID N0.: 2進行序列比對而確定的，其中所述突變均是用T置換C。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0056]本領域技術人員會意識到不同大腸桿菌菌株的IpdA基因序列可能與SEQ IDN0.:2所示IpdA基因序列不完全等同，以及不同大腸桿菌菌株的IpdA基因所編碼的多肽序列可能與SEQ ID N0.:1所示的多肽序列不完全等同。在本發明的某些實施方案中，所述突變的IpdA基因中的突變位於對應於SEQ ID N0.:2的第C242位、第823位、和/或第1073位的位置上。在本發明的某些實施方案中，所述突變的IpdA基因所編碼的多肽中的置換位於對應於SEQ ID N0.:1的第81位、第275位、和/或第358位的位置上。
[0057]在本發明中，「對應於」 SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.:2中某一特定位置的位置可以通過序列比對而確定，包括如使用人工排列對比及通過使用眾多可利用的排列對比程序(例如BLASTP)以及本領域技術人員已知的其它方法。通過對比多肽或核苷酸序列，本領域技術人員可以在適當的位置引入相應的突變，從而實現本發明的技術效果。另外，本領域技術人員也可以使用保守和類似的胺基酸殘基來置換相應位置上的胺基酸殘基，或者在IpdA基因序列中引入同義突變，而實現本發明的技術效果。
[0058]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中SthA基因和tktA基因的表達增強、或者sthA基因和tktA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0059]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下遺傳修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質的活性增強；(b)sthA基因的表達增強、和/或SthA基因所編碼的蛋白質的活性增；和(c)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQIDN0.:1所示胺基酸序列的如下位置的一個或多個位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對應於Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0060]在另一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQ ID N0.:1所示胺基酸序列如下位置的位置上含有修飾:Τ81、Ρ275和Α358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對應於Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0061]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因在對應於SEQID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突變:C242、C823和C1073，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:2進行序列比對而確定的，其中所述突變均是用T置換C。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0062]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下遺修飾:(a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質的活性增強；(b) sthA基因的表達增強、和/或sthA基因所編碼的蛋白質的活性增強；和(c)突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQIDN0.:1所示胺基酸序列如下位置的位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對應於Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強，和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0063]在一個實施方案中，本發明涉及一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中含有如下修飾:(a) tktA基因的表達增強、和/或tktA基因所編碼的蛋白質的活性增強，(b)sthA基因的表達增強、和/或sthA基因所編碼的蛋白質的活性增強，和(c)突變的IpdA基因，其在對應於SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列如下位置的位置上含有突變:C242、C823和C1073，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:2進行序列比對而確定的，其中所述突變均是用T置換C。在一個優選的實施方案中，本發明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的表達增強,和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
[0064]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)所涉及的基因表達的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(2)pflB和/或adhE基因表達的抑制、和/或pflB或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(3) IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(4) galP基因和/或外源gif基因表達的增強、和/或galP基因或外源gif基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(9)pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0065]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)所涉及的基因表達的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的抑制，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統酶I的基因ptsl、編碼PTS系統酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統酶IIAGlc的基因err和編碼PTS系統酶IICBele的基因ptsG。
[0066]在本發明中，ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶I (EC No:2.7.3.9)。ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶Hpr(EC No:2.7.1.69)。err基因(GenBank No:ACA76927.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶IIAGle(EC No:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBankNo:ACA78131.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶IICBele(EC No:2.7.1.69)。
[0067]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(l)ptsl基因表達的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質的活性抑制；(2) pflB和/或adhE基因表達的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(3) IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(4) galP基因和/或外源gif基因表達的增強、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(9)pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0068]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(I) PtsI基因表達的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質的活性抑制；(2)pflB和/或adhE基因表達的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(3) IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(4) galP基因表達的增強、和/或galP基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(9)pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0069]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:(I) PtsI基因表達的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質的活性抑制；(2) pflB基因表達的抑制、和/或pflB所編碼的蛋白質活性的抑制；(3) IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(4)galP基因表達的增強、和/或galP基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(9)pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0070]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有選自如下修飾:(l)ptsl基因表達的抑制、和/或PtSl基因所編碼的蛋白質的活性抑制；(2)pflB基因表達的抑制、和/或PflB所編碼的蛋白質活性的抑制；(3) IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(4) galP基因表達的增強、和/或galP基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(9)pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0071]在本發明中，pflB基因(GenBank No:ACA78322.1)編碼丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC N0.2.3.1.54)。adhE 基因(Genbank No:ACA78022.1)編碼乙醇 / 乙醒脫氫酶(Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase) (EC No: 1.1.1.1, ECNo: 1.2.1.10)。IdhA 基因(GenBank No:ACA77176.1)編碼乳酸脫氫酶 A(lactatedehydrogenase A) (EC No: 1.1.1.28)。galP 基因(GenBank No:ACA76443.1)編碼半乳糖MFS轉運蛋白。gif基因(GenBank No:AAA27691.1)編碼葡萄糖轉運蛋白Glf (glucosefacilitator protein)。pck 基因(GenBank No:ACA75988.1)編碼憐酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，又稱作 PCK 酶(EC No:4.1.1.49)。
[0072]如本文所用，術語「基因表達的抑制」具有本領域內熟知的含義，是指基因表達強度的降低，從而導致基因轉錄後產生的mRNA數量的減少。基因表達的抑制可以通過如下方式實現，例如但不限於:基因的敲除、減少基因的拷貝數、改變基因的啟動子(例如使用弱啟動子)等。如本文所用，術語「基因所編碼的蛋白質的活性抑制」具有本領域內熟知的含義，是指基因轉錄翻譯後產生的蛋白活性的降低。其可以例如通過基因表達強度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、胺基酸位點的突變來實現。實現「基因表達的抑制」以及「基因所編碼的蛋白質的活性抑制」的各種技術手段是本領域技術人員熟知的。
[0073]在另一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下修飾:(l)ptsl基因表達的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質的活性抑制；(2) pflB基因表達的抑制、和/或pflB所編碼的蛋白質活性的抑制；(3) IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(4)galP基因表達的增強、和/或galP基因所編碼的蛋白質活性的增強。
[0074]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(5) ackA和pta基因表達的抑制、和/或ackA和pta基因所編碼的蛋白質活性的抑制；(6) aceBA基因簇表達的增強、和/或aceBA基因簇所編碼的蛋白質活性的增強；(7)dcuC基因表達的增強、和/或dcuC基因簇所編碼的蛋白質活性的增強；和(8)mgsA基因表達的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質活性的抑制。
[0075]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下的修飾:(9)pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質的活性增強。在另一個實施方案中，本發明的大腸桿菌中的pck基因被敲除。
[0076]pta 基因(GenBank No:ACA77021.1)編碼磷酸乙醯轉移酶(EC No:2.3.1.8)，而ackA 基因(GenBank No:ACA77022.1)編碼乙酸激酶(EC No: 2.7.2.1)。aceBA 基因簇包括aceB 基因(GenBank No:ACA79615.1)編碼蘋果酸合成酶(EC No:2.3.3.9)和 aceA 基因(GenBank No:ACA79614.1)編碼異檸檬酸裂解酶(EC No:4.1.3.1) ? dcuC 基因(GenBankNo:ACA78647.1)編碼 C4 二羧酸轉運蛋白 DcuC。mgsA 基因(GenBank No:ACA78263.1)編碼甲基乙二醛合成酶(EC No:4.2.3.3)。
[0077]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下修飾:(10) adhE基因表達的抑制、和/或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制；和(11) tdcDE基因簇表達的抑制、和/或tdcDE基因簇所編碼的蛋白質活性的抑制。
[0078]tdcDE 基因簇包括 tdcD 基因(GenBank No:ACA76259.1)和 tdcE 基因(GenBankNo:ACA76260.1)，其中tdcD基因編碼丙酸激酶(EC No:2.7.2.15)，而tdcE基因編碼2-酮基丁酸甲酸裂解酶/丙酸甲酸裂解酶(EC No:2.3.1.54)。adhE基因(GenBankNo:ACA78022.1)編碼乙醇 / 乙醛脫氫酶(EC No: 1.1.1.1/EC No: 1.2.1.10)。
[0079]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌還含有如下的一或多種修飾:(12)aceEF基因簇表達的增強、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質活性的增強；(13)dcuB基因表達的增強、和/或dcuB基因所編碼的蛋白質活性的增強；(14)mdh基因表達的增強、和/或mdh基因所編碼的蛋白質活性的增強；(15)fumA基因表達的增強、和/或fumA基因所編碼的蛋白質活性的增強；(16)fumB基因表達的增強、和/或fumB基因所編碼的蛋白質活性的增強；和(17)frdABCD基因簇表達的增強、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質活性的增強。
[0080] aceEF基因簇編碼丙酮酸複合體E1/E2 (EC No: 1.2.4.1)，包括aceE基因(GenBankNo:ACA79159.1)編碼丙酮酸脫氫酶複合體El和aceF基因(GenBank No:ACA79158.1)編碼丙酮酸脫氫酶複合體E2。dcuB基因(GenBank No:ACA79506.1)編碼厭氧C4 二羧酸轉運蛋白 DcuB0 mdh 基因(GenBank No:ACA76147.1)編碼蘋果酸脫氫酶(EC No: 1.1.1.37)。fumA 基因(GenBank No:ACA77662.1)編碼好氧富馬酸酶 I(EC No:4.2.1.2) ? fumB 基因(GenBank No:ACA79507.1)編碼厭氧富馬酸酶 I (EC No:4.2.1.2)。frdABCD 基因簇編碼富馬酸還原酶(EC No: 1.3.5.4),包括frdA基因(GenBank No:ACA79460.1)編碼富馬酸還原酶黃素蛋白亞基、frdB基因(GenBank No:ACA79461.1)編碼富馬酸還原酶鐵硫蛋白亞基、frdC基因(GenBank No:ACA79462.1)編碼富馬酸還原酶C亞基、和frdD基因(GenBankNo:ACA79463.1)編碼富馬酸還原酶D亞基。
[0081]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌是以保藏號CGMCC7260 (2013年2月25日，分類命名:大腸埃希氏菌E.coli)保藏於CGMCC(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中科院微生物所)的菌株。
[0082]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌是以保藏號CGMCC7259 (2013年2月25日，分類命名:大腸埃希氏菌E.coli)保藏於CGMCC(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中科院微生物所)的菌株。
[0083]在一個實施方案中，本發明的大腸桿菌是以保藏號CGMCC7550(2013年5月3日，分類命名:大腸埃希氏菌E.coli)保藏於CGMCC(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中科院微生物所)的菌株。
[0084]在第二方面，本發明提供了一種生產丁二酸的方法，其中包括培養本發明的大腸桿菌的步驟。
[0085]在一個實施方案中，本發明生產丁二酸的方法包括培養本發明的大腸桿菌，以及任選的收集或者純化丁二酸。
[0086]在一個實施方案中,本發明所述的「培養」包括種子培養和發酵培養。
[0087]如本文所用，術語「種子培養」是指將用於發酵的菌種在固體培養基上活化後，再經過搖瓶及種子罐逐級擴大培養而獲得一定數量和質量的純種的過程。
[0088]如本文所用，術語「發酵培養」是指利用微生物菌種，在適宜的條件下，將培養基組分經過特定的代謝途徑轉化為某些特定產物的過程。
[0089]在一個實施方案中，本發明的方法中包括將本發明的大腸桿菌厭氧發酵。
[0090]如本文所用，術語「厭氧發酵」是指利用厭氧發酵菌株，在隔絕空氣的條件下，經特定代謝途徑將培養基組分轉化為某些特定產物的過程。
[0091 ] 在一個實施方案中，本發明的方法中的培養過程不進行任何通氣步驟。
[0092]在一個實施方案中，本發明中對大腸桿菌進行培養的方法包括以下步驟:
[0093](I)將本發明的重組大腸桿菌接種於種子培養基，在適宜大腸桿菌生長的條件下培養一段時間得到種子液；
[0094](2)將種子液接種於發酵培養基，在厭氧條件下培養。
[0095]本發明的方法中可以使用本領域中常規用於培養大腸桿菌的各種培養條件，例如培養基、培養溫度、培養時間和是否搖動以及搖動速度等。本領域技術人員根據需要可以選擇適當的培養條件。本發明的方法中所使用的培養條件以及發酵條件是本領域技術人員熟知的(諸葛健等，1994，工業微生物實驗技術手冊，中國輕工業出版社)。
[0096]在一個實施方案中，本發明的培養條件包括但不限於:溫度為30_45°C，例如30-31 0C >31-32 °C >32-33 °C >33-34 °C >34-35 °C >35-36 °C >36-37 °C >37-38 °C >38-39 °C、39-40 O、40-410、41-42 O、42-43 O、43-44 O、或 44-45 V。
[0097]在一個實施方案中，本發明的培養條件包括但不限於:種子培養的時間為6-16小時,例如6-7 小時、7-8小時、8-9小時、9-10小時、10-11小時、11-12小時、12-13小時、13-14小時、14-15小時、或15-16小時。
[0098]在一個實施方案中，本發明的培養條件包括但不限於:發酵培養的時間為2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。
[0099]在一個實施方案中，本發明的培養條件包括但不限於:將本發明的重組大腸桿菌按照0.1-10% (V/V)的接種量接種於種子培養基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。
[0100]在一實施方案中，本發明的培養條件包括但不限於:將種子液按照終濃度OD550=0.05-0.5 的接種量接種於發酵培養基，例如 OD55tl 為 0.05-0.1,0.1-0.2,0.2-0.3、0.3-0.4 或 0.4-0.5。
[0101]在一實施方案中，可以使用常用於大腸桿菌的培養基。用於本發明的大腸桿菌的培養基可以包括合適的氮源，例如有機含氮化合物或無機含氮化合物或其混合物。在一實施方案中，所述有機含氮化合物例如選自豆餅粉、花生餅粉、牛肉膏、魚粉、酵母膏、蛋白腖、玉米漿中的一種或任意幾種的混合物，所述無機含氮化合物選自硝酸鹽(如硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣)，銨鹽(如磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨)中的一種或任意幾種的混合物。在一實施方案中，用於本發明的大腸桿菌的培養基可以包括合適的碳源，例如選自葡萄糖、澱粉、澱粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富馬酸中的一種或任意幾種的混合物。
[0102]在一個實施方案中，本發明的方法中所使用的種子培養基和發酵培養基由以下成分組成(溶劑為水):
[0103]大量元素:葡萄糖、KH2PO4、K2HP04、(NH4)2HPO4^MgSO4.7H20、和甜菜鹼-KCl ；
[0104]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0105]在一個實施方案中，本發明的培養基由以下成分組成(溶劑為水):
[0106]大量元素:葡萄糖20-120g/L，KH2P042_5g/L、K2HP044_8g/L、(NH4) 2HP043_5g/L、MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜鹼-KC10.1-lg/L ；
[0107]微量元素=FeCl3.6H20 1-5 μ g/L、CoCl2.6H20 0.05-1 μ g/L、CuCl2.2H200.05-1 μ g/L、ZnCl20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2H20 0.05-1 μ g/L、MnCl2.4H2020.1-1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0108]在一個實施方案中，本發明的方法中所使用的種子培養基和發酵培養基由以下成分組成(溶劑為水):
[0109]大量元素:葡萄糖、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4^MgSO4.7H20、和甜菜鹼-KCl ；
[0110]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0111]在一個實施方案中，本發明的培養基由以下成分組成(溶劑為水):
[0112]大量元素:葡萄糖20-120g/L，NH4H2PO40.5-1.5g/L、(NH4) 2HP042_5g/L、MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜喊-KCl 0.1-lg/L ；
[0113]微量元素:FeCl3.6Η201-5μ g/L、CoCl2.6Η20 0.05-1 μ g/L、CuCl2.2Η20
0.05-1 μ g/L、ZnC l20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2Η200.05-1 μ g/L、MnCl2.4Η2020.1-1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0114]在一個實施方案中，本發明中對大腸桿菌進行培養的具體方法如下:
[0115]將菌株厭氧發酵，包括以下步驟:
[0116](I)種子培養:將1/3-1/2體積的種子培養基置於三角瓶中，高溫高壓滅菌。冷卻後將本發明的重組大腸桿菌按照0.1-10%(V/V)的接種量接種於種子培養基，在37°C以及搖動的條件下培養6-16小時得到種子液，用於發酵培養基接種；
[0117](2)發酵培養:將1/3-1/2體積的發酵培養基體積置於厭氧發酵罐中，將種子液按照終濃度OD55tl=0.05-0.5的接種量接種於發酵培養基，37°C培養2_5天，得到發酵液。
[0118]在一個實施方案中，本發明生產丁二酸的方法中還包括從發酵液中提取和/或純化丁二酸的步驟。
[0119]在第三方面，本發明涉及本發明的大腸桿菌在生產丁二酸中的用途。
實施例
[0120]本發明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發明的範圍或實施方式的限制。本發明的範圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的範圍。在不偏離本發明的精神和範圍的前提下，本領域技術人員可以對本發明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發明的範圍內。
[0121]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0122]本發明具體包括如下實施例:
[0123]實施例1、重組大腸桿菌NZ-037的構建
[0124]重組大腸桿菌NZ-037的構建(表1)，分為以下八個步驟:
[0125](I)乳酸脫氫酶基因IdhA的敲除
[0126](1-1):首先構建質粒pXZ-CS，用於基因敲除、基因表達調控和外源基因整合。
[0127]質粒構建操作步驟共四步:
[0128]第一步，以pACYC184 質粒 DNA (Mok et al., 1991, Nucleic AcidsResl9:2321-2323)為模板，使用引物 184-cat-up (SEQ ID N0.:7)和 184-cat-down(SEQ IDN0.:8)，擴增得到氯黴素抗性基因，基因片段大小為994bp，包含有氯黴素基因啟動子序列，稱為片段I。
[0129]擴增體系為:NewEnglandB1labs Phus1n5X 緩衝液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP 各1mM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phus1n High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0130]擴增條件為98°C預變性2分鐘(I個循環)；98°C變性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸30秒(30個循環);72°C延伸5分鐘(I個循環)。
[0131]第二步，以芽抱桿菌Bacillus subtilis sp subtilisl68的染色體DNA(該菌購自中國普通微生物菌種保藏中心，CGMCC N0.1.1390)為模板，使用引物Bs-sacB-up (SEQ IDN0.: 9)和Bs-sacB-down (SEQ ID N0.:10)進行PCR擴增果聚糖鹿糖轉移酶基因(sacB),基因片段大小為1618bp，含有sacB基因啟動子序列，稱為片段II。擴增體系和擴增條件參見上文第一步。
[0132]第三步，將第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分別用限制性內切酶SacI (NEB公司)在37°C酶切30分鐘；PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCR Extrat1n Kit，購自B1MIGA生物技術有限公司);各取20ng片段I和片段II，加入I μ 110ΧΤ4連接緩衝液(NEB公司)、I μ I T4-DNA連接酶(NEB公司)，補充蒸餾水至10 μ 1，25°C反應5分鐘；以酶連片段為底物，取I μ 1，用引物184-cat-up和Bs-sacB-down進行PCR擴增，擴增體系和擴增條件參見上文第一步，得到含有cat-sacB的連接片段III。
[0133]第四步，將PCR獲得的片段III取1μ 1，加入1μ I pEASY-blunt simple載體(試劑盒，北京全式金生物技術有限公司)，25°C反應15分鐘；氯化鈣轉化法:加入50 μ ITranslO感受態細胞(購自北京全式金生物技術有限公司)中進行，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置於冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養基，200rpm，37°C孵育I小時。取200 μ I菌液塗在含有氨苄黴素(終濃度為100 μ g/ml)和氯黴素(終濃度為34 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，進行菌落PCR驗證，引物為M13-F(SEQ IDN0.:11)/M13-R(SEQ ID N0.: 12)。送樣測序分析，結果正確的為陽性克隆，得到質粒pXZ_CS (表3)。
[0134](1-2):從大腸桿菌ATCC8739 (Gunsalus et al.，1941，J B1l ChemHl: 853-858)出發，採用兩步同源重組的方法敲除IdhA基因，獲得重組大腸桿菌SUC-T102，包括以下六
I K
少:
[0135]第一步，以大腸桿菌ATCC8739基因組DNA為模板，使用引物XZ-ldhA-up(SEQIDN0.:13 和 XZ-ldhA-down(SEQ ID N0.: 14)進行 PCR 擴增，PCR 產物為 1753bp，該 PCR 產物包含大腸桿菌ATCC8739的乳酸脫氫酶編碼基因IdhA (GenBank No:ACA77176.1)及其上下遊各大約400個鹼基。擴增體系和擴增條件參考實施例上文(1-1)中的第一步。
[0136]將擴增得到的1753bp PCR產物克隆到pEASY-Blunt克隆載體(購自北京全式金生物技術有限公司)上。克隆體系及氯化鈣轉化法參見上文(1-1)中質粒ρΧΖ-CS構建方法中的第四步。取200 μ I菌液塗在含有卡那黴素(終濃度為15 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，進行菌落PCR驗證，引物為M13-F/M13-R。送樣測序分析，結果正確的為陽性克隆，將得到的重組質粒命名為PXZ001。
[0137]第二步，以pXZOOl質粒DNA為模板，使用引物XZ-1dhA-1 (SEQ ID N0.: 15和XZ-1 dhA-2 (SEQ ID N0.: 16)進行PCR擴增，得到4758bp的PCR產物，該PCR產物包含pEASY-Blunt載體和乳酸脫氫酶編碼基因上下遊各約400個鹼基。擴增體系和擴增條件參考實施例上文(1-1)中的第一步。
[0138]第三步，將含有氯黴素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)DNA片段cat-sacB連接至第二步的PCR擴增產物,具體如下:
[0139]以pXZ-CS 為模板,使用引物 cat-sacB-up (SEQ ID N0.: 17)和 cat-sacB-down (SEQIDN0.:18)進行PCR擴增，得到2618bp的PCR產物，即為含有氯黴素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的DNA片段。
[0140]連接體系為:10ng的第二步4758bp的PCR產物、30ng的cat-sacB DNA片段，2μ 110XT4 連接緩衝液(NEB 公司)，1μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive endunits/ml),補充蒸懼水至20 μ I。室溫連接2小時。取1ul用氯化|丐轉化法轉入TranslO,過程參見上文(1-1)中質粒PXZ-CS構建方法中的第四步。取200 μ I菌液塗在含有氯黴素(終濃度為17ug/ml)的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒(將cat-sacB DNA片段克隆到pXZOOl中的質粒)進行測序驗證，測序結果在上述第二步的PCR擴增產物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ002C。
[0141]第四步，以pXZ002C質粒DNA為模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA_down擴增出3447bp DNA片段I。擴增體系和擴增條件參見上文(1-1)中質粒ρΧΖ-CS構建步驟中的第一步。DNA片段I包含乳酸脫氫酶編碼基因IdhA上遊約400個鹼基、cat-sacB DNA片段、乳酸脫氫酶編碼基因IdhA下遊約400個鹼基。
[0142]將DNA片段I用於第一次同源重組:首先將pKD46質粒(Datsenko andWanner2000, Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645;質粒購買於美國耶魯大學 CGSC 大腸桿菌保藏中心)通過氯化鈣轉化法轉化至大腸桿菌ATCC8739，然後將DNA片段I電轉至帶有pKD46的大腸桿菌ATCC8739。
[0143]電轉條件為:首先準備帶有PKD46質粒的大腸桿菌ATCC8739的電轉化感受態細胞(Dower et al.，1988，Nucleic Acids Resl6:6127-6145);將 50 μ I 感受態細胞置於冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分鐘，轉移至0.2cm的B1-Rad電擊杯。使用MicroPulser (B1-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2.5kv。電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，75rpm，30°C孵育2小時。取200 μ I菌液塗在含有氯黴素(終濃度為17ug/ml)的LB平板上，37°C過夜培養後，挑選5個單菌落進行PCR驗證，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down進行驗證，挑選一個正確的單菌落，命名為Suc-TlOl。
[0144]第五步，將第二步得到的4758bp的PCR產物進行磷酸化處理，自連得到的質粒用於第二次同源重組；具體步驟如下:將第二步的4758bp的PCR產物首先用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCR Extrat1n KU，購自B1MIGA生物技術有限公司)；取30ng純化後的PCR擴增產物，加入2 μ 110ΧΤ4連接緩衝液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，補充蒸餾水至20 μ 1，37°C反應30分鐘；加入1μ I Τ4連接酶(NEB公司，400，000粘附末端單位/ml)，室溫反應2小時得到連接產物。酶連產物取1ul用氯化鈣轉化法轉入Trans 10，過程參見上文(1-1)中質粒ρΧΖ-CS構建步驟中的第四步。取200 μ I菌液塗在含有卡那黴素(終濃度為15ug/ml)的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果上述第二步的PCR擴增產物進行了自連，證明質粒構建正確，得到質粒PXZ003。
[0145]第六步，以pXZ003質粒DNA為模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down擴增出829bp DNA片段ILDNA片段II用於第二次同源重組。將DNA片段II電轉至菌株Suc_T101。
[0146]電轉條件為:首先準備帶有PKD46質粒的Suc-TlOl的電轉化感受態細胞(製備方法參見Dower et al., 1988);將50 μ I感受態細胞置於冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉移至0.2cm的B1-Rad電擊杯。使用MicroPulser (B1-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數為電壓2.5kv。電擊後迅速將Iml LB培養基轉移至電擊杯中，吹打5次後轉移至試管中，75轉，30°C孵育4小時，去除pKD46質粒。將菌液轉移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養基(250ml燒瓶中裝50ml培養基)，培養24小時後在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養基上劃線培養。經過PCR驗證，所用引物為XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正確的菌落擴增產物為763bp的片段，挑選一個正確的單菌落，將其命名為Suc-T102(表I)。
[0147]敲除IdhA基因所構建的質粒見表3,使用的引物序列見表2。
[0148](2)丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB的敲除
[0149]從重組大腸杆 SUC-T102出發，使用上文(I)部分中相同的方法敲除pfIB基因(GenBank No:ACA78322.1)，獲得重組大腸桿菌Suc_T104。構建的質粒見表3，使用的引物序列見表2，其中引物的命名對應於敲除IdhA基因過程中所使用的引物的名稱，僅將IdhA替換為PflB。
[0150](3)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶I基因PtsI的敲除
[0151]從重組大腸桿菌SUC-T104出發，使用上文(I)部分中相同的方法敲除ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1)，獲得重組大腸桿菌Suc_T106。構建的質粒見表3，使用的引物序列見表2，其中引物的命名對應於敲除IdhA基因過程中所使用的引物的名稱，僅將IdhA替換為ptsl。
[0152](4)半乳糖MFS轉運蛋白GalP的激活
[0153]從重組大腸桿菌Suc-T106出發，將galP基因(GenBank No:ACA76443.1)的原始調控元件替換為調控元件Ppck* (SEQ ID N0.108)，獲得重組大腸桿菌SUC-T108。在本發明中，Ppck*代表大腸桿菌pck啟動子突變體，也即在相對於ATG起始處的-64位處G變為A(Zhang et al., 2009b, Appl Environ Microb1l75:7807-7813)。
[0154]包括以下六步:
[0155]第一步，以大腸桿菌ATCC8739基因組DNA為模板，使用引物XZ-galP-P-up (SEQIDN0.:27)和 XZ-galP-P-down (SEQ ID N0.:28)進行 PCR 擴增，得到 841bp 擴增產物，為大腸桿菌ATCC8739的半乳糖轉運蛋白編碼基因galP調控元件以及其上下遊各約400個鹼基。將擴增產物克隆到PEASY-Blunt克隆載體上。提取陽性克隆質粒進行測序驗證，測序結果表明在載體pEASY-Blunt上插入了敲除半乳糖轉運蛋白編碼基因galP調控元件及其上下遊各400個左右鹼基，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為pXZOll。
[0156]第二步，以pXZOll 質粒 DNA 為模板，使用引物 XZ-galP-P_l(SEQ ID N0.:29 和XZ-galP-P-2 (SEQ ID N0.: 30)進行PCR擴增，得到4614bp擴增產物，其擴增產物包含pEASY-Blunt載體和半乳糖轉運蛋白編碼基因galP調控元件及上下遊各約400個鹼基。
[0157]第三步，以pXZ-CS質粒為模板,使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down進行PCR擴增，得到2618bp的PCR產物，即為含有氯黴素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)的 DNA 片段。
[0158]將含有氯黴素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉移酶基因(sacB)DNA片段連接至第二步的4614bp PCR擴增產物。轉化Transl-Tl感受態細胞。取200 μ I菌液塗在含有氯黴素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養後，挑選5個陽性單菌落，將陽性克隆進行液體培養，提取陽性克隆質粒(將cat-sacB DNA片段克隆到ρΧΖΟΙΟ中的質粒)進行測序驗證，測序結果在上述第二步的PCR擴增產物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質粒構建正確，將得到的重組質粒命名為PXZ012C。
[0159]第四步，以pXZ012C 質粒 DNA 為模板，使用引物 XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down 進行PCR擴增，得到3303bp DNA片段I ;該0嫩片段I包含半乳糖轉運蛋白編碼基因galP調控元件上遊約400個鹼基、cat-sacB DNA片段、半乳糖轉運蛋白編碼基因galP調控元件下約400個鹼基。
[0160]將DNA片段I用於第一次同源重組。首先將PKD46質粒通過氯化鈣轉化法轉化至菌株Suc-T106，然後將DNA片段I電轉至帶有pKD46的菌株Suc_T106。
[0161]電轉條件參見上文(1-2)中IdhA基因敲除的第四步。取200 μ I菌液塗在含有氯黴素(終濃度為17ug/ml)的LB平板上，37°C過夜培養後，挑選5個單菌落進行PCR驗證，使用引物為XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down，得到驗證正確的單菌落，將其命名為SUC-T107。
[0162]第五步，以大腸桿菌ATCC8739基因組DNA為模板，使用引物P-pck*-up-SpeI (SEQID N0.:31)和 P-pck*-down-KpnI (SEQ ID N0.:32)擴增大腸桿菌 ATCC8739 的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的調控元件pck，引物序列見表2。PCR產物進行SpeI (購自NEB公司)和KpnI (購自NEB公司)酶切。將其克隆到經過相同酶酶切的質粒pTrc99A (Amann etal., 1998, Gene69:301-15)表達載體上，命名為質粒pXZ602。以質粒pXZ602為模板，使用引物pck*-F(SEQ ID N0.:33)和pck*-R(SEQ ID N0.:34)進行擴增，引物序列為見表2。擴增產物經過T4多核苷酸激酶(購自NEB公司)磷酸化，自連得到陽性質粒，測序驗證無誤後，命名為PXZ603。
[0163]以pXZ603 為模板，使用引物 P-pck^-up-Spel 和 P-pck^-down-Kpnl 進行 PCR 擴增，得到378bp磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的突變調控元件Ppck*，與第二步得到的4614bp擴增產物連接，得到質粒pXZ013。
[0164]用XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down引物對以質粒pXZ013為模板擴增出DNA片段II。
[0165]第六步，DNA片段II用於第二次同源重組。將DNA片段II電轉至Suc_T107。電轉條件參見上文(1-2)中IdhA基因敲除步驟中的第六步。用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down進行PCR以及測序驗證，得到1051bp為正確的單菌落，將其命名為Suc-T108(表 I)。
[0166]將半乳糖轉運蛋白編碼基因galP調控元件置換成Ppck*所構建的質粒見表3，使用的引物序列見表2。
[0167](5)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的激活
[0168]從重組大腸桿菌Suc-T108出發，將pck基因(GenBank No:ACA75988.1)的原始調控元件替換為調控元件Ppck*,獲得重組大腸桿菌Suc-TllO (表1)。
[0169]具體如下:
[0170]第一步同源重組:以pXZ-CS 為模板,使用引物 pck-cat-sacB-up (SEQ ID N0.:35)和pck-cat-sacB-down(SEQ ID N0.:36)擴增DNA片段I,用於第一次同源重組。引物序列見表2 ;得到2717bp DNA片段I，將所得DNA擴增片段I電轉至帶有pKD46質粒的重組菌Suc-TlOS，篩選氨苄青黴素與氯黴素抗性的菌落，得到中間重組菌；
[0171]第二步同源重組:以pXZ603質粒為模板，使用引物P-pcP-up-Spel/P-pck*-down-KpnI擴增(引物序列見表2)，得到378bp人工調控元件Ppck* ;將378bp人工調控元件Ppck*電轉入整合了片段I的中間重組菌，得到重組菌I。重組菌IPCR驗證的引物pck-YZ-up(SEQ ID N0.:37)和pck-YZ-down(SEQ ID N0.:38)，得到 676bp且測序正確的單菌落，將其命名為菌株Suc-TllO。
[0172](6)磷酸乙醯轉移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA的敲除
[0173]從重組大腸桿菌Suc-TllO出發，使用上文(I)部分中相同的方法敲除磷酸乙醯轉移酶編碼基因pta(GenBank N0.ACA77021.1)和乙酸激酶編碼基因ackA(GenBankN0.ACA77022.1)，獲得重組大腸桿菌NZ-035 (表1)。構建的質粒見表3，使用的引物序列見表2，其中引物的命名對應於敲除IdhA基因過程中所使用的引物的名稱，僅分別將IdhA替換為ackA或者pta。
[0174](7)蘋果酸合成酶AceA和異檸檬酸裂解酶AceB的激活
[0175]以重組大腸桿菌NZ-035出發，使用和實施案例上文(4)部分中相同的方法將aceBA 基因簇(aceB GenBank No:ACA79615.1, aceA GenBank No:ACA79614.1)的原始啟動子替換為Ppck*啟動子，獲得重組大腸桿菌NZ-036(表1)。構建的質粒見表3，使用的引物序列見表2，其中引物的命名對應於激活galP基因過程中所使用的引物的名稱，僅將galP替換為aceB。
[0176](8) 二羧酸Dcu轉運蛋白DcuC的激活
[0177]以重組大腸桿菌NZ036出發，使用和上文(4)部分中相同的方法將dcuC基因(GenBank N0.ACA78647.1)的原始調控元件替換為調控元件Ppck*,獲得重組大腸桿菌NZ-037(表1)。構建的質粒見表3，使用的引物序列見表2，其中引物的命名對應於激活galP基因過程中所使用的引物的名稱，僅將galP替換為dcuC。
[0178]表1、生產丁二酸的重組大腸桿菌
[0179]
【權利要求】
1.一種重組大腸桿菌，所述大腸桿菌中含有如下修飾: (1)磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)中所涉及的基因表達的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的抑制， (2)pflB和/或adhE基因表達的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制， (3)IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質活性的抑制，和 (4)galP基因和/或外源gif基因表達的增強、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質活性的增強； 其中所述大腸桿菌還含有如下的一或多種修飾: (a)磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因表達的增強、和/或磷酸戊糖途徑(PPP)中所涉及的基因所編碼的蛋白質活性的增強；和 (b)SthA基因表達的增強、和/或SthA基因所編碼的蛋白質活性的增強。
2.權利要求1的大腸桿菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉移酶系統(PTS)中所涉及的基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統酶I的基因ptsl、編碼PTS系統酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統酶IIAele的基因err和編碼PTS系統酶IICBele的基因ptsG。
3.權利要求1或2的大腸桿菌，其中所述磷酸戊糖途徑中所涉及的基因是選自如下的一或多種基因:編碼轉酮醇酶的基因tktA、編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因zwf、編碼6-磷酸葡糖酸內酯酶的基因pgl、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd、編碼5-磷酸核糖異構酶的基因rp1、編碼5-磷酸核酮糖差向異構酶的基因rpe和編碼轉醛醇酶的基因talBo
4.權利要求3的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中SthA基因和tktA基因的表達增強、和/或SthA基因和tktA基因所編碼的蛋白質活性的增強。
5.權利要求1-4任一項的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的修飾: (5)ackA和pta基因表達的抑制、和/或ackA和pta基因所編碼的蛋白質活性的抑制； (6)aceBA基因簇表達的增強、和/或aceBA基因簇所編碼的蛋白質活性的增強； (7)dcuC基因表達的增強、和/或dcuC基因所編碼的蛋白質活性的增強；和 (8)mgsA基因表達的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質活性的抑制。
6.權利要求1-5任一項的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中還含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對應於SEQ ID N0.:1所示胺基酸序列的如下位置的位置上含有修飾:T81、Ρ275和Α358，對應的位置是通過與SEQ ID N0.:1進行序列比對而確定的，其中在對應於Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對應於Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對應於Α358的位置上的修飾是用V置換Α， 任選地，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達增強、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質的活性增強。
7.權利要求6的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因位於質粒或染色體中。
8.權利要求6的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號CGMCC7260保藏於CGMCC。
9.權利要求1-7任一項的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的修飾:(9)pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質活性的增強。
10.權利要求9的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號CGMCC7259保藏於CGMCC。
11.權利要求9的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下修飾: (10)adhE基因表達的抑制、和/或adhE基因所編碼的蛋白質活性的抑制；和 (11)tdcDE基因簇表達的抑制、和/或tdcDE基因簇所編碼的蛋白質活性的抑制。
12.權利要求11的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌以保藏號CGMCC7550保藏於CGMCC。
13.權利要求9的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的遺傳改造:aceEF基因簇表達的增強、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質活性的增強。
14.生產丁二酸的方法,所述方法包括培養權利要求1-13任一項的大腸桿菌。
15.權利要求1- 13任一項的大腸桿菌在生產丁二酸中的用途。
【文檔編號】C12N1/21GK104178443SQ201310198953
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月24日 優先權日:2013年5月24日
【發明者】張學禮, 朱欣娜, 徐洪濤, 譚在高 申請人:中國科學院天津工業生物技術研究所