人乳腺癌組織抗原及其編碼基因、其製備方法和應用的製作方法

2023-08-03 23:09:16 1

專利名稱：：人乳腺癌組織抗原及其編碼基因、其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種腫瘤相關抗原，尤其涉及人乳腺癌組織抗原及其編碼基因，本發明還涉及表達該人乳腺癌組織抗原的重組表達載體、含有該重組表達載體的宿主細胞和重組抗原的分離和純化方法、該重組抗原在早期診斷或治療乳腺癌中的應用，屬於分子生物學和細胞免疫學領域
背景技術：
：乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，其死亡率僅次於肺癌而位居第二位，且發病率呈直線上升趨勢。在我國沿海經濟較發達地區，尤其在京、津、滬三大城市的部分地區中，乳腺癌發病率已居於女性惡性腫瘤的首位；西歐和北美經濟發達地區的婦女中，乳腺癌是一種主要的死亡原因。乳腺癌的自然病程以臨床前期最長，約佔疾病全程的2/3。早期癌中多數尚未出現明顯包塊或腫塊較小，此時治療效果較好。有研究表明，乳腺癌原發灶越小，預後越好。T4、T3、T2、T1期乳腺癌的10年生存率分別為19.7%、46.0%、62.6%、87.8%。直徑小於lcm的微小癌，其10年總體生存率在90%99%。由此可見，早期診斷和早期治療是降低乳腺癌死亡率的關鍵。目前臨床常用的早期診斷乳腺癌的方法主要有乳房鉬靶X射線攝影、超聲診斷、近紅外線掃描、CT及MRI等。這些常規影像學方法只能發現直徑^lcm的結節(約lg)，相當於109個腫瘤細胞。乳腺癌從單細胞發展到臨床能檢出的lcm小腫塊，其生長期一般已逾3年，此時常常已出現其它系統或器官的轉移。既往研究業已證明生物化學標誌物最低檢測限為108個腫瘤細胞，因此能在亞臨床期較早的發現乳腺癌，從而更加有利於早期診斷及早期治療乳腺癌，降低其死亡率。目前常用的檢測乳腺癌的標誌物有CEA、MUC-1、CK-19等，但這些指標均缺乏特異性，因而缺乏診斷價值，限制了它們的臨床應用。因此，研究和發現乳腺癌的特異性標誌物，建立經濟、更適合早期診斷乳腺癌的檢測方法，對乳腺癌防治工作無疑將起到極大促進作用。
發明內容本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種新的特異性高的人乳腺癌組織抗原(HumanGalactophoretissueantigen，hGTA)，該抗原可準確的診斷或檢測出早期乳腺癌。本發明首先所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的一種人乳腺癌組織抗原(hGTA)，其是以下(a)或(b)的胺基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的胺基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的胺基酸序列通過一個或多個胺基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有所述抗原活性的蛋白衍生物。優選的，本發明人乳腺癌組織抗原(hGTA)為SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種編碼上述人乳腺癌組織抗原的基因。本發明所要解決的第二個技術問題是通過以下技術途徑來實現的一種編碼人乳腺癌組織抗原的基因，該基因是以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴謹條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列,且該核苷酸序列編碼具有所述人乳腺癌組織抗原活性的蛋白；或(c)編碼SEQIDNO:2所示胺基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有所述人乳腺癌組織抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過將SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的一個或多個胺基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。優選的，本發明編碼人乳腺癌組織抗原的基因(hGTA)是SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，該基因編碼大約36kD的分泌性糖蛋白，定位於染色體llql2.8密集基因簇內，該基因僅在乳腺癌中表達，是繼乳腺珠蛋白之後發現的另一個具有乳腺器官特異性的腫瘤標誌物，在一系列的臨床試驗中發現，該抗原在乳腺癌的早期診斷、治療、監測病程轉移及判斷預後等方面都具有重要意義。在49%原發性的I期乳腺癌腫瘤中，hGTA過度表達。這表明hGTA基因的失調多發於乳腺癌的早期。所述的"多個"通常意味著2~60個，優選為2~15個，這些取決於乳腺癌組織特異蛋白的三維結構中胺基酸殘基的位置或胺基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的胺基酸殘基取代一個或多個胺基酸殘基；所述的"缺失"是指胺基酸序列的改變，其中分別缺少一個或多個胺基酸殘基；所述的"插入"是指胺基酸序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個胺基酸殘基。所述的"嚴謹雜交條件"意指在所屬領域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常，在嚴謹條件下，探針將雜交到核酸的複合混合物中的其目標子序列上，但並不雜交到複合混合物中的其它序列上。嚴謹條件是序列依賴性的並且在不同環境中將有所不同。嚴謹條件通常被選擇為低於特異序列在規定離子強度pH下的熱熔點(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度(在指定離子強度、pH和核酸濃度下)。嚴謹條件可為以下條件其中在pH7.0到8.3下鹽濃度低於約1.0M鈉離子濃度，通常為約O.Ol到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，並且溫度對於短探針(包括(但不限於)10到50個核苷酸)而言為至少約3(TC，而對於長探針(包括(但不限於)大於50個核苷酸)而言為至少約6(TC。嚴謹條件也可通過加入諸如甲醯胺的去穩定劑來實現。對於選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。一種例示性嚴謹雜交條件可如下50%甲醯胺，5xSSC和P/。SDS，在42"C下培養；或5xSSC，1%SDS，在65"C下培養，在0.2xSSC中洗滌和在65。C下於0.1%SDS中洗滌。所述洗滌可進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。本發明所要解決的第三個技術問題是構建含有SEQIDNO.l所示核苷酸序列的重組表達質粒及獲取含有該重組表達載體的重組菌株。本發明所要解決的第三個技術問題是通過以下技術途徑來實現的本發明的重組表達質粒可通過本領域的常規方法構建而成，即將SEQIDNO.l所示的核苷酸序列插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使SEQIDNO:1所示的核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將SEQIDNO:l所示的核苷酸序列插入到質粒pQE上的EcoRI和HindIII限制性酶切位點之間，得到重組表達質粒pQE-hGTA。本發明選擇JM109作為擴增菌，將重組表達質粒pQE-hGTA轉化入JM109中擴增，擴增後提取重組質粒，雙酶切鑑定後轉化入M15[pREP4]表達菌中，經IPTG誘導後，M15[pREP4]工程菌成功表達了目的蛋白。本發明所要解決的又一個技術問題是提供一種製備所述的重組乳腺癌組織特異蛋白的方法。本發明所要解決的又一個技術問題是通過以下技術途徑來實現的優選的，一種製備重組乳腺癌組織特異蛋白的方法，包括以下步驟構建含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的重組表達質粒；培養用該重組表達質粒所轉化的宿主細胞，得重組菌株；培養重組菌株，誘導重組乳腺癌組織特異蛋白的表達，回收並純化所表達的重組抗原。上述製備重組抗原的方法中，優選的，所述的重組表達質粒是pQE-hGTA;所述的宿主細胞是大腸桿菌M15[pREP4]。所述的回收並純化重組乳腺癌組織特異蛋白的方法如下冰浴超聲破菌法裂解轉入重組質粒pQE-hGTA的細菌；收集包涵體並將其溶解；收集變性蛋白，用N產鰲合親和層析純化變性蛋白，復性純化後的變性蛋白離子，得粗復性蛋白，用陰離子交換層析純化復性蛋白。本發明最優選的整體技術方案詳細描述本發明主要涉及鑑定新的在乳腺癌中過度表達的基因，本發明自乳腺癌組織提取總RNA，以其為模板，經RT-PCR逆轉錄擴增出hGTA的cDNA。為了獲得高質量的RNA，本發明採用新鮮切除的乳腺癌組織，在液氮中運輸，並儘快提取RNA，避免反覆凍融，提取的乳腺癌組織標本中總RNA用紫外核酸蛋白儀檢測和瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定通過RT-PCR擴增hGTA基因編碼序列，將擴增產物克隆至pGEM-T載體中，DNA測序鑑定後，用限制性內切酶切下目的基因，經鑑定，所表達的蛋白是一種新的乳房特異性分泌蛋白即hGTA，該cDNA是純化及分離形式的，其核苷酸序列經鑑定為SEQIDNo:1，基因全長1159個核苷酸，編碼321個胺基酸，其編碼的蛋白，即乳腺癌組織特異抗原hGTA，是純化及分離形式的，其胺基酸序列經鑑定為SEQIDNO:2。根據已獲取的hGTAcDNA序列，用primer軟體設計特異引物，並在其上下遊引入不同的酶切位點和特異的保護鹼基，降低載體的自連率，提高連接成功率。以乳腺癌組織RNA為模板擴增出的hGTAcDNA經AB13730全自動DNA測序儀測序，與預期的序列完全一致，共1159bp。該cDNA序列的45bp上遊不包含其它框內甲硫氨酸或翻譯終點，所編碼多肽的前36個殘基可能是一段疏水肽信號序列，殘基53-55和68-70是共有的N糖基化位點，這說明hGTA蛋白是分泌糖蛋白，因此可以在外周血中檢測到該標誌物。在基因庫(Genebank)中査找與hGTAcDNA相似的DNA序列沒有發現明顯同源的DNA序列，說明hGTAcDNA是一段新的、迄今未知的DNA序列。表達載體的選擇要考慮多種因素，如要表達蛋白的大小、蛋白的需要量、表達蛋白是否要純化，純化產物是否具有良好的生物學活性等。pQE表達載體屬於PDS質粒家族，是一種原核高效表達載體，具有以下幾個特點首先該表達載體含有噬菌體TS啟動子和兩個乳糖操縱序列構成的最適啟動子-操縱子成分。當有誘導物IPTG存在時，誘導物與Lac阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白失活，與LacO解離，使RNA聚合酶能夠進入結構基因，轉錄處於開放狀態；其次，該載體有合成的核糖體結合位點RBSII確保高轉錄效率，有/3-內醯氨酶基因利於氨苄青黴素的抗性篩選；有轉錄終止只密碼可保證轉錄的及時終止；此外，在多克隆位點上遊還含有6個組氨酸的編碼序列(6xffistag)。重組質粒經誘導表達後，6XHistag-nJ-以和外源插入片段共同表達。6xHistag為短肽，免疫原性很弱，並且對蛋白質的表達、摺疊及生物學活性均無影響，因此表達後可不必用蛋白酶切割去除而自接用於免疫動物；6xHistag的存在對於重組蛋白的純化也非常重要，使重組蛋白通過鎳柱親和技術得以有效純化，從而為製備重組hGTA抗原及製備診斷抗體的研製奠定物質基礎。本發明選擇JM109作為擴增菌，將重組表達質粒pQE-hGTA轉化入JM109中擴增，擴增後提取重組質粒，雙酶切鑑定後轉化入M15[pREP4]表達菌中，經IPTG誘導後，M15[pREP4]工程菌表達到了目的蛋白。表達外源蛋白的系統有大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等。其中大腸桿菌具有繁殖快、營養要求低、轉化和表達效率高、遺傳背景清楚、易發酵，並且易於操作並可以快速大量生產重組蛋白等特點，仍是許多外源蛋白首選的表達系統。本發明所選用的大腸桿菌M15中含有質粒pREP4，能翻譯Lac抑制子，並具有卡那黴素抗性，可嚴格調控外源重組蛋白在IPTG誘導後高效表達而不致產生細胞毒性。基於這些因素，本發明應用分子克隆的方法成功的構建了pQE-hGTA重組表達質粒，經酶切鑑定與預期的結果完全相符。通過質粒的轉化，將其導入大腸桿菌M15[pREP4]中，實現了高效表達。本發明中重組質粒經IPTG誘導後實現了在E.coliM15[pREP4]中的高效融合表達，表達量最高達27.4%。然而同大多數原核表達產物一樣，其表達形式為包涵體，這可能是由於分子的二硫鍵不能正確配對的原因所致。本發明的另一目的是提供一種純化重組hGTA的方法。本發明採用了冰浴超聲破菌(表達大腸桿菌)法，鏡下觀察破碎後的細菌裂解完全。由於本發明表達的產物是包涵體蛋白，包涵體中主要含有重組蛋白，但也含有一些其他的雜質成分，這些雜質成分在包涵體的溶解和復性過程中會導致重組蛋白質的降解，因此，包涵體的洗滌處理非常重要，本發明中採用了1%左右的中性去垢劑洗滌包涵體，並在洗滌劑中加入了1%的TritonX-100，2mol/L的尿素，並在pH8.2條件下進行，通過該方法洗漆的包涵體基本上未影響蛋白質的結構。由於該表達質粒表達的包涵體不溶於水，本發明採用濃度5mol/L的尿素溶解包涵體，儘管尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70%-90%，但由於用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性後除去不會造成大量蛋白質沉澱並可選用多種色譜法純化等優點，因此本發明採用尿素溶解包涵體。本發明所表達的目的蛋白以不溶性包涵體形式存在，尿素經洗滌後而溶解於尿素溶液中，由於在其氨基端含有6個連續的組氨酸。而組氨酸具有與多種二價金屬離子，如Nit+、Zn2+、012+等結合的能力，因此，本發明利用金屬鰲合層析方法純化該包涵體。金屬鰲合親和層析利用共價結合在層析載體上的二價金屬離子鰲合劑能與表面富含組氨酸殘基的蛋白質牢固結合，使其留在層析柱上，而不帶有組氨酸殘基的其他蛋白質則不能結合，再以洗脫溶液洗脫就可以獲得高純度的重組蛋白，然後用較低pH值的洗脫緩衝液洗脫，對親和層析純化後的目的蛋白行SDS-PAGE分析顯示，雜蛋白條帶明顯減少，說明目的蛋白己被有效的初步純化。包涵體的復性是目前基因工程蛋白生產過程中的難點問題，本發明採用分步稀釋，逐漸降低變性劑濃度的方法，以有效的降低蛋白質分子多聚體的產生，從而提高活性蛋白質的回收率，最終取得了較好的復性結果。為了獲得高純度的hGTA蛋白，本發明對復性的目的蛋白利用陰離子交換層析進行了再次純化。離子交換層析純化蛋白的效果與離子交換條件的選擇及梯度的選擇有密切關係。陰離子交換要求平衡液和樣品的pH值應高於目的蛋白pl值1個單位以上，而且鹽濃度最好在20mmol-5Ommol/L之間。本發明中的目蛋白hGTA經DNAsis分析其pI值為5.5。因此，本發明平衡液採用25mmol/LTris，pH8.0緩衝液。在此條件下，目的蛋白可以很好地與離子交換柱上的正性基團結合。梯度洗脫常用的有鹽梯度和pH梯度或二者一併使用，由於鹽梯度容易操作，且更為常用，所以本發明選擇了鹽梯度洗脫，洗脫液中的蛋白經SDS-PAGE電泳分析顯示純化效果較好，純度在93%左右，最後再用截流分子量為10000的超濾膜進行超濾，純化的hGTA蛋白濃度為0.79mg/ml，1L菌液所得的包涵體蛋白最終獲得了27.4mg純度為98.4X的hGTA腫瘤相關抗原。本發明獲得hGTA重組蛋白與從乳腺組織中分離得到的hGTA蛋白具有完全相同的結構和功能，證明為同一種蛋白，臨床試驗表明，該蛋白可以用於乳腺癌的早期診斷。圖lRT-PCR逆轉錄後的瓊脂糖圖譜；其中M為DNAmarker;1為陰性對照；2為PCR產物。圖2pQE-hGTA酶切鑑定結果；其中M為DNAmarker;1為pQE-hGTA質粒；2，3為雙酶切結果。圖3hGTA基因的誘導表達結果；其中M為proteinmarker;1為M15(pQE)未誘導；2為M15(pQE)誘導6小時；3為M15(pQE-hGTA)未誘導；4，5為M15(pQE-hGTA)誘導6小時。圖4用離子交換純化hGTA重組蛋白結果；其中M為proteinmarker;1為M15(pQE-hGTA)未誘導；2為M15(pQE-hGTA)誘導6小時；3，4，5為蛋白質洗脫峰。以下通過實施例來進一步描述本發明的製備方法及有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的保護範圍。具體實施例方式實施例1人hGTAcDNA的逆轉錄及表達質粒的構建①乳腺癌細胞總RNA提取將乳腺癌細胞MDA-MB453(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院乳腺中心)培養於完全RPMI1640培養基，在37"，5%(:02、飽和溼度下培養至對數生長期，對細胞則消化、吹打細胞，製備細胞懸液，計數，2000r/min，棄去培養液，吸取細胞(5-10><106細胞/鼠)，待小鼠腹部開始增大後，收集腹水。一隻小鼠收集腹水2-3次後，殺死小鼠一次性取腹水，離心除去腹水中的細胞和細胞碎片，加入等體積的飽和硫酸銨到上清液中，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時，使蛋白質充分沉澱，將沉澱物溶於少量的PBS中，用10mmol/LPBS(Ph7.4)在4'C透析24小時。然後通過DEAE-SephadexA52層析柱，收集並合併洗脫液中含蛋白的部分，濃縮後即得抗hGTA單克隆抗體，將所篩選到的合格單克隆抗體保存備用。表l雜交瘤細胞染色體數目、單克隆抗體的亞型以及單克隆抗體的親和常數tableseeoriginaldocumentpage16實施例4抗hGTA單克隆抗體的酶標記稱取2mgHRP溶解於1ml超純水中，加入30ul新配的0.1MNal04溶液，將上述溶液裝入攔截分子量為8000的透析袋中，對2mMPH4.4的醋酸鈉緩衝液透析過夜；加30/d0.2MPH9.5碳酸鹽緩衝液，調醛化HRP的PH升高到9.09.5，立即加入0.5ml抗hGTA抗體，室溫避光在脫色搖床上輕輕振搖2小時；加40ul新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4。C2小時。上述液裝入分子量為8000的透析袋中，對0.01MPH8.2磷酸鹽緩衝液透析過夜，用硫酸銨法純化即得。實施例4乳腺癌早期檢測標誌物hGTA試劑盒的製備1、試驗材料1)hGTA抗原實施例2所純化的重組hGTA抗原2)抗hGTA單克隆抗體l，2:實施例3所製備。3)所用的試劑3.1包被緩衝液碳酸鈉0.75g，碳酸氫鈉1.45g，硫柳汞O.lg，氯化鈣，0.2g，對羥基水楊酸0.02g，加雙蒸水至1000ml調PH9.6，滅菌備用。3.2、封閉液氯化鈉4.0g，磷酸二氫鉀O.lg，磷酸氫二鈉1.45g，氯化鉀O.lg，硫柳汞0.08g，去免疫球蛋白牛血清白蛋白15g，加雙蒸水至500ml，調pH7.2，高壓滅菌即可。3.3、終止液20ml硫酸加雙蒸水至184ml3.4稀釋液的配製氯化鈉4.0g，磷酸二氫鉀O.lg，磷酸氫二鈉1.45g，氯化鉀O.lg，硫柳汞0.08g，加雙蒸水至500ml，調PH7.2，高壓滅菌即可。3.5酶底物液的製備A液磷酸氫二鈉14.60g以酸鈉9.33g0.75%過氧化氫尿素20ml加雙蒸水至IOOO，調PH值5.0B液TMB20mgDMF28ml雙蒸水60ml3.6、洗滌液的配製氯化鈉4.0g，磷酸二氫鉀O.lg磷酸氫二鈉1.45g氯化鉀O.lg硫柳汞0.08g吐溫201.0ml加雙蒸水至1000ml:調pH值7.2。表2試劑盒的組成:酶標板96孔酶標抗體1瓶(5ml)底物A液l瓶(5ml)標準品5支(5ug/支)底物B液l瓶(5ml)樣品稀釋液(10x)1瓶(10ml)終止液1瓶(5ml)洗滌液(20x)1瓶(12.5ml)試劑盒使用說明書一份。3.8、本發明試劑盒保存及有效期2-8°C、密閉、避光保存，有效期12個月。3.9操作方法包被用包被緩衝液將hGTA抗體稀釋成2/ig-8/ig/ml工作濃度，每孔加入工作濃度抗體100/xL，共包被96孔，蓋好酶標板，置於4"C冰箱中過夜；洗滌棄去包被液，用PBS-T洗滌液滿孔洗滌3次，每次3分鐘，最後一次扣幹；封閉用封閉液加滿各反應孔，去除加樣時產生的貼壁氣泡，蓋好酶標板，於37"C水浴箱中孵育30分鐘。洗滌棄去包被液，用PBS-T洗滌液滿孔洗滌3次，每次3分鐘，最後一次拍千。於37。C乾燥20分鐘，然後真空包裝於鋁箔袋中保存備用。灌裝(1)灌裝濃縮洗滌液調整分裝器灌裝量至12.5ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過濾後洗滌液通過自動灌裝機將洗滌液灌裝於15ml白色的塑料瓶中，隨灌裝進行及時旋上瓶塞。(2)灌裝濃縮樣品稀釋液調整分裝器灌裝量至lO.Oml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過濾後樣品稀釋液通過自動灌裝機將樣品稀釋液灌裝於15ml白色的塑料瓶中，隨灌裝進行及時旋上瓶塞。(3)灌裝酶標抗體工作液調整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過濾後酶標抗體工作液通過自動灌裝機將酶標抗體工作液灌裝於8.0ml白色塑料瓶中，隨灌裝進行及時旋上瓶塞。(4)灌裝底物A液調整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過濾後底物A液通過自動灌裝機將底物A液灌裝於8.0ml白色塑料瓶中，隨灌裝進行及時旋上瓶塞。(5)灌裝底物B液調整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過濾後底物A液通過自動灌裝機將底物A液灌裝於8.0ml黑色塑料瓶中，隨灌裝進行及時旋上瓶塞o(6)灌裝終止液調整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，通過自動灌裝機將終止液灌裝於8.0ml白色塑料瓶中，隨灌裝進行及時旋上瓶塞。(7)包裝將每支塑料瓶插入泡沫墊各個孔中，將泡沬墊裝入中紙盒中，在上面放上經真空包裝的酶標板，然後放上兩張不乾膠片，放入一張說明書即得。實施例5本發明試劑盒的使用方法一、樣品的採集和試劑的準備1)待檢樣品的採集取病人靜脈血，離心分離得血清備用2)、試劑準備1)將10x稀釋液用前置於37'C水浴15分鐘，然後用蒸餾水做10倍稀釋；2)將20x洗滌液用前置於37'C水浴15分鐘，然後用蒸餾水做20倍稀釋；3)將0.2叫標準品用500ul稀釋液準確復溶(0.2ug/ml)。取出200ul用稀釋液作五次倍比稀釋，得濃度200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml六個標準點。二、操作步驟1、加樣將酶標孔每孔加入標準品100ul，每個濃度加一個孔，繪製回歸曲線；加入待測血清樣本100Ul，每個樣本加復孔；陰性對照血清加兩個復孔，輕輕振蕩混勻，37'C水浴40分鐘；2、洗滌棄去反應孔內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3分鐘，甩幹，反覆3次後拍幹；3、加酶標抗體每孔加入酶標抗體100ul，輕輕振蕩混勻，37。C水浴40分鐘；4、洗滌棄去反應孔內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3分鐘，甩幹，反覆3次後拍幹；5、顯色臨用前把底物A、B溶液按體積比l:l混合均勻。每孔加底物液IOOul，37"C水浴15分鐘；6、終止比色每孔加入50ul終止液，輕輕混勻30秒，在酶標儀450nm處，以底物空白孔調零，測各孔的吸光值。三、數據處理以hGTA標準品濃度(ng/ml)的常用對數為橫坐標，吸光值為縱坐標作圖，待測標本含量(ng/ml)可從標準曲線上算出，然後乘以稀釋倍數即可。四、評定標準1)陰性10.0ng/ml。3)臨界值5-10ng/ml，若檢測結果為臨界值，應進行重複實驗，若仍為臨界值判為陰性，重複實驗以後者結果為準。試驗例1本發明試劑盒臨床應用觀察試驗於2005年1月10日到2005年8月10日在哈爾濱醫科大學附屬第一醫院進行臨床考核80例，其中陰性病人30例，陽性病人50例，以影像檢測法為進標準，將考核人群分為四個組正常，i期乳腺癌，n期乳腺癌，in期乳腺癌，臨床考核結果見表3:表3本發明試劑盒臨床應用觀察結果tableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22569099495HY-F0056女36正常2.13正常57，531HY-F0057女28正常1.35正常589099504HY-F0058女5丄正常2.36正常596084160HY-F0059女37正常3.45正常609119732HY-國0女25II期乳腺癌135.69n期乳腺癌619119741HY-F0061女38II期乳腺癌124.56n期乳腺癌629119725HY-F0062女46正常7.25可疑636084712HY-F0063女49正常4.45止常649114358HY-F0064女37正常1.56正常655486915HY-F0065女32II期乳腺癌135.78n期乳腺癌666115740hy-f0066女26ii期乳腺癌142.48ii期乳腺癌676105255HY-F0067女36正常3.45正常686140205HY-F0068女29I期乳腺癌23.47i期乳腺癌695373805HY-F0069女34I期乳腺癌23.58i期乳腺癌709114576HY-F0070女39正常4.25正常716116085HY-F0071女26II期乳腺癌26.45n期乳腺癌726092254HY-F0072女34II期乳腺癌30.25n期乳腺癌739114947HY-F0O73女46I期乳腺癌44.59i期乳腺癌749114970HY-F0074女37正常4.12正常759134052HY-F0075女31正常3.25正常768984117HY-F0076女36正常6.15可疑774414078HY-F0077女35正常6,48可疑789149490HY-F0078女35n期乳腺癌164.58n期乳腺癌799149805HY-F0079女42n期乳腺癌125.48n期乳腺癌806102275HY-F0080女37i期乳腺癌66.47i期乳腺癌應用本發明實施例所製備的hGTA酶聯定量檢測試劑盒，對50例患有各期乳腺癌病人及對30例無乳腺癌疾患的健康人檢測，結果顯示在乳腺癌各期中hGTA陽性率為1期78%，11期98%，111期100%。並且在對本法檢測可疑的病人其中有4例最終進展為乳腺癌，說明本法診斷乳腺癌具有比影像檢測更早的特點。試驗結果表明，本發明hGTA酶聯定量檢測試劑盒對早期發現發現乳腺癌有極好的臨床意義，可適用於婦女早期乳腺癌的篩査檢測。O10>〈120>〈130><212〉<213〉序列表北京關康生物技術研究中心人乳腺^組織抗原及U:編碼樣W、Jt制各方法和應用P0882PatentInversion3.311158DNA智人(Homosapiens)CDS〈222>(97)..(1059)<400〉1gccaagggtccaggctccttg3gctacaacttccggactgcctactaaccgcaattggct60caagttaaccgccttaccttcttaggctgccctgaaggccaagcagccaacggc114GIyGinAlaAlaAsnGlv15cgcggcgtgaactggctgegggccctgtgcgagsacgetcagctgggc162ArgGlvValAsnTrpLeuArgAlaLeuCysGluAsnAlaGinLeuGly101520agaaccegggccttcgetgccaccgetgetgacgtcagaagegggccc210ArgThrArgAlaPheAlaAlaThrAlaAlaAspValArgSerGlyPro253035ateatgctggccgagagstgcteacagtgcctgggctecgacgcctea258lieMetLeuAlaGluArgCysSerGinCysLeuGlvSerAspAlaSer40450ctggagacgacctggctgcacgaggetaagagetgcaataccgtcggt306LeuGluThrThrTrpLeuHisGluAlsLysSerCysAsnThrValGlv55606570agaaacccacacgaaaccaggcctggagetctgggacacetcgccggc354ArgAsnProHisGluThrArgProGlyAlaLeuGlyHisLeuAlaGly758085atetttgacagetecgacggceggageeggatectggccaacgaggcc402liePheAspSerSerAspGlvArgSerArglieLeuAlaAsnGluAla9095100ccgaaggagctgctgactggcaataccgtgcccgtcgatagegetgtc450ProLvsGluLeuLeuThrGlvAsnThrValProValAspSerAlaVal105110115atgagtaggctttacteccgaattaccctgtacUcetctgtteaaag498MetSerArgLeuTyrSerArglieThrLeuTvrPheLeuCvsSerLys120125130t"、gccgggagg"('asggtctegtattgcctg('agtacageetcUt546PheAlaGlvArgPheLvsValSerTvrCysLeuGinTvrSerLeuPhe135145150gccetcccccagct.gtgcccctegcaggaccccctggacgcctatgca594A]aLeuProGinLeuCvsProSerGinAspProLeuAspAlaTvr人la155160gtggccacagccgggctgctgaagetccagttcgcctgggggttcgcc642ValAiaThrAlaGlvLeuLetiLysLeuGinPheAlaTrpGlyPheAla170175腦ttggcctggcc(:agtcccacaaticgagtgggacct.g(、aactgcc('aggfi90LeuAlaTrpProSerProThrAsnGluTrpAspLeuGinLeuProArggtgcccValPro200gagaccGluThr215etcgagLeuGlu33gctgLysLeutac333TyrLysagttttSerPhe280ctgtatLeuTyr295'gtgtecValSer185ageSerG]ictgLeuProetcLeuC3gGin3CCThr265gccAlatecSerttcPhetttPhegccAla250Pro3gtSergggGlycgcArgtecSer235ctgLeutegSergacAsp3tClie220ctgLeutscTyrThrcgtArg205GluC3gGing33GlutacTyr190gggGlytggTrptggTrpctgLeutggTrpttgLeugtcVal315LysLys300TyrGin285g3CAspetcLeuGluetcLeuttcPheattlie270gesAlaestHiscctPro8CtThr255eggArg3gtSerThrgecAlat.t.tPhe240gtgValProgtggccValAla210gagcat.GluHis225tggageTrpSerttccagPheGin33gt3CLysTyr195ctgttgLeuHisttgLeutggTrp3ggArgProGingtcaasValLysCC33CtProThr305Thr275t3tTyrcagGinLeusagLysGluctgLeu260gatAspAlaatgMetttcPhe245gccAlaThrctgLeuatgMet230C3gGineggArgAsptctSerSerg3tAsp33gLysgtcValaggArg3107387868348829309781026ProThratelie320cagagctgcaacctcgagctccc1079Gintgtcctgctcaccaagtcttgcttcacctgtgacgcccagcttggtcaactgatctaatg1139accttcaacaaegtaatec1158<210〉2321<212〉PRT<213〉智人<400〉2(Homosapiens)GlyGinAlaAlaAsnGlyArgGlyValAsnTrpLeuArgAlaLeuCys151015GluAsnAlaGinLeuGlvArgThrArgAlaPheAlaAlaThrAlaAla202530AspValArgSerGlyProlieMetLeuAlaGluArgCysSerGinCys354045LeuGlySerAspAlaSerLeuGluThrThrTrpLeuHisGluAlaLys505560SerCysAsnThrValGlyArgAsnProHisGl_uThrArgProGyAla65707580LeuGlvHisI,euAlaGlyliePheAspSerSerAspGlvArgSerArg859095HeLpiiAlaAsn(;hiAlaProLvsGI11UniI.euThrGlvAsnThrVa100105110ProVhIAspSe]'AlaVaMelSerArgLeuTyrSerArglieThrLeu25115120125TyrPheLeuCysSerLysPheAlaGlyArgPheLysValSe]'Ty]'Cys130135140LeuGinTyrSerLeuPheAlaUuProGinLeuCysProSerGinAsp145150155160ProLeuAspAlaTyrAlaValAlaThrAlaGlyLeuLeuLysLeuGin165170175PheAlaTrpGlyPheAlaLeuAlaTrpProSerProThrAsnGluTrp180185190AspLeuGinLeuProArgValProSerGinLeuAspArgGlyTrpThr195200205ValAlaLeuLeuAlaLeuGluThrProPheArglieGluGluHisAla210215220GluHisLeuLysMetMet.LeuGluLeuPheSerLeuGinLeuProPhe225230235240TrpSerHisGluPheGinLysLeuGinAlaLeuTyrGluPheThrVal245250255PheGinLeuLeuAlaArgTvrLysThrProSerThrTvrlieArgPro260265270LysTyrThrAspThrAspSerPheAlaSerTrpLysGinAlaSerTrp275280285ValLysTvrSerAspValLeuTyrSerG1yLeuLysAspArgProGin290295300ProThrGinSerLysArgValSerTrpLeuValTyrLeuProThrlie305310315320Gin權利要求1.一種人乳腺癌組織抗原，其特徵在於是以下(a)或(b)的胺基酸序列(a)SEQIDNO2所示的胺基酸序列；或(b)將SEQIDNO2所示的胺基酸序列通過一個或多個胺基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有該抗原活性的蛋白衍生物。2.根據權利要求1的人乳腺癌組織抗原，其特徵在於其是SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。3.—種編碼權利要求1所述人乳腺癌組織抗原的基因，其特徵在於是以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴謹條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有該抗原活性的蛋白；或(c)編碼SEQIDNO:2所示胺基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有所述抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過將SEQIDNO:2所示的胺基酸序列的一個或多個胺基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。4.按照權利要求3的基因，其特徵在於其是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。5.含有權利要求3或4所述基因的重組表達質粒。6.按照權利要求5的重組表達質粒，其特徵是所述的重組表達質粒是pQE國hGTA。7.含有權利要求5或6所述重組表達質粒的重組菌株。8.—種製備權利要求1人乳腺癌組織抗原的方法，包括以下步驟構建含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的重組表達質粒；培養用該重組表達質粒所轉化的宿主細胞，得重組菌株；培養重組菌株，誘導重組乳腺癌組織特異蛋白的表達，回收並純化所表達的重組蛋白。9.按照權利要求8的方法，其特徵是所述的重組表達質粒是pQE-hGTA;所述的宿主細胞是大腸桿菌M15[pREP4]。10.按照權利要求8的方法，其特徵是所述的回收並純化重組蛋白的方法包括以下步驟冰浴超聲破菌法裂解表達重組質粒pQE-hGTA的大腸桿菌Ml5[pREP4];收集包涵體並將其溶解，收集變性蛋白；用N產鰲合親和層析純化變性蛋白；復性純化後的變性蛋白離子，得粗復性蛋白；將粗復性蛋白用陰離子交換層析純化，即得。ll.權利要求1的人乳腺癌組織抗原在製備診斷或治療乳腺癌藥物中的用途。全文摘要本發明公開了一種用於乳腺癌早期診斷的癌抗原(HumanGalactophoretissueantigen，hGTA)及其編碼基因，含有該編碼基因的重組質粒和含有該重組質粒的宿主細胞。本發明還公開了該重組抗原的製備和純化方法以及該重組抗原在乳腺癌早期診斷中的應用。hGTA是一種只在乳腺組織表達，在原發性乳腺癌及乳腺癌細胞系中表達顯著增加的蛋白，其cDNA編碼大約36kD的分泌性糖蛋白。hGTA乳腺組織特異性和分泌性蛋白的特點，使其在乳腺癌臨床早期診斷上具有潛在的應用價值，其腫瘤相關抗原的特性，使其可作為腫瘤疫苗設計的靶點應用於乳腺癌免疫治療。文檔編號A61P35/00GK101260153SQ200710064199公開日2008年9月10日申請日期2007年3月6日優先權日2007年3月6日發明者路戴,軍杜,王文雅,鑫金申請人:北京美康生物技術研究中心