一種合成聚羥基烷酸的方法
2023-07-15 05:13:11 2
專利名稱：一種合成聚羥基烷酸的方法
技術領域：
本發明屬於環境保護技術領域，具體涉及一種利用富含聚糖菌(GAO)的 活性汙泥在厭氧條件下合成聚羥基烷酸(PHA)的方法。
背景技術：
眾所周知，隨著經濟和社會的發展，化學合成塑料所造成的"白色汙染" 變得越來越為嚴重。目前，塑料垃圾以每年2.5X10、的速度在自然界中積累， 其填埋、焚燒等處理過程中表現出了許多影響環境的弊端。因此，加強可降解 塑料的研究與開發，爭取在工藝上取得突破並應用於實際，生產出具有生物可 降解性且價格合理的塑料製品，對於環境保護和可持續發展都具有重要的現實 意義。聚羥基垸酸(PHA)是許多原核微生物在不平衡生長條件下，作為胞內能 量和碳源貯藏性物質而合成的聚酯，是一類可生物降解塑料，不僅具有與化學 合成高分子材料(如聚丙烯)相似的性質，而且還有一般化學合成高分子材料 所不具有的性質，如可完全生物降解性、生物相容性、壓電性、光學活性等特 殊性質。因此，PHA是合成塑料的理想替代品，具有廣闊的應用前景，也引起 了眾多學者的研究興趣。目前，對PHA合成方法的研究主要有以下兩個方向研究最多的一類是通 過野生菌種的篩選、利用基因工程技術獲得能夠高效合成PHA的菌種以及開發 有效的發酵技術，並通過單一菌株的純培養來收穫PHA，採用此方法，其PHA 最高合成率可達到細胞乾重的70%以上(例如，文獻Applied and Environment Microbiology, 1998， 64: 4897—4卯3.)。現階段採用此種方法合成PHA在工業 生產中已經可以實現，如美國Monsanto公司以微生物發酵方式生產生物可降解 塑料。其生產工藝大多是利用純種微生物，生產原料主要是葡萄糖等價格昂貴 的有機底物，在工藝運行過程中，要求滅菌消毒，保證發酵系統無雜菌存在。 因此，這種PHA生產方式與以石油為原料的傳統塑料生產工藝相比成本較高 每公斤PHA生產成本約為9歐元，而每公斤合成塑料僅為1歐元，因而，目前 採用此方法合成的PHA大多應用於醫學領域(如，骨骼替代品等)，在日常生 活中的大量使用還不太現實。為了降低PHA的生產成本，近幾年來國內外開始利用混合菌種和多種底物 合成PHA的活性汙泥法進行實驗研究。活性汙泥是廢水處理系統中自然形成的3微生物與有機物的聚集體，1974年有人從活性汙泥中提取到PHA，為利用活性 汙泥生產PHA奠定了基礎(例如，文獻Environmental Science & Technology, 1974， 8: 576 — 583.)。最初對於胞內儲存物質的研究僅僅局限在生物除磷範圍 內，直到Cech等1993年首次發現同樣能累積PHA和糖原的聚糖菌(GAO)， 研究者開始意識到微生物胞內儲存代謝的特殊性與重要性(例如，文獻Water Research, 1993， 27 (7): 1219—1225)。混合菌種多種底物活性汙泥法生產PHA 比純菌種單底物的方法更具有現實可行性。混合菌種使工藝運行簡單易於操控， 不需要嚴格的滅菌消毒環境，節省了工藝消耗費用。多種底物的使用可以從根 本上降低PHA的生產價格，使底物的選擇從昂貴的單一底物轉向了低廉的混合 底物，例如，使用碳源豐富的工業廢水、市政汙水和有機廢料作為底物。上述 諸多優勢使活性汙泥微生物成為PHA合成方法研究中的新寵，國內外很多學者 都對此方法進行了探索和嘗試(例如，中國發明專利，申請號200510015481.4; 中國發明專利，申請號98126486.7;文獻Water Science and Technology, 1998， 38 (2): 103_109)。從目前的研究來看，採用這一方法，PHA佔細胞乾重的比 例不是很高，且工藝運行的最優條件也不十分明確，還難以解決PHA大規模商 業化生產的經濟性問題，所以此方法還有待改進。同時，這些研究多局限於利 用活性汙泥中的聚磷菌(PAO)作為合成PHA的微生物，卻忽視了活性汙泥中 的GAO同樣具有這一能力。PAO和GAO都是活性汙泥中存在的微生物，但到目前為止，還沒有文獻報 導能夠分離出純的GAO或PAO，但這並沒有影響人們對其進行研究。在文獻中， PAO指的是活性汙泥中具有在厭氧條件下釋放磷、合成PHA，好氧條件下過量 吸收磷、分解PHA的一類微生物的總稱；而GAO指的是活性汙泥中具有在厭 氧條件下分解糖原、合成PHA、但不釋放磷，好氧條件下積累糖原、分解PHA、 但不過量吸收磷的一類微生物的總稱。GAO具有的微生物學特徵是呈四分體 排列，主要來自於蛋白菌屬(Proteobacteria)的a亞綱以及y亞綱，35%的微生 物呈雜交陽性，Gram染色呈陰性。此外，不像PAO合成PHA時要求廢水中有 一定量的磷存在，利用GAO合成PHA的一個優勢是可以在汙水中磷含量較低 的條件下進行。本發明另闢蹊徑，依據GAO的代謝規律，建立了一種利用富集GAO的活 性汙泥在厭氧條件下合成PHA的方法。該活性汙泥為來源於A/0、 SBR等具除 磷功能的汙水處理廠的剩餘汙泥，由於這些工藝多採用厭氧/好氧交替的方式運 行，使其剩餘汙泥中不僅含有大量的PAO，而且含有GAO，便於從中富集培養 GAO。該方法的基本原理是在厭氧條件下，富集GAO的活性汙泥微生物利用 降解體內糖原所獲得的能量吸收乙酸等揮發性脂肪酸，並以PHA的形式儲存在 體內，能量也隨之轉移到PHA中。而在好氧條件下，由於此時在環境溶液中缺乏營養物質，但卻存在著氧氣這種電子受體，所以GAO就會降解體內的PHA， 並將產生的電子通過電子傳遞鏈最終傳遞給氧氣，使其還原成H20，在這個過 程中產生大量的能量，這些能量一部分用於GAO的自身生長，而餘下的則在 PHA重新轉化成糖原的過程中以糖原的形式儲存起來，以便下次在厭氧條件下 重新被利用。本發明利用了GAO能在厭氧條件下合成PHA的代謝特點，為解 決PHA的合成問題提供了一種有益的方法。到目前為止，有關利用富集GAO 的活性汙泥在厭氧條件下合成PHA的研究尚未見報導。發明內容本發明的目的在於提供一種利用富含聚糖菌(GAO)的活性汙泥在厭氧條 件下合成聚羥基烷酸(PHA)的方法。一種合成聚羥基烷酸的方法，其中利用汙泥中的聚糖菌合成聚羥基烷酸， 步驟如下(a) 採用除磷汙水處理廠的剩餘汙泥在一定條件下富集培養聚糖菌，得到富 含聚糖菌的活性汙泥；(b) 富含聚糖菌的活性汙泥在厭氧條件下經處理合成聚羥基烷酸。(c) 收集、分離含有聚羥基烷酸的聚糖菌，經溶劑抽提後處理得到聚羥基烷 酸產物。如上所述的方法，其中所述的GAO呈四分體排列，屬於蛋白菌屬 Proteobacteria的a亞綱以及Y亞綱，35%的微生物呈雜交陽性，Gram染色呈陰 性；其生理代謝特徵是厭氧階段不釋放磷、但分解糖原和合成PHA，好氧階 段積累糖原並分解PHA、但不過量吸收磷。如上所述的方法，其中步驟(a)將除磷汙水處理廠的活性汙泥放入反應器 中，加入磷濃度1.3-5mg/L、有機酸濃度216.7-350mg-COD/L、 pH6.8-8.0的廢水， 在厭氧條件下攪拌反應0.5-4h，然後好氧曝氣2-5h，經過沉澱和排水後，再加入 0.3-0.8體積新鮮廢水，如此進行一天3-6個周期、每個周期4-8h的操作。經過 l-5個月的培養後，測得每周期厭氧末，活性汙泥微生物吸收單位有機酸的磷釋 放量小於0.25mol磷/C-mol乙酸，吸收單位有機酸的糖原降解量大於0.8C-mol 糖原/C-mol乙酸，據此可以判斷活性汙泥中聚糖菌已成為優勢種群，該汙泥即 為富含聚糖菌的活性汙泥。如上所述的方法，其中步驟(b)將步驟(a)得到的含有富集聚糖菌的活 性汙泥經l-5小時靜置沉澱，取出沉澱物稀釋至濃度1500-4500mg/L，置於反應 器中在有機酸濃度216—2100mg-COD/L，控制進水pH值6.4—8.0，氨氮濃度3 一21mg/L，在厭氧條件下攪拌0.5-3h，反應結束後收集含有聚羥基烷酸的聚糖菌體。如上所述的方法，其中步驟(b)中控制進水pH在7.6 — 8.0;氨氮濃度為 7mg/L;有機酸濃度為420-490 mg/L，採用的有機酸種類為乙酸、丙酸、丁酸 等短鏈脂肪酸；厭氧運行時間為2h;所用的反應器為SBR序批式反應器。與純種微生物合成PHA相比，本發明的有益效果是無需滅菌消毒提供無 菌環境，可有效降低運行成本，同時系統也較穩定，為PHA的大規模工業化生 產提供了可能。
具體實施方式
下面結合實例作進一步詳細說明，其中PHA的測定方法參照相關文獻 (Applied Microbiology and Biotechnology, 1978， 6: 29—37)，具體步驟是將 汙泥樣品於冷凍乾燥機中乾燥至粉末狀，稱取乾燥後的汙泥粉於裂解瓶中，依 次加入氯仿、硫酸一甲醇和苯甲酸一甲醇溶液，於102'C下裂解數小時，待冷卻 後，加蒸餾水離心，取有機相進行氣相色譜分析。實施例1GAO的富集培養:按文獻(Biotechnology and Bioengineering， 2001， 76(1): 17-31)的培養方法並適當改進進行，即將具除磷功能的城市汙水處理廠的剩餘 汙泥放入有機玻璃製成的3.5L反應器中，加入磷濃度1.3mg/L、乙酸濃度 216.7mg-COD/L、 pH6.8的廢水2.75L,在厭氧條件下攪拌反應2h，然後好氧曝 氣3h，經過沉澱和排水後，再加入2.75L新鮮廢水，如此進行一天3個周期、 每個周期8h的操作。經過近三個月的培養後，測得每周期厭氧末，活性汙泥微 生物吸收單位有機酸的磷釋放量小於0.25mol磷/C-mol乙酸，吸收單位有機酸的 糖原降解量大於0.8C-mo1糖原/C-mol乙酸，據此可以判斷活性汙泥中聚糖菌已 成為優勢種群，該汙泥即為富含GAO的活性汙泥，其微生物學特徵是呈四分 體排列，主要來自於蛋白菌屬(Proteobacteria)的a亞綱以及Y亞綱，35%的微 生物呈雜交陽性，Gmm染色呈陰性；其生理代謝特徵是厭氧階段基本沒有磷 的釋放、但分解糖原和合成PHA，好氧階段積累糖原並分解PHA、但沒有磷的 過量吸收。PHA的合成方法如下將700ml經3小時靜置沉澱的富含GAO的活性汙 泥置於工作容積3.5L的有機玻璃反應器中，並稀釋至汙泥濃度約3000mg/L，以 丙酸為碳源(濃度280mg-COD/L)，控制進水pH=6.4，氨氮濃度21mg/L，在 厭氧條件下攪拌2h，厭氧結束時收集菌體，測得每克菌體中含PHA35mg。實施例2GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下改變進水pH二7.2，並在厭氧條件下攪拌3h，其餘合成條件同實施例l，測得每 克菌體中含PHA44 mg。實施例3GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為350mg-COD/L，並控制進水pH二7.6，在厭氧條件下攪拌0.5h， 其餘合成條件同實施例1，測得每克菌體中含PHA31mg。實施例4GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改變進水pH二8.0，其餘合成條件同實施例l，測得每克菌體中含PHA69mg。實施例5GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改為以乙酸和丙酸為碳源(濃度216 mg-COD/L，其中丙酸193mg-COD/L，乙 酸23mg-COD/L)，並控制進水pH二6.8，其餘合成條件同實施例1,測得每克菌 體中含PHA54mg。實施例6GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改為將GAO置於工作容積1L的燒杯中，並以乙酸和丙酸為碳源(濃度2100 mg-COD/L，其中乙酸1750mg -COD/L,丙酸350mg-COD/L)，控制進水pH= 7.6，氨氮濃度7mg/L，其餘合成條件同實施例1，測得每克菌體中含PHA30mg。實施例7GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為350mg-COD/L,並控制進水pH二8.0，其餘合成條件同實施例 1，測得每克菌體中含PHA90mg。實施例8GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為350mg-COD/L,並控制進水pH二7.6，氨氮濃度7mg/L，其餘 合成條件同實施例1，測得每克菌體中含PHA161mg。實施例9GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改變進水pH二6.8，並控制進水氨氮濃度3mg/L，其餘合成條件同實施例1，測 得每克菌體中含PHA 132mg。實施例10GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下改變丙酸濃度為420 mg-COD/L，並控制進水pH二7.6，氨氮濃度7mg/L，其餘 合成條件同實施例1，測得每克菌體中含PHA418mg。實施例11GAO的富集培養及汙泥中PHA的測定方法見實施例1。 PHA的合成如下 改變丙酸濃度為490 mg-COD/L，並控制進水pH二7.6，氨氮濃度7mg/L，其餘 合成條件同實施例l，測得每克菌體中含PHA 589 mg，採用凝膠滲透色譜測得 該PHA相對分子質量約8X 105，採用差示掃描量熱儀測得結晶度約80%。上述的對實施例的描述是為便於該技術領域的普通技術人員能理解和應用 本發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改， 並把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此， 本發明不限於這裡的實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，對於本發明 做出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種合成聚羥基烷酸的方法，其特徵在於利用汙泥中的聚糖菌合成聚羥基烷酸，步驟如下(a)採用具除磷功能的汙水處理廠的剩餘汙泥在一定條件下培養富集聚糖菌，得到富含聚糖菌的活性汙泥；(b)富含聚糖菌的活性汙泥在厭氧條件下經處理合成聚羥基烷酸。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的聚糖菌呈四分體排列，屬 於蛋白菌屬Proteobacteria的oc亞綱以及y亞綱，35 %的微生物呈雜交陽性，Gram 染色呈陰性；其生理代謝特徵是厭氧階段不釋放磷、但分解糖原和合成PHA， 好氧階段積累糖原並分解PHA、但不過量吸收磷。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(a)將除磷汙水處理廠的活性汙泥放入反應器中，加入磷濃度1.3-5mg/L、 有機酸濃度216.7-350mg-COD/L、 pH6.8-8.0的廢水，在厭氧條件下攪拌反應 0.5-4h,然後好氧曝氣2-5h，經過沉澱和排水後，再加入0.3-0.8體積新鮮廢水， 如此進行一天3-6個周期、每個周期4-8h的操作；經過l-5個月培養，測得每周 期厭氧末，活性汙泥微生物吸收單位有機酸的磷釋放量小於0.25mol磷/C-mol乙 酸，吸收單位有機酸的糖原降解量大於0.8C-mol糖原/C-mol乙酸，據此可以判 斷活性汙泥中聚糖菌已成為優勢種群，該汙泥即為富含聚糖菌的活性汙泥。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(b)將步驟(a)得到的富含聚糖菌的活性汙泥經1-5小時靜置沉澱，取出 沉澱物稀釋至濃度1500-4500mg/L，置於反應器中在有機酸濃度216 — 2100mg-COD/L，控制進水pH值6.4—8.0，氨氮濃度3—21mg/L，在厭氧條件下 攪拌0.5-3h，反應結束後收集含有聚羥基垸酸的聚糖菌體。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(b)中控制進水pH在7.6-8.0。
6. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(b)中控制進水氨氮濃度 為7mg/L。
7. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(b)中控制進水有機酸濃 度為420-490 mg/L。
8. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(b)中採用的有機酸種類 為C2-C6短鏈脂肪酸，具體包括乙酸、丙酸、丁酸。
9. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(b)中厭氧運行時間為2h。
10. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(b)中所用的反應器為SBR 序批式反應器。
全文摘要
本發明屬於環境保護技術領域，具體涉及一種利用富含聚糖菌(GAO)的活性汙泥在厭氧條件下合成聚羥基烷酸(PHA)的方法，即通過對汙水處理廠的剩餘汙泥進行培養馴化使GAO得到富集，在序批式反應器(SBR)中，以短鏈脂肪酸為碳源，通過控制進水pH和氨氮濃度，將富含GAO的活性汙泥微生物在厭氧條件下攪拌一段時間，使其合成PHA。本發明提供了一種合成PHA的新方法，降低了PHA的生產成本。
文檔編號C12P7/62GK101323864SQ20071004187
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月12日 優先權日2007年6月12日
發明者櫻 姚, 姜亞敏, 陳銀廣, 顧國維 申請人:同濟大學