Foxp3+天然殺傷t細胞及免疫相關疾病的治療的製作方法

2023-07-26 06:07:11

專利名稱：Foxp3+天然殺傷t細胞及免疫相關疾病的治療的製作方法
F0XP3+天然殺傷T細胞及免疫相關疾病的治療相關申請案本申請案根據35U. S. C. § 119(e)的規定主張2008年11月13日申請的標題為 "Foxp3+調節天然殺傷 T 細胞及其產生方法(Foxp3+Regulatory natural killer T cells and a method for their generation) 」 的美國臨時申請案第 61/114，362 號的權利。本申請案主張2009年9月25日申請的標題為「細胞的新方法及用途(New process and use of cells) 」的葡萄牙臨時申請案第104764號的權利。各上文所指出申請案的全部內容均以引用方式併入本文中。
背景技術：
近年來，NKT細胞在調節免疫系統中的作用獲得重大關注。NKT細胞的功能依賴於細胞殺傷，且尤其依賴於細胞因子的釋放。具體來說，已顯示，NKT細胞能夠產生為Thl、Th2 或Thl7應答所特有的細胞因子，因此影響適應性免疫(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)。對常規T 細胞的影響轉變為多種NKT細胞抑制或加劇的免疫病狀⑶(9) (10) (11) (12) (13)。已在移植(14)、過敏症(15)、自身免疫(16) (17)及其他炎性病狀(18) (19)中報導這種NKT細胞對適應性免疫的影響。

發明內容
一方面，本發明提供分離的R)xp3+天然殺傷T細胞及包含R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞群。一方面，本發明還提供使用TGF-β及一或多種NKT刺激劑產生R)xp3+天然殺傷T細胞的方法。R)xp3+天然殺傷T細胞可在體外產生，且其可在個體中原位產生。本文中指出，Foxp3+天然殺傷T細胞具有與Treg細胞類似的免疫抑制特性，且因此R)xp3+天然殺傷T細胞可用於治療多種免疫病症及病狀。當全身投予時，Foxp3+天然殺傷T細胞尋靶至肝及肺。因此，一方面，本發明提供通過全身投予i^Xp3+天然殺傷T細胞來治療肝及肺免疫病症及病狀的方法。這些免疫病症及病狀包括移植物抗宿主病(graft versus host disease)、與肝移植及胰島移植有關或由其引起的不期望副作用、及哮喘。你即3+天然殺傷T細胞尋靶至肝及肺也容許向這些器官投予治療性多肽及其他藥劑。本文中進一步指出，R)xp3+天然殺傷T細胞可通過局部投予TGF-β及NKT刺激劑而在特定解剖學位置(例如器官)原位產生。本文中還指出，如果TGF-β或NKT刺激劑在特定解剖學位置能夠以足量得到，則無需投予。因此，一方面，本發明提供通過局部原位產生R)Xp3+天然殺傷T細胞來治療特定解剖學位置免疫病症及病狀的方法。一方面，本發明提供分離的R)xp3+天然殺傷T細胞。一方面，本發明提供分離的細胞群，其包含(a)至少0.001%的^)即3+天然殺傷 T細胞，或(b)至少10個R)Xp3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞所佔百分比為至少0. 001%、至少0. 01%、至少0. 05%、至少0. 1%、至少0. 5%、至少1%、 至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%。在一些實施例中，R)xp3+天然殺傷T細胞的數目為至少1個、至少 10個、至少50個、至少100個、至少500個、至少1，000個、至少5，000個、至少10，000個、 至少50，000個、至少100，000個、至少1 X IO6個、至少1 X IO7個、或至少1 X IO8個細胞。在
一些實施例中，所述細胞群是血細胞群、白細胞群、T細胞群或天然殺傷T細胞群。在一些實施例中，所述細胞群是T細胞群。一方面，本發明提供一種產生R)Xp3+天然殺傷T細胞的方法，所述方法包含使包含天然殺傷τ細胞的細胞群與足以產生R)Xp3+天然殺傷T細胞的量的TGF- β與一或多種 NKT刺激劑的組合接觸。在一些實施例中，所述方法進一步包含使細胞群與IL-2接觸。在一些實施例中，所述方法進一步包含使細胞群與IL-7、IL-15及IL-21中的任一者或任一組合接觸。在一些實施例中，所述方法進一步包含使細胞群與選自由抗-IFN γ、抗-IL-4、 抗-IL-6、抗-IL12及抗-IL-27組成群組的中和抗體中的任一種或其任一組合接觸。在一些實施例中，所述細胞群是血細胞群、白細胞群、T細胞群或天然殺傷T細胞群。在一些實施例中，所述細胞群收穫自個體。一方面，本發明提供一種增加R)xp3+天然殺傷T細胞的數目的方法，所述方法包含使包含至少一你即3+天然殺傷T細胞的細胞群與足以增加R)xp3+天然殺傷T細胞的數目的量的TGF-β、NKT刺激劑、一或多種增殖誘導細胞因子及一或多種中和抗體的組合接觸。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞的數目增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少10，000倍、至少100，000 倍、至少IO6倍、至少IO7倍。在一些實施例中，增殖誘導細胞因子是IL-2、IL-7、IL-15及 IL-21中的一者或任一組合。在一些實施例中，中和抗體是抗-正^^、抗-11^-4、抗-11^-6、 抗-IL12及抗-IL-27中的任一者或任一組合。一方面，本發明提供一種將天然殺傷T細胞遞送至個體的肝或黏膜組織的方法， 所述方法包含向個體全身投予你@3+天然殺傷T細胞。一方面，本發明提供一種將天然殺傷T細胞遞送至個體的肝或黏膜組織的方法，所述方法包含向個體局部投予R)Xp3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，R)xp3+天然殺傷T細胞是自體細胞。在一些實施例中，通過使天然殺傷T細胞與足以產生R)xp3+天然殺傷T細胞的量的一或多種NKT細胞刺激劑及TGF-β接觸來產生R)xp3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，以有效抑制肝或黏膜組織中的免疫應答的量投予你@3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，抑制肝中的免疫應答旨在治療移植物抗宿主病、由胰島移植引起或與其有關的不期望的免疫應答、由肝移植引起或與其有關的不期望的免疫應答或免疫介導的肝炎症。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞與胰島移植或肝移植結合投予。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞的基因組包含編碼多肽的核酸，且其中將你即3+天然殺傷T細胞遞送至肝使所述多肽在肝中得以表達。一方面，本發明提供一種抑制個體器官中的免疫應答的方法，所述方法包含將一或多種NKT刺激劑以足以抑制器官中的免疫應答的量局部遞送至器官。在一些實施例中， 所述方法進一步包含將TGF-β以足以抑制器官中的免疫應答的量局部遞送至器官。在一些實施例中，所述免疫應答是針對抗原的免疫應答。在一些實施例中，所述免疫應答是自身免疫應答。在一些實施例中，所述器官是腸或肺。在一些實施例中，抑制免疫應答旨在治療炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)或哮喘。在一些實施例中，局部遞送至器官是遞送至黏膜組織。一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含含有R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞群。在一些實施例中，所述細胞群是血細胞群。在一些實施例中，所述細胞群是白細胞群。 在一些實施例中，所述細胞群是T細胞群。在一些實施例中，所述細胞群是NKT細胞群。一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含TGF-β及一或多種NKT刺激劑。每一本發明的限制規定均能夠涵蓋本發明的全部各個實施例。因此，預期涉及任一要素或要素組合的每一本發明限制規定可包括於本發明的每一方面中。本發明在其應用方面不僅限於下文說明中所列舉或圖中所示的構造細節及組件配置。本發明可具有其他實施例且能夠以各種方式來實踐或實施。而且，本文中所用的措詞及術語旨在說明目的而不應視為限制性的。本文中對「包括(including)，，、「包含(comprising) 」、「具有(having)」、 「含有(containing) 」、「涉及(involving) 」及其變化形式的使用意在涵蓋隨後所列出的項目及其等效物以及增列項目。


這些圖僅用於舉例說明目的，而非實現本文所揭示發明所必不可少的。圖1顯示iNKT細胞在TGF-β的存在下上調R)xp3表達。(a)將來自C57B1/6小鼠或R)xp3gfp基因敲入小鼠的脾的iNKT和CD4+CD25-T細胞進行FACS分選並在IL-2和 IL-15的存在下在添加或不添加TGF-β的情況下培養3天。左側點圖顯示用於iNKT細胞的細胞分選的門選技術(gating strategy)、以及用空的⑶Id四聚體評估的背景對照染色。也繪示了 iNKT細胞(上部圖)和在TCRβ +群中門選的⑶4T細胞(下部圖)。通過在從C57B1/6小鼠分離出的iNKT(上列)和對照CD4T細胞培養物(下列)中進行細胞內染色、或通過在從i^oxpSgfp基因敲入小鼠中分離的細胞中的GFP螢光來評估R)xp3表達。 所示點圖代表來自三個獨立實驗的一式三份培養物。(b)對來自C57B1/6小鼠(頂部)和 Foxp3gfp基因敲入小鼠(底部)的胸腺iNKT細胞進行分選，在IL-2、IL-15和TGF-β的存在下進行培養，並如所述針對你即3表達進行分析。(c) iNKT細胞對R)Xp3的表達通過聚焦顯微鏡檢查法在單細胞水平得到證實。在培養3天後對R)Xp3gfp細胞進行FACS分選， 將其不變TCR用PE標記的⑶ld/PBS57四聚體(紅色)重新染色，並將細胞核用DAPI (藍色)進行對比染色。Foxp3表達發出綠色螢光。(d)將C57B1/6小鼠的iNKT和⑶4+⑶25-T 細胞從脾分離並在5ng/mL的IL-2和不同濃度的TGF-β的存在下培養3天。培養物設定為一式兩份且結果代表三個獨立實驗。(e)將脾iNKT和CD4+CD25-T細胞(圖未示出)和不同濃度的板結合抗-CD3 —起培養3天。所示點圖代表來自三個獨立實驗的一式三份培養物。圖2顯示在不同細胞因子條件下Balb/c iNKT細胞的培養物。將iNKT細胞從 Balb/c小鼠的脾分離，根據CDld/PBS57四聚體與泛TCR-β MAb (pan TCR-β MAb)的共表達進行FACS分選，並在指定條件下用3 μ g/mL的板結合抗-⑶3刺激3天。圖3顯示R)xp3+iNKT細胞的表型和體內穩定性。對鼠科iNKT和⑶4+⑶25-細胞進行FACS分選，在TGF- β和IL-2的存在下培養3天並針對R)Xp3和所指示的分子進行共染色。(a和b)。所繪示的概圖是iNKT或CD4-細胞區域內門選(如圖6中所示而界定)。 結果代表來自至少兩個獨立實驗的一式三份培養物。(c)在TGF-β和IL-2的存在下培養3天後來自經FACS分選iNKT細胞或CD4T細胞的R)xp3和PLZF的mRNA編碼RT-PCR。每一基因的表達均是相對於EFlA表達而給出。圖4顯示i^oxp3+iNKT細胞的體內穩定性。將脾iNKT和CD4+CD25-T細胞從 R)Xp3gfp基因敲入小鼠分離並在TGF-β和IL-2的存在下培養3天。通過FACS來分選 R)xp3-GFP+細胞並將5X104iNKT(上部圖)或⑶4+⑶25-T細胞(下部圖)靜脈注射入 RAG2-/"受體宿主中。21天後將這些小鼠殺死並在幾個器官中對iNKT和⑶4T細胞的存在進行評估。圖顯示肝和混合淋巴結(pool oflymph nodes ;pLNs)中iNKT和CD4T細胞的 Foxp3和⑶25表達。只能在肝中檢測到iNKT細胞。圖5顯示，Foxp3+iNKT細胞通過GITR介導的接觸依賴機制抑制T細胞的增殖。 (a)在極化條件下從來自R)xp3gfp基因敲入小鼠的iNKT細胞和CD4T細胞體外培養物分選出Foxp3+iNKT細胞、Foxp3-iNKT細胞或iTreg細胞，並從幼稚C57B1/6小鼠分離出 nTreg細胞。將所分選出的細胞以一式三份與經絲裂黴素C處理的脾細胞和FACS分選的 ⑶4+⑶25-( 「應答者」)T細胞一起以不同的比率在可溶性抗-⑶3MAb的存在下進行共培養 96小時。在最後12小時的培養中通過[3H]胸苷摻入來評估增殖。頂部圖繪示來自三個獨立實驗(每一實驗均一式三份)並根據單獨的應答細胞的增殖標準化的增殖抑制平均值 (均值士SEM)。底部圖顯示2 1比率下(8000個調節細胞比4000個應答細胞)的代表性實驗的數據。對增殖的抑制具有統計學顯著性(n = 3, *Ρ < 0. 05)。(b)添加抗-GITR 而非抗-ILlOR封閉抗體消除抑制效應(n = 4，**Ρ < 0. 01)。(c)將Foxp3+iNKT細胞與如 (a)中經刺激的應答細胞一起以1 1的比率在轉孔培養板中進行培養。黑色柱狀圖代表當這些細胞與R)xp3+iNKT細胞一起在同一孔中進行培養時的應答細胞增殖；灰色柱狀圖代表當這些細胞與R)xp3+iNKT細胞分開在單獨的孔中培養時的應答細胞增殖，點線柱狀圖代表不存在調節細胞時的應答細胞增殖。百分比表示在指定閘門內三種情況的應答細胞的頻率。圖6顯示，Foxp3+iNKT細胞的體內轉變與TGF- β相關。(a)分析在從幼稚 C57B1/6小鼠的肝、混合淋巴結、派爾集合淋巴結、脾和胸腺分離的淋巴細胞中的R)xp3 表達。在淋巴細胞閘門內，通過與負載有PBS57的⑶Id四聚體和泛TCR-β抗體(pan TCR-β antibody)共染色來識別iNKT細胞。用空的⑶Id四聚體平行染色來評估每一器官的 iNKT細胞背景染色(僅顯示肝的圖)。(b)通過細胞內抗體染色分析R)xp3表達。R)xp3+ 細胞僅存在於⑶ld/PBS57-細胞之中。我們證實，這些R)xp3+細胞是⑶4+T淋巴細胞(右側點圖，僅顯示淋巴結的圖)。結果代表來自兩個獨立實驗的三隻小鼠。(c)分析R)xp3在來自C57BL/6小鼠或dnTGFi3RII小鼠的腸繫膜淋巴結的iNK細胞中的表達，這些小鼠暴露至一周α-GalCer的胃內遞送(在iNKT細胞上門選)。(d)分析在從慢性或急性過敏性氣道疾病小鼠肺分離的iNKT或⑶4T細胞中的R)xp3表達以及家務基因EF1A。從每一動物的肺中，通過流式細胞術分選1，000至5，000個iNKT細胞，並在單個的道(lane)中繪示。因為細胞數目較少，所以將來自五隻未經處理的幼稚對照小鼠的肺iNKT和CD4T細胞匯集在一起。該實驗在C57B1/6小鼠和BALB/c小鼠中獨立進行。圖7顯示，來自幼稚Balb/c小鼠和R)xp3gfp基因敲入小鼠的iNKT細胞缺乏R)xp3 表達。分析從Balb/c小鼠和R)xp3gfp幼稚小鼠的肝、混合淋巴結、派爾集合淋巴結、脾和胸腺分離的淋巴細胞中的你即3表達。在淋巴細胞閘門內，通過與負載有PBS57的⑶Id四聚體和泛TCR-β抗體共染色來識別iNKT細胞。圖8顯示從患過敏性氣道疾病的Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠的肺分離iNKT細胞。在指定的天數上，將由5隻雌性Balb/c小鼠或C57B1/6小鼠組成的多個組用OVA-明礬(腹膜注射)敏化並用在鹽水中的50yg0VA進行鼻內激發，以誘導過敏性氣道疾病的慢性或急性形式。(a)誘導慢性或急性過敏性氣道疾病所遵照的方案的示意圖。(b)支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage ;BAL)中的嗜酸性粒細胞增多及肺中的細胞含量。(c) FACS數據，繪示來自每一實驗組的一隻代表性小鼠的肺中的iNKT細胞和⑶4T細胞染色，顯示在雙重排除(圖未示出)後和定量RT-PCR分析之前的用於分選iNKT (左側欄)和CD4T 細胞(右側)的閘門。(d)來自慢性小鼠(上部圖)、急性小鼠(中部圖)和幼稚小鼠(下部圖)的用蘇木精/伊紅染色的肺組織的組織切片。圖9顯示，Foxp3+iNKT細胞聚集在被保護免於遭受EAE的小鼠的頸淋巴結中。通過共同投予MOG肽和CFA及百日咳毒素在C57B1/6小鼠中誘導EAE。如別處所述，同時用 α -GalCer對一些小鼠進行治療26。對EAE進行臨床評分並對中樞神經系統浸潤液以及頸淋巴結(LN)和脾的淋巴細胞群進行評價。(a)左側圖顯示頸淋巴結中的iNKT群，而右側圖顯示iNKT閘門內的R)xp3表達。(b)繪示iNKT細胞(頂部圖)和R)xp3+iNKT細胞(底部圖) 的絕對數目，每一符號對應於來自幼稚實驗組、經MOG誘導的實驗組及經MOG+ α -GalCer治療的實驗組的一隻個別小鼠。薄橫條表示平均值，而厚橫條表示組間的統計顯著性(η = 4 或 5，*Ρ < 0. 05)。圖10顯示，可在人類iNKT細胞中誘導R)xp3表達。將來自外周血的人類iNKT細胞和⑶4+T細胞以磁性方式濃集並在存在或不存在含TGF-β、抗-IL4、抗-IL12、抗-IFN-γ 和抗-OT^MAb的轉變混合劑的情況下共培養5天。在淋巴細胞閘門內，通過負載有PBS57 的⑶Id四聚體和抗-TCR-Vβ 11 MAb的共染色來識別iNKT細胞(頂部)。在用空的人類 CDld四聚體的平行染色中評價iNKT細胞的背景染色(頂部左側)。CD4T細胞在CDld/ PBS57-陰性區域(頂部右側)門選。下部圖顯示Foxp3與CD25、CD127、GITR或CD161 一起在iNKT(上列)和CD4+T細胞閘門(下列)中的共表達。結果代表來自不同供血者的三個獨立實驗，每一情況至少有三份複製培養物。
具體實施例方式一方面，本發明提供分離的R)xp3+天然殺傷T細胞及包含R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞群。一方面，本發明提供使用TGF-β及一或多種NKT刺激劑產生R)Xp3+天然殺傷T細胞的方法。R)xp3+天然殺傷T細胞可在體外產生，且其可在個體中原位產生。本文中指出，Foxp3+天然殺傷T細胞具有與Treg細胞類似的免疫抑制特性，且因此R)xp3+天然殺傷T細胞可用於治療多種免疫病症及病狀。Foxp3+天然殺傷T細胞一方面，本發明提供分離的R)xp3+天然殺傷T細胞及包含R)xp3+天然殺傷T細胞的分離的細胞群。天然殺傷T細胞(Natural Killer T-cell ；NKT)是衍生自胸腺的淋巴細胞，其表達識別由⑶Id分子呈遞的糖脂抗原的α β TCR及NK譜系受體(包括NKl. 1及NKG2D) (19)。 天然殺傷T細胞可分為1型NKT (不變)、2型NKT及類ΝΚΤ。研究最多的NKT細胞亞群具有半不變TCR，其包含不變α-鏈(在小鼠中為Va 14-Ja 18，在人類中為V a M-J a 18)及有限的TCR-β鏈譜(在小鼠中為\^8.2、￥3 7、￥3 2，在人類中為\^11)。這些細胞被稱為I型經典或不變NKT(iNKT)細胞，且在MHC I類相關分子CDld情形下能夠識別糖脂。雖然具有可用於其識別的獨特的幾！？，但iNKT細胞與T細胞共享許多表面分子，即在小鼠中為⑶3及⑶4，且在人類中還有⑶8 (19) (20)。T細胞及NKT細胞二者均在胸腺中產生。基於其不變TCR的NKT細胞的陽性選擇是由擔當CDld+抗原呈遞細胞的雙陽性胸腺細胞來介導，而非用於常規T淋巴細胞的胸腺上皮細胞01)。NKT細胞通常視為分離自T淋巴細胞的譜系，其在分子層面上的特徵在於表達譜系標記物PLZF02)。在體內發現的iNKT細胞亞群呈現與Thl細胞(產生IFN_Y)、Th2細胞(產生IL_4 及IL-13)及(最近闡述的)Thl7細胞(產生IL-17)類似的功能特性⑴(2) (3)⑷(5)。 令人感興趣的是，由TCR刺激引起的iNKT細胞細胞因子產生似乎不受控制常規T淋巴細胞的功能專門化的相同轉錄因子所影響03)。一方面，本發明提供經轉化以表達R)xP3的NKT細胞。在本文中，表達R)xP3的 NKT細胞稱為R)xp3+NKT細胞、Foxp3+天然殺傷T細胞、Foxp3+TregNKT細胞、NKTreg細胞、 天然殺傷iTreg細胞、TregNKT細胞、Foxp3+Treg天然殺傷T細胞及R)Xp3+T調節天然殺傷 T細胞。在一些實施例中，本發明提供已轉化成R)xp3+細胞的不變NKT細胞(iNKT)，在本文中也稱為iNOreg。在一些實施例中，本發明提供已轉化成NKT R)Xp3+細胞的非-iNKT 細胞O型NKT或類NKT細胞)。Foxp3表達通常與Treg細胞有關，且先前在NKT細胞中未發現。Treg細胞具有強效免疫抑制特性，且被認為可預防病理性自反應(即，自身免疫性疾病)及免疫病症，例如過敏症、炎性腸病、移植物抗宿主病及移植排斥。令人感興趣的是， Foxp3+NKT細胞展示與R)xp3+Treg淋巴細胞類似的表型即CD25+、CTLA-4+及GITR+，且在功能上，其能夠以與R)Xp3+Treg細胞相當的效率抑制T細胞增殖。本文所述的R)xp3+天然殺傷T細胞具有NKT表型(例如，標記物)及Treg表型 (例如，FoxP3標記物)二者。另外，本文所述的R)xp3+天然殺傷T細胞具有與Treg細胞同等的功能(抑制T細胞增殖的能力)。然而，應了解，Foxp3+天然殺傷T細胞不同於R)xp3 天然殺傷T細胞、Treg細胞以及實際上任何其他細胞類型。最低程度上，Foxp3+天然殺傷T 細胞可通過識別NKT細胞所特有的至少一種標記物及R)xP3標記物來鑑定。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞的特徵在於結合負載有糖脂(例如a-GalCer)的⑶Id的能力， 且具有標記你計3。下文進一步介紹用於測定各種NKT細胞與⑶Id的結合的特異性分析以及分析中所用的各種配體。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞具有以下標記表型中的任一者或任一組合CD25+、CTLA-4+、GITR+、CD103+、IL7_Ra -、CD27-、CD62L-、NKl. 1_、 DX5-、NKGD2+及PLZF+。Foxp3+天然殺傷T細胞可為CD4+或CD4-。應了解，並非所有這些標記物都必須存在於擬分類為R)xp3+NKT細胞的細胞上。誘導iNKT細胞上的R)xp3表達與上調同樣由i^oxpS+I^reg細胞表達的一組基因配合。在功能上，Foxp3+NKT細胞展示較強的調節潛力。然而，T細胞-特異性表型的採用並非絕對的，其中Foxp3+NKTreg細胞保留一些區別性特徵。例如，Foxp3+iTreg的⑶62L表達不均一，表明一些細胞保留通過高內皮小靜脈(high endothelial venule ；HEV)再循環至次級淋巴器官的能力。相比之下，NKTreg細胞缺少⑶62L，且因此將限於幹擾外周中的免疫情況。
應了解，R)xp3+天然殺傷T細胞可通過功能分析予以表徵。Foxp3+NKT細胞已失去以與NKT細胞相同的量及組成分泌細胞因子的能力。R)xp3+天然殺傷T細胞具有與Treg細胞相同的免疫抑制特性。細胞的免疫抑制特性可通過(例如)細胞抑制經刺激CD4+CD25-應答細胞增殖的能力來測量。據認為，Foxp3+NKT細胞的免疫抑制功能由 GITR-GITRL相互作用來介導，這是因為阻斷此相互作用導致免疫抑制特性消除。本發明涵蓋分離的R)xp3+天然殺傷T細胞、僅由R)xp3+天然殺傷T細胞組成的細胞群及包含 ^οχρβ+天然殺傷T細胞的細胞群。當關於細胞或細胞群時，術語「分離的」 是指不在個體(即，人類或非人類動物)中的細胞或細胞群。在一些實施例中，所述細胞與其他細胞充分分開或細胞數目相對於其他細胞增加，使得可根據本文所述方法確認其身份並測試或利用其特性。例如，分離的細胞或細胞群已自個體收穫，在體外生長或已自其他細胞產生。在一些實施例中，包含R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞群具有至少0. 001 %、至少 0. 01%、至少0. 05%、至少0. 1%、至少0. 5%、至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、或至少90 %的R)xp3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，包含R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞群具有至少1個、至少 10個、至少50個、至少100個、至少500個、至少1，000個、至少5，000個、至少10，000個、 至少50，000個、至少100，000個、至少Ix IO6個、至少Ix IO7個、或至少IxlO8個Foxp3+天然殺傷T細胞。細胞群中的其餘細胞(即，非R)xP3細胞)可為任何性質。因此，例如，本發明涵蓋你即3+天然殺傷T細胞與R)xP3_天然殺傷T細胞的群、Foxp3+天然殺傷T細胞與T細胞(屬於任一亞類)的群。在一些實施例中，所述細胞群是R)xp3+天然殺傷T細胞與血細胞(屬於任一亞類，例如紅細胞)的組合。在一些實施例中，所述細胞群是 ^οχρβ+ 天然殺傷T細胞與非血細胞的組合。在一些實施例中，所述細胞群是R)Xp3+天然殺傷T細胞、血細胞及非血細胞的組合。本發明涵蓋 ^οχρβ+天然殺傷T細胞及包含任何來源(例如， 動物，例如人類或小鼠)或得自任何組織(例如，脾、胸腺等)的你@3+天然殺傷T細胞的細胞群。Foxp3+天然殺傷T細胞的產生一方面，本發明提供產生R)xp3+天然殺傷T細胞的方法。在一些實施例中，產生 Foxp3+天然殺傷T細胞的方法包含使包含天然殺傷T細胞的細胞群與足以產生R)xp3+天然殺傷T細胞的量的TGF-β與一或多種NKT刺激劑的組合接觸。在一些實施例中，也使所述細胞群與IL-2接觸。在一些實施例中，也使所述細胞群與IL-7、IL-15及/或IL-21接觸。在一些實施例中，也使所述細胞群與中和抗體抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12 及/或抗-IL-27接觸。在一些實施例中，所述細胞群是血細胞群、白細胞群、T細胞群或天然殺傷T細胞群。在一些實施例中，所述細胞群收穫自個體。本文介紹自R)xP3-天然殺傷T細胞(即，「規則(regular) "NKT細胞)產生R)xp3+ 天然殺傷T細胞的方法。在一些實施例中，R)Xp3+天然殺傷T細胞的產生是在體外實施。 在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞的產生是在體內。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞的產生是在特定解剖學位置(例如，器官)原位實施。產生R)xp3+細胞的NKT 細胞可為任何來源。在一些實施例中，NKT細胞是鼠科動物細胞。在一些實施例中，NKT細胞是人類細胞。在一些實施例中，NKT細胞收穫自肝、脾及胸腺。在一些實施例中，NKT細胞收穫自血液。
本文介紹的產生R)Xp3+天然殺傷T細胞的方法最低程度上包含使NKT細胞與一或多種NKT刺激劑及TGF- β接觸。本發明涵蓋使用導致R)xP3在經刺激NKT細胞中表達的任何TGF- β或TGF- β類似物。因此，用於產生你即3+天然殺傷T細胞的TGF-β包括三種TGF-β同種型中的每一者(TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3)、TGF-β的蛋白質前體及成熟的TGF-β。本文所用的 TGF-β還包括變體TGF-β及具有與TGF-β類似功能的TGF-β類似物(例如，細胞調節素-IO(Cytomodulin-IO))。本發明還涵蓋使用分泌TGF-β的細胞。另外，應了解，一些器官天然地富集TGF-β，且任選地不投予額外TGF-β來在所述器官中體內產生R)xp3+天然殺傷T細胞。天然地富集TGF-β的器官包括腸及肺、骨髓、肝及含有某些癌細胞的器官。應了解，並非器官中的所有細胞都需要富集TGF-β以提供TGF-β富集環境而容許NKT細胞轉化成你即3+陽性細胞。然而，在TGF-β富集器官中產生R)xp3+天然殺傷T細胞仍然需要投予一或多種NKT刺激劑。在一些實施例中，自NKT細胞產生R)Xp3+NKT細胞的條件包括將所述細胞暴露於至少lng/ml TGF-β、至少2ng/ml TGF-β、至少3ng/ml TGF-β、至少 4ng/ml TGF-β、至少 5ng/ml TGF-β、至少 10ng/ml TGF-β、至少 lOOng/mlTGF-β、至少 1 微克/ml TGF-β或至少10微克/ml TGF-β。在一些實施例中，Foxp3+NKT細胞的產生是在體外實施且TGF-β的濃度為至少lOng/ml。TGF-β的濃度最低程度上取決於包含NKT 細胞的細胞群的組成的性質以及NKT細胞的性質。在所有實施例中，導致在NKT細胞中表達R)XP3的TGF-β濃度較佳。所屬領域的技術人員可容易地確定R)xP3是否表達並(如果需要)調節TGF-β的濃度。NKT細胞刺激劑已為所屬領域的技術人員所習知，且包括可由⑶Id呈遞的任何糖脂(例如α-GalCe)以及可作用於受體下遊路徑的任何藥劑，例如抗_CD3抗體。NKT刺激劑包括抗-CD3抗體、植物血凝素(phytohemaglutinin ；PHA)、伴刀豆球蛋白A(concanavalin A ；ConA)、佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate ；PMA)、 離子黴素(ionomycin)及TCR激動劑，例如載有配體(CDld配體，包括α-GalCer、PBS57、 GSL-1、0CH及其他配體)的⑶Id四聚體。可由⑶Id呈遞的所有糖脂均可用作NKT刺激劑。 此外，存在諸多可刺激NKT細胞的糖脂類似物。NKT刺激劑還可在功能分析中予以識別。例如，可將NKT細胞與抗原呈遞細胞及推定的刺激劑一起培養，且可通過評價NKT細胞是否分泌諸如IL-2、IL-4及IFN-Y等細胞因子針對刺激對NKT細胞進行分析。可通過例如使 NKT細胞與固定的抗-CD3抗體接觸或通過向NKT細胞的生長培養基中添加NKT刺激劑來刺激NKT細胞以在體外產生R)xp3+NKT細胞。另外，也可將載有這些NKT刺激劑中任一者的抗原呈遞細胞與NKT群混合。體內NKT細胞的刺激可通過向個體投予NKT刺激劑(例如 α -GalCer)來實施。應了解，也可將NKT細胞暴露於多種NKT刺激劑。NKT刺激劑的濃度最低程度上取決於NKT刺激劑的性質、NKT細胞的性質以及包含NKT細胞的細胞群的組成。 在所有實施例中，導致NKT細胞受刺激的NKT刺激劑濃度較佳。所屬領域的技術人員可容易地確定NKT細胞是否受刺激並(如果需要)調節NKT刺激劑的濃度。在一些實施例中，除TGF-β及一或多種NKT刺激劑外，還使NKT細胞與IL-2接觸。本文所用的IL-2是指IL-2及具有與IL-2類似的生物功能的任何變體。本文所用的與IL-2接觸不限於特定的IL-2種類或特定的IL-2變體。因此，可使人類NKT細胞與非人類IL-2接觸，只要非人類IL-2可交叉反應。此外，已闡述IL-2的功能變體(例如，包括
11胺基酸突變，例如R38A或F42K)，且本發明也涵蓋這些變體以及IL-2及這些IL-2變體的功能片段。在一些實施例中，將細胞暴露於至少5ng/ml濃度的IL-2。在一些實施例中，除 TGF-β、一或多種NKT刺激劑及視情況IL-2外，也向NKT細胞中添加一或多種細胞因子或細胞因子-中和抗體。在一些實施例中，使NKT細胞與IL-7、IL-15及/或IL-21或其功能變體及類似物接觸。在一些實施例中，使NKT細胞與抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12 及抗-IL-27接觸。應了解，細胞因子及細胞因子-中和抗體的濃度及組合可有所變化，這取決於NKT細胞的性質(例如，鼠科動物或人類)、NKT細胞的來源(例如，得自胸腺、得自血液)、包含NKT細胞的細胞群的組成、或所用細胞因子或中和抗體的性質。例如，在主要包含 NKT細胞的細胞群或主要包含非NKT血細胞及僅少量NKT細胞的細胞群中，細胞因子及中和抗體的組合及濃度可不同。所屬領域的技術人員可根據本文所介紹的方法來調節細胞因子及細胞因子-中和抗體的組合及濃度，以達到期望的R)xp3+NKT細胞水平。在一些實施例中，NKT細胞是人類細胞，且將人類NKT細胞暴露於至少lOng/ml TGF-β、至少5微克/ml 抗-IL12、至少5微克/ml抗-IL-4、至少5微克/ml抗-IFN- γ、至少2微克/ml抗-⑶觀及 20U/ml IL-2。Foxp3+NKT細胞可自包含至少一 NKT細胞的任何細胞群產生。例如，Foxp3+NKT可自包含介於0，001%與之間的NKT細胞的外周血產生。在一些實施例中，外周血收穫自個體。在一些實施例中，使外周血與引起你計3NKT細胞產生的NKT刺激劑及TGF- β接觸。即使僅有較小百分比的血細胞是NKT 細胞，通過暴露於NKT刺激劑來選擇性刺激NKT細胞也將增加血細胞群中NKT細胞的數目且由此增加所產生的 ^οχρβ+ΝΚΤ細胞群。在一些實施例中，在使細胞經受TGF-β及NKT刺激劑處理之前，純化或衝洗血細胞群。每一純化步驟均可將不含有NKT細胞的細胞群移除， 且因此剩餘部分中NKT細胞的百分比將增加。例如，可對血液實施離心並衝洗細胞以移除可溶性物質。同樣，可純化血液以僅僅分離出白細胞(其包含NKT細胞)，且可隨後使白細胞經受TGF-β及NKT刺激劑處理，以將白細胞群內的NKT細胞轉變成R)xp3+NKT細胞。類似地，可進一步純化血液以僅僅分離出T細胞及包含NKT細胞的T細胞群。可隨後使T細胞與TGF-β及NKT刺激劑接觸。在一些實施例中，自血細胞群純化NKT細胞，且僅使(基本上)NKT細胞群經受TGF- β及NKT刺激劑處理。NKT細胞及包含NKT細胞的細胞群(例如T細胞)也可自非血液來源獲得。在一些實施例中，NKT細胞收穫自脾或胸腺或任何其他器官。在一些實施例中，自器官收穫細胞群(例如，T細胞)並隨後將其暴露於TGF-β及 NKT刺激劑。如果需要，可在暴露於TGF-β及NKT刺激劑之前自收穫自器官的細胞群純化 NKT細胞。應了解，也可顛倒R)xp3+NKT細胞的純化及產生步驟。因此，可使血細胞群與 TGF-β及NKT刺激劑接觸，且可隨後自其餘血細胞純化R)xp3+NKT細胞或所有NKT細胞 (Foxp3+NKT 細胞及 FoxP3-NKT 細胞)。對於R)xp3+NKT細胞的產生方法，本發明並不限於特定產率。在一些實施例中，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的NKT細胞轉變成R)xp3+NKT細胞。在一些實施例中，至少40%的NKT細胞轉變成 R)xp3+NKT細胞。應了解，Foxp3+NKT細胞的產率至少取決於NKT細胞的性質(例如，自來人類還是小鼠，得自器官還是得自血液)及包含NKT細胞的細胞群。還應了解，Foxp3+NKT細胞的最終百分比將取決於細胞群中NKT細胞的初始百分比。因此，僅具有介於0，001%與 1 %之間的NKT細胞的血細胞群可僅包含少數幾個NKT細胞，且因此在NKT刺激劑及TGF- β 暴露結束後，可僅包含較小百分比的R)xp3+NKT細胞。然而，NKT細胞的百分比可能高於最初的0，001 %至1 %，這是因為僅NKT細胞受到刺激，且因此NKT細胞將以比存在於細胞群中的任何其他細胞要快的速率生長。一方面，本發明提供自包含一或多個R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞群開始增加 Foxp3+天然殺傷T細胞數目的方法。在一些實施例中，所述方法包含使包含至少一 R)xp3+ 天然殺傷T細胞的細胞群與足以增加R)xp3+天然殺傷T細胞數目的量的TGF- β、一或多種 NKT刺激劑、一或多種增殖誘導細胞因子與一或多種中和抗體的組合接觸。應了解，此方案可對單獨R)xp3+天然殺傷T細胞群、或包含R)xp3+天然殺傷T細胞及其他細胞的細胞群實施。如果細胞群包含非R)xp3+NKT細胞，則可能的情形是大量NKT細胞將轉變成R)xp3+ 天然殺傷T細胞，隨後可將其擴增。因此，刺激包括R)xp3+天然殺傷T細胞及非R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞組合物實際上是通過增殖與轉變來增加R)xp3+天然殺傷T細胞數目的組合。在一些實施例中，增殖誘導細胞因子是IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21。在一些實施例中，中和抗體是抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL-12及/或抗-IL-27。應了解， 增殖誘導細胞因子及中和抗體的期望最佳組合及濃度將取決於細胞群中你@3+天然殺傷 T細胞的性質、Foxp3+天然殺傷T細胞的百分比及非R)xp3+天然殺傷T細胞的性質。在一些實施例中，1^0即3+天然殺傷T細胞的數目增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50 倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少10，000倍、至少100，000倍、 至少IO6倍、至少IO7倍。應了解，本發明包括增加NKT細胞數目、增加R)Xp3+天然殺傷T細胞數目的方法與將NKT細胞轉變成R)Xp3+天然殺傷T細胞的方法的組合。因此，例如，R)xp3+天然殺傷T細胞群可通過擴增NKT細胞群、隨後將NKT細胞轉變成R)xp3+天然殺傷T細胞並擴增 Foxp3+天然殺傷T細胞來產生。Foxp3+NKT細胞的免疫抑制特性本文中指出Foxp3+NKT細胞具有與Treg細胞類似的免疫抑制特性。Treg細胞呈 Foxp3+,已顯示其可有效地預防移植排斥、移植物抗宿主病(graft versus host disease ； GVHD)、過敏性疾病、自身免疫及其他基於炎症的病狀(24)。事實上，所述報導為目前正在實施的R)xp3+Treg細胞臨床試驗提供了理由0 。假定R)xp3+NKTreg細胞與R)xp3+Treg 細胞具有類似的功能特徵，預期它們應具有相同的臨床應用潛能。另外，由於NKTreg具有不變TCR，所以NOreg細胞優於Treg細胞。包含不變TCR的細胞比不具有不變TCR的細胞 (例如iTreg細胞)可更容易地加以分離及刺激。NKTreg細胞不變特異性的結果是抗原非特異性免疫調節。因此，相對於抗原特異性作用，Foxp3+NKTreg細胞可能具有普遍免疫抑制作用，且可能對於施加Treg細胞所要實現的治療目的有用。多克隆Treg細胞群可能具有(至少部分)類似的非特異性免疫抑制效應，這可能緣於與自身抗原的交叉反應性06)。正是此非特異性效應作為Treg抑制淋巴細胞減少驅動的增殖及預防移植物抗宿主病GVHD的基礎07，觀)。GVHD是容許基於Treg 的幹預的一種臨床疾病，且已針對此疾病開始Treg臨床試驗09-32)。器官移植也可受益於基於Treg的表觀非特異性調節以預防移植物排斥(33，34)。可能的情形是，通過提供一定程度的非特異性抑制，天然的抗原特異性調節機制有機會將免疫應答重新設定為耐受。將R)Xp3+NKT細胞遞送至肝及肺的方法一方面，本發明提供將R)xp3+天然殺傷T細胞遞送至肝的方法及抑制肝中免疫應答的方法。一方面，本發明提供將你@3+天然殺傷T細胞遞送至肺的方法及抑制肺中免疫應答的方法。一方面，本發明提供將i^Xp3+天然殺傷T細胞遞送至黏膜組織的方法及抑制黏膜組織中免疫應答的方法。在上述實施例中，所述方法包含向個體全身投予你@3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，R)xp3+天然殺傷T細胞是自體細胞。在一些實施例中，通過使天然殺傷T細胞與足以產生R)xp3+天然殺傷T細胞的量的NKT細胞刺激劑及TGF- β 接觸來產生你即3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，以有效抑制肝中免疫應答的量投予你即3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，以有效誘導能夠抑制黏膜(例如腸或肺)中免疫應答的足量你即3+天然殺傷T細胞的量投予NKT細胞刺激劑或TGF- β。在一些實施例中，抑制肝中的免疫應答旨在治療移植物抗宿主病、與胰島移植有關或由其引起的不期望免疫應答、與肝移植有關或由其引起的不期望免疫應答或免疫介導的肝炎症。在一些實施例中，免疫介導的肝炎症是自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化或脂肪性肝炎。在一些實施例中，R)xp3+天然殺傷T細胞與胰島移植或肝移植結合投予。在一些實施例中，Foxp3+ 天然殺傷T細胞的基因組包含編碼多肽的核酸，其中將R)xp3+天然殺傷T細胞遞送至肝使所述多肽在肝中得以表達。本文中令人驚奇地發現，在將R)xp3+NKTreg細胞靜脈內遞送至個體體內後，聚集在肝中(而非聚集在淋巴結中)的iNKT細胞使R)xp3表達保持穩定。也在肺黏膜組織內及脾中(在投予後最初)發現一些R)Xp3+NKTreg細胞。因此，在一個實施例中，本發明提供將R)xp3+天然殺傷T細胞遞送至肝、肺或脾的方法，其包含全身投予R)Xp3+天然殺傷T 細胞。然而，應了解，也可將你即3+天然殺傷T細胞通過局部投予直接投予至肝、肺或脾。 在一些實施例中，將你即3+天然殺傷T細胞遞送至肝的方法包含使包含天然殺傷T細胞的細胞群與足以產生你即3+天然殺傷T細胞的量的一或多種NKT細胞刺激劑及TGF- β接觸。 隨後全身投予 ^οχρβ+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，投予包含R)xp3+天然殺傷T細胞的醫藥組合物。在一些實施例中， ^οχρβ+天然殺傷T細胞是自體細胞。因此，在一些實施例中，所述方法包含自個體收穫血液並使血細胞群與足以產生你即3+天然殺傷T細胞的量的一或多種NKT細胞刺激劑及TGF-β接觸，且隨後向個體投予現已包含R)xp3+天然殺傷T細胞的血細胞群。應了解，可在與一或多種NKT細胞刺激劑及TGF-β接觸之前對血細胞群實施純化或濃集以增加NKT細胞的數目。另外，也可在產生R)xp3+天然殺傷T細胞後純化細胞群，以提高你即3+天然殺傷T細胞的百分比。在一些實施例中，在投予之前擴增R)Xp3+天然殺傷T細胞。R)xp3+天然殺傷T細胞尋靶至肝及肺的能力容許在肝及肺中實施通過利用你即3+天然殺傷T細胞的固有特性(即，免疫抑制能力)的治療方法。當期望抑制肺及/ 或肝中的免疫應答時，可全身投予(例如通過靜脈內投予)Foxp3+天然殺傷T細胞。另外， Foxp3+天然殺傷T細胞尋靶至肝及肺的能力也使得能夠利用這些細胞的尋靶特性將由這些細胞產生或這些細胞中所含有的重組多肽及/或其他藥劑遞送至肺及肝。因此，NKTreg 細胞為免疫介導的肝病提供了細胞療法不僅對於肝自身免疫或肝移植，而且將肝用作免疫特權部位以沉積免疫原性細胞或分子(即，胰島移植或基因療法)。此外，肝特異性作用降低了與全身免疫抑制有關的脫靶效應。iNKTreg細胞的肝特異性聚集也對治療肝炎症 (例如與移植有關)、自身免疫性疾病、病毒有關的炎性變化、脂肪性肝炎及肝中毒具有治療用途。在一些實施例中，以有效抑制肝中免疫應答的量投予你即3+天然殺傷T細胞，其中抑制肝中的免疫應答旨在治療移植物抗宿主病、與胰島移植有關或由其引起的不期望免疫應答、與肝移植有關或由其引起的不期望免疫應答或免疫介導的肝炎症。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞與胰島移植或肝移植結合投予。應了解，在一些實施例中，R)Xp3+天然殺傷T細胞的尋靶特性被改變。擬投予的 Foxp3+天然殺傷T胞可配備有助於細胞尋靶至特定器官的細胞器官標記物(例如，細胞表面蛋白)，例如腎標記物或腸標記物。器官標記物已為所屬領域的技術人員所習知，而且修飾R)Xp3+天然殺傷T細胞以包括標記物的方法(例如，通過在細胞基因組中引入編碼標記物的核酸)也已習知。因此，在一個實施例中，本發明提供包含細胞表面蛋白的 ^οχρβ+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，包含細胞表面蛋白的R)Xp3+天然殺傷T細胞是通過將編碼細胞表面蛋白的核酸引入至 ^οχρβ+天然殺傷T細胞的基因組中來產生。將藥劑及多肽遞送至肝及肺遞送具有免疫抑制特性的R)xp3+天然殺傷T細胞容許產生免疫特權部位(肝或肺)而無全身免疫抑制。此發現可在治療上與其他免疫原性治療法組合利用以將此類免疫原性治療法安全遞送至肝中，例如通過門靜脈或通過直接投予。實例是用於治療糖尿病的胰島移植(通常通過門靜脈給予)及細胞產生可溶性產物的其他細胞替代療法(例如用於凝血功能障礙的凝血因子、或用於治療溶酶體貯積症的酶替代療法)。一方面，本發明提供將藥劑(例如，治療劑、多肽、診斷劑)遞送至肝或肺的方法。 在一個實施例中，所述方法包含修飾你@3+天然殺傷T細胞，使得其能夠將藥劑遞送至肝或肺。修飾可通過(例如)將藥劑附著至你即3+天然殺傷T細胞的細胞表面蛋白或細胞表面糖來實施。另外，可對你即3+天然殺傷T細胞的基因組實施修飾以包括編碼多肽的核酸，所述多肽在你即3+天然殺傷T細胞遷移至肝或肺時會表達。因此，在一個實施例中，本發明提供將多肽遞送至肝或肺的方法，其包含對你即3+天然殺傷T細胞的基因組實施修飾以納入編碼多肽的核酸，及投予包含經修飾基因組的R)xp3+天然殺傷T細胞，其中投予 Foxp3+天然殺傷T細胞使得R)Xp3+天然殺傷T細胞遞送至肝或肺，進一步使得在肝或肺中表達所述多肽。在一些實施例中，遞送至肝的多肽是代謝酶。因此，在一個實施例中，本發明提供治療溶酶體貯積症的方法，其通過將功能代謝酶遞送至肝並由此補償患有溶酶體貯積症的個體中缺乏的代謝酶來實施。在一個實施例中，遞送至肝的多肽是在血液內穩態中起作用的多肽(例如，凝血因子)。因此，在一個實施例中，本發明提供通過將在血液內穩態中起作用的功能多肽遞送至肝來治療血液疾病的方法。在一些實施例中，遞送至肺的多肽是酶。因此，在一個實施例中，本發明提供用於可通過投予治療性多肽予以治療的肺病的方法。例如，可遞送阿法澱粉酶來治療囊性纖維化。在一些實施例中，使用自體細胞將藥劑(例如多肽)遞送至肝或肺。自體細胞將被身體識別為「自身」，由此防止任何不期望的免疫效應。在一個實施例中，自個體收穫血細胞，且視情況實施純化以增加NKT細胞的數目。隨後修飾NKT細胞以將藥劑附著至細胞或將編碼期望多肽的核酸納入至細胞基因組中。修飾NKT細胞後，使細胞與TGF-β及NKT刺激劑接觸，以將細胞轉變成你@3+天然殺傷T細胞。隨後可向個體投予包含附著藥劑或編碼多肽的核酸的經修飾你即3+天然殺傷T細胞以將經修飾細胞遞送至肝或肺。應了解，也可改變步驟的順序。例如，可首先將NKT細胞轉變成R)xp3+天然殺傷T細胞且隨後實施修飾以納入核酸或藥劑。器官特異性免疫應答一方面，本發明提供在特定解剖學部位(例如器官)中原位產生R)xp3+天然殺傷 T細胞的方法以及抑制這些部位中免疫應答的方法。一方面，本發明提供抑制個體器官中的免疫應答的方法，所述方法包含將一或多種NKT細胞刺激劑以足以抑制器官中免疫應答的量局部遞送至器官。在一些實施例中，所述方法進一步包含將TGF-β以足以抑制器官中免疫應答的量局部遞送至器官。在一些實施例中，所述免疫應答是針對抗原的免疫應答。在一些實施例中，所述免疫應答是自身免疫應答。在一些實施例中，所述器官是腸。在一些實施例中，抑制免疫應答旨在治療炎性腸病。在一些實施例中，局部遞送至器官是遞送至黏膜組織。在一些實施例中，局部遞送至器官是遞送至肺黏膜組織。在一些實施例中，在投予一或多種NKT細胞刺激劑後，若產生R)xp3+NKT細胞的身體部位含有足量驅動其產生的TGF- β， 則在身體內產生 ^οχρβ+ΝΚΤ細胞。在一些實施例中，在投予TGF-β後，若產生R)xp3+NKT細胞的身體部位含有足量驅動其產生的NKT細胞刺激劑，則在身體內產生R)xp3+NKT細胞。一方面，本發明提供一種通過將一或多種NKT細胞刺激劑以足以抑制器官中免疫應答的量局部遞送至器官來在個體器官中原位產生你即3+天然殺傷T細胞的方法。將一部分局部遞送至特定器官的方法已為所屬領域的技術人員所習知，且在下文更詳細地闡述。 例如，本文中指出，在富集TGF-β的環境中在胃內遞送NKT細胞激動劑α-半乳糖苷基神經醯胺(a -Galactosylceramide ； α -GalCer)後，可在腸中誘導 NKTreg 細胞。富集 TGF-β 的其他器官實例是肺、肝、骨髓及某些癌細胞。應了解，並非這些器官中的所有細胞都富集 TNF-β。並非所有器官都富集TGF-β，且不富集TGF-β的器官中R)xp3+天然殺傷T細胞的原位產生可通過向器官局部投予TGF-β及一或多種NKT細胞刺激劑來實施。當然也可將TGF-β與NKT刺激劑的組合遞送至富集TGF-β的器官。在天然存在足夠濃度的NKT刺激劑的器官中，原位產生你即3+天然殺傷T細胞僅需要投予TGF-β。當然也可將TGF-β 與NKT刺激劑的組合遞送至富集NKT刺激劑的器官。在特定解剖學部位(例如器官)中自NKT細胞原位產生R)xp3+天然殺傷T細胞使得能夠在所述器官中誘導免疫抑制效應而不抑制其他器官中的免疫應答。因此，例如，本文所述方法可用於治療腸免疫相關病症(例如，克羅恩氏病、炎性腸病、潰瘍性結腸炎)、肝免疫相關病症(例如自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、非酒精性及酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic and alcoholic steato-h印atitis ;NASH及 ASH)、肝硬化、C型肝炎病毒及B型肝炎病毒(hepatitis C virus and hepatitis B virus ；HCV 及 HBV))、肺免疫相關病症(例如，哮喘)、中樞神經系統炎症及關節炎。局部產生免疫抑制性i^Xp3+天然殺傷 T細胞也使得能夠抑制擬實施移植手術的任何器官或部位中的免疫應答。Foxp3+天然殺傷T細胞的檢測Foxp3+天然殺傷T細胞的特徵在於能夠結合⑶Id分子呈遞的糖脂且具有標
16記物R)Xp3+。II型NKT細胞可通過細胞與負載有硫腦苷脂的⑶Id四聚體的結合來鑑定(參見例如，J Exp Med. 2004年4月5日；199 (7) :947-57)。I型NKT細胞也稱為不變NKT細胞，其可通過與負載有以下化合物中的一種化合物的CDld四聚體的結合來鑑定α-半乳糖苷基-神經醯胺(α-GalCer)、PBS-57、OCH、GSL-1、異紅細胞三己糖基神經醯胺(isoglobotrihexosylceramide ；iGb3), α-C-半乳糖苷基神經醯胺。也參見(http//www. bdbiosciences. com/external_f iles/pm/doc/tds/dimerx/1ive/web_ enabled/557764, pdf)。I型NKT細胞也可藉助其不變標記物予以鑑別。CDld分子是非經典MHC分子，其特徵是非多形、種類保守且具有窄而深的疏水性配體結合袋。這些結合袋能夠將糖脂及磷脂呈遞至天然殺傷T (Natural Killer T ；NKT)細胞。表徵最充分的CDld配體是α-半乳糖苷基神經醯胺(a-GalCer)，其最初得自海洋海綿提取物。⑶Id分子呈遞α -GalCer導致NKT細胞識別及快速產生大量IFN- γ及IL_4， 使得α-GalCer具有治療功效。近來，溶酶體鞘脂異紅細胞三己糖基神經醯胺(WM)已被確認為⑶Id配體。認為此內源性鞘脂引起NKT細胞產生。ftOlmmime提供螢光標記的小鼠CDld四聚體，出於方便起見其預負載有α-GalCer，或者是空白的以負載使用者選擇的配體。四聚體CDld-脂質複合物結合具有特定特異性的NKT細胞的TCR(由所使用的脂質配體決定)，此容許通過流式細胞術來識別及列舉限於CDld的抗原特異性NKT細胞。針對細胞內細胞因子(例如IFN- y /IL-2)及/或表面標記物(例如CD69)實施額外共染色可獲得關於抗原特異性亞群的功能數據。PBS-57是Paul Savage博士及同事最近研發的α -半乳糖苷基神經醯胺類似物。 三個獨立的實驗室已指出，PBS-57的活性與a_半乳糖苷基神經醯胺無差別。NIH Tetramer Facility提供與CDld單體或四聚體複合的PBS-57配體。OCH是具有截短側鏈的α -半乳糖苷基神經醯胺類似物，其在天然殺傷T細胞中刺激偏向Th2的細胞因子產生。已顯示此配體在動物模型中延遲實驗性自身免疫性腦脊髓炎發作。也可獲得純化的OCH配體以在體外刺激NKT細胞或用於體內動物研究。將OCH溶解在Tween/蔗糖/組氨酸緩衝液中，無菌過濾，放置於高壓釜處理的小瓶中，並凍幹。所得粉末可在水中以0. 2mg/mL的最終濃度重構。最新研究顯示，來自鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)細菌家族的糖脂能夠通過將配體呈遞於⑶Id分子上而刺激天然殺傷T細胞。GSL-I與PBS-57及α -半乳糖苷基神經醯胺結構類似。也可獲得純化的GSL-I配體以在體外刺激NKT細胞或用於體內動物研究。將GSL-I溶解於Tween/蔗糖/組氨酸緩衝液中，無菌過濾，放置於高壓釜處理的小瓶中，並凍幹。所得粉末可在水中以0. 2mg/mL的最終濃度重構。α -半乳糖苷基神經醯胺的α _C_半乳糖苷基神經醯胺類似物是天然殺傷T細胞的強效刺激劑，且已顯示可保護動物免於遭受某些感染及癌症。NKT細胞的刺激本發明提供轉變NKT細胞及擴增NKT (包括R)Xp3+NKT細胞)細胞群的方法。刺激NKT細胞的方法已為所屬領域的技術人員所習知，且包括使細胞與一或多種以下NKT刺激劑接觸抗-CD3抗體(結合板或在另一表面上，例如珠粒；抗原呈遞細胞可以溶解)、植物血凝素(Phytohemaglutinin ；PHA)、伴刀豆球蛋白 A (Concanavalin A ；ConA)、佛波醇 12 肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)+離子黴素、上文所述的⑶Id呈遞的特異性配體以及添加至具CDld細胞(或塗敷CDld的珠粒)的配體。存在大量的也可刺激NKT細胞的糖脂類似物 (例如α-GalCer)。應了解，也可使用NKT刺激劑的組合來接觸細胞。免疫病症在一個實施例中，本發明提供產生具有免疫抑制特性的細胞的方法。在一個實施例中，本發明提供使用這些細胞治療免疫病症的方法。本文所用的免疫病症包括具有不期望免疫應答(包括自身免疫應答及針對過敏原的免疫應答)的任何疾病或病症。本文所用的免疫病症還包括在移植(包括器官移植)及引入任何期望的非自身實體(例如，細胞及蛋白質，例如用於替代療法中)情形下發生或由其引起的不期望免疫應答。免疫病症包括但不限於全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus ;SLE)、 乾燥症候群(Sjogren' s syndrome)、類風溼性關節炎、青少年發作型糖尿病、韋格納氏肉芽腫病(Wegener' s granulomatosis)、炎性腸病、多發性肌炎、皮肌炎、多發性內分泌衰竭、施密特氏症候群(Schmidt' s syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病 (Addison' s disease)、腎上腺炎、格雷夫斯病(Graves' disease)、甲狀腺炎、橋本甲狀腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)、自身免疫性甲狀腺疾病、惡性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、類狼瘡性肝炎、動脈粥樣硬化、早衰性痴呆、脫髓鞘疾病、多發性硬化、亞急性皮膚紅斑狼瘡、甲狀旁腺功能減退症、德雷斯勒症候群(Dressier' s syndrome)、重症肌無力、 自身免疫性血小板減少、特發性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、尋常天皰瘡、天皰瘡、皰疹樣皮炎、斑禿、類天皰瘡、硬皮病、進行性全身性硬化、CREST症候群(鈣質沉著症、雷諾現象(Raynaud' s phenomenon)、食管活動不良、指端硬化、及毛細管擴張)、成年發作型糖尿病(II型糖尿病)、男性及女性自身免疫性不育、強直性脊柱炎、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、混合性結締組織病、結節性多動脈炎、全身性壞死性血管炎、青少年發作型類風溼性關節炎、腎小球腎炎、特應性皮炎、特應性鼻炎、古德帕斯丘症候群(Goodpasture' s syndrome)、恰加斯氏病(Chagas' disease)、結節病、風溼熱、哮喘、復發性流產、抗-磷脂症候群、農民肺(farmer' s lung)、多形紅斑、心切開術後症候群(post cardiotomy syndrome)、庫興氏症候群(Cushing' s syndrome)、自身免疫性慢性活動性肝炎、養鳥人肺(bird-fancier' s lung)、過敏性疾病、過敏性腦脊髓炎、中毒性表皮壞死松解症、禿髮、阿爾波特氏症候群(Alport' s syndrome)、肺泡炎、過敏性肺泡炎、纖維化肺泡炎、間質性肺病、結節性紅斑、壞疽性膿皮病、輸血反應、麻風、瘧疾、利什曼病(leishmaniasis)、 錐蟲病、高安動脈炎(Takayasu' s arteritis)、風溼性多肌痛、顳動脈炎、血吸蟲病、巨細胞動脈炎、蛔蟲病、麴黴菌病、塞姆特症候群(Sampter' s syndrome)、溼疹、淋巴瘤樣肉芽腫病、貝切特氏病(Behcet' s disease)、卡普蘭症候群(Caplan『 s syndrome)、川畸病 (Kawasaki' s disease)、登革熱、腦脊髓炎、心內膜炎、心內膜心肌纖維化症、眼內炎、持久性隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum)、銀屑病、胎兒成紅細胞增多症、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、輸血後紫癜症候群(Shulman 『 s syndrome)、費爾提氏症候群(Felty' s syndrome)、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、虹膜異色性睫狀體炎 (heterochronic cyclitis)、弗斯睫狀體炎(Fuch『 s cyclitis)、IgA 腎病變、過敏性紫癜(Henoch-khonlein purpura)、腎小球腎炎、移植物抗宿主病、移植排斥、人類免疫缺陷病毒感染、埃可病毒(echovirus)感染、心肌病、阿茲海默氏症(Alzheimer' s disease), 細小病毒感染、風疹病毒感染、疫苗接種後症候群、先天性風疹感染、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)及非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin' s lymphoma)、腎細胞癌、多發性骨髓瘤、蘭伯特-伊頓症候群(Eaton-Lambert syndrome)、復發性多軟骨炎、惡性黑色素瘤、冷球蛋白血症、沃爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom' s macroglobulemia)、愛潑斯坦-巴爾病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、流行性腮腺炎、埃文斯症候群 (Evan' s syndrome)及自身免疫性生殖腺衰竭。應了解，本文所用的免疫病症特定而言包括哮喘。本文所用的「哮喘」是指一種發作性的且以發炎並伴有氣道變窄及氣道對吸入劑的反應性增強為特徵的呼吸系統病症。哮喘通常(但非全部如此)與特應性或過敏性症狀有關。哮喘的症狀公認包括呼吸困難、咳嗽及哮鳴；儘管全部三種症狀通常共存，但哮喘的診斷並不需要三種症狀共存。在一個實施例中，治療哮喘的方法進一步涉及投予選自由下列組成的群組的抗哮喘藥物糖皮質激素、β腎上腺素能激動劑、甲基黃嘌呤、抗膽鹼能藥、色甘酸鈉、奈多羅米(nedocromil)、抗組織胺藥及抗-IgE。在多個實施例中，抗哮喘藥物是丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate) (VANCERIL ，Schering)、氟尼縮松(f lunisolide) (AEROBID Forest)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)(FLOVENT GlaxoSmithKline)、潑尼松(prednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、曲安奈德 (triamcinolone acetonide) (AZMACORT Aventis)、硫酸舒喘靈(albuterol sulfate) (VENTOLIN GlaxoSmithKline ；PROVENTIL Schering)、腎上腺素、鹽酸異丙腎上腺素 (isoproterenol hydrochloride)、硫酸間輕異丙腎上腺素(metaproterenol sulfate) (ALUPENT Boehringer Ingelheim)、特布他林(terbutaline) (BRETHINE LAMISIL Novartis)、異丙託溴銨(ipratropium bromide) (ATROVENTBoehringer Ingelheim)、茶鹼(theophylline)、色甘酸鈉、奈多羅米、或抗-IgE (奧馬佐單抗(omalizumab) ；XOLAIR ； Genentech/Novartis)。溶酶體貯積症在一個實施例中，本發明提供治療溶酶體貯積症的方法。溶酶體貯積症是由溶酶體功能障礙而引起，其通常是由於脂質、糖蛋白(含有糖的蛋白質)或所謂的粘多糖代謝所需單一酶缺乏。溶酶體貯積症已為所屬領域的技術人員所習知，且包括激活劑缺乏症/GM2神經節苷脂貯積症、α -甘露糖苷貯積症、天冬氨醯基葡萄糖胺尿症 (Aspartylglucosaminuria)、膽固醇酯貯積症、慢性己糖胺酶A缺乏症、胱氨酸貯積症、達農病(Danon disease)、法布裡病(Fabry disease)、法伯病(Farber disease)、巖藻糖苷貯積症、半乳糖唾液酸苷貯積症、戈謝病(Gaucher Disease) ,GMl神經節苷脂貯積症、1_細胞病/粘脂質貯積症II、嬰兒游離唾液酸貯積症/ISSD、青少年己糖胺酶A缺乏症、克拉伯病(Krabbe disease)、異染性腦白質營養不良、粘多糖貯積症、假性胡爾勒多種營養不良 (Pseudo-Hurler polydystrophy) /粘脂質C積症 IIIA、MPS I 胡爾勒症候群(MPS I Hurler Syndrome)、MPS I 謝伊症候群(MPS I Scheie Syndrome)、MPS I 胡爾勒-謝伊症候群(MPS I Hurler-Scheie Syndrome)、MPS II 亨特症候群(MPS II Hunter syndrome)、桑菲列普症候群(Sanfilippo syndrome) A型/MPS III A、桑菲列普症候群B型/MPS III B、桑菲列普症候群C型/MPS III C、桑菲列普症候群D型/MPS III D、莫爾丘症A型(Morquio Type A) /MPS IVA、莫爾丘症B型/MPS IVB,MPS IX透明質酸酶缺乏症、MPS VI馬-蘭二氏症(MPS VI Maroteaux-Lamy)、MPS VII 斯萊症候群(MPS VII Sly ^mdrome)、粘脂質C積症I/唾液酸貯積症、粘脂質貯積症IIIC、粘脂質貯積症IV型、多發性硫酸脂酶缺乏症、尼曼皮克病(Niemarm-Pick Disease)、神經元蠟樣脂褐質貯積症、CLN6病、巴-斯-沃三氏症(Batten-Spielmeyer-Vogt)/ 青少年型 NCL/CLN3 病、Finnish 變異型晚期嬰兒型 CLN5、 Jansky-Bielschowsky病/晚期嬰兒型CLN2/TPP1病、Kufs/成年發作型NCL/CLN4病、北方癲癇(Northern Epil印sy) / 變異型晚期嬰兒型 CLN8、Santavuori-Haltia/嬰兒型 CLNl/ PPT病、β-甘露糖苷貯積症、龐皮病(Pompe disease) /糖原貯積症II型、緻密性成骨不全症、Sandhoff病/成年發作型/GM2神經節苷脂貯積症、Sandhoff病/GM2神經節苷脂貯積症-嬰兒型、Sandhoff病/GM2神經節苷脂貯積症-青少年型、Schindler病、Salla病/唾液酸貯積症、Tay-SaChs/GM2神經節苷脂貯積症及沃爾曼病(Wolman disease)。血液病症在一個實施例中，本發明提供治療血液病症的方法。在一個實施例中，血液病症是患者不具有血液內穩態(例如凝血)所需要的足量多肽的遺傳病症。血液病症包括(但不限於)血友病、馮·威利布蘭德症(von Willebrand Disease)、巨血小板症候群(Bernard-Soulier syndrome)、威斯科特-奧爾德裡奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)及格蘭茲曼血小板機能不全(Glanzmann' s thrombasthenia)。多肽在R)Xp3+NKT細胞中的表達一方面，本發明提供將多肽遞送至肝或肺的方法。在一些實施例中，對R)xp3+NKT 細胞的基因組或擬轉變成R)Xp3+NKT細胞的NKT細胞的基因組實施修飾以納入編碼擬在肝或肺中表達的多肽的核酸。修飾基因組以納入擬在肝或肺中表達的核酸的方法已為所屬領域的技術人員所習知。使編碼擬由R)xp3+細胞表達的多肽的核酸可操作地連接至調節序列。當編碼序列與調節序列共價連接而使得編碼序列的表達或轉錄處於調節序列的影響或控制下時，認為編碼序列與調節序列「可操作地連接」。為使編碼序列轉譯至功能蛋白質中，使編碼序列可操作地連接至調節序列。以下情形下認為兩個DNA序列可操作地連接5調節序列中的啟動子經誘導導致編碼序列轉錄，且所述兩個DNA序列間連接的性質不會(1)導致引入移碼突變，(2)幹擾啟動子區引導編碼序列轉錄的能力，或C3)幹擾對應RNA轉錄物轉譯至蛋白質中的能力。因此，如果啟動子區能夠實現所述DNA序列的轉錄而使得所得轉錄物可轉譯至期望蛋白質或多肽中，則所述啟動子區可操作地連接至編碼序列。基因表達所需調節序列的準確性質可因物種或細胞類型而變化，但通常應視需要包括分別參與轉錄及轉譯起始的5'非轉錄及5'非轉譯序列，例如TATA盒、加帽序列 (capping sequencehCAAT序列及諸如此類。此類5'非轉錄調節序列尤其包括啟動子區， 所述啟動子區包括用於可操作地連接基因轉錄控制的啟動子序列。啟動子可為組成型或誘導型的。調節序列也可視需要包括增強子序列或上遊激活序列。視宿主性質而定，可使用多種轉錄及轉譯調節序列。轉錄及轉譯調節信號可自病毒來源獲得，例如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒或諸如此類，其中調節信號與具有高水平表達的特定基因序列有關。或者，可使用來自哺乳動物表達產物的啟動子，例如肌動蛋白、膠原、肌球蛋白及諸如此類。可選擇容許阻遏或激活且由此能夠調節基因序列表達的轉錄起始調節信號。令人感興趣的是具有溫度敏感性且由此可通過改變溫度來阻遏或起始表達的調節信號，或者受化學物質(例如代謝物)調節支配的調節信號。
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核酸在個體中的表達需要使用真核調節區。此類區域通常包括足以引導RNA合成起始的啟動子區。真核啟動子包括(例如)小鼠金屬硫蛋白I基因序列的啟動子(Hamer等人，1982，J. Mol. Appl. Gen. 1，273-288)；皰疹病毒的 TK 啟動子(McKnight, 1982 Cell 31， 355-365)；及 SV40 早期啟動子(Benoist 等人，1981 Nature (London) 290, 304-310) 應了解，用於核酸表達的調節元件可以是導致核酸在靶組織(例如，肝及肺)中表達的調節元件。因此，在一些實施例中，使核酸可操作地連接至能夠在肝或肺環境中表達核酸的啟動子。此類啟動子包括用於肝細胞的啟動子及用於肺細胞的啟動子。在一些實施例中，將核酸插入載體中。本文所用的「載體」可以是其中可通過限制及連結插入期望序列以用於不同遺傳環境間轉運或宿主細胞中表達的諸多種核酸中的任一種核酸。表達載體是其中可通過限制及連結插入期望DNA序列以使其可操作地連接至調節序列且可作為RNA轉錄物表達的載體。載體可進一步含有適用於識別經或未經載體轉變或轉染的細胞的一或多種標記序列。標記物包括(例如)編碼會增強或減弱對抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白質的基因、編碼活性可通過業內已知的標準分析法檢測的酶(例如，β-半乳糖苷酶或鹼性磷酸酶)的基因、及明顯影響所轉變或轉染細胞、宿主、菌落或噬斑的表型的基因。在一個實施例中，使用能夠將期望基因序列整合至宿主細胞染色體中的載體。所引入DNA穩定整合至染色體中的細胞還可通過引入容許選擇含有表達載體的宿主細胞的一或多種標記物加以選擇。可將可選標記基因序列直接連接至擬表達的DNA基因序列或通過共轉染引入至相同細胞中。核酸mRNA的最佳合成也可需要其他元件。這些元件可包括剪接信號、以及轉錄啟動子、增強子及終止信號。納入此類元件的cDNA表達載體包括 Okayama (1983, Molec. Cell. Biol. 3，280)所闡述的載體。優選真核質粒包括(例如)BPV、EBV、SV40、2_微米環Q-micron circle)、及諸如此類、或其衍生物。此類質粒已為所屬領域的技術人員所熟知(1982，Botstein等人， Miami ffntr. Symp. 19,265-274 ；Broach,1981,T :The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces :Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,第 445-470 頁；Broach，1982，Cell 28 :203-204 ；Bollon 等人，1980， J.Clin. Hemato1. Oncol. 10 :39-48 ；Maniatis,1980,於Cell Biology :A Comprehensive Treatise,第 3 卷，Gene Sequence Expression, Academic Press, NY,第 563-608 頁)。其他優選真核載體是病毒載體。例如且不作為限制，可使用痘病毒、皰疹病毒、腺病毒及各種反轉錄病毒。病毒載體可包括DNA病毒或RNA病毒，以表達插入物DNA或插入物RNA。含有構建體的載體或DNA序列準備好用於表達後，可將DNA構建體通過多種適宜手段中的任一種手段引入至合適宿主細胞(例如R)xp3+NKT細胞)中，即，轉化、轉染、接合 (conjugation)、原生質體融合、電穿孔、磷酸鈣沉澱、直接顯微注射及諸如此類。引入載體後，在選擇生長含載體細胞的選擇性培養基中生長受體細胞。克隆基因序列的表達將產生核酸。此可在原樣轉化細胞中或在誘導這些細胞分化(例如，通過向神經母細胞瘤細胞投予溴脫氧尿嘧啶(bromodeoxyuracil)或諸如此類)後實施。將藥劑附著至細胞的方法一方面，本發明提供將藥劑遞送至肝或肺的方法。在一個實施例中，將藥劑附著至 Foxp3+NKT細胞或擬轉變成R)xp3+NKT細胞的NKT細胞。附著藥劑的方法已為所屬領域的
21技術人員所習知，且本發明並不限於任一特定方法。例如，可通過使藥劑與天然存在於細胞表面上的分子(例如糖或蛋白質)反應來將藥劑共價附著至細胞。也可通過使藥劑非共價結合至存在於細胞表面上的分子來將藥劑附著至細胞。例如，可使藥劑連接至抗表面蛋白抗體並隨後可使抗體-藥劑結合至表面蛋白。也可使藥劑連接至配體(例如受體配體)並隨後可使配體-藥劑組合附著至細胞。在所有實施例中，較佳地，藥劑結合至細胞，使得在細胞局部化至肝或肺中之前藥劑不會自細胞釋放。可附著至細胞的藥劑包括毒素或藥物(S卩，以治療肝或肺特異性疾病)、遞送至肝或肺時具有有益效果的治療性多肽(即，多肽，例如溶酶體貯積症酶)、及診斷劑。個體一方面，本發明提供治療個體病症的方法。本文所用的「個體」是人類或其他脊椎動物類哺乳動物，包括但不限於小鼠、大鼠、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊或非人類靈長類動物。治療有效量在一些實施例中，本文所述的所有化合物、藥劑及細胞(例如，TGF-β、NKT刺激劑、Foxp3+天然殺傷T細胞、IL-2、細胞因子、抗-細胞因子抗體)可以治療有效量使用。術語「治療有效量」或「有效量」可互換使用，其是指實現期望治療效果(例如，抑制特定器官中的免疫應答)所必需的或足以實現期望治療效果的量。結合本文所提供的教示，通過選擇不同活性化合物及權衡例如效能、相對生物利用度、個體體重、不利副作用的嚴重程度及優選投予模式等因素，可選擇出不會造成實質毒性且仍可有效地治療特定個體的有效預防性或治療性治療方案。用於任何特定應用的有效量可視例如所治療疾病或病狀、擬投予的本文所述特定化合物、藥劑及細胞、個體體格、或疾病或病狀的嚴重程度等因素而有所變化。所屬領域的技術人員可根據經驗確定本文所述特定化合物、藥劑及細胞及/或一或多種其他治療藥劑的有效量，無需進行過多實驗。通常，較佳使用最大劑量，即，根據某一醫學判斷的最高安全劑量。可涵蓋每天、每周或每月多次劑量以實現本文所述化合物、藥劑及細胞的合適全身水平。合適全身水平可通過(例如)測量患者的本文所述化合物、藥劑及細胞的峰值或持續血漿水平來確定。化合物或藥劑的治療有效量通常介於0. 001mg/kg與1000mg/kg之間。預期可用於本發明的化合物將以所述範圍投予。在一些實施例中，所述範圍介於0. 01mg/kg與IOOmg/ kg之間。在其他實施例中，所述範圍介於0.05mg/kg與50mg/kg之間。在一些實施例中，治療有效量小於50mg/kg，例如小於45mg/kg、小於40mg/kg、小於35mg/kg、小於30mg/kg、小於 25mg/kg、小於20mg/kg或小於15mg/kg。在一些實施例中，治療有效量小於10mg/kg，例如小於 9mg/kg、小於 8mg/kg、小於 7mg/kg、小於 6mg/kg、小於 5mg/kg、小於 4mg/kg、小於 3mg/ kg或小於ang/kg。在一些實施例中，治療有效量小於1. 5mg/kg，例如小於1. %ig/kg、小於 1. 3mg/kg、小於 1. 2mg/kg、小於 1. lmg/kg、小於 lmg/kg、小於 0. 9mg/kg、小於 0. 8mg/kg、小於 0. 7mg/kg、小於 0. 6mg/kg、小於 0. 5mg/kg、小於 0. 4mg/kg、小於 0. 3mg/kg、小於 0. 2mg/kg 或小於0. lmg/kg TGF-β、NKT刺激劑或本文所述的其他藥劑或化合物。R)xp3+天然殺傷T細胞的治療有效量通常介於10個細胞與Ix IO8個細胞之間。 在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞將以Ix IO2個細胞至IxlO7個細胞的範圍投予。在一些實施例中，Foxp3+天然殺傷T細胞將以Ix IO3個細胞至Ix IO6個細胞的範圍投予。 在一些實施例中，治療有效量小於IxlO7個R)Xp3+天然殺傷T細胞，例如小於Ix IO6個、小於Ix IO5個、小於Ix IO4個或小於Ix IO3個R)xp3+天然殺傷T細胞。在一些實施例中，以一個劑量投予治療有效量。在一些實施例中，以多個劑量投予治療有效量。可視投予模式適當調節劑量以實現本文所述化合物、藥劑及細胞的期望水平 (局部或全身)。在個體中的應答在所述劑量下不充分的情況下，可在個體耐受性允許的條件下使用甚至更高劑量(或通過不同的更局部化遞送途徑達成更高有效劑量)。本發明涵蓋每天多個劑量以實現化合物的合適全身水平。醫藥組合物設投予途徑本文所述化合物、藥劑及細胞通常以醫藥組合物的形式投予給個體，這些醫藥組合通常可含有醫藥上可接受濃度的鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性載劑、佐劑及視情況其他治療成分。醫藥組合物的藥物載劑和其他組分的性質將取決於投予方式。在實施本文所述治療方法時，本發明的醫藥組合物可通過所屬領域的技術人員所熟知的任何方式和途徑投予。在一些實施例中，本文所述化合物、藥劑和細胞局部投予。局部投予方法在業內被人所熟知且將取決於靶部位或靶器官。局部投予途徑包括使用標準局部投予方法，例如經皮(印icutaneous)(施加在皮膚上)、吸入、經直腸(例如使用灌腸劑或栓劑)、通過滴眼劑 (滴在結膜上)、通過滴耳劑、鼻內途徑、及經陰道。可通過經腸投予途徑向胃腸道局部給藥。經腸投予途徑包括經口、通過胃飼管、通過十二指腸飼管、胃造口術或經直腸。局部投予也可通過輸注進行。輸注入特定器官或與特定器官直接接觸的靜脈(例如門靜脈)將至少在開始時將實現所輸注實體的局部投予。除輸注至特定靜脈外，局部輸注也能夠遞送至骨髓(骨內輸注)、腹膜以及遞送至膀胱中(膀胱內輸注)。本文所用局部投予也包括本文所述化合物、藥劑和細胞的局部注射。局部注射幾乎可在任何部位或器官中進行，可進行局部投予的部位的實例是肌內、大腦內、腦室內、心臟內、皮下、皮內、鞘內、腹膜內、及海棉體腔內(intracavernosal)。應了解，局部投予也包括使用緩釋基質。因此，本文所述的化合物、藥劑和細胞可通過手術或注射引入個體體內，且實體的緩釋將促進特定實體的局部釋放。本文所用局部投予也涵蓋使用載劑進行局部遞送。因此，擬局部遞送的本文所述化合物、藥劑和細胞可偶聯至在投予時尋靶至特定身體部位的載劑。對於經口投予，藥劑和化合物可通過將化合物與業內熟知的醫藥上可接受的載劑組合而容易地加以調配。此類載劑使本發明化合物能夠調配成可由欲治療患者經口攝取的片劑、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及類似劑型。用於經口使用的醫藥製劑可通過以下獲得使用固體賦形劑，視情況研磨所得混合物，並在添加其他適宜助劑 (若需要)後處理粒料混合物以獲得片劑或糖衣丸芯。適宜賦形劑尤其為填充劑，例如糖， 包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；纖維素製劑，例如，玉米澱粉、小麥澱粉、水稻澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone ；PVP) 0需要時，可添加崩解劑，例如，交聯聚乙烯吡咯烷酮、 瓊脂、或海藻酸或其鹽(例如海藻酸鈉)。視情況，口服調配物也可調配在鹽水或緩衝劑(例如，用於中和內部酸性環境的EDTA)中，或可在無任何載劑的情況下調配。對於經口遞送，釋放位置可為胃、小腸(十二指腸、空腸、或迴腸)、或大腸。所述領域的技術人員已經利用在胃中不溶解、而將在十二指腸或者在腸中其他部位釋放材料的調配物。用作腸溶包衣的更常用惰性成分的實例有乙酸偏苯三酸纖維素(cellulose acetate trimellitate ；CAT)、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethyl-cellulose phthalate ;HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚乙酸鄰苯二甲酸乙烯酯(polyvinyl acetate phthalate ；PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、乙酸鄰苯二甲酸纖維素(cellulose acetate phthalate ；CAP) > Eudragit L> Eudragit S 及 Shellac。這些包衣可作為t昆合膜使用。包衣或包衣混合物也可用在片劑上，其並非意欲抵抗胃。這可包括糖衣、或使片劑易於吞咽的包衣。膠囊可由用於遞送幹治療粉末的硬殼(例如明膠)組成；對於液體形式，可使用軟明膠殼。扁囊劑的殼材料可為稠澱粉或其他可食用紙。對於藥丸、菱形片劑、模製片劑或研製片劑，可使用溼密集技術(moist massing technique)。本文所述藥劑和化合物可包括在作為微細多微粒呈微粒或丸粒形式的調配物中。 用於膠囊投予的材料的調配物也可為粉末、略微壓縮的柱塊或甚至為片劑。醫藥組合物可通過壓縮製備。可利用惰性材料稀釋醫藥組合物或增加其體積。這些稀釋劑可包括碳水化合物，尤其是甘露醇、α -乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、經改性葡聚糖及澱粉。某些無機鹽也可用作填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂及氯化鈉。一些市售稀釋劑是hst-FlcKEmdex、 STA-Rx 1500、Emcompress 及 Avicellο崩解劑可包括在呈固體劑型的醫藥組合物的調配物中。用作崩解劑的材料包括(但不限於)澱粉，其包括基於澱粉的市售崩解劑Explotab。澱粉羥乙酸鈉、安伯萊特(Amber 1 ite)、羧甲基纖維素鈉、超支鏈澱粉(ultramylopectin)、海藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿及膨潤土均可使用。粘合劑可用於將治療劑保持在一起以形成硬片劑且包括來自天然產物的材料，例如阿拉伯膠、黃蓍膠、澱粉及明膠。抗磨劑可包括在治療劑的調配物中，以防止在調配過程期間粘著。潤滑劑可用作治療劑與模具壁之間的層，且這些潤滑劑包括(但不限於)硬脂酸(包括其鎂鹽及鈣鹽)、聚四氟乙烯 (polytetrafluoroethylene ；PTFE)、液體石蠟、植物油及蠟。可添加可改良調配期間藥物的流動性且有助於壓縮期間的重新布置的助流劑。助流劑可包括澱粉、滑石粉、火成二氧化矽及水合矽鋁酸鹽。對於通過吸入投予，本文所述藥劑和化合物可藉助適當推進劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適宜氣體)方便地以氣溶膠噴霧形式由壓力包或霧化器遞送。本文也打算涵蓋本文所述藥劑和化合物的肺部遞送。本文所述藥劑和化合物可遞送到哺乳動物的肺以實現局部或全身遞送。對吸入分子的其他報導包括Adjei等人，， 1990，Pharmaceutical Research，7 :565-569 ；Adjei 等人，1990，International Journal of Pharmaceutics,63 :135-144( ZjM^(leuprolide acetate)) ；Braquet ^A 1989, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5) :143-146 (內管月太-1) ；Hubbard 等人，1989，Annals of Internal Medicine，Vol. III，pp. 206—212 (al_ 抗胰蛋白酶)；Smith 等人，1989，J. Clin. Invest. 84 :1145-1146 (a_l_ 蛋白酶)；Oswein 等人，1990，「Aerosolization of Proteins」， Proceedings of Symposium on Respiratory
24Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,(重組人類生長激素)；Debs 等人，1988， J. Immunol. 140 :；3482-3488(幹擾素-g和腫瘤壞死因子α)及Platz等人，美國專利第 5，觀4，656號(粒細胞集落刺激因子)。用於肺部遞送藥物以實現全身作用的方法及組合物在1995年9月19日頒予Wong等人的美國專利第5，451，569號中予以描述。本文也打算涵蓋包含本文所述藥劑和化合物的醫藥組合物的經鼻遞送。經鼻遞送使得將治療產品投予至鼻子後本發明的醫藥組合物直接流至血流，而產品無需在肺中沉積。本文所述的藥劑和化合物也可調配在例如栓劑或留滯灌腸劑等含有(例如)常規栓劑基質(例如，可可油或其他甘油酯)等直腸或陰道組合物中。除上述調配物外，化合物亦可調配成儲積製劑。此類長效調配物可用適宜聚合或疏水性材料(例如作為在可接受油中的乳液)或離子交換樹脂調配，或作為微溶性類似物(例如，微溶性鹽)。用於投予細胞(包括最佳化的醫藥組合物)的方法在業內為人熟知。細胞可通過輸注、注射(例如注射至關節中)或通過外科插入而投予。然而，本發明並不限於這些實施例，而是打算涵蓋任何細胞投予方法。醫藥組合物還可包含適合的固相或凝膠相載劑或賦形劑。此類載劑或賦形劑的實例包括(但不限於)碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、澱粉、纖維素類似物、明膠、及聚合物(例如聚
乙二醇)。適宜的液體或固體醫藥製劑形式為(例如)用於吸入的水溶液或鹽水溶液、經微膠囊化、呈螺旋狀、塗敷在微型金顆粒上、包含在脂質體中、呈噴霧狀、氣溶膠、用於植入皮膚中的丸粒、或乾燥至擬刺入皮膚中的尖銳物體上。醫藥組合物還包括微粒、粉末、片劑、包衣片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿、乳液、懸浮液、乳霜、滴劑或活性化合物延長釋放的製劑，在其製備中通常如上所述使用賦形劑及添加劑及/或一或多種助劑，例如崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、潤滑劑、矯味劑、甜味劑或增溶劑。這些醫藥組合物適合用於各種藥物遞送系統。關於藥物遞送方法的綜述，參見Langer，1990，Science M9，1527-1533，其以引用的方式併入本文中。本文所述藥劑和化合物可以自身(純淨)形式或以醫藥上可接受的鹽的形式投予。當用於藥品中時，鹽應為醫藥上可接受的，但非醫藥上可接受的鹽可方便地用於製備其醫藥上可接受的鹽。此類鹽包括但不限於從以下酸製備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、 磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、 萘-2-磺酸、及苯磺酸。並且，此類鹽也可製備成鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，例如羧酸基的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。 本發明的醫藥組合物含有包括在醫藥上可接受載劑中的有效量的本文所述藥劑、 化合物及細胞以及視情況另外的治療劑。術語醫藥上可接受的載劑是指適用於投予給人類或其他脊椎動物的一或多種相容固體或液體填充劑、稀釋劑或囊封物質。術語載劑指天然或合成的有機或無機成分，其可與活性成分組合以有利於應用。醫藥組合物的各組分也能與本發明化合物及相互之間以沒有實質上消弱期望醫藥功效的相互作用的方式混合。
非生物可降解及生物可降解兩種聚合物材料均可用於製備遞送本發明化合物的粒子。此類聚合物可為天然或合成聚合物。根據期望釋放的時間周期選擇聚合物。特別令人感興趣生物粘結聚合物包括Sawhney等人在1993，Macromolecules 26，581-587中所述的可生物蝕解的水凝膠，其教示併入本文中。這些聚合物包括聚透明質酸、酪蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸鹽、殼聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、 聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂基酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、及聚(丙烯酸十八烷基酯)。本文所述的藥劑和化合物可包含在控釋系統中。術語「控釋」意欲指其中本文所述的藥劑和化合物從調配物中釋放的方式和曲線受到控制的任何含有本文所述藥劑和化合物的調配物。這是指立即釋放調配物以及非立即釋放調配物，其中非立即釋放調配物包括但不限於持續釋放調配物及延遲釋放調配物。術語「持續釋放」(亦稱為「延長釋放」)是以其習知含義使用，意指提供化合物在延長時間周期內的逐漸釋放、且較佳(儘管未必一定) 在延長時間周期內獲得實質恆定的血液藥物含量的藥物調配物。術語「延遲釋放」是以其習知含義使用，意指其中調配物的投予與化合物自其中的釋放之間有時間延遲的藥物調配物。「延遲釋放」可包括或可不包括藥物在延長時間周期內的逐漸釋放，且因此可為或可不為「持續釋放」。使用長期持續釋放植入物可尤其適用於治療慢性病狀。本文所用「長期」釋放是指植入物構造並布置成持續至少7天、且較佳30至60天遞送治療量的活性成分。長期持續釋放植入物已為所述領域的技術人員所熟知且包括以上所述的一些釋放系統。試劑盒一方面，本發明提供試劑盒，其包括包含本文所述藥劑和化合物的醫藥組合物以及關於投予醫藥組合物的用法說明。在本發明的一些方面，試劑盒可包括醫藥製劑小瓶、醫藥製劑稀釋小瓶、以及本文所述化合物和藥劑。稀釋小瓶含有稀釋劑，例如生理鹽水，用以稀釋可能的本發明化合物的濃縮溶液或凍乾粉末。在一些實施例中，用法說明包括關於將一定量的稀釋劑與一定量的經濃縮醫藥製劑混合而由此製備用於注射或輸注的最終調配物的說明。在一些實施例中，用法說明包括關於在注射器或其他投予裝置中使用的說明。在一些實施例中，用法說明包括關於用有效量的本發明化合物治療患者的說明。還應理解，含有製劑的容器，無論容器是瓶子、帶隔片的小瓶、帶隔片的安瓿、輸注袋及類似容器，其均可含有標記，例如在製劑已經過高壓滅菌或以其他方式滅菌時會改變顏色的常規標籤等。將通過以下實例對本發明進行進一步說明，無論如何不能將這些實例視為進一步限制。本說明書全文所引用的所有參考資料(包括參考文獻、已授權專利、公開專利申請案及共同待決專利申請案)的全部內容均以引用方式明確併入本文中，尤其是上文所參考的教示。實例實例的材料和方法小鼠將C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠、TGF β RIIdn小鼠及FoxP3gfp基因敲入小鼠(由華盛頓大學(University of Washington)(西雅圖，華盛頓州)的A. Y. Rudensky慷慨提供) 在化8丨^肚0 Gulbenkian de Cigncia (奧埃拉斯(Oeiras)，葡萄牙)處在無特定病原體條件下飼餵和供養。實驗小鼠性別相匹配並為6至8周齡。所有實驗均根據動物使用者和機構倫理委員會(Animal User and Institutional Ethical Committee)的指導原則進行。 對於iNKT細胞的體內轉變，通過胃內灌服法遞送30 μ g α -GalCer (Alexis，聖地牙哥，加利福尼亞州)，每隔一天進行3次。器官加工所有所分析的器官均藉助BD細胞濾器和注射器活塞加工成單細胞懸浮液。脾進一步在冰冷的三-氯化銨紅細胞溶胞液中培育5分鐘。在加工前，將肝用含肝素的PBS衝洗3次，隨後用補充有10%胎牛血清的RPMI衝洗。將肝細胞通過覆蓋35% (vol/vol)珀可(Percoll) (Sigma)溶液(Ilml)並隨後在室溫下在1360g下無降速度(with no brake) 離心25min而進行分級分離。通過抽吸棄除上清液並將片狀沉澱物在冰冷的三_氯化銨紅細胞溶胞液中培育5分鐘。人類外周血細胞的分離在獲得知情同意後，從兩種性別的健康志願者獲得經肝素化的靜脈血試樣。程序經裡斯本大學的醫學系(Faculty of Medicine, University of Lisbon)(裡斯本 (Lisbon)，葡萄牙)審查和批准。通過在Histopaque-1077 Hybri-Max密度梯度(Sigma) 上離心而分離夕卜周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell ；PBMC)並如下所述濃集T細胞。流式細胞術和細胞分選偶聯至PE的小鼠和人類CDld_PBS57四聚體由NIH Tetramer Facility提供。抗小鼠 CD3(145-2C11)、CD4 (GK1. 5 和 RM4-5)、CD8 (53-6. 7)、CD25(PC61. 5)、CD27 (LG. 7F9)、 CD62L(MEL-14)、CD103 (2E7)、CTLA-4(UC10-4B9)、DX5 (DX5)、Foxp3 (FJK_16s)、 GITR(DTA-I)、NKl. 1 (PK136)、NKG2D (CX5)、TCR-β 鏈(Η57-597)、Thyl. 1 (HIS51)、 Thyl. 2 (53-2. 1)的螢光染料標記的單克隆抗體(括號中指示的克隆)自eBioscience或 BD Biosciences 購得。抗人類 CD4(SK3)、CD25 (2A3), CD127 (eBioRDR5)、CD161(DX12)、 CTLA-4(14D3)、Foxp3 (PCHlOl)、GITR(eBioAITR)和 TCR V β 11 (C21)的螢光顏料標記的單克隆抗體自 eBioscience、BD Biosciences 或 Beckman Coulter 購得。對於鼠科NKT細胞濃集，用未經偶聯的抗_CD16/32(克隆2.4G2)大鼠抗體(內部自行生產)培育細胞，以阻斷與FcR的非特異性結合，並用偶聯PE的CDld-PBS57四聚體標記，但不進行衝洗。加入抗-PE磁性珠粒並在autoMACS細胞分離器(Miltenyi Biotech) 中分離出經磁性標記的部分。將試樣在FACSCanto I (Becton Dickinson)進行分析或在 FACSAria(Becton Dickinson)上進行分選，在所有實驗中均執行雙重排除。對於人類NKT 細胞濃集，用生物素化的抗CD14(61D3)、CD19(HIB19)和CD123(6H6)的抗體標記細胞，將其結合至抗生物素磁性珠粒並在autoMACS細胞分離器(Miltenyi Biotech)上進行濃集， 棄除經磁性標記的部分。對於細胞內流式細胞術染色，首先針對表面標記物對細胞進行標記，用購自eBioscience的滲透和固定緩衝液「套裝R)xp3染色緩衝液(Foxp3 Staining Buffer kt)」進行衝洗和固定。在進行細胞內抗體染色前，用未經偶聯的抗_CD16/32(克隆2. 4G2)大鼠抗體(內部自行生產)培育鼠科細胞，並用正常大鼠血清(eBioscience)培育人類細胞。用FlowJoCTree Star)對數據進行分析。細胞培養在先前已塗覆有3μ g/mL的抗_CD3(克隆145_2Cll，eBioscience)的M孔或96 孔平底板中培養所分選出的小鼠細胞。培養基為含GlutaMAX的RPMI-1640，補充有10% 胎牛血清、IfepesU %盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(str印tomycin)、1 %丙酮酸鈉和0.1% β-巰基乙醇(Invitrogen)。在一些情況下，將以下細胞因子和抗體添加至培養物中TGF-3 (5ng/mL, R&DSystems)、重組 IL-1 β (10ng/mL, eBioscience)、IL_2(5ng/mL， eBiocience)、IL-4(20ng/mL, eBioscience)、IL-6(20ng/mL, R&D Systems)、IL-15 (lOOng/ mL, eBioscience)、IL-7 (5ng/mL, R&D Systems)、禾口抗-CD28 (2 μ g/mL，eBioscience)。在進行細胞內細胞因子檢測前，在Brefeldin A(Sigma)的存在下用50ng/mL的- α -佛波醇 12-肉豆蔻酸酉旨 13-乙酸酯 α -phorbol 12-mystrate 13-acetate ；PMA)及 500ng/mL 的離子黴素(Sigma)將細胞在37°C、5% CO2下刺激3小時。在先前已塗覆有lyg/mL的抗_CD3(克隆0KT3，BD eBiosciences)的M孔平底板中培養人類細胞。培養基為含GlutaMAX的RPMI-1640，補充有10%胎牛血清、 !fepes和盤尼西林/鏈黴素(Invitrogen)。在一些情況下，將以下細胞因子和抗體添加至培養物中TGF-3 (10ng/mL, R&D Systems)、重組 IL-2 (10U/mL，Roche)、抗 IL12 和抗-IFN- γ (5 μ g/mL, eBioscience)、抗-IL-4 (5 μ g/mL, R&D Systems)、禾口抗-CD28 (2 μ g/ mL, eBioscience)。細胞因子檢測從各孔中取出培養物的上清液並在-80°C下冷凍，直到進行細胞因子檢測為止。使用仏-川⑴印！^丨一油)和IL-4(BD-Pharmingen)試劑盒進行ELISA。使用細胞因子珠粒矩陣小鼠 IL-9Flex 亞群(Mouse IL_9Flex Set) (BD-Pharmingen)進行 IL-9 檢測。所有檢驗均按照製造商的說明書進行。體外增殖和抑制檢驗為追蹤細胞增殖，在培養前用5μΜ的羧基螢光素琥珀醯亞胺酯 (carboxyfluorescein succinimidyl ester ；CFSE, Invitrogen)標記分選出的鼠禾鬥細胞。為評估調節iNKT和CD4T細胞的抑制能力，將各亞群以一式三份或一式四份在60孔 Terasaki板(Greiner)中與經絲裂黴素C(Sigma)處理的脾細胞和新分選出的⑶4+⑶25_T 細胞一起共培養，並添加2. 5 μ g/mL的可溶性抗-CD3 (BD Pharmingen) 0在一些實驗中， 添加 200 μ g/mL 的抗-ILlORdBl. 2)、200 μ g/mL 的抗-IL-4 (IlBll)和 100 μ g/mL 的抗-GITR(YGITR)22。將細胞在37°C下培養96小時並在培養的最後12小時中向各孔中添加 1 μ Ci [3H]胸苷(Amersham)。將各板收穫到纖維玻璃過濾器上並使用Microbeta Trilux閃爍計數器(Perkin Elmer)來評估[3H]胸苷摻入。所有培養物均以一式三份或一式四份進行測試。轉孔試驗(Transwell Assay)在跨膜培養中，在平底96孔培養板的底部孔中用經絲裂黴素C處理的脾細胞和 1 μ g/mL可溶性抗-CD3抗體來刺激經CFSE標記的「應答者(responder) 」CD4+CD25—T細胞。 將調節群或者在底部孔中用「應答者」細胞培養，或者在0.2ym Anopore膜插入皿(Nunc) 的上部孔中僅用經絲裂黴素C處理的脾細胞培養。72小時後，通過流式細胞術分析來評估底部孔中的CFSE稀釋度。過敏性氣道疾病在第O天和第14天通過腹腔注射20yg的卵清蛋白(ovalbumin ;0VA，V級； Sigma，聖路易斯，美國)或β-乳球蛋白(Sigma)來敏化Balb/c小鼠，卵清蛋白或β-乳球蛋白預先按照製造商說明書通過DetoxyGel柱(Pierce，羅克福德(Rockford)，美國)並懸浮在2. Omg的無內毒素的氫氧化鋁(Alu-gel-S, Serva，海德爾堡(Heidelberg)，德國) 中。在第0天、第7天和第14天用一半的OVA劑量來敏化C57/B16小鼠。隨後，所有動物均在圖14中所示日期用在無致熱源的鹽水中的50 μ g的OVA進行激發，並在最後一次激發後M小時殺死。為量化BAL嗜酸性粒細胞增多，經由氣管通過緩慢輸注並抽吸Iml冷PBS 10% BSA(Sigma)來衝洗氣道，衝洗三次。接著，將BAL離心，移除上清液並將片狀沉澱物重懸浮在PBS中。用血球計數器計數細胞。對用Giemsa-Wright (Sigma)染色的細胞離心塗片器(cytopsin)試樣進行差示細胞計數。使用遮光載玻片(blinded slide)對每份試樣的至少200個細胞進行計數，以確定每個細胞類型的相對頻率。對於組織分析，用4%的甲醛溶液(Sigma)對肺進行灌注，收集並進行切片。使用蘇木精(hematoxylin)/伊紅(eosin) 進行染色，並使用過碘酸-希夫(periodic acid-Schiff ；PAS)染料來顯示含粘液的細胞。 使用Leica DM2500顯微鏡和Leica DFC420照相機拍照。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis ； EAE)在C57BL/6小鼠中，通過注射在CFA中乳化的髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein ；M0G)35_55Jft (MEVGWYRSPFSRVVH LYRNGK, SEQ ID NO :1)並兩次靜脈內注射百日咳毒素(第0天，200ng;第2天，400ng)而誘導EAE。一些小鼠在第0 天(在M0G35_55CFA混合物中乳化)和第4天(腹腔注射)用兩份4 μ g劑量的α -GalCer 進行處理。每天均監測疾病嚴重程度並將EAE分級如下1分尾部軟弱無力；2分，後足部分癱瘓；3分，後足完全癱瘓；4分，前足軟弱無力；5分，奄奄一息。聚焦顯微鏡檢查法將R)xp3_GFP+細胞在FACSAria(Becton Dickinson)中進行分選，塗布在預先塗覆有聚-L-賴氨酸(Sigma)的蓋玻片上，並在37°C下培育1小時進行粘附。將載玻片用經 PE標記的⑶ld/PBS57四聚體在4°C下培育1小時並小心地用冰冷的PBS衝洗。將細胞在 PBS 3%低聚甲醛(Sigma)中在4°C下固定15分鐘並通過用冰冷的PBS衝洗來除去過量的固著劑。將載玻片在DAPI Fluoromount G(Southern Biotech)螢光封固劑中進行封固並用雷射掃描聚焦顯微鏡(LSM 510 ΜΕΤΑ, Carl Zeiss)檢查。RNA 提取、RT 禾口 PCR用RNeasy Micro Kit ^jiagen)按照製造商說明書從 1，000-50，000 個經 FACS 分選的細胞中提取RNA，例外之處是將細胞直接分選入RLT緩衝液中。使用隨機引物 (Invitrogen)和 Superscript III 逆轉錄酶(Invitrogen)進行 cDNA 合成。用以下引物 (購自 Bonsai Technologies)檢測轉錄物:PLZF(Zbtbl6)正向cagtttgcgactgagaatgc， (SEQ ID NO :2)， 反向:ttcccacacagcagacagaa (SEQ ID NO :3) ；Foxp3 正向 cccaggaaagacagcaacctt(SEQ ID NO -A) ； Jx. ( :ttctcacaaccaggccacttg(SEQ ID NO 5)； EFAl 正向acacgtagattccggcaagt (SEQ ID NO :6)，反向aggagccctttcccatctc (SEQ ID NO :7)。使用 Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems)和 ABI-PRISM 7000 測序系統(Applied Biosystems)進行PCR。所有的PCR產物均在瓊脂糖凝膠中進行試驗並確認是否具有正確的尺寸。統計分析通過非參數不成對t檢驗和Wfelch校正來計算P值。
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實例1 在TGF- β的存在下講行培養後， ΝΚΤ細胞表汰Foxp3我們研究了在TGF-β的存在下(已知可將常規T細胞轉變為R)Xp3+ 「誘導的」Treg的條件(35，36))被激活時iNKT在上調R)Xp3表達中的可塑性。用板結合的抗-⑶3 刺激自幼稚C57B1/6小鼠的脾分選出的iNKT細胞並在IL-2和TGF-β的存在下進行培養。 使用幼稚CD4+CD25_T淋巴細胞的平行培養物作為對照。3天後，對經培養細胞的細胞內染色揭示，在很大比例的iNKT ( . 35% ±11.80)細胞培養物和CD4 (53. 21 % 士 12. 03) T細胞培養物中均可檢測到R)Xp3表達(圖la)。來自具有GFP-Foxp3融合蛋白-報導子(importer) 基因敲入等位基因的小鼠(Foxp3gfp小鼠)(37)和Balb/c小鼠的iNKT細胞也給出類似的結果(圖Ib和圖2)。從胸腺分選出的iNKT淋巴細胞也可分化成R)xp3+iNKT細胞，但是轉變效率較低(圖Ic)。在轉變後分選R)xp3+iNKT並通過聚焦顯微鏡檢查法分析各細胞。如圖 Id中所示，用負載有PBS57配體的CDld四聚體進行的染色證實，這些表達R)xp3的細胞的表面具有會識別糖脂抗原的不變TCR，這是iNKT細胞所獨有的特徵。因此，真正的iNKT細胞在於特定條件下受到刺激時上調i^Xp3轉錄因子的能力方面與常規CD4T細胞類似。需要注意的是，例如Y S T細胞等其他非常規(非MHC限制的)T細胞並不具有這一特性，這些非常規T細胞當在TGF- β存在下被激活時並不能上調R)xp3 (數據未顯示)。為進一步界定將iNKT細胞轉變為Foxp3表達細胞的最佳條件，我們對衝擊 TCR-信號強度、共刺激、及細胞因子的添加進行了測試。在3 μ g/mL板結合抗-⑶3和5ng/mL TGF-β和IL-2的存在下實現轉變成R)xp3+NKT細胞的最佳轉變(圖Ie)。進一步將IL-15 或IL-7添加至先前的細胞因子混合劑對iNKT細胞轉變幾乎沒有影響(圖幻。可以在不存在IL-2的情況下實現轉變，但R)xp3+細胞的頻率卻大大降低(降低至約5%的水平)，這可能是因於這些細胞的擴增受損而造成的。相反，在含IL-2或IL-15但不存在TGF-β的培養物中可能不會誘導I^oxpS+iNKT細胞(圖2)。確實，TGF-β濃度的滴定清楚地揭示，該細胞因子對於在iNKT細胞中誘導R)xp3至關重要(圖If)。對於不同的TGF-β和胎牛血清批次，我們觀察到經轉變R)xp3+iNKT細胞的頻率有一定變化(在20%與50%之間)。也對將抗-CD^單克隆抗體添加至培養物進行了測試，但並沒有提高轉變成R)Xp3+iNKT細胞的轉變率(數據未顯示)。這些數據清楚地證明，在iNKT細胞激活時，TGF-β信號會促進 Foxp3表達的誘導。實例2 :Foxp3+iNKT細胞展示和NKT細胞表型特性在確定iNKT淋巴細胞可表達R)Xp3後，我們對經轉變細胞的表型進行了檢驗。 Foxp3+iNKT細胞的許多表型特性為體外經轉變R)xp3+CD4 Treg細胞所共有兩種細胞群均主要是CD25+、CTLA-4+、GITR+、⑶103+和IL_7Ra_(圖3a)。然而，我們在兩種細胞群之間觀察到一些不同之處R)xp3+⑶4T細胞主要是⑶27+且對於⑶62L表達是不均一的，而 Foxp3+iNKT細胞主要是⑶27—和⑶6217。不存在⑶62L與⑶103的高表達聯繫在一起表明， 在體內，Foxp3+iNKT細胞被從淋巴結逐出並優先遷移至周邊組織。確實，在將R)xp3+iNKT 細胞靜脈注射至RAG2+小鼠後三周，我們可在肝中優先檢測到這些細胞(見下文)。⑶4表達在iNKT淋巴細胞中的不均一性已得到確認9。令人感興趣的是，我們發現表達R)Xp3的可能性並不限於⑶4+iNKT細胞亞群，而是⑶4+和⑶4—iNKT細胞均有可能(圖 3b) 0我們還發現，大多數R)xp3+iNKT淋巴細胞為NKl. Γ、Κ 5_、和NKG2D+。另外，我們檢測到在所分選的Γ^οχρβ+和R)xp3_iNKT細胞中存在PLZF的轉錄物，PLZF是據報導為NKT譜系特徵的轉錄因子02)(圖3c)。這些觀察合在一起表明，在iNKT淋巴細胞中誘導R)xp3表達並不破壞它們基於來自T譜系和NK譜系二者的分子的非種系選擇性表達(promiscuous expression)的 NKT 性質。實例3 :Foxp3+iNKT細胞i千移至肝並體內維持Foxd3表汰誘導基因表達程序後需考慮的基本方面是它的穩定性。此外，可明顯看出，常規 Treg細胞的R)xp3表達的穩定性要低於最初的預期(38)。為了研究能否體內在iNKT細胞中維持R)Xp3表達，我們將轉變後的R)xp3gfpiNKT或作為對照將體外誘導的R)xp3gfp CD4細胞注射入RAG2+小鼠體內。7天和21天後，評估脾、淋巴結(LN)、肺、腸和肝中iNKT細胞的表型。⑶4T細胞優先遷移至淋巴結，但也可在脾和肝中發現，而與⑶4T細胞不同，iNKT細胞不在淋巴結中，而是大部分在肝和肺中檢測到，並且在早期的時間點上，還存在於脾中。 然而，三周後，Foxp3+iNKT細胞在脾中便不再檢測到，而是存在於肝中，在肝中，高達80% 的iNKT細胞仍保持對R)xp3的表達(圖4)。這些結果合起來表明，轉變後iNKT的R)Xp3 表達的體內穩定性並不比轉變後i^oxpS+Treg細胞差，儘管這兩個群具有不同的生理生態位(physiological niche) :iNKT細胞優先尋靶至非淋巴器官，例如肝，而CD4Treg主要遷移至次級淋巴器官。實例4 =INKTreR細胞展示接觸依賴GITR介導的抑制功能Foxp3是據報導可在外周⑶25TD4+T細胞中誘導基因程序、進而導致Treg表型和抑制功能的轉錄因子(39-41)。為評價R)Xp3+iNKT細胞的調節功能，我們對其抑制用APC和可溶性抗_CD3MAb刺激的CD25—CD4+ 「應答者」細胞的增殖的能力進行了測試。我們使用從 Foxp3gfp小鼠獲得的在TGF-β的存在下轉變的iNKT細胞，並使用天然CD25highCD4+(nTreg) 細胞和體外轉變的R)xp3+⑶4+T細胞(也來自Foxp3gfp小鼠)作為對照。調節細胞與應答細胞比率的滴定揭示，轉變後的R)xp3+iNKT細胞確實能抑制靶CD25TD4+T細胞的增殖， 其效率類似於轉變後的R)xp3+CD4+T細胞，且僅略微次於nTreg細胞的效率(圖fe)。將抗-GITR(4 而非抗-IL10R中和抗體添加至培養物會使抑制作用逆轉，表明GITR在由 Foxp3+iNKT淋巴細胞介導的調節功能中起主導作用(圖恥)。與這些結果一致，當與應答細胞分開在轉孔培養板(transwell)中培育時，Foxp3+iNKT細胞表現出嚴重受損的抑制功能(圖5c)。這些結果證明，類似於常規Treg細胞，在iNKT淋巴細胞中誘導R)xp3會通過由GITR介導的接觸依賴機制而賦予這些細胞以抑制功能。實例5 :Foxp3+iNKT細胞的體內分化為TGF-β依賴性在產生R)xp3gfp小鼠時，針對R)xp3的表達對主要的造血譜系進行篩選。在T淋巴細胞和B淋巴細胞、NKl. 1+細胞、巨噬細胞和樹突細胞中，觀察到R)xp3表達局限於α βΤ 細胞(37)。在該項研究中，NKT細胞被認為是NKl. I+TCRiT淋巴細胞且排除在該細胞亞群中的R)xp3表達。然而，有一小亞群的NKT細胞缺乏NKl. 1受體的表達。另外，常規T淋巴細胞的一些亞群可在激活時表達NKl. 1。因此，我們嘗試用特異性識別不變NKT細胞的TCR 的四聚體來明確地找出不變NKT細胞，以此來證實那些觀察結果。我們從幼稚C57B1/6小鼠的肝、脾、混合淋巴結(pooled LN)、派爾集合淋巴結(Peyer's Patches ；PP)以及胸腺收集單核細胞(圖6a，b)。雖然一部分⑶4+T細胞表達R)xp3，但未在來自任何器官的iNKT細胞閘門(gate)內觀察到可檢測到的Foxp3表達。對於Balb/c小鼠和Foxp3gfp小鼠，獲得類似的結果(圖7)。
我們研究了腸暴露至α-GalCer是否可導致在腸繫膜淋巴節(mesenteric lymph node ；MLN)中找到R)xp3+iNKT細胞，並以相同的方式研究了口服耐受(oral tolerance)是否會導致在MLN中再一次誘導R)xp3+Treg細胞03)。當通過胃內途徑遞送α-GalCer時， 我們觀察到I^oxpS+iNKT細胞在MLN中的聚集，達到每隻小鼠1383個(士 206，SD)的均值 (圖6c)。值得注意的是，大多數來自MLN的R)Xp3+iNKT細胞表達低水平的CD25。為了測試 Foxp3+iNKT細胞的體內產生是否需要TGF-β，我們觀察到當通過胃內灌服法將α -GalCer 遞送至dnTGF0 RII小鼠時，未誘導R)xp3+iNKT細胞，在dnTGF0 RII小鼠中，T細胞和NKT 細胞不能轉導TGF-β信號(圖6c) (44)。我們還對過敏性氣道疾病的小鼠模型進行了研究，在該模型中，已知iNKT細胞存在於含包括TGF-β在內的細胞因子的環境中，TGF-β是表徵組織重塑的纖維化的關鍵介體G5)。我們對R)xp3在iNKT細胞以及對照CD4+T淋巴細胞中的表達進行了分析，這些細胞是從Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠的肺分離出來的，而這些Balb/c小鼠和C57B1/6小鼠已根據已知可導致急性或慢性過敏性氣道疾病的方案而用在氫氧化鋁(明礬)中的卵清蛋白(OVA)敏化(腹腔注射)並隨後用遞送至氣道的OVA激發(圖8) (45)。我們發現，無論是急性還是慢性疾病，從大多數過敏小鼠的肺分選出的iNKT細胞均表達R)xp3，儘管表達水平要比所分選出的CD4+T細胞低(圖6d)。值得注意的是，與CD4T細胞不同，從幼稚的未經處理的對照小鼠分選出的iNKT細胞不顯示R)xp3表達(圖6d)。合在一起，我們的觀察表明，Foxp3+iNKT細胞並不天然地由胸腺產生，但是可在存在TGF-β的環境中在外周誘導。實例6:實騎件過敏腦炎(Experimental Allergic Encephalitis :EAE)保護與 Foxp3+iNKTreg細胞的局部存在有關我們使用多發性硬化症(multiple sclerosis ；MS)的實驗性小鼠模型來驗證先前被認為是由iNKT細胞的存在所產生的保護作用06)是否與R)Xp3+iNKTreg細胞的局部聚集有關。我們發現，在被徵集至頸淋巴結的iNKT細胞中，存在R)xp3+iNKT細胞的過度表現(over-r印resentation)(圖9)。令人注意的是，Foxp3+iNKT細胞的這一增加僅限於中樞神經系統(central nervous system ;CNS)-引流淋巴結，並未在全身中觀察到(即，在不引流CNS的脾或淋巴結中)。這一觀察結果表明，iNKTreg細胞可介導局部抗炎作用，但不導致全面的免疫抑制。我們還將α-GalCer投送至經受EAE誘導的小鼠。所有的經α-GalCer 處理的小鼠仍受到保護而沒有罹患該病，並且在CNS-引流淋巴結中觀察到R)xp3+NKTreg 細胞增多，進一步證實了我們的數據，即可以將NKT細胞激動劑用於NKTreg細胞的體內產生，能夠預防免疫介導的疾病。實例7 人類iNKT細胞能轉變成Foxp3+iNKI~reg細胞我們還對是否能在人類iNKT細胞中誘導R)xp3表達進行了評價。考慮到iNKT淋巴細胞在人類外周血液中的出現頻率較低(47)，我們通過磁性分離來濃集全部的T細胞並將這些混合群在不僅含有TGF-β而且也含有抗IL-12、IFN-Y和IL-4的封閉抗體的混合劑的極化條件(被認為有利於人類CD4T細胞轉變成R)Xp3+Treg的條件08))下進行培養。 培養5天後，高達40%的人類iNKT細胞已上調R)xp3，這一轉變效率與常規⑶4+T細胞相當(圖10)。轉變後的人類R)xp3+NKT細胞為⑶25+、GITR+，且主要為⑶161+，而近乎一半的 Foxp3+iNKT 細胞表達 CD127。
實例8 通過原位產牛FoXD3+iNKT細胞來預防過敏件氣道疾病(哮喘)我們使用得到確認的過敏性氣道疾病小鼠模型(基於在第0天和第14天用在明礬中的卵清蛋白(OVA)或常見過敏原房塵蟎(house dust mite ；HDM)敏化，隨後在第20天、 第21天和第22天用過敏原進行鼻內激發)。我們對alpha-GalCer (NKT細胞刺激性化合物)單獨或與TGF-β —起的鼻內給藥是否能導致NKTreg細胞在氣道中聚集並預防該疾病的臨床表現進行測定。在用過敏原進行鼻內激發的日期裡，同時給予NKTreg誘導治療。通過組織切片中炎性浸潤液的減少、肺勻漿中Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的減少、BAL 中嗜酸細胞含量的降低、以及氣道超敏反應性的重大降低(通過對增加吸入乙醯甲膽鹼的劑量的響應(在氣道阻力方面)來判斷)來評估疾病嚴重程度的降低。我們對不同的給藥時間與過敏原進入氣道的時間的關係進行了測試是否可以通過預先使氣道暴露至NKTreg誘導治療來預防這些表現；( 是否可以在與過敏原接觸時以及伴隨而來的在小鼠將具有明顯的過敏性氣道炎症時，通過給予NKTreg誘導治療來降低疾病表現。參考文獻1. Kronenberg, M.於 2005 年所發表的 Toward an understanding of NKT cell biology :progress and paradoxes。Annual review of immunology 23 :877_900o2. Gumperz，J. E.、S. Miyake、T. Yamamura> 以及 M. B. Brenner 於 2002 年所發表的 Functionally distinct subsets of CDld-restricted natural killer T cells revealed by CDld tetramer staining。 The Journal of experimental medicine 195 625-636。3. Michel, M. L. 、A. C. Keller> C. Paget、M. Fujio、 F. Trottein、 P. B. Savage> C. H. Wong、E. Schneider, M. Dy、以及 Μ. C. Leite-de-Moraes 於 2007 年所發表的 Identification of an IL-17-producing NKl. 1 (neg)iNKT cell population involved in airway neutrophilia。The Journal of experimental medicine 204 :995-1001。4. Coquet, J. M. 、 S. Chakravarti> K. Kyparissoudis> F. W. McNab> L. A. Pitt、 B.S.McKenzie、S.P.Berzins、M. J.Smyth、以及 D. I. Godfrey 於 2008 年所發表的 Diverse cytokine production by NKT cell subsets and identification of an IL-17-producing CD4-NK1. I-NKT cell population。 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105 :11287_11292。5. Rachitskaya, A. V.、A. M. Hansen、R. Horai> Z. Li、R. VillasmiK D. Luger、 R. B. Nussenblatt、以及 R. R. Caspi 於 2008 年所發表的 Cutting edge :NKT cells constitutively express IL—23 receptor and RORgammat and rapidly produce IL—17 upon receptor ligation in an IL-6-independent fashion。J Immunol 180 :5167_517106. Lee，K. A.、M. H. Kang、Y. S. Lee、Y. J. Kim、D. H. Kim、H. J. Ko、以及 C. Y. Kang 於 2008 年所發表的 A distinct subset of natural killer T cells produces IL—17, contributing to airway infiltration of neutrophils but not to airway hyperreactivity。 Cellular immunology 251:50_55o7. Niemeyer, Μ.、A. Darmoise>H. J. Mollenkopf >K. Hahnke>R. Hurwitz>G. S. Besra、 U. E.Schaible、以及 S.H.Kaufmann 於 2008 年所發表的 Natural killer T-cellcharacterization through gene expression profiling :an account of versatility bridging T helper type 1(Th l)，Th2 and Th 17 immune responses。 Immunology 123 45-56 ο8. Raftery, M. J. 、F. Winau^ T. Giese、 S. H. Kaufmann^ U. E. Schaible^ 以 R G· Schonrich於2008年所發表的 Viral danger signals control CDld de novo synthesis and NKT cell activation。 European journal of immunology 38 :668_679。9.Biburger，M.、以及 G. Tiegs 於 2008 年所發表的 Activation-induced NKT cell hyporesponsiveness protects from alpha-galactosylceramide hepatitis and is independent of active transregulatory factors。Journal of leukocyte biology 84 264-279 ο10. Moreno, M. 、 J. W. Moiling、 S. von Mensdorff-Pouilly^ R. H. Verhei jen、 E.Hooijberg、D. Kramer、A.W. ReursΛ A. J. van den EertweghΛ B. Μ. von Blomberg、 R. J. Scheperλ 以及 H· J· Bontkes 於 2008 年所發表的 IFN-gamma-producing human invariant NKT cells promote tumor-associated antigen-specific cytotoxic T cell responses。J Immunol 181 :2446_2454。11. Akbari，0.、P. Stock、E. Meyer、M. Kronenberg、S. Sidobre、T. NakayamaΛ Μ. Taniguchi、Μ. J. Grusby、R. H. DeKruyff、以及 D. Τ. Umetsu 於 2003 年所發表的 Essential role of NKT cells producing IL_4 and IL-13 in the development of allergen-induced airway hyperreactivity。 Nature medicine 9 :582_588012. Gober, M. D. 、R. Fishelevich^ Y. Zhao、D. Unutmaz^ 1 A. A. Gaspari T 2008 ^Bf^^WHuman natural killer T cells infiltrate into the skin at elicitation sites of allergic contact dermatitis。 The Journal of investigative dermatology 128 :1460-1469o13. Mattner, J. 、 P. B. Savage^ P. Leung、 S. S. Oertelt、V. Wang^ 0. Trivedi、 S. T. Scanlon、K. Pendem、L. Teyton、J. Hart、W. M. Ridgway、L S. Wicker、Μ. E. Gershwin、 以及 A· Bendelac 於 2008 年所發表的 Liver autoimmunity triggered by microbial activation of natural killer T cells。 Cell host & microbe 3 :304_315o14. Jiang, X. 、T. Shimaoka^ S. Kojo、M. Harada^ H. Watarai ^H. Wakao^N. Ohkohchi、 S. Yonehara、M. Taniguchi、以及K. Seino 於 2005 年所發表的 Cutting edge :critical role of CXCL16/CXCR6 in NKT cell trafficking in allograft tolerance。 J Immunol 175 2051-2055。15. Meyer, E. H.、S. Goya、0. Akbari、G. J. Berry、P. B. Savage、M. Kronenberg、 T. Nakayama^R. H. DeKruyff、以及 D. Τ. Umetsu 於 2006 年所發表的 Glycolipid activation of invariant T cell receptor+NK T cells is sufficient to induce airway hyperreactivity independent of conventional CD4+T cells。 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 :2782_2787016. Hong, S. 、Μ. T. Wilson、I. Serizawa^ L. Wu^ N. Singh、0. V. Naidenko^ T. Miura^ T. Haba、D. C. Scherer、J. Wei、M. Kronenberg、Y. Koezuka、以及 L· Van Kaer 於 2001 年 Bf ^ ^ W The natural killer T一cell ligand alpha-galactosylceramide prevents
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權利要求
1.一種分離的1^0即3+天然殺傷T細胞。
2.一種分離的細胞群，包含(a)至少0.001 % Foxp3+天然殺傷細胞，或(b)至少10個R)xp3+天然殺傷T細胞。
3.如權利要求2所述的細胞群，其中R)xp3+天然殺傷T細胞所佔百分比為至少 0. 001%、至少0. 01%、至少0. 05%、至少0. 1%、至少0. 5%、至少1%、至少5%、至少10%、 至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、或至少90 %。
4.如權利要求2所述的細胞群，其中R)Xp3+天然殺傷T細胞的數目為至少1個、至少 10個、至少50個、至少100個、至少500個、至少1，000個、至少5，000個、至少10，000個、 至少50，000個、至少100，000個、至少1 X IO6個、至少1 X IO7個、或至少1 X IO8個細胞。
5.如權利要求2至4中任一項所述的細胞群，其中所述細胞群為血細胞群、白細胞群、 T細胞群、或天然殺傷T細胞群。
6.如權利要求2至4中任一項所述的細胞群，其中所述細胞群為T細胞群。
7.—種產生R)Xp3+天然殺傷T細胞的方法，所述方法包含使包含天然殺傷T細胞的細胞群與足以產生R)xp3+天然殺傷T細胞的量的TGF- β與一或多種NKT刺激劑的組合接觸。
8.如權利要求7所述的方法，進一步包含使所述細胞群與IL-2接觸。
9.如權利要求7或8所述的方法，進一步包含使所述細胞群與IL-7、IL-15及IL-21中的任一者或任一組合接觸。
10.如權利要求7至9中任一項所述的方法，進一步包含使所述細胞群與選自由抗-IFN γ、抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12及抗-IL-27組成群組的中和抗體中的任一者或任一組合接觸。
11.如權利要求7至10中任一項所述的方法，其中所述細胞群是血細胞群、白細胞群、 T細胞群或天然殺傷T細胞群。
12.如權利要求7至11中任一項所述的方法，其中所述細胞群收穫自個體。
13.一種增加R)xp3+天然殺傷T細胞的數目的方法，所述方法包含使包含至少一你即3+天然殺傷T細胞的細胞群與足以增加R)xp3+天然殺傷T細胞的數目的量的TGF-β、一或多種NKT刺激劑、一或多種增殖誘導細胞因子、及一或多種中和抗體的組合接觸。
14.如權利要求13所述的方法，其中R)xp3+天然殺傷T細胞的數目增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少 10，000倍、至少100，000倍、至少IO6倍、至少IO7倍。
15.如權利要求13或14所述的方法，其中所述增殖誘導細胞因子是IL-2、IL-7、IL-15 及IL-21中的一者或任一組合。
16.如權利要求14至16中任一項所述的方法，其中所述中和抗體是抗-IFNy、 抗-IL-4、抗-IL-6、抗-IL12及抗-IL-27中的任一者或任一組合。
17.一種將天然殺傷T細胞遞送至個體的肝或黏膜組織的方法，所述方法包含向所述個體全身投予你即3+天然殺傷T細胞。
18.一種將天然殺傷T細胞遞送至個體的肝或黏膜組織的方法，所述方法包含向所述個體局部投予你即3+天然殺傷T細胞。
19.如權利要求17或18所述的方法，其中所述R)xp3+天然殺傷T細胞是自體細胞。
20.如權利要求17至19中任一項所述的方法，其中通過使天然殺傷T細胞與足以產生 Foxp3+天然殺傷T細胞的量的一或多種NKT細胞刺激劑及TGF- β接觸來產生所述R)xp3+ 天然殺傷T細胞。
21.如權利要求17至20中任一項所述的方法，其中以有效抑制肝或黏膜組織中的免疫應答的量投予所述你即3+天然殺傷T細胞。
22.如權利要求21所述的方法，其中抑制肝中的所述免疫應答旨在治療移植物抗宿主病、由胰島移植引起或與其有關的不期望的免疫應答、由肝移植引起或與其有關的不期望的免疫應答、或免疫介導的肝炎症。
23.如權利要求21所述的方法，其中所述R)xp3+天然殺傷T細胞與胰島移植或肝移植結合投予。
24.如權利要求17至19中任一項所述的方法，其中所述R)xp3+天然殺傷T細胞的基因組包含編碼多肽的核酸，以及其中將所述你即3+天然殺傷T細胞遞送至肝使所述多肽在肝中得以表達。
25.—種抑制個體器官中的免疫應答的方法，所述方法包含將一或多種NKT刺激劑以足以抑制所述器官中的所述免疫應答的量局部遞送至所述器官。
26.如權利要求25所述的方法，進一步包含將TGF-β以足以抑制所述器官中的所述免疫應答的量局部遞送至所述器官。
27.如權利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫應答是針對抗原的免疫應答。
28.如權利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫應答是自身免疫應答。
29.如權利要求25至觀中任一項所述的方法，其中所述器官是腸、或肺。
30.如權利要求四所述的方法，其中對所述免疫應答的所述抑制旨在治療炎性腸病、 克羅恩氏病或哮喘。
31.如權利要求25至觀中任一項所述的方法，其中所述局部遞送至所述器官是遞送至黏膜組織。
32.一種醫藥組合物，包括包含R)xp3+天然殺傷T細胞的細胞群。
33.如權利要求32所述的醫藥組合物，其中所述細胞群是血細胞群。
34.如權利要求32所述的醫藥組合物，其中所述細胞群是白細胞群。
35.如權利要求32所述的醫藥組合物，其中所述細胞群是T細胞群。
36.如權利要求32所述的醫藥組合物，其中所述細胞群是NKT細胞群。
37.一種醫藥組合物，包含TGF-β及一或多種NKT刺激劑。
全文摘要
本發明提供包含Foxp3+天然殺傷T細胞的細胞群、產生Foxp3+天然殺傷T細胞的方法以及抑制包括肝和肺在內的特定器官中的免疫應答的方法。
文檔編號A61K35/12GK102216448SQ200980145224
公開日2011年10月12日 申請日期2009年11月13日 優先權日2008年11月13日
發明者瑪爾塔·索非亞·費雷拉·蒙泰羅, 路易斯·裡卡多·西蒙斯·達·席爾瓦·格拉薩 申請人:分子醫學研究院, 裡斯本大學