融合蛋白及其在利什曼病的診斷和治療中的用途的製作方法

2023-07-25 23:08:26

專利名稱：融合蛋白及其在利什曼病的診斷和治療中的用途的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及由合成的嵌合基因構建體產生的融合蛋白及其在利什曼病的診 斷和治療中的用途，所述合成的嵌合基因構建體包含來自D6、K39和K9的序列。相關領域的描述利什曼原蟲屬(Leishmania)生物是巨噬細胞的細胞內原生動物寄生蟲，其導致 人和家畜中廣泛範圍的臨床疾病，所述家畜主要是犬。在某些感染中，該寄生蟲可處於潛伏 很多年。在其他的情況中，宿主可以發展為多種形式的利什曼病中的一種。例如，該疾病 可以是無症狀的或可以表現為亞臨床內臟利什曼病，所述亞臨床內臟利什曼病的特徵為不 適、腹瀉和間歇性肝腫大的輕微症狀。患有亞臨床或無症狀疾病的患者通常具有低的抗體 滴度，這使得該疾病難以用標準技術進行檢測。可選擇地，利什曼病可表現為皮膚疾病，該 皮膚疾病是嚴重的但通常是自限的醫學問題，或者利什曼病可表現為高度破壞性的不是自 限的黏膜疾病。最終並且最嚴重的情況下，該疾病可表現為累及脾、肝和淋巴結的急性內臟 感染，如果聽任不治療的話，該疾病通常是致死疾病。急性內臟利什曼病的症狀包括肝脾腫 大、發熱、白細胞減少、貧血和丙種球蛋白過多。該疾病的3種主要臨床變種已知為皮膚變種、黏膜皮膚變種和內臟變種。皮膚利 什曼病可自身表現為白蛉叮咬部位的單一皮膚潰瘍，感染後不久或數月後顯現為彌散性損 傷。黏膜皮膚症候群以皮膚形式發展，但數月或數年後進展為口、鼻或咽的損傷。皮膚和粘 膜皮膚疾病的主要長期影響是瘢痕形成。內臟利什曼病具有3-6個月的潛伏期並且累及網 狀內皮系統。內臟利什曼病的臨床表現包括肝和脾的增大、發熱、貧血和體重丟失。在缺乏治療 的情況下，有症狀的內臟疾病通常以死亡結束。近些年來，Hiv和引起內臟疾病的利什曼原 蟲屬種的共存已經導致數百雙重感染的個體的病例(Berman，J. D.，(1997)Clin. Infect. Dis. 24 684)。在2000年，世界衛生組織最近估計利什曼病侵襲88個國家的人，3億5千萬 人處於染上該疾病的風險並且每年約2百萬新病例。該疾病的毀滅性的影響的實例為蘇丹 內臟利什曼病的最近流行，其奪去估計100，000人的生命(Seaman, J.，et al. (1996) Int. J. Epidemiol. 25:862)。如海灣戰爭期間親內臟利什曼病的爆發所證實的，該疾病頻繁成為軍事行動中的威脅(Magill，J.，et al. (1993)N Engl J Med 328 :1383)。在世界很多地區，利什曼病是嚴重的問題，包括巴西、中國、東非、印度和中東地 區。該疾病在地中海地區還是地方性的，包括法國南部、義大利、希臘、西班牙、葡萄牙和北 非。在過去的20年中，利什曼病的病例數顯著增加並且現在世界各地存在數百萬的該疾病 的病例。每年診斷約2百萬的新病例，25%的新病例是內臟利什曼病。然而，目前沒有疫苗 或可行的有效治療。利什曼病由利什曼原蟲屬的數個種引起。動質體目的這些單細胞生物與錐體蟲有 關，錐體蟲是非洲的昏睡病和南美的查加斯病的成因生物。利什曼原蟲屬寄生蟲通常以兩 種截然不同的方式存在，昆蟲載體的能動的前鞭毛體和存在於哺乳動物宿主中的固定的無 鞭毛體。前鞭毛體通過受感染的遍及世界熱帶和溫帶各處的白蛉的叮咬而被傳播到人。當 傳遞至哺乳動物宿主時，前鞭毛體感染網狀內皮系統的巨噬細胞並轉變為無鞭毛體。利什曼病的準確診斷常常難以實現。有利什曼原蟲屬的20個種感染人，包 括杜氏利什曼原蟲(L. donovani)、恰氏利什曼原蟲(L. chagasi)、嬰兒利什曼原蟲 (L. infantum)、碩大利什曼原蟲(L. major)、亞馬遜利什曼原蟲(L. amazonensis)、巴西 利什曼原蟲(L. braziliensis)、巴拿馬利什曼原蟲(L. panamensis)、墨西哥利什曼原蟲 (L. mexicana)、熱帶利什曼原蟲(L. tropica)和蓋亞那利什曼原蟲(L. guyanensis)，並且 沒有明確指示利什曼原蟲屬感染存在的特有跡象或症狀。已經使用了寄生蟲檢測方法，但 這些方法既不是敏感的也不是臨床實用的。現有的皮膚測試通常使用整體的或分解的寄生 蟲。這些測試通常是不敏感的、不可再現的並且易於與多種其他疾病交叉反應。此外，這些 測試中使用的製劑通常是不穩定的。因此，需要改進的方法用於利什曼原蟲屬感染的檢測。例如，本領域需要更敏感的 和特異性更強的方法用於檢測利什曼原蟲屬感染和鑑別那些可能進展為急性內臟感染的 無症狀利什曼原蟲屬感染。本發明實現這些需要並且進一步提供其他相關利益。概述本發明通常涉及包含至少兩種異源利什曼原蟲屬抗原的組合物、包含所述抗原的 融合多肽和編碼所述抗原和融合物的多核苷酸，其中所述利什曼原蟲屬抗原選自K39、K26 和/或K9。本發明還涉及在利什曼病的診斷、治療和預防中使用本發明的多肽和多核苷酸 的方法。本發明的抗原，當被聯合使用和/或作為如本文所述的融合多肽或多核苷酸使用 時，提供改進的和預想不到的優勢，並且在利什曼病診斷和疫苗開發方面是特別有用的。因此，根據一個實施方案，本發明提供分離的融合多肽，其包含兩個或更多個選自 K26.K39和K9的利什曼原蟲屬抗原或其免疫原部分或變體。在相關實施方案中，分離的融 合多肽包含至少全部三種以上的利什曼原蟲屬抗原，其中至少一種抗原分離自杜氏利什曼 原蟲。在具體實施方案中，本發明的融合多肽包含以下包含至少以6的142-267位殘基 (SEQ ID NO 5)的第一免疫原部分；包含至少K39的2110-2343位殘基(SEQ ID NO 6)的 第二免疫原部分；和包含至少K9的1-399位殘基(SEQ ID NO 7)的第三免疫原部分。在更 具體的實施方案中，本發明的融合多肽包含如SEQ ID NO :8的10-262位胺基酸殘基所示的 胺基酸序列。在某些實施方案中，所述融合多肽包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO :21)的N末端 胺基酸序列。在某些其他實施方案中，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8所示的胺基酸序列。在多個實施方案中，本發明提供編碼本發明的融合多肽的分離的多核苷酸。本發明還提供與本文各處所述的融合多肽特異性地結合的分離的抗體或抗原結 合片段。在另一實施方案中，本發明考慮到藥物組合物，其包含以下與生理學可接受的載 體的組合本發明的融合多肽，或識別本發明的融合多肽的分離的抗體或抗原結合片段，或 編碼本發明的融合多肽的多核苷酸。在相關實施方案中，本發明考慮到疫苗組合物，其包含以下與非特異性免疫應答 增強劑的組合本發明的融合多肽，或識別本發明的融合多肽的分離的抗體或抗原結合片 段，或編碼本發明的融合多肽的多核苷酸。在具體實施方案中，本發明提供在選自血清、血液和唾液的生物樣品中檢測無症 狀或亞臨床利什曼原蟲屬感染的方法，所述方法包括使生物樣品與融合多肽接觸，所述融 合多肽包含兩個或更多個選自K26、K39和K9的利什曼原蟲屬抗原或其免疫原部分；並在 所述生物樣品中檢測與所述融合多肽結合的抗體的存在，從而檢測所述生物樣品中無症狀 亞臨床或活動性利什曼原蟲屬感染。在更具體的實施方案中，檢測生物樣品中無症狀或亞 臨床利什曼原蟲屬感染的方法利用包含以下的融合多肽包含至少以6的142-267位殘基 (SEQ ID NO 5)的第一免疫原部分；包含至少K39的2110-2343位殘基(SEQ ID NO 6)的 第二免疫原部分；和包含至少K9的1-399位殘基(SEQ ID NO 7)的第三免疫原部分。在仍 然更具體的實施方案中，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8的10-262位殘基所示的胺基酸 序列。在仍然更具體的相關實施方案中，所述融合多肽還包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端胺基酸序列。在相關實施方案中，檢測生物樣品中無症狀或亞臨床利什曼原蟲屬感染的方法使 用與固體支持物結合的融合多肽，其中所述固體支持物可以包含，例如硝化纖維、膠乳或塑 料材料。在某些實施方案中，所述方法還包括i)從固體支持物去除未結合的樣品；ii)將 檢測試劑添加到所述固體支持物；並且iii)相對於預定截斷值測定與所述固體支持物結 合的檢測試劑的的水平，從而檢測所述生物樣品中無症狀或亞臨床利什曼原蟲屬感染。在多個實施方案中，本發明提供鑑別受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或 亞臨床內臟利什曼病侵襲的患者的方法，所述方法包括使獲自受無症狀或亞臨床內臟利 什曼病侵襲的患者的生物樣品與第一多肽接觸，所述第一多肽是融合多肽，其包含兩個或 更多個選自K26、K39和K9的利什曼原蟲屬抗原或其免疫原部分，所述生物樣品選自血清、 血液和唾液；並且獨立地使所述生物樣品與包含如SEQ ID N0s:6、10或11所示的胺基酸 序列的第二多肽接觸；並且在所述樣品中檢測與第一和第二多肽的至少一個結合的抗體的 存在，從而鑑別受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床內臟利什曼病侵襲的患 者ο在具體實施方案中，鑑別受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床內臟 利什曼病侵襲的患者的方法使用融合多肽，其包含包含至少K26的142-267位殘基(SEQ ID NO 5)的第一免疫原部分；包含至少K39的2110-2343位殘基(SEQ ID NO 6)的第二免 疫原部分；和包含至少K9的1-399位殘基(SEQ ID NO 7)的第三免疫原部分。在仍然更具 體的實施方案中，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8的10-262位胺基酸殘基所示的胺基酸序列。在仍然更具體的相關實施方案中，所述融合多肽還包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端胺基酸序列。在相關實施方案中，鑑別受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床內臟 利什曼病侵襲的患者的方法使用與固體支持物結合的融合多肽，其中所述固體支持物可以 包含，例如硝化纖維，膠乳或塑料材料。在某些相關實施方案中，所述方法還包括i)從每個 固體支持物去除未結合的樣品；ii)將檢測試劑添加到每個固體支持物；並且iii)相對於 預定截斷值的水平比較與每個固體支持物結合的檢測試劑水平，從而鑑別受可能發展為急 性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床內臟利什曼病侵襲的患者。在具體實施方案中，所述檢測試劑包含與結合劑結合的報告基團。在相關實施方 案中所述結合劑選自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。在其他相關實施方案中，所述 報告基團選自放射性同位素、螢光基團、發光基團、酶、膠體金、生物素和染料顆粒。在多個其他實施方案中，本發明提供用於檢測生物樣品中無症狀或亞臨床內臟利 什曼病的診斷試劑盒。在具體實施方案中，用於檢測生物樣品中無症狀或亞臨床內臟利什 曼病的試劑盒包含融合多肽和檢測試劑，所述融合多肽包含兩個或更多個選自K26、K39和 K9的利什曼原蟲屬抗原或其免疫原部分，其中所述樣品選自血清、血液和唾液。在某些實施方案中，用於鑑別受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床 內臟利什曼病侵襲的患者的診斷試劑盒包含第一多肽、第二多肽和檢測試劑，所述第一多 肽是融合多肽，其包含兩個或更多個選自D6、K39和K9的利什曼原蟲屬抗原或其免疫原部 分，所述第二多肽包含如SEQ ID NOs 10或11所示的胺基酸序列。本發明的試劑盒還可以包含含有與結合劑結合的報告基團的檢測試劑，和/或結 合劑選自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素和/或報告基團選自放射性同位素、螢光基 團、發光基團、酶、膠體金、生物素和染料顆粒。附圖簡要描述

圖1顯示出以8融合基因構建體的示意圖，其包含N末端9個胺基酸的基序、Ldl^6 基因序列的142-267位多核苷酸(SEQ ID NO :1)、LdK39基因序列的2110-2343位多核苷酸 (SEQ ID NO 2)和LdK9基因序列的1-399位多核苷酸(SEQ ID NO :3)，所述N末端9個氨 基酸的基序包含6 XHIS標籤(即6個組氨酸殘基)。圖2顯示出以8、1(39和K9抗原檢測來自委內瑞拉的人類患者的血清中的VL的能 力的比較。圖3顯示出1(9、以6、以8和K39抗原檢測來自委內瑞拉的犬的血清中的VL的能力 的比較。序列標識簡要描述SEQ ID NO :1表示杜氏利什曼原蟲以6基因序列的142-267位多核苷酸，其編碼 K26抗原的免疫原部分。SEQ ID NO :2表示杜氏利什曼原蟲K39基因序列的2110-2343位多核苷酸，其編 碼K39抗原的免疫原部分。SEQ ID NO 3表示杜氏利什曼原蟲K9基因序列的1_399位多核苷酸，其編碼免疫 原部分和全長K9抗原。SEQ ID NO :4表示合成基因K28的多核苷酸序列，其包含N末端9個胺基酸的基序、SEQ ID N0:1的多核苷酸序列，所述N末端9個胺基酸的基序包含6XHIS標籤，所述 SEQ ID NO :1的多核苷酸序列與SEQ IDNO :2的多核苷酸序列融合，所述SEQ ID NO :2的多 核苷酸序列與SEQ IDNO :3的多核苷酸序列融合。ORF始於第4位核苷酸。SEQ ID NO 5表示杜氏利什曼原蟲以6抗原的142-267位多核苷酸所編碼的免疫 原多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO 6表示杜氏利什曼原蟲K39抗原的2110-2343位多核苷酸所編碼的免
疫原多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO 7表示杜氏利什曼原蟲K9抗原的1-399位多核苷酸所編碼的免疫原 全長多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO 8表示SEQ ID NO 4所編碼的以8多肽的胺基酸序列。SEQ ID NO 9表示杜氏利什曼原蟲以6抗原的單一重複單元的胺基酸序列。SEQ ID NO 10表示杜氏利什曼原蟲K39抗原的單一重複單元的胺基酸序列。SEQ ID NO 11表示杜氏利什曼原蟲K39抗原的單一重複單元的胺基酸序列。SEQ ID NO :12表示編碼SEQ ID NO :9的杜氏利什曼原蟲以6抗原的單一重複單 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO :13表示編碼SEQ ID NO :9的杜氏利什曼原蟲以6抗原的單一重複單 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO 14表示編碼SEQ ID NO 10的杜氏利什曼原蟲K39抗原的單一重複單 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO :15表示編碼SEQ ID NO :11的杜氏利什曼原蟲K39抗原的單一重複單 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO 16表示杜氏利什曼原蟲以6基因的全長多核苷酸序列。SEQ ID NO 17表示杜氏利什曼原蟲K39基因的全長多核苷酸序列。SEQ ID NO 18表示杜氏利什曼原蟲K9基因的全長多核苷酸序列。SEQ ID NO 19表示SEQ ID NO 16所編碼的胺基酸序列。SEQ ID NO 20表示SEQ ID NO 17所編碼的胺基酸序列。SEQ ID NO :21表示在本發明的多肽的重組產生中使用的示例性的N末端組氨酸 標籤。詳細描述利什曼原蟲屬抗原及其融合物本發明通常涉及使用利什曼原蟲屬抗原的組合物和方法。本發明的組合物 通常包含利什曼原蟲屬種的至少兩種異源抗原或其免疫原部分。可以從例如對於多 種利什曼原蟲屬種的國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information (NCBI))資料庫獲得利什曼原蟲屬抗原序列，所述多種利什曼原蟲屬種包括杜 氏利什曼原蟲、恰氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、亞馬遜利什曼原蟲、委 內瑞拉利什曼原蟲(L. venezuelensis)、巴西利什曼原蟲、巴拿馬利什曼原蟲、墨西哥利什 曼原蟲、熱帶利什曼原蟲和蓋亞那利什曼原蟲。在一方面，本發明提供如本文所述的包括融合多肽的分離的利什曼原蟲屬多肽和 包含所述分離的利什曼原蟲屬多肽的組合物。通常，本發明的多肽會是分離的多肽並且可以包含來自兩個或更多個利什曼原蟲屬基因的胺基酸序列的多肽片段(例如抗原/免疫原 部分)、多個多肽片段(例如融合多肽)或全長多肽，所述利什曼原蟲屬基因包括但不限於 K26、K39和/或K9。本領域技術人員應當理解到，抗原多肽片段還可以獲自本領域內已經 可以獲得的那些。使用常規重組和/或合成技術可以製備本發明的多肽、所述多肽的抗原 /免疫原片段和其他變體。在某些實施方案中，本發明的多肽是融合多肽。在具體實施方案中，所述融合多肽 包含Κ26、Κ39和/或Κ9抗原或其免疫原部分，所述免疫原部分是抗原的/免疫原的，即它 們在免疫測定(例如ELISA或T細胞刺激檢測)中與來自受感染的個體的抗血清和/或T 細胞可檢測地反應。可以使用技術人員熟知的技術進行對於免疫原活性的篩選。例如，可 以使用諸如 Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實驗手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中所述的那些方法進行這些篩選。在一個示例性 的實例中，本發明的多肽(例如融合多肽)可以被固定在固體支持物上並且與患者血清接 觸以允許血清中的抗體與固定的多肽的結合。然後，可以去除未結合的血清並使用諸如125I 標記的蛋白A檢測結合的抗體。如技術人員應當意識到的，本發明的融合多肽可以包含本文公開的利什曼原蟲屬 K26、K39和/或K9多肽的抗原或免疫原部分或片段。如本文所用的「免疫原部分」是本發 明的免疫原多肽的片段，所述片段自身與識別所述多肽的B細胞和/或T細胞表面抗原受 體是免疫上反應性的(即特異性地結合)。通常可以使用熟知技術鑑定免疫原部分，例如 Paul, Fundamental Immunology (基石出免疫學)，5th ed. , Lippincott Williams &Wilkins, 2003和其中引用的文獻中總結的那些方法。這些技術包括對於與抗原特異性抗體、抗血清 和/或T細胞系或克隆反應的能力篩選多肽。如本文所用的抗血清和抗體是「抗原特異性 的」，如果它們特異性地與抗原結合(即它們在免疫測定中與蛋白反應並且不與無關蛋白可 檢測地反應)。可以如本文所述和使用熟知技術製備這些抗血清和抗體。在具體實施方案中，本發明的融合多肽的抗原/免疫原部分或多肽片段是以基本 不低於全長融合多肽的反應性的水平與抗血清和/或T細胞反應的部分(例如在ELISA和 /或T細胞反應性檢測中)。優選地，融合多肽中抗原/免疫原部分的免疫原活性的水平是 全長融合多肽的免疫原性的至少約50%、優選地至少約70%和最優選地大於約90%。在 某些情況下，會鑑定出具有高於對應的全長融合多肽的免疫原活性的免疫原活性水平的優 選的免疫原部分，例如，具有高於約100%或150%或更高的免疫原活性。在具體實施方案 中，所述全長融合多肽的免疫原性會具有由其中包含的每種抗原/免疫原部分所貢獻的加 成的免疫原性。本發明的融合多肽還可以包含一個或多個多肽，其與T細胞和/或針對本發明的 多肽生成的抗體是免疫上反應性的，特別是與針對具有本文公開的胺基酸序列的多肽或其 免疫原片段或變體生成的抗體是免疫上反應性的。在具體實施方案中，所述被針對的多肽 是本文所述的融合多肽。在本發明的另一實施方案中，提供了融合多肽，其包含能夠激發T細胞和/或抗體 的兩個或更多個多肽，所述抗體與兩個或更多個本文所述的多肽是免疫上反應性的，或由 包含在本文公開的多核苷酸序列中的連續多核苷酸序列編碼的兩個或更多個多肽或其免 疫原片段或變體，或與這些多核苷酸序列中的兩個或更多個在中嚴緊性至高嚴緊性的條件下雜交的兩個或更多個多核苷酸序列編碼的兩個或更多個多肽。本發明還提供包含以6、以9和/或K9多肽的片段的融合多肽，所述片段包括抗原 /免疫原片段，所述抗原/免疫原片段包含利什曼原蟲屬D6、K39和/或K9抗原的至少約 5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250，300或350個連續胺基酸或更多並且包括所有中 間的長度，所述抗原/免疫原片段例如本文所示的那些片段或由本文所示的多核苷酸序列 所編碼的那些片段。在另一方面，本發明的融合多肽包含多肽片段的多拷貝，多肽片段的重複或多亞 基多肽片段，包括以任何順序包含至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個連續片段的、諸 如利什曼原蟲屬D6、K39和/或K9多肽的抗原/免疫原片段，並且包括所有長度的本文所 示的多肽組合物或由本文所示的多核苷酸序列編碼的那些。在另一方面，本發明的融合多 肽可以包含兩個或更多個如SEQ ID NOs :5-7和9-11中所示的利什曼原蟲屬抗原片段。在 相關方面，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :8的10-262位胺基酸所示的氨 基酸序列。在仍然另一方面，本發明提供包含兩個或更多個本文所述的利什曼原蟲屬K26、 K29和/或K9多肽的變體的融合多肽。本發明通常所包括的多肽變體與本文所示的多肽 序列通常，沿著其長度，表現出至少約70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95^^96^^97^^98%或99%或更高的一致性(按照下文所述測定)。優選地，相對於天然 K26.K29和/或K9序列，這些變體會具有相同的、相似的或提高的免疫活性。如本文所用的術語多肽「變體」是通常與本文具體公開的多肽(例如利什曼原蟲 屬K26、K29和/或K9多肽)的區別在於一個或多個取代、缺失、添加和/或插入的多肽。 這些變體可以是天然存在的或可以是合成生成的，例如，通過使用許多本領域公知的技術 中的任何技術修飾一個或多個本發明的以上多肽序列並評估其如本文所述的免疫原活性。在很多情況下，變體會包含保守型取代。「保守型取代」是胺基酸被具有相似性質 的另一胺基酸取代的一種取代，以使肽化學領域技術人員會期望多肽的二級結構和親水性 質基本上不改變。如上文所述，可以在本發明的多核苷酸和多肽的結構中進行修飾並且仍 獲得編碼具有諸如免疫原特性的所需特性的變體或衍生物多肽的功能性分子。當希望改變 多肽的胺基酸序列以產生等同的或甚至改進的本發明多肽的免疫原變體或部分時，本領域 技術人員通常會按照表1改變編碼DNA序列的一個或多個密碼子。例如，在蛋白結構中，某些胺基酸可以被其他胺基酸取代，而沒有與諸如抗體的抗 原結合區或底物分子上的結合位點的結構的相互作用結合能力的明顯丟失。因為蛋白的相 互作用能力和性質限定該蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列中並且當然，在其根本的 DNA編碼序列中進行某些胺基酸序列取代，並且仍然獲得具有相似性質的蛋白。因此，預期 可以在公開的組合物的肽序列或編碼所述肽的對應的DNA序列中進行各種改變，而沒有它 們生物效用或活性的明顯丟失。表 權利要求
1.分離的融合多肽，其包含兩個或更多個選自K26、K39和K9的利什曼原蟲屬 (Leishmania)抗原或其免疫原部分或變體，其中所述抗原中至少一個分離自杜氏利什曼原 蟲(Leishmania donovani)0
2.如權利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含包含SEQIDN0:5的K26序 列、包含SEQ ID NO 6的K39序列和包含SEQ ID NO 7的K9序列。
3.如權利要求2所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含如SEQIDNO 8的10-262位 所示的胺基酸序列。
4.如權利要求1-3中任一項所述的融合多肽，其中所述融合多肽還包含 MHHHHHHTS (SEQ ID NO 21)的N末端胺基酸序列。
5.分離的多核苷酸，其編碼權利要求1-4中任一項所述的融合多肽。
6.分離的抗體或抗原結合片段，其特異性地結合權利要求1-4中任一項所述的融合多肽。
7.藥物組合物，其包含(a)權利要求1所述的融合多肽，或(b)權利要求6所述的分離的抗體或抗原結合片段，或(c)權利要求5所述的多核苷酸；和 生理學可接受的載體。
8.疫苗，其包含(a)權利要求1所述的融合多肽，或(b)權利要求6所述的分離的抗體或抗原結合片段，或(c)權利要求5所述的多核苷酸；和 非特異性免疫應答增強劑。
9.檢測生物樣品中無症狀或亞臨床利什曼原蟲屬(Leishmania)感染的方法，所述生 物樣品選自血清、血液和唾液，所述方法包括(a)使生物樣品與融合多肽接觸，所述融合多肽包含兩個或更多個選自K26、K39和K9 的利什曼原蟲屬抗原或其免疫原部分或變體；以及(b)檢測所述生物樣品中與所述融合多肽結合的抗體的存在，從而檢測所述生物樣品 中無症狀或亞臨床利什曼原蟲屬感染。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述融合多肽包含SEQIDNOs :5-7中所示的氨基 酸序列。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述融合多肽包含如SEQIDNO 8的10-262位所示的胺基酸序列。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述融合多肽還包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端胺基酸序列。
13.如權利要求9所述的方法，其中所述融合多肽與固體支持物結合。
14.如權利要求10所述的方法，其中所述固體支持物包括硝化纖維、膠乳或塑料材料。
15.如權利要求9所述的方法，其中檢測步驟包括(a)從固體支持物中去除未結合的樣品；(b)將檢測試劑添加到固體支持物；以及(C)相對於預定截斷值的水平檢測與固體支持物結合的檢測試劑水平。
16.鑑定受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床內臟利什曼病侵襲的患者 的方法，所述方法包括(a)使獲自受無症狀或亞臨床內臟利什曼病侵襲的患者的生物樣品與第一多肽接觸， 所述第一多肽是包含兩個或更多個選自D6、K39和K9的利什曼原蟲屬(Leishmania)抗原 或其免疫原部分或變體的融合多肽，所述生物樣品選自血清、血液和唾液；以及(b)獨立地使所述生物樣品與第二多肽接觸，所述第二多肽包含如SEQID N0s:10或 11所示的胺基酸序列；以及(c)檢測所述樣品中與所述第一和第二多肽中至少一個結合的抗體的存在，從而鑑定 受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床內臟利什曼病侵襲的患者。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述融合多肽包含SEQIDNOs :5-7中所示的氨基 酸序列。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述融合多肽包含如SEQIDNO 8的10-262位所示的胺基酸序列。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述融合多肽還包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端胺基酸序列。
20.如權利要求16所述的方法，其中所述第一和第二多肽各自與分別的固體支持物結I=I O
21.如權利要求20所述的方法，其中所述固體支持物包括硝化纖維、膠乳或塑料材料。
22.如權利要求16所述的方法，其中其中檢測步驟包括(a)從每個固體支持物中去除未結合的樣品；(b)將檢測試劑添加到每個固體支持物；以及(c)相對於預定截斷值的水平比較與每個固體支持物結合的檢測試劑水平。
23.如權利要求15或22中任一項所述的方法，其中所述檢測試劑包含與結合劑結合的報告基團。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述結合劑選自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。
25.如權利要求23所述的方法，其中所述報告基團選自放射性同位素、螢光基團、發光 基團、酶、生物素和染料顆粒。
26.用於檢測生物樣品中無症狀或亞臨床內臟利什曼病的診斷試劑盒，所述生物樣品 選自血清、血液和唾液，所述試劑盒包含(a)融合多肽，其包含兩個或更多個選自D6、K39和K9的利什曼原蟲屬(Leishmania) 抗原或其免疫原部分或變體；和(b)檢測試劑。
27.用於受可能發展為急性內臟利什曼病的無症狀或亞臨床內臟利什曼病侵襲的患者 的診斷試劑盒，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽是包含兩個或更多個選自D6、K39和K9的利什曼原蟲屬 (Leishmania)抗原或其免疫原部分或變體的融合多肽；(b)第二多肽，其包含如SEQID NO 10或11所示的胺基酸序列；和(C)檢測試劑。
28.如權利要求26或27中任一項所述的試劑盒，其中所述檢測試劑包含與結合劑結合 的報告基團。
29.如權利要求26或27中任一項所述的試劑盒，其中所述結合劑選自抗免疫球蛋白、 蛋白G、蛋白A和凝集素。
30.如權利要求26或27中任一項所述的試劑盒，其中所述報告基團選自放射性同位 素、螢光基團、發光基團、酶、生物素和染料顆粒。
全文摘要
本發明通常涉及由合成的基因構建體產生的融合蛋白，所述合成的基因構建體包含來源於利什曼原蟲屬抗原K26、K39和K9的元件。所述融合蛋白在利什曼病的診斷中，特別是在諸如人和犬的動物中的內臟利什曼病的診斷中是特別有用的。
文檔編號C07K14/44GK102083853SQ200980125647
公開日2011年6月1日 申請日期2009年7月2日 優先權日2008年7月3日
發明者史蒂文·G·裡德, 阿賈伊·巴蒂亞 申請人:傳染性疾病研究院